CN110144323A - 一种外周血免疫细胞的静置分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种人外周血免疫细胞的分离方法，本方法采用无菌容器静置的方式使外周血中免疫细胞实现分离，无菌容器静置法采用无菌容器静置的方式减少了离心作用对细胞的损伤，保证细胞的活率；同时静置分离法中添加羟乙基淀粉还能显著提高免疫细胞的回收率。

Description

一种外周血免疫细胞的静置分离方法

技术领域

本发明涉及一种外周血免疫细胞的静置分离方法，属于生物技术领域。

背景技术

人体免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，因此免疫细胞分离冻存具有非常大的意义。

目前外周血免疫细胞的分离主要采用Ficoll分离法，Ficoll分离法在分离过程中需要进行多次的离心操作，高速的离心对细胞容易造成一定的损伤，减少离心次数可以确保细胞的活率。Ficoll分离法使用淋巴细胞分离液进行分离，在吸取白膜层的过程中，损失细胞较多，回收率比较低，对于免疫细胞的冻存数量具有一定的影响，而在外周血免疫细胞分离过程中，羟乙基淀粉的加入可以促使红细胞加速沉降，从而提高免疫细胞的回收率。

发明内容

本发明针对上述问题，从而提出了一种外周血免疫细胞的静置分离方法。

具体的技术方案如下：

一种外周血免疫细胞的静置分离方法，包括以下步骤：

1)将外周血样本转移至无菌细胞培养瓶中，混匀后，取0.5ml全血进行细胞计数；

2)将羟乙基淀粉加入到细胞培养瓶中，使羟乙基淀粉和外周血样本充分混匀；

3)混匀后将细胞培养瓶的盖子盖上，放在无菌操作台中进行静置，标记开始静置时间；

4)当分离上清液与沉淀的刻度达到1：1时，用移液管将富含PBMCs的血浆的分离上清液转移至新的离心管中，标记静置时间及上清体积；

5)混匀离心管中的分离上清液，取0.5ml计细胞数量及活率，将其余分离上清液经室温离心400g，10min；

6)离心后，将离心上清液转移至50ml离心管中留存，取16ml分别进行需氧菌和厌氧菌检测；离心管中剩余的免疫细胞根据计数结果加入冻存液，调整密度至0.5×10⁷/ml～4×10⁷/ml，混匀后进行冻存。

进一步的，在步骤2)中，羟乙基淀粉的加入量为：外周血体积：羟乙基淀粉体积＝5:1，外周血体积＝(采血袋总重量-采血袋空袋重量)/1.05。

进一步的，在步骤4)中，吸取分离上清液时，将培养瓶倾斜，用移液管沿着液面吸取；当上清液高度低于0.5-1cm时，可继续倾斜培养瓶，待稳定后，从上清液高度最高处以最缓慢的速度吸取。

进一步的，在步骤6)中，冻存所需的冻存液由CIK培养基、DMSO和人血白蛋白三种试剂依次按照18：1：1的体积比混合配制而成。

本发明的有益效果为：

1)静置的方式减少了离心机的离心次数，易于操作，又避免离心对细胞造成的损伤，保证了细胞的活率；

2)在分离过程中加入了一定比例的羟乙基淀粉，加速了红细胞的沉降，提高了免疫细胞的回收率；

3)采用无菌容器的分离方式确保整个分离过程完全密闭，减少外源性污染，安全性高。

附图说明

图1是本发明需氧菌及真菌检测结果图；

图2是本发明厌氧菌及真菌检测结果图；

图3是本发明细胞活率检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案更加清晰明确，下面对本发明进行进一步描述，任何对本发明技术方案的技术特征进行等价替换和常规推理得出的方案均落入本发明保护范围。

实施例一

一种外周血免疫细胞的静置分离方法，包括以下步骤：

1)将无菌的T75细胞培养瓶放入无菌操作台中，打开T75细胞培养瓶的盖子，并做好标记；

2)将外周血采集袋血辫中的液体排空，用酒精棉球消毒采集袋的血辫，待酒精挥发后，用无菌剪刀剪开采血袋的血辫，将外周血样本转移至T75细胞培养瓶中，用10ml移液管将样本混匀，取0.5ml全血进行细胞计数；

3)按采血量的1/5体积计算好羟乙基淀粉的体积，然后将准备好的羟乙基淀粉加入到T75细胞培养瓶中，用10ml移液管置于培养瓶的两侧分别上下吹打各5次，使羟乙基淀粉和外周血样本充分混匀；

4)混匀后将T75细胞培养瓶盖子盖上，放在无菌操作台中进行静置，标记开始静置时间；

5)当静置25-35min或分离上清液与沉淀的刻度达到1：1时，用10ml移液管将富含PBMCs的血浆的分离上清液转移至新的离心管中，标记静置时间及分离上清液体积；

6)在吸取上清时，将培养瓶倾斜，用移液管沿着液面吸取；当分离上清液的高度低于0.5-1cm时，可继续倾斜培养瓶，待稳定后，从上清液高度最高处吸取；

7)吸液过程中，注意观察上清中红细胞的量及分层界面的状态，当界面晃动或者吸取红细胞过多，可移动移液管于另一较高液位，继续吸取；当吸取的液体中红细胞过量且无法吸取更多上清时，即可停止吸取；

8)用10ml移液管混匀上清液，取0.5ml计细胞数量及活率；将其余分离上清液室温离心400g，10min。

9)离心后，将离心上清液转移至50ml离心管中留存，取16ml分别进行需氧菌和厌氧菌检测；离心管中剩余的免疫细胞根据计数结果加入冻存液，调整密度至0.5×10⁷/ml～4×10⁷/ml，混匀后进行冻存；冻存液由CIK培养基、DMSO和人血白蛋白三种试剂依次按照18：1：1的体积比混合配制而成。

实施例二

取5份人外周血免疫细胞通过实施例一的方法分别进行分离，结果如下：

在上述数据中，需氧菌及真菌检测结果见图1，厌氧菌及真菌检测结果见图2，细胞活率检测结果见图3。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，包括以下步骤：

1)将外周血样本转移至无菌细胞培养瓶中，混匀后，取0.5ml全血进行细胞计数；

2)将羟乙基淀粉加入到细胞培养瓶中，使羟乙基淀粉和外周血样本充分混匀；

3)混匀后将细胞培养瓶的盖子盖上，放在无菌操作台中进行静置，标记开始静置时间；

4)当分离上清液与沉淀的刻度达到1：1时，用移液管将富含PBMCs的血浆的分离上清液转移至新的离心管中，标记静置时间及上清体积；

5)混匀离心管中的分离上清液，取0.5ml计细胞数量及活率，将其余分离上清液经室温离心400g，10min；

6)离心后，将离心上清液转移至50ml离心管中留存，取16ml分别进行需氧菌和厌氧菌检测；离心管中剩余的免疫细胞根据计数结果加入冻存液，调整密度至0.5×10⁷/ml～4×10⁷/ml，混匀后进行冻存。

2.如权利要求1所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤2)中，羟乙基淀粉的加入量为：外周血体积：羟乙基淀粉体积＝5:1，外周血体积＝(采血袋总重量-采血袋空袋重量)/1.05。

3.如权利要求1或2所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤4)中，吸取分离上清液时，将培养瓶倾斜，用移液管沿着液面吸取；当上清液高度低于0.5-1cm时，可继续倾斜培养瓶，待稳定后，从上清液高度最高处以最缓慢的速度吸取。

4.如权利要求3所述的一种外周血免疫细胞的静置分离方法，其特征为，在步骤6)中，冻存所需的冻存液由CIK培养基、DMSO和人血白蛋白三种试剂依次按照18：1：1的体积比混合配制而成。