CN105420192A - 外周血中分离富集造血干细胞的方法 - Google Patents

外周血中分离富集造血干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105420192A
CN105420192A CN201510657508.3A CN201510657508A CN105420192A CN 105420192 A CN105420192 A CN 105420192A CN 201510657508 A CN201510657508 A CN 201510657508A CN 105420192 A CN105420192 A CN 105420192A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
stem cell
hemopoietic stem
centrifugal
peripheral blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510657508.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王泰华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510657508.3A priority Critical patent/CN105420192A/zh
Publication of CN105420192A publication Critical patent/CN105420192A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：步骤1：自体血浆的制备阶段；步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段；步骤3：单个核细胞的制备；步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段；步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段。本发明从简单方便的取材中体外分离数量及纯度高的造血干细胞，以便于后期大量扩增培养，用于造血干细胞移植治疗临床造血系统疾病。

Description

外周血中分离富集造血干细胞的方法
技术领域
本发明属干细胞技术领域，具体涉及一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，具体说也属于生物技术领域，尤其涉及一种非骨髓动员的外周血中分离富集造血干细胞的方法。
背景技术
目前，大多数生物学家和医学家认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。
造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞，也是发现最早、研究最多的一种成体干细胞，是体内各种血细胞的惟一来源。哺乳动物造血包含原始造血(primitivehematopoiesis)和永久造血(definitivehematopoiesis)，而永久造血是由多能的HSC维持的。HSC是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞，可形成血液各系的血细胞，并可重建致死量照射破坏的造血系统，HSC除可以分化为各系血细胞外，还可以分化为多种非造血组织的细胞，如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。
造血干细胞在细胞大小上类似于小淋巴细胞，细胞密度一般小于1.066g/ml。因此，至今仍不能单纯从形态学上来识别造血干细胞。而要对HSC进行研究，首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用HSC表面的标志蛋白对其进行分离。目前人的HSC表面标志包括CD34+、CD38－、Lin－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA－、CD71－、Rhodull等。CD34分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，相对分子质量为115KD，其编码基因位于第1号染色体长臂，基因长约26—28kb，含8个外显子，表达在造血干细胞、一部分造血祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面，通过筛选CD34+细胞至少可以使HSC得到富集，随着HSC的分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞(Lin+)不表达CD34。因而CD34+为人们普遍认同的造血干细胞及造血祖母细胞的代表性表面标志，因此本发明及使用富集CD34+细胞进行体外分离HSC。
目前HSC提取的主要三种来源为骨髓、动员的外周血和脐带血。成年人的HSC主要存在于骨髓，约占骨髓细胞的0.05％，但采用骨髓来源的HSC需要骨髓穿刺会给病人造成极大的创伤，使其承受极大痛苦，且恢复时间较长；从动员的外周血中提取则需要动员，目前动员剂按动员机制可分为造血生长因子G-CSF、化疗药物和聚阴离子化合物3类，使用动员剂都会有相关的毒副作用如造血生长因子近期最常见的副反应为骨痛、发热、疲乏、头痛、失眠、食欲减退、恶心呕吐、白细胞过多等而且正常供者使用G-CSF是否增加患白血病和其他恶性肿瘤的危险性,目前尚不清楚；而脐带则属于控制品，获得材料需要一些控制。因此三种常规来源都有一些局限性。
也就是说，此三种方式，骨髓取材会造成创伤，病人需要承受极大痛苦；从动员的外周血中提取，既需要使用动员剂，会存在相关的副作用；脐带血来源存在一些方面控制。因此取材方面三种都存在一定缺陷。而且，非动员的外周血中造血干细胞的含量少，因而从非动员的外周血中提取造血干细胞的数量、纯度不高，不利于后期体外扩增培养。
发明内容
本发明的目的提供一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，以克服现有技术的不足。二价DNA疫苗技术来源于普通DNA疫苗，其原理是将针对对虾白斑病毒两个重要膜蛋白功能区域蛋白基因克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对同一个病原的两个不同抗原蛋白的表达。将这种二价DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、有效。本发明将WSSV的VP28、VP19基因串联克隆为融合基因，克隆至Pvax1.0真核表达载体，制备多价基因DNA疫苗，可有效的提高DNA疫苗的保护效果，为对虾抗WSSV的DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种外周血中分离富集造血干细胞的方法的处理方案，具体如下：
一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：
步骤1：自体血浆的制备阶段，具体如下：
(1-1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中；
(1-2)将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2-8℃条件下保存1-7天；
步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段，具体如下:
将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与羟乙基淀粉溶液按1:5的体积比例完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2％，然后60×g离心10min，取上清液备用；
步骤3：单个核细胞的制备，具体如下：
(3-1)将步骤2中备用的上清，用含胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；
(3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll液；
(3-3)将(3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液于上清液的体积比例为1:1.25，平衡后800×g离心20min；(3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液(DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清；
(3-5)用磷酸盐缓冲液(DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一次；
(3-6)用含质量百分比为5％的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步骤(3-5)，去上清收集细胞并计数；
步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段，具体如下：
(4-1)配置造血干细胞培养体系，由此而得造血干细胞培养基：
(4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5×106/ml，接种于75cm2的细胞培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱孵育120min；
(4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一75cm2的培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱培养，即可去除贴壁的细胞。
(4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；
(4-5)富集培养7天后，计数并检测CD34+阳性率；
步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：
(5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个核细胞；
(5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)清洗一遍，1400r/m离心5min，弃上清；
(5-3)计算细胞浓度，按每1×108个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不足1×108个细胞按1×108个计算；
(5-4)(5-3)中体系每1×108个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC受体介导的结合CD34震荡15s混匀；
(5-5)(5-4)中体系加入100μL抗CD34磁珠，震荡15s混匀，并置于4℃冰箱孵育30min；
(5-6)(5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300×g离心11min后弃上清，用500μLBuffer液重悬单个核细胞；
(5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将(5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁场中的吸附柱，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在吸附柱中；
(5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34+细胞；
(5-9)计数并流式细胞仪检测CD34+阳性率。
所述的抗凝管为肝素钠抗凝管。
所述的配置造血干细胞培养体系的方法为往IMDM培养基中加入质量百分比为15％的胎牛血清、60ng/mL的干细胞因子(SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子(TPO)、10ng/mL的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、30ng/mL的白介素6(IL-6)、30ng/mL的IL-3/GM-CSF融合蛋白(G3)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯(CAPE)，由此而得造血干细胞培养基。
步骤2中所述的将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6％的羟乙基淀粉溶液按1：6的体积比例完全混匀。
步骤2中所述的使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.0％。
(1-2)中所述的将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于-80℃条件下长期保存备用。
所述的(4-5)中的计数方法为MNC计数方法。
所述的(4-5)中的检测方法为用流式细胞仪检测CD34+阳性率。
所述的步骤2中的羟乙基淀粉溶液质量百分比为6％。
所述的(3-1)中的胎牛血清的质量百分比为5％。
本发明的取材方面：从目前三种来源以外的来源即非动员的外周血中提取造血干细胞，即避免了给病人造成极大痛苦、创伤及副作用，又不存在来源控制，解决了取材不便的问题。
技术方面：本发明解决了目前的技术从非动员的外周血中提取造血干细胞的纯度不高，提取数量偏少不利于后期扩增的问题。
因此本发明重在研究从简单方便的取材中体外分离数量及纯度高的造血干细胞，以便于后期大量扩增培养，用于造血干细胞移植治疗临床造血系统疾病。
附图说明
图1为本发明的实施例的表面标志CD34+的流式检测图；
图2为本发明的纯化前单个核细胞中CD34+的纯度；
图3为本发明的纯化后单个核细胞中CD34+的纯度。
具体实施方式
本发明即从非动员的外周血中提取HSC，避免了现有技术中的问题，开辟了新的来源。
近年来，HSC表面标志研究的发展丰富了干细胞分离纯化的手段。根据HSC的表面标志，可通过免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和分子生物学手段来检测造血干细胞。正如上述所提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。如荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)纯度可达到95％，但是，成本较高，仪器也较贵，因此本发明使用免疫吸附系统--免疫磁珠分离CD34+细胞，免疫磁珠分离系统分离量大，分离纯度和细胞质量均可用于后期大量扩增培养。
一般来说，HSC大部分在骨髓里，而外周血液中含有少量的HSC，因此从非动员的外周血中分离HSC有一定困难，本发明先采用特殊培养体系富集培养，再分离HSC，突破了从非动员的外周血中分离HSC数量较少，纯度不高的问题，可用于大规模分离HSC并用于后期大量培养扩增，以便于临床使用。
造血干细胞在临床应用的深远意义已毋庸置疑。HSC是首先被应用于临床治疗的一群干细胞。由于它们具有自我更新、多向分化、来源相对广泛、采集和体外处理容易等特点,使它们具有广阔的应用前景。临床治疗中，造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation)技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用，已经成为治愈恶性血液病和实体瘤(如淋巴瘤，生殖细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌)等疾病的可靠选择，成为干细胞研究和应用的成功范例。
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：
步骤1：自体血浆的制备阶段，具体如下：
(1-1)抽取病人80ml血液，至肝素钠抗凝管中；
(1-2)将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2-8℃保存1-7天或-80℃长期保存备用；
步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段，具体如下:
将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6％的羟乙基淀粉溶液按1:5或者1：6的体积比例完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2％或者1.0％，然后60×g离心10min，取上清液备用；
步骤3：单个核细胞的制备，具体如下：
(3-1)将步骤2中备用的上清，用含质量百分比为5％的胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；
(3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll液；
(3-3)将(3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液于上清液的体积比例为1:1.25，平衡后800×g离心20min；
(3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液(DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清；
(3-5)用磷酸盐缓冲液(DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一次；
(3-6)用含质量百分比为5％的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步骤(3-5)，去上清收集细胞并计数；
步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段，具体如下：
(4-1)配置造血干细胞培养体系：
往IMDM培养基中加入质量百分比为15％的胎牛血清、60ng/mL的干细胞因子(SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子(TPO)、10ng/mL的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、30ng/mL的白介素6(IL-6)、30ng/mL的IL-3/GM-CSF融合蛋白(G3)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯(CAPE)，由此而得造血干细胞培养基；
(4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5×106/ml，接种于75cm2的细胞培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱孵育120min；
(4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一75cm2的培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱培养，即可去除贴壁的细胞。
(4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；
(4-5)富集培养7天后，MNC计数并流式细胞仪检测CD34+阳性率；
步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：
(5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个核细胞；
(5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)清洗一遍，1400r/m离心5min，弃上清；
(5-3)计算细胞浓度，按每1×108个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不足1×108个细胞按1×108个计算；
(5-4)(5-3)中体系每1×108个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC受体介导的结合CD34震荡15s混匀；
(5-5)(5-4)中体系加入100μL抗CD34磁珠，震荡15s混匀，并置于4℃冰箱孵育30min；
(5-6)(5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300×g离心12min后弃上清，用500μLBuffer液重悬单个核细胞；
(5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将(5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁场中的吸附柱，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在吸附柱中；
(5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34+细胞；
(5-9)计数并流式细胞仪检测CD34+阳性率。
本实施例的CD34+造血干细胞实验结果数据统计表格如下表1所示：
表1
图1为本实施例的表面标志CD34+的流式检测图；而图2和图3为对应的流式荧光信号直方图，其中图2为纯化前单个核细胞中CD34+的纯度；图3为纯化后CD34+单个核细胞中CD34+的纯度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1：自体血浆的制备阶段，具体如下：
(1-1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中；
(1-2)将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2-8℃条件下保存1-7天；
步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段，具体如下:
将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与羟乙基淀粉溶液按1:5的体积比例完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2％，然后60×g离心10min，取上清液备用；
步骤3：单个核细胞的制备，具体如下：
(3-1)将步骤2中备用的上清，用胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；
(3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll液；
(3-3)将(3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液与上清液的体积比例为1:1.25，平衡后800×g离心20min；(3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液(DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清；
(3-5)用磷酸盐缓冲液(DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一次；
(3-6)用含质量百分比为5％的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步骤(3-5)，去上清收集细胞并计数；
步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段，具体如下：
(4-1)配置造血干细胞培养体系，由此而得造血干细胞培养基：
(4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5×106/ml，接种于75cm2的细胞培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱孵育120min；
(4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一75cm2的培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱培养，即可去除贴壁的细胞；
(4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；
(4-5)富集培养7天后，计数并检测CD34+阳性率；
步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：
(5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个核细胞；
(5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、pH7.2的磷酸盐缓冲液(DPBs)清洗一遍，1400r/m离心5min，弃上清；
(5-3)计算细胞浓度，按每1×108个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不足1×108个细胞按1×108个计算；
(5-4)(5-3)中体系每1×108个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC受体介导的结合CD34震荡15s混匀；
(5-5)(5-4)中体系加入100μL抗CD34磁珠，震荡15s混匀，并置于4℃冰箱孵育30min；
(5-6)(5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300×g离心10min后弃上清，用500μLBuffer液重悬单个核细胞；
(5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将(5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁场中的吸附柱，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在吸附柱中；
(5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34+细胞；
(5-9)计数并流式细胞仪检测CD34+阳性率。
2.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的抗凝管为肝素钠抗凝管。
3.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的配置造血干细胞培养体系的方法为往IMDM培养基中加入质量百分比为15％的胎牛血清、60ng/mL的干细胞因子(SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子(TPO)、10ng/mL的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、30ng/mL的白介素6(IL-6)、30ng/mL的IL-3/GM-CSF融合蛋白(G3)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯(CAPE)，由此而得造血干细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于步骤2中所述的将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6％的羟乙基淀粉溶液按1：6的体积比例完全混匀。
5.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于步骤2中所述的使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.0％。
6.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于(1-2)中将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆,于56℃水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于-80℃条件下长期保存备用。
7.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的(4-5)中的计数方法为MNC计数方法。
8.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的(4-5)中的检测方法为用流式细胞仪检测CD34+阳性率。
9.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的步骤2中的羟乙基淀粉溶液质量百分比为6％。
10.根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的(3-1)中的胎牛血清的质量百分比为5％。
CN201510657508.3A 2015-10-12 2015-10-12 外周血中分离富集造血干细胞的方法 Pending CN105420192A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510657508.3A CN105420192A (zh) 2015-10-12 2015-10-12 外周血中分离富集造血干细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510657508.3A CN105420192A (zh) 2015-10-12 2015-10-12 外周血中分离富集造血干细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105420192A true CN105420192A (zh) 2016-03-23

Family

ID=55498735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510657508.3A Pending CN105420192A (zh) 2015-10-12 2015-10-12 外周血中分离富集造血干细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105420192A (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106727244A (zh) * 2017-01-10 2017-05-31 成都中科同体生物医学研究院 同体生物微球及用于注射该微球的注射器
CN108441474A (zh) * 2018-03-23 2018-08-24 天晴干细胞股份有限公司 一种来源于脐带血、胎盘造血干细胞分离纯化的方法
CN109718396A (zh) * 2019-03-07 2019-05-07 秦文锋 一种用于整形装填的自提填充物及其制备方法
CN110055219A (zh) * 2019-01-16 2019-07-26 浙江大学 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法
CN110144323A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 江苏省北科生物科技有限公司 一种外周血免疫细胞的静置分离方法
CN110172446A (zh) * 2019-04-18 2019-08-27 青岩生物科技(湖州)有限公司 一种分离中胚层基质细胞的方法
CN111778212A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 因诺伟(北京)生物医疗科技有限公司 动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用
CN112852734A (zh) * 2021-02-24 2021-05-28 河南省银丰生物工程技术有限公司 一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法
CN113234673A (zh) * 2021-05-14 2021-08-10 上海赛笠生物科技有限公司 一种优化的食蟹猴单个核细胞分离方法
CN113913381A (zh) * 2021-10-27 2022-01-11 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用
CN115478052A (zh) * 2022-11-01 2022-12-16 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) 一种人单核前体细胞体外分离培养的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080248515A1 (en) * 2004-08-03 2008-10-09 Sino Cell Technologies Inc. Optimizing culture medium for CD34<+> hematopoietic cell expansion
CN101560495A (zh) * 2008-04-14 2009-10-21 深圳市北科生物科技有限公司 一种分离单个核细胞的方法和装置
CN101864396A (zh) * 2010-05-17 2010-10-20 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN103484428A (zh) * 2013-09-06 2014-01-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 Cape在体外培养造血干/祖细胞中的用途
CN104845934A (zh) * 2015-06-08 2015-08-19 河北利同康生物科技有限公司 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080248515A1 (en) * 2004-08-03 2008-10-09 Sino Cell Technologies Inc. Optimizing culture medium for CD34<+> hematopoietic cell expansion
CN101560495A (zh) * 2008-04-14 2009-10-21 深圳市北科生物科技有限公司 一种分离单个核细胞的方法和装置
CN101864396A (zh) * 2010-05-17 2010-10-20 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN103484428A (zh) * 2013-09-06 2014-01-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 Cape在体外培养造血干/祖细胞中的用途
CN104845934A (zh) * 2015-06-08 2015-08-19 河北利同康生物科技有限公司 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO-LING YAO, ET AL.: "A systematic strategy to optimize ex vivo expansion medium for human hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood mononuclear cells", 《EXPERIMENTAL HEMATOLOGY》 *
LIU YIMING, ET AL.: "CAPE promotes the expansion of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem and progenitor cells in vitro", 《SCI CHINA LIFE SCI》 *
叶韵斌 等: "造血细胞生长因子对脐血CD34+细胞短期体外扩增的作用", 《福建医科大学学报》 *
张威 等: "免疫磁珠分离脐血CD 133阳性细胞的方法研究", 《中国微循环》 *
郭继强 等: "两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件", 《中国组织工程研究与临床康复》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106727244A (zh) * 2017-01-10 2017-05-31 成都中科同体生物医学研究院 同体生物微球及用于注射该微球的注射器
CN108441474B (zh) * 2018-03-23 2021-10-08 天晴干细胞股份有限公司 一种来源于脐带血、胎盘造血干细胞分离纯化的方法
CN108441474A (zh) * 2018-03-23 2018-08-24 天晴干细胞股份有限公司 一种来源于脐带血、胎盘造血干细胞分离纯化的方法
CN110055219A (zh) * 2019-01-16 2019-07-26 浙江大学 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法
CN110055219B (zh) * 2019-01-16 2021-05-18 浙江大学 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法
CN109718396A (zh) * 2019-03-07 2019-05-07 秦文锋 一种用于整形装填的自提填充物及其制备方法
CN110172446A (zh) * 2019-04-18 2019-08-27 青岩生物科技(湖州)有限公司 一种分离中胚层基质细胞的方法
CN110144323A (zh) * 2019-05-29 2019-08-20 江苏省北科生物科技有限公司 一种外周血免疫细胞的静置分离方法
CN111778212A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 因诺伟(北京)生物医疗科技有限公司 动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用
CN111778212B (zh) * 2020-07-08 2022-09-27 因诺伟(北京)生物医疗科技有限公司 动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用
CN112852734A (zh) * 2021-02-24 2021-05-28 河南省银丰生物工程技术有限公司 一种人外周血造血干细胞的分离及鉴定方法
CN113234673A (zh) * 2021-05-14 2021-08-10 上海赛笠生物科技有限公司 一种优化的食蟹猴单个核细胞分离方法
CN113913381A (zh) * 2021-10-27 2022-01-11 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用
CN115478052A (zh) * 2022-11-01 2022-12-16 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) 一种人单核前体细胞体外分离培养的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420192A (zh) 外周血中分离富集造血干细胞的方法
Raynaud et al. Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation
Zhao et al. Systematic comparison of hUC-MSCs at various passages reveals the variations of signatures and therapeutic effect on acute graft-versus-host disease
Yang et al. Identification of Lin–Sca1+ kit+ CD34+ Flt3–short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients
CN103937743B (zh) 一种利用三维诱导系统获得造血干细胞的方法
US20080118477A1 (en) Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis
CN102367435B (zh) 人富血小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用
JP7473984B2 (ja) 幹細胞移植のための方法および組成物
Arcangeli et al. Function of Jam-B/Jam-C interaction in homing and mobilization of human and mouse hematopoietic stem and progenitor cells
CN103330720A (zh) 一种混合干细胞注射剂及其制备方法
UA122562C2 (uk) Іn vitro спосіб виділення мезенхімальних стромальних клітин (msc)
Česen Mazič et al. Treatment of severe steroid-refractory acute-graft-vs.-host disease with mesenchymal stem cells–single center experience
JP2016509863A (ja) 細胞、臍帯血収集のための方法及び装置、並びに細胞の単離のための方法及び装置
Han et al. Cotransplantation of cord blood hematopoietic stem cells and culture-expanded and GM-CSF-/SCF-transfected mesenchymal stem cells in SCID mice
Yoshioka et al. Isolation of mesenchymal stromal/stem cells from small-volume umbilical cord blood units that do not qualify for the banking system
KR20050042046A (ko) 조혈 줄기세포의 증식방법
WO2020147272A1 (zh) 一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法
Sun et al. Human umbilical cord blood-derived stromal cells are superior to human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in inducing myeloid lineage differentiation in vitro
Shen et al. AMD3100 and G-CSF disrupt the cross-talk between leukemia cells and the endosteal niche and enhance their sensitivity to chemotherapeutic drugs in biomimetic polystyrene scaffolds
CN103509101A (zh) 一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
WO1998021313A1 (fr) Procede pour la mise en culture de cellules souches hematopoïetiques
Romanov et al. Human umbilical cord mesenchymal stromal cells support viability of umbilical cord blood hematopoietic stem cells but not the “stemness” of their progeny in co-culture
US20090298045A1 (en) Method For Selectively Expanding, Selecting And Enriching Stem/Progenitor Cell Populations
CN109182268B (zh) 脐动脉内皮细胞在构建造血干细胞微环境中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160323