CN112481098A - 外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法 - Google Patents

外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法，包括第一分离袋、第二分离袋、上清袋和冻存袋，所述第一分离袋连接有第一导管，所述第一导管连接有穿刺器，所述第一分离袋与所述第二分离袋通过第二导管连接，所述第二分离袋与所述上清袋通过第三导管连接，所述第二分离袋与所述冻存袋通过第四导管连接。本发明的有益效果在于：提供了一种包含分离袋、上清袋及冻存袋组成的四联袋，能够实现外周血免疫细胞的分离及储存为一体，整个分离过程全部密闭，污染风险小，符合目前细胞产品制备无菌的要求，结合HES沉淀法的优点，整个过程分离时间短，免疫细胞回收率高，提高了分离后的细胞活率及质量。

Description

外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，尤其是指一种外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法。
背景技术
静脉外周血中含有丰富的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞及其他细胞，在机体内发挥着免疫防御、免疫稳定及免疫监视的功能，而经过体外分离提取后可用于多种免疫细胞治疗技术，如CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)、TCR-T(T细胞受体T细胞)、NK(自然杀伤细胞)、CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK(树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞)等，从而应用于肿瘤免疫治疗。
经研究发现，不同年龄段提取的外周血中的免疫细胞存在较大差异，由于胸腺的衰老，T细胞随着年龄的增长导致细胞数量及多样性逐渐减少。将外周血中的免疫细胞分离后储存于低温环境，有利于保存细胞状态不会随着年龄增加而改变。
外周血中免疫细胞的提取分离方法主要有Ficoll(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法及HES(羟乙基淀粉)沉降法。HES沉降法主要原理是：HES与血液充分混匀后，HES能引起红细胞聚集而加速红细胞的沉淀，其他的免疫细胞位于上层细胞悬液中，其分离得到的免疫细胞回收率较高，但含有较多粒细胞。Ficoll密度梯度离心法主要原理是：血液在Ficoll分离液介质中经离心后，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，Ficoll密度梯度离心法分离的到的免疫细胞纯度较高，是目前的主要分离方法。然而，该方法分离过程暴露于环境，属于开放式操作，需要环境严格无菌，同时，该方法的分离后的免疫细胞的回收率不稳定，对操作人员要求高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便，能够确保外周血分离得到的免疫细胞质量稳定的外周血免疫细胞分离储存四联袋及分离方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种外周血免疫细胞分离储存四联袋，包括第一分离袋、第二分离袋、上清袋和冻存袋，所述第一分离袋连接有第一导管，所述第一导管连接有穿刺器，所述穿刺器设置于所述第一导管远离第一分离袋的一端，所述第一导管设有第一夹子、第一三通和第一滤网，所述第一三通连接有第一鲁尔口；
所述第一分离袋与所述第二分离袋通过第二导管连接，所述第二分离袋设有第二分离袋取样口，所述第二导管设有滑轮调速夹；
所述第二分离袋与所述上清袋通过第三导管连接，所述上清袋设有上清袋取样口，所述第三导管设有第二夹子；
所述第二分离袋与所述冻存袋通过第四导管连接，所述第四导管设有第三夹子和第二三通，所述第二三通通过第五导管与第二鲁尔口连接，所述第五导管设有第四夹子和第二滤网。
进一步的，所述第一分离袋靠近第一导管一侧宽度到所述第一分离袋靠近第二导管一侧的宽度逐渐减小。
进一步的，所述第二滤网的网孔大小为0.22μm。
进一步的，所述冻存袋包括至少两个储存室，每个储存室均设有储存室取样口。
进一步的，每个储存室之间通过连通管连接。
进一步的，所述第一导管、第二导管、第三导管、第四导管和连通管均设有热合部。
本发明还涉及一种外周血免疫细胞分离方法，包括：
S1、采集一份外周血，注入第一分离袋中；
S2、通过第一鲁尔口向外周血中注入HES，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
S3、将装有HES与外周血的混合液的第一分离袋倒置并静置，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
S4、将细胞上清液挤压至第二分离袋，热合第二导管并去除第一分离袋，使细胞上清液与红细胞沉淀液分离；
S5、将装有细胞上清液的第二分离袋进行离心处理，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液；
S6、将离心上清液挤压至上清袋，热合第三导管并去除上清袋，使离心上清液和离心沉淀液分离；
S7、向离心沉淀液中注入细胞冷冻保护剂，边注入边混匀，得到细胞悬液；
S8、将细胞悬液转移至冻存袋，热合第四导管，去除第二分离袋；
S9、对冻存袋进行程序降温；
S10、将降温完成的冻存袋放入液氮罐中保存。
进一步的，在步骤S2之中，外周血与HES的体积比为a，其中，3：1≤a≤5：1。
进一步的，在步骤S3之中，静置时间为20-30分钟。
进一步的，在步骤S5之中，采用300g的离心参数对细胞上清液进行离心处理，离心处理时间为10分钟。
本发明的有益效果在于：提供了一种包含分离袋、上清袋及冻存袋组成的四联袋，能够实现外周血免疫细胞的分离及储存为一体，整个分离过程全部密闭，污染风险小，符合目前细胞产品制备无菌的要求，结合HES沉淀法的优点，整个过程分离时间短，免疫细胞回收率高，提高了分离后的细胞活率及质量。
附图说明
下面结合附图详述本发明的具体结构及流程：
图1为本发明的整体结构示意图；
图2为本发明的整体流程示意图；
1-第一分离袋；2-第二分离袋；3-上清袋；4-冻存袋；5-第一导管；6-穿刺器；7-第一夹子；8-第一滤网；9-第一三通；10-第一鲁尔口；11-第二导管；12-滑轮调速夹；13-第二分离袋取样口；14-第三导管；15-第二夹子；16-上清袋取样口；17-第四导管；18-第三夹子；19-第二三通；20-第二滤网；21-第四夹子；22-第五导管；23-第二鲁尔口。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例1
请参阅图1，一种外周血免疫细胞分离储存四联袋，包括第一分离袋1、第二分离袋2、上清袋3和冻存袋4，所述第一分离袋1连接有第一导管5，所述第一导管5连接有穿刺器6，所述穿刺器6设置于所述第一导管5远离第一分离袋1的一端，所述第一导管5设有第一夹子7、第一三通9和第一滤网8，其中，第一夹子7套接于第一导管5，第一滤网8串接于第一导管5，所述第一三通9包括主路通道和支路输入口，所述主路通道用于连通第一导管5，所述支路输入口连接有第一鲁尔口10；
所述第一分离袋1与所述第二分离袋2通过第二导管11连接，所述第二分离袋2设有第二分离袋取样口13，所述第二导管11设有滑轮调速夹12，滑轮调速夹12套接于第二导管11，可通过调整滑轮的位置对第二导管进行夹紧或放松，从而实现限制通过第二导管的流体的流速及关断；
所述第二分离袋2与所述上清袋3通过第三导管14连接，所述上清袋3设有上清袋取样口16，所述第三导管14设有第二夹子15，第二夹子15套接于第三导管14；
所述第二分离袋2与所述冻存袋4通过第四导管17连接，所述第四导管17设有第三夹子18和第二三通19，所述第二三通19包括第二三通主路通道和第二三通支路输入口，第二三通主路通道用于连通第四导管，第二三通支路输入口通过第五导管22与第二鲁尔口23连接，所述第五导管22设有第四夹子21和第二滤网20，其中第四夹子21套接于第五导管，第二滤网20串接于第五导管22。
为了能够更方便地分离红细胞和白细胞，第一分离袋1采用上宽下窄的结构，需要说明的是“上”是指第一分离袋靠近第一导管的一侧，“下”是指第一分离袋靠近第二导管的一侧，具体的，所述第一分离袋靠近第一导管一侧宽度到所述第一分离袋靠近第二导管一侧的宽度逐渐减小。
所述第二滤网20的网孔大小为0.22μm，可以有效阻挡微生物进入第二分离袋2。
所述冻存袋4包括至少两个储存室，每个储存室均设有储存室取样口，可以将免疫细胞分为多份，增加细胞的应用次数。
每个储存室之间通过连通管连接，可以通过热合连通管实现将各储存室之间分开保存。
所述第一导管、第二导管、第三导管、第四导管和连通管均设有热合部。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：提供了一种包含分离袋、上清袋及冻存袋组成的四联袋，能够实现外周血免疫细胞的分离及储存为一体，整个分离过程全部密闭，污染风险小，符合目前细胞产品制备无菌的要求，结合HES沉淀法的优点，整个过程分离时间短，免疫细胞回收率高，提高了分离后的细胞活率及质量。
实施例2
本发明还涉及一种外周血免疫细胞分离方法，包括：
S1、采集一份外周血，注入第一分离袋中；
S2、根据外周血的体积计算HES的加入量，优选的，外周血与HES的体积比为a，其中，3：1≤a≤5：1，通过第一鲁尔口向第一分离袋的外周血中注入适量HES，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
S3、将装有HES与外周血的混合液的第一分离袋倒置并静置一段时间，静置时间优选为20-30分钟，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
S4、将细胞上清液挤压至第二分离袋，热合第二导管并去除第一分离袋，使细胞上清液与红细胞沉淀液分离；
S5、将装有细胞上清液的第二分离袋进行离心处理，其中离心参数为采用300g的离心参数对细胞上清液进行离心处理，离心处理时间为10分钟，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液；
S6、将离心上清液挤压至上清袋，热合第三导管并去除上清袋，使离心上清液和离心沉淀液分离；
S7、向离心沉淀液中注入细胞冷冻保护剂，边注入边混匀，得到细胞悬液；
S8、将细胞悬液转移至冻存袋，热合第四导管，去除第二分离袋；
S9、对冻存袋进行程序降温；
S10、将降温完成的冻存袋放入液氮罐中保存。
实验例1
使用采血袋采集一份外周血，经称重计算出抗凝血体积为83.43mL，血细胞计数：WBC浓度为6.8×109/L，RBC浓度为3.52×1012/L，LYM浓度为2.3×109/L；
取一个外周血免疫细胞分离储存四联袋，关闭第二夹子、第三夹子、第四夹子，打开第一夹子，使用穿刺器插入采血袋蝴蝶辫中，将采血袋垂直置于四联袋的上方，使外周血转移至第一分离袋中，转移完毕后关闭第一夹子；
使用注射器抽取HES 17mL，从第一鲁尔口通过第一三通注入至第一分离袋，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
注入完毕后，将第一分离袋倒置悬挂于挂钩上，静置分离25分钟，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
从挂钩上取下四联袋，将第一分离袋置于分浆夹中，缓慢打开滑轮调速夹，将细胞上清液挤压至第二分离袋中。细胞上清液与红细胞沉淀液分离后，关闭滑轮调速夹，从第二导管中间处热合，去除第一分离袋及其上端部分；
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起称重，计算出一次分离后细胞上清液体积为48mL，计算公式为：一次分离后细胞上清液体积(mL)＝(含细胞上清液的第二分离袋、上清袋及冻存袋部分重量(g)-第二分离袋、上清袋及冻存袋部分空袋重量(g))/1.05；
使用注射器从第二分离袋取样口取0.5mL，使用计数仪及细胞活率分析仪检测细胞数量及活率，检测结果：WBC浓度为8.8×109/L，RBC浓度为0.06×1012/L，LYM浓度为2.9×109/L，细胞活率为99.90％。
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起置于离心机中进行离心处理，离心条件为300g，10min，离心结束后，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液。
取出第二分离袋、上清袋及冻存袋，将第二分离袋置于分浆夹中，打开第二夹子，将二次分离后的离心上清液全部挤压至上清袋，关闭第二夹子，从第三导管中间处热合去除上清袋；
打开第三夹子及第四夹子，从第二鲁尔口注入30mL细胞冷冻保护剂至第二分离袋，边注入边混匀冷冻保护剂与离心沉淀液，注入完毕后关闭第四夹子；
排除冻存袋中空气，将第二分离袋中含有冷冻保护剂的离心沉淀液全部转移至冻存袋，保持冻存袋各室的混合液体的体积一致。转移完毕后，关闭第三夹子，从第四导管中间处热合去除第二分离袋，可将第二分离袋作为无菌留样，并继续热合冻存袋的两段导管作为复检样本及留样样本。
将冻存袋及样本经过程序降温后，放置于-196℃液氮罐中保存。
实验例2
使用采血袋采集一份外周血，经称重计算出抗凝血体积为95.52mL，血细胞计数：WBC浓度为8.4×109/L，RBC浓度为3.68×1012/L，LYM浓度为2.3×109/L；
取一个外周血免疫细胞分离储存四联袋，关闭第二夹子、第三夹子、第四夹子，打开第一夹子，使用穿刺器插入采血袋蝴蝶辫中，将采血袋垂直置于四联袋的上方，使外周血转移至第一分离袋中，转移完毕后关闭第一夹子；
使用注射器抽取HES 20mL，从第一鲁尔口通过第一三通注入至第一分离袋，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
注入完毕后，将第一分离袋倒置悬挂于挂钩上，静置分离30分钟，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
从挂钩上取下四联袋，将第一分离袋置于分浆夹中，缓慢打开滑轮调速夹，将细胞上清液挤压至第二分离袋中。细胞上清液与红细胞沉淀液分离后，关闭滑轮调速夹，从第二导管中间处热合，去除第一分离袋及其上端部分；
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起称重，计算出一次分离后细胞上清液体积为60mL，计算公式为：一次分离后细胞上清液体积(mL)＝(含细胞上清液的第二分离袋、上清袋及冻存袋部分重量(g)-第二分离袋、上清袋及冻存袋部分空袋重量(g))/1.05；
使用注射器从第二分离袋取样口取0.5mL，使用计数仪及细胞活率分析仪检测细胞数量及活率，检测结果：WBC浓度为9.7×109/L，RBC浓度为0.05×1012/L，LYM浓度为2.6×109/L，细胞活率：99.90％。
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起置于离心机中进行离心处理，离心条件为300g，10min，离心结束后，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液。
取出第二分离袋、上清袋及冻存袋，将第二分离袋置于分浆夹中，打开第二夹子，将二次分离后离心上清液全部挤压至上清袋，关闭第二夹子，从第三导管中间处热合去除上清袋；
打开第三夹子及第四夹子，从第二鲁尔口注入30mL细胞冷冻保护剂至第二分离袋，边注入边混匀冷冻保护剂与离心沉淀液，注入完毕后关闭第四夹子；
排除冻存袋中空气，将第二分离袋中含有冷冻保护剂的离心沉淀液全部转移至冻存袋，保持冻存袋各室的混合液体的体积一致。转移完毕后，关闭第三夹子，从第四导管中间处热合去除第二分离袋，可将第二分离袋作为无菌留样，并继续热合冻存袋的两段导管作为复检样本及留样样本；
将冻存袋及样本经过程序降温后，放置于-196℃液氮罐中保存。
实验例3
使用采血袋采集一份外周血，经称重计算出抗凝血体积为81.33mL，血细胞计数：WBC浓度为8.0×109/L，RBC浓度为3.63×1012/L，LYM浓度为2.2×109/L；
取一个外周血免疫细胞分离储存四联袋，关闭第二夹子、第三夹子、第四夹子，打开第一夹子，使用穿刺器插入采血袋蝴蝶辫中，将采血袋垂直置于四联袋的上方，使外周血转移至第一分离袋中，转移完毕后关闭第一夹子；
使用注射器抽取HES 17mL，从第一鲁尔口通过第一三通注入至第一分离袋，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
注入完毕后，将第一分离袋倒置悬挂于挂钩上，静置分离20分钟，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
从挂钩上取下四联袋，将第一分离袋置于分浆夹中，缓慢打开滑轮调速夹，将细胞上清液挤压至第二分离袋中。细胞上清液与红细胞沉淀液分离后，关闭滑轮调速夹，从第二导管中间处热合，去除第一分离袋及其上端部分；
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起称重，计算出一次分离后细胞上清液体积为50mL，计算公式为：一次分离后细胞上清液体积(mL)＝(含细胞上清液的第二分离袋、上清袋及冻存袋部分重量(g)-第二分离袋、上清袋及冻存袋部分空袋重量(g))/1.05；
使用注射器从第二分离袋取样口取0.5mL，使用计数仪及细胞活率分析仪检测细胞数量及活率，检测结果：WBC浓度为10.1×109/L，RBC浓度为0.05×1012/L，LYM浓度为2.5×109/L，细胞活率：99.80％。
将第二分离袋、上清袋及冻存袋一起置于离心机中进行离心处理，离心条件为300g，10min，离心结束后，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液。
取出第二分离袋、上清袋及冻存袋，将第二分离袋置于分浆夹中，打开第二夹子，将二次分离后的离心上清液全部挤压至上清袋，关闭第二夹子，从第三导管中间处热合去除上清袋；
打开第三夹子及第四夹子，从第二鲁尔口注入30mL细胞冷冻保护剂至第二分离袋，边注入边混匀冷冻保护剂与离心沉淀液，注入完毕后关闭第四夹子；
排除冻存袋中空气，将第二分离袋中含有冷冻保护剂的离心沉淀液全部转移至冻存袋，保持冻存袋各室的混合液体的体积一致。转移完毕后，关闭第三夹子，从第四导管中间处热合去除第二分离袋，可将第二分离袋作为无菌留样，并继续热合冻存袋的两段导管作为复检样本及留样样本。
将冻存袋及样本经过程序降温后，放置于-196℃液氮罐中保存。
WBC回收率 LYM回收率 RBC去除率 细胞活率
实验例1 74.45％ 72.54％ 99.02％ 99.90％
实验例2 72.54％ 71.01％ 99.15％ 99.90％
实验例3 77.62％ 69.86％ 99.20％ 99.80％
表1实验例1-3分离后WBC、LYM回收率、RBC去除率及细胞活率结果
回收率计算方法为：回收率＝分离后细胞数量/分离前细胞数量×100％；
去除率计算方法为：去除率＝1-(分离后细胞数量/分离前细胞数量)×100％。
从表1中可以看出，每个实施例分离后的免疫细胞与分离前全血相比较，WBC回收率及LYM回收率均在70％左右，RBC去除率大于99％，细胞活率大于99％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：包括第一分离袋、第二分离袋、上清袋和冻存袋，所述第一分离袋连接有第一导管，所述第一导管连接有穿刺器，所述穿刺器设置于所述第一导管远离第一分离袋的一端，所述第一导管设有第一夹子、第一三通和第一滤网，所述第一三通连接有第一鲁尔口；
所述第一分离袋与所述第二分离袋通过第二导管连接，所述第二分离袋设有第二分离袋取样口，所述第二导管设有滑轮调速夹；
所述第二分离袋与所述上清袋通过第三导管连接，所述上清袋设有上清袋取样口，所述第三导管设有第二夹子；
所述第二分离袋与所述冻存袋通过第四导管连接，所述第四导管设有第三夹子和第二三通，所述第二三通通过第五导管与第二鲁尔口连接，所述第五导管设有第四夹子和第二滤网。
2.如权利要求1所述的外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：所述第一分离袋靠近第一导管一侧宽度到所述第一分离袋靠近第二导管一侧的宽度逐渐减小。
3.如权利要求2所述的外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：所述第二滤网的网孔大小为0.22μm。
4.如权利要求3所述的外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：所述冻存袋包括至少两个储存室，每个储存室均设有储存室取样口。
5.如权利要求4所述的外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：每个储存室之间通过连通管连接。
6.如权利要求5所述的外周血免疫细胞分离储存四联袋，其特征在于：所述第一导管、第二导管、第三导管、第四导管和连通管均设有热合部。
7.一种外周血免疫细胞分离方法，包括：
S1、采集一份外周血，注入第一分离袋中；
S2、通过第一鲁尔口向外周血中注入HES，边注入边混匀，得到HES与外周血的混合液；
S3、将装有HES与外周血的混合液的第一分离袋倒置并静置，得到分层混合液，所述分层混合液包括细胞上清液与红细胞沉淀液；
S4、将细胞上清液挤压至第二分离袋，热合第二导管并去除第一分离袋，使细胞上清液与红细胞沉淀液分离；
S5、将装有细胞上清液的第二分离袋进行离心处理，得到离心分层混合液，所述离心分层混合液包括离心上清液和离心沉淀液；
S6、将离心上清液挤压至上清袋，热合第三导管并去除上清袋，使离心上清液和离心沉淀液分离；
S7、向离心沉淀液中注入细胞冷冻保护剂，边注入边混匀，得到细胞悬液；
S8、将细胞悬液转移至冻存袋，热合第四导管，去除第二分离袋；
S9、对冻存袋进行程序降温；
S10、将降温完成的冻存袋放入液氮罐中保存。
8.如权利要求7所述的外周血免疫细胞分离方法，其特征在于：在步骤S2之中，外周血与HES的体积比为a，其中，3：1≤a≤5：1。
9.如权利要求8所述的外周血免疫细胞分离方法，其特征在于：在步骤S3之中，静置时间为20-30分钟。
10.如权利要求9所述的外周血免疫细胞分离方法，其特征在于：在步骤S5之中，采用300g的离心参数对细胞上清液进行离心处理，离心处理时间为10分钟。
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