CN104845934A - 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞免疫学领域，是关于从脐血CD34+造血干细胞诱导树突状细胞（Dendritic Cell，DC）大量生成的方法学研究，其主要步骤包括从脐血中分离单核细胞，通过免疫磁珠阳性筛选法分离出CD34+造血干细胞，使用扩增培养基（IMDM，FBS，GM-CSF，SCF）连续扩增CD34+细胞30天，扩增过程中阶段性收获大批量CD34-DC前体细胞，通过GM-CSF/IL-4培养基诱导前体细胞分化为未成熟DC。本发明所述的方法能够获得109数量级的DC，和传统外周血单个核细胞诱导的DC相比，CD34-DC具有较强的抗原吞噬能力和诱导T淋巴细胞增殖的能力。
Description
技术领域
本发明涉及CD34+造血干细胞的一种新用途，特别涉及到脐带血来源的CD34+造血干细胞诱导大批量树突状细胞的制备方法。
背景技术
树突状细胞（Dendritic cell，DC）是存在于人体的能够诱发免疫反应的专职抗原提呈细胞。目前，基于DC细胞制备的特异性DC抗肿瘤疫苗已经广泛应用于临床。DC细胞主要来源于骨髓，脐带血，或外周血单个核细胞。通过负载肿瘤抗原，DC能够诱导机体产生强大的特异性抗肿瘤免疫，全球已启动超过150个临床试验以验证DC疫苗对各种肿瘤的安全性及有效性。
目前DC生物制备方法大多数都是采用肿瘤病人的自体外周血单个核细胞，但存在数量少、抗原递呈能力差等问题。被誉为“造血干细胞池”的新鲜脐带血中含有大量的CD34+造血干细胞，比起外周血和骨髓中的干细胞具有更强的增殖潜能和分化潜能。近年来已有某些方法从造血干细胞中培养出数量大、功能强的DC细胞，使DC细胞的大规模生产、储存和临床应用成为可能。
本方法旨在从产后废弃物脐带血获取CD34+造血干细胞并于体外诱导生成大量DC前体细胞，通过功能性实验来验证CD34-DC前体细胞是诱导分化为未成熟DC的优质前体细胞。
发明内容
本发明主要目的是解决目前常用的外周血来源DC数量少、抗原吞噬能力差、抗原提成功能低、个体差异大等实际问题。本发明所阐述的大批量CD34-DC的制备方法、流程和工艺，相较文献中发表的脐带血CD34+造血干细胞来源DC的培养扩增技术，具有制备工艺先进可靠、DC数量大、功能强等优势，是对现有制备方法的创新、改进和升级。
本发明所采用的技术方案是：提供一种脐血CD34+造血干细胞诱导大量DC的制备方法，包括以下步骤：
（1）从健康足月产孕妇分娩后新鲜脐带血中分离出单个核细胞。
（2）脐血CD34+造血干细胞的获得：从分离的脐血单个核细胞中，通过免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34+造血干细胞。
（3）脐血CD34+造血干细胞的扩增：使用GM-CSF/SCF扩增培养基培养细胞，每3天更换新鲜的GM-CSF/SCF培养基，将扩增的悬浮细胞按接种密度（1-2）×105/ml依次转移到新的六孔板、25cm2或75cm2细胞培养瓶中，连续扩增培养30天。
（4）CD34-DC前体细胞的收获：上述培养的第8天起，相继有DC前体细胞开始贴壁，将悬浮细胞转移到新的细胞培养瓶中继续扩增培养，收获贴壁细胞为脐血CD34-DC前体细胞，其进一步培养或置于液氮长期冻存备用；新鲜或冻存复苏后的CD34-DC前体细胞可继续在GM-CSF/IL-4培养基中进行未成熟DC的诱导扩增。此后连续30天的培养过程中，每3天收获一批贴壁的CD34-DC前体细胞。
在所述（1）脐血单个核细胞分离的方法，包括以下步骤：
采集健康足月产孕妇分娩后新鲜脐带血50ml，在3000r/min条件下离心10min，弃上层血浆，加入无菌生理盐水和羟乙基淀粉按1:1:1比例重悬沉淀的脐带血细胞，放置37℃温箱中孵育30min使红细胞沉淀，用小吸管吸出上层悬液，在避光的条件下，按2:1的比例加入到人淋巴细胞分离液上，900g/min离心30min，小吸管吸出单个核细胞层，加入无菌生理盐水重悬细胞，1500r/min离心10min，反复洗2次，获得单个核细胞。
在所述（2）获得CD34+造血干细胞的步骤中，本发明采用免疫磁珠阳性分选法获得CD34+造血干细胞。免疫磁珠阳性分选法是基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单克隆抗体相结合，在外磁场作用下，与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面标记抗原的细胞不能与磁珠的抗体结合而没有磁性，不停留在磁场中，从而使高纯度的CD34+造血干细胞被分选出来，进而可从这些CD34+造血干细胞中诱导和扩增出大批量的CD34-DC前体细胞。
在所述（3）CD34+造血干细胞扩增培养的方法中，本发明采用的GM-CSF/SCF培养基，使用含有10%FBS、100ng/ml重组人GM-CSF、及50ng/ml SCF的IMDM细胞培养基。
在所述（4）的方法中，用于脐血CD34-DC前体细胞进一步诱导分化为未成熟DC的GM-CSF/IL-4培养基，使用含800units/ml GM/CSF和500units/ml IL-4的AIM V细胞培养基。
与现有的技术相比，本发明具有的积极有效效果：
脐带血分离CD34+造血干细胞诱导的DC相比文献中发表的脐带血CD34+造血干细胞来源DC的培养扩增技术，具有生成DC数量大的突出优势，约（2-7）*109/50ml脐带血，且相比传统外周血单状核细胞诱导的DC具有更强的抗原吞噬能力，更高的表面分子表达水平和类似的刺激淋巴细胞增殖的能力。
附图说明
图1A和图1B分别为DC形态特征图。图1A为CD34-DC成熟后倒置显微镜下的形态（400×）；图1B为PBMC-DC成熟后倒置显微镜下的形态（400×）。
图2为CD34-DC在未成熟和成熟状态下，其CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达均显著高于PBMC-DC柱形图。
图3为新鲜和冻存复苏的CD34-DC前体细胞，其抗原吞噬能力均显著优于所对应状态下PBMC-DC柱形图。
图4为CD34-DC和PBMC-DC一样具有较强的诱导T细胞增殖能力折线图。
具体实施方式
实施例1 脐带血来源DC的制备
分离脐带血单核细胞：
1. 无菌注射器采集健康足月产孕妇分娩后新鲜脐带血50 ml，肝素抗凝；
2. 将50ml脐带血平均分装到2个50ml离心管内，然后置于离心机中离心10 min，转速为3000 r／min ；离心后用吸管将上层血浆吸出后弃之；
3. 分别按1：1：1的比例，加无菌生理盐水和羟乙基淀粉液到上一步的沉淀脐带血中，使细胞重悬；置于37℃培养箱中孵育30分钟，使红细胞沉淀；
4. 待红细胞沉淀后，用小吸管吸出上层液体，在避光条件下按2：1（2份体积细胞混悬液：1份体积淋巴分离液）的比例将细胞混悬液沿管壁缓慢加入人淋巴细胞分离液的液面之上，小心置于离心机中，900g/min无制动离心30min；
5. 离心后取出分为四层液面的离心管，小吸管吸取白膜层（单个核细胞）置于新50ml离心管中，加无菌生理盐水重悬细胞并轻柔吹打洗涤，1500r/min离心10min；如此反复洗涤两次，收获脐血单个核细胞。
磁珠阳性分选获得CD34+造血干细胞：
1. PBS缓冲液重悬单个核细胞，制备成单细胞悬液，经30μm的尼龙网过滤；加入PBS缓冲液轻柔吹打洗涤，2-8℃环境，300g/min离心10min；
2. 用PBS缓冲液，按108/300μl细胞密度重悬细胞，每108个细胞加入100μl FcR试剂和100μl CD34磁珠试剂，充分混匀后在2-8℃条件下孵育30分钟；
3. 加入5-10ml的PBS缓冲液，2-8℃环境，300g/min离心洗涤10min，弃上清；
4. 用PBS缓冲液，按108/500μl细胞密度重悬细胞；用500μl的PBS缓冲液湿化MS分选柱，将上述细胞悬液加入置于磁场中的分选柱阳性分选；
5. 将MS分选柱移开磁场，用1ml的PBS缓冲液冲洗分选柱内细胞到10ml离心管中，300g/min离心10min，收集阳性细胞为脐血CD34+造血干细胞。
脐血 CD34+造血干细胞的扩增：
1. 将所分离的初始CD34+造血干细胞，用GM-CSF/SCF培养基调整细胞密度至（1-2）×105/ml，按照3ml/孔接种至六孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，在培养过程中每12h轻轻晃动六孔板。
2. 培养过程中每3天更换新鲜GM-CSF/SCF培养基，重悬细胞并按（1-2）×105/ml将悬浮细胞转移到新的六孔板、25cm2或75cm2细胞培养瓶中，以此方法连续扩增培养30天，间断观察细胞计数并记录（表1）。
CD34-DC前体细胞的收获及诱导分化：
1.从上述培养的第8天开始，相继有DC前体细胞开始贴壁；每3天在扩增细胞转移接种的同时收获贴壁细胞直至30天扩增周期结束。将上述持续分批次收获的贴壁细胞即CD34-DC前体细胞继续培养或冻存，连续培养30天后，贴壁细胞大幅减少。此时，收获的CD34-DC总数达到7.0×109。连续培养过程中扩增细胞总数及CD34-DC前体细胞总数见表1。
表1 扩增细胞总数及CD34-DC前体细胞总数
2.上述新鲜或冻存复苏后的CD34-DC前体细胞，可直接加入GM-CSF/IL-4培养基中在37℃，5%CO2条件下连续培养7天，获取第1、3、5、7天的未成熟DC细胞进行表型检测；部分DC于培养第5天加入50ng/ml的TNF-α，继续成熟化培养48小时获得成熟DC（mDC ），进行表型检测。检测结果显示，培养第 1、3、5、7天的未成熟DC和成熟DC表面分子 CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子表达逐渐增高，且CD34-DC较PBMC-DC增高更显著（图2）。成熟CD34-DC胞体较大，成熟后，树突回缩，细胞呈类圆形，细胞呈集落聚集（图1）。
实施例2 外周血来源DC的制备及淋巴细胞的制备
外周血DC（PBMC-DC）的分离、诱导和分化
1. 外周血取自河北省血液中心的，获取过滤400ml健康人外周血后的废弃白细胞滤器，用无菌注射器抽吸无菌生理盐水后，由滤器的反方向冲洗获取白细胞悬液，并收集到2个50ml离心管，每个离心管30ml；
2. 避光条件下按2：1（2份体积细胞混悬液：1份体积淋巴分离液）的比例将细胞混悬液沿管壁缓慢加入人淋巴细胞分离液（Ficoll）的液面之上，轻柔置于离心机中，900g/min无制动离心30min；
3. 离心结束后，离心管中细胞分为4层，小吸管吸出白膜层，加无菌生理盐水洗涤细胞，300g/min离心6min，离心后弃上清，反复洗涤两次，获得外周血单核细胞；
4. 用1640培养基重悬细胞后接种到25cm2贴壁细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2 稳定湿度的细胞培养箱内培养2小时，期间每隔30min轻轻晃动培养瓶，使细胞分布均匀；
5. 2小时后贴壁细胞即为PBMC-DC前体细胞，悬浮的细胞即为淋巴细胞。为与CD34-DC对照研究，将收获PBMC-DC前体细胞部分直接液氮冻存备用；部分加入GM-CSF/IL-4培养基中连续培养7天诱导分化为未成熟DC（imDC）；获取第1、3、5、7天的未成熟DC细胞进行表型检测。部分DC于培养第5天加入50ng/ml的TNF-α，继续成熟化培养48小时获得成熟DC（mDC ），进行表型检测。检测结果显示，培养第 1、3、5、7天的未成熟PBMC-DC和成熟DC表面分子 CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子表达逐渐增高，但较CD34-DC的表达稍低（图2）。成熟PBMC-DC胞体偏小，整个细胞呈长梭形，细胞逐渐悬浮，树突回缩，从胞膜伸出少量毛刺，细胞呈集落聚集（图1）。
淋巴细胞培养：
1.外周血PBMC贴壁2小时后，将悬浮的淋巴细胞移至新的培养瓶，加入含有150ng/ml的抗CD3单克隆抗体和10% FBS的1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
2.次日加入含50ng/ml的IL-2和10%FBS的1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；每3天更换新鲜培养基连续培养；
3.以上淋巴细胞扩增培养过程，可直接冻存备用，可直接用于CTL制备。
实施例1、实施例2中DC表面分子表达水平检测
1. 为了解两种来源的DC前体细胞在诱导分化过程中细胞表面分子表达水平变化，应用流式细胞仪，分别对培养不同时间点（第1，3，5，7天）CD34-DC和PBMC-DC的表面标志物CD83、CD80、CD86、HLA-DR进行检测分析；
2. 收集悬浮和贴壁状态的106个DC细胞，用含有0.5%叠氮钠，0.1% 牛血清白蛋白的PBS洗涤后，400g/min离心6min，弃上清，重复洗涤2次；
3. 避光条件下，分别加入10μL FITC-抗CD80，CD83，CD86，HLA-DR抗体，4℃冰箱中放置10min；
4. 用含有0.5%叠氮钠，0.1%牛血清白蛋白的冷PBS缓冲液洗涤，400g/min离心6min，弃上清；重复洗涤2次；
5. 用冷1%多聚甲醛重悬细胞后上流式仪检测，CellQuest软件分析，结果显示CD34-DC较PBMC-DC表面分子表达水平明显增高（图2）。
实施例1、实施例2中DC抗原吞噬能力检测
1.为检测不同时间点（第1, 3, 5, 7天）收获的新鲜CD34-DC和PBMC-DC抗原吞噬能力的变化，在细胞培养基中加入20μg/ml右旋糖酐（dextran），在37℃，5%CO2中培养30min；
2.避光条件下，用含0.5%叠氮钠，0.1% 牛血清白蛋白的PBS洗涤，400g离心6min，弃上清，重复洗涤2次；冷1%多聚甲醛重悬细胞后流式仪检测，CellQuest软件分析，结果显示培养第5天的DC吞噬能力最强，CD34-DC相比PBMC-DC具有更强的抗原吞噬能力（图3）。
实施例1、实施例2中DC混合淋巴细胞反应
1.脐带血CD34+来源的未成熟DC（CD34-imDC）和外周血单个核细胞来源的未成熟DC（PBMC-imDC）刺激淋巴细胞增殖的能力用MTS法检测；
2.取培养第5天的外周血淋巴细胞用无菌生理盐水重复洗2遍，用含10% FBS的1640培养基重悬后，按细胞浓度（106/每孔）接种到96孔板中；
3.分别取GM-CSF/IL-4培养基培养到第5天的CD34-imDC和PBMC-imDC，用无菌生理盐水洗两遍后，加入含10% FBS的1640培养基重悬细胞，按1:10，1:20，1:40，1:100（imDC：淋巴细胞）比例将imDC接种至淋巴细胞孔板中，未经imDC刺激的淋巴细胞设置为对照组，充分混匀后在37℃、5%CO2 稳定湿度细胞培养箱培养。
4.培养第4天时，在避光条件下每孔加20μL MTS，培养箱中孵育3小时后，取出96孔板在酶标仪490nm下检测并记录OD值，将OD值绘成细胞扩增曲线，结果显示CD34-DC和PBMC-DC一样具有较强的淋巴细胞促增殖活性（图4）。
Claims (5)
1.一种应用脐血CD34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法，所述的方法，包括以下步骤：
（1）从脐带血中分离单个核细胞；
（2）从分离的脐带血单个核细胞中，通过免疫磁珠阳性筛选法分离出CD34+造血干细胞；
（3）CD34+造血干细胞的扩增：将上述CD34+造血干细胞加入GM-CSF/SCF培养基，调整细胞密度为（1-2）×105/ml，以3ml/孔接种至六孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中进行扩增培养，每3天更换新鲜的GM-CSF/SCF培养基，将扩增的悬浮细胞按照（1-2）×105/ml的细胞密度，转移到新的六孔板、25cm2或75cm2细胞培养瓶中，以此方法依次连续扩增培养30天；
（4）脐血CD34-DC前体细胞的收获及诱导分化：按照步骤⑶对悬浮细胞进行连续扩增培养至第8天，部分细胞开始贴壁，此后每3天转移接种扩增细胞的同时收获贴壁细胞直至30天扩增周期结束；从培养体系中分离出的贴壁细胞为脐血CD34-DC前体细胞，将其进一步培养或置于液氮长期冻存备用；新鲜或冻存复苏后的CD34-DC前体细胞在GM-CSF/IL-4培养基中进行诱导分化为未成熟DC并发生一定程度的扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（1）脐带血单个核细胞的获取步骤中，采集健康足月产孕妇分娩后新鲜脐带血50 ml， 3000 r／min离心10 min，离心后弃上层血浆，按1:1:1的比例加入无菌生理盐水和羟乙基淀粉重悬沉淀的脐带血细胞，于37℃孵育30分钟使红细胞沉淀，吸出上层液体，在避光条件下按2：1的比例缓慢加入到人淋巴细胞分离液之上，900g/min离心30min，小吸管吸出白膜层，加无菌生理盐水重悬细胞，1500r/min离心10min，反复洗两次，获得单个核细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（2）免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞步骤中，使用PBS缓冲液重悬脐血单个核细胞，经30μm的尼龙网过滤，2-8℃环境，300g/min离心10min，弃上清；用PBS缓冲液重悬细胞其密度为108/ 300μl，每108细胞加入100μl FcR试剂和100μl CD34磁珠试剂，在2-8℃条件下反应30分钟；加入5-10mL的缓冲液清洗细胞，300g/min离心10min，弃上清；使用PBS缓冲液重悬细胞其密度为108/ 500μl，细胞悬液加入分选柱中；将MS分选柱移开磁场，用1ml的PBS缓冲液冲洗分选柱内细胞至10ml离心管中，300g/min离心10min，收集阳性细胞即为脐带血CD34+干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（3）CD34+造血干细胞的扩增步骤中，所述的GM-CSF/SCF培养基为IMDM培养基、10%FBS、人重组GM-CSF为100ng/ml和 SCF为50ng/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（4）脐血CD34-DC前体细胞的收获及诱导分化步骤中，所述的GM-CSF/IL-4培养基为无血清AIM V培养基、GM-CSF为800units/ml和IL-4为500units/ml。
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