CN103667192A - 一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于白血病细胞株技术领域。本发明提供了一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了上述白血病细胞株NT-1的制备方法以及应用。本发明对人不典型慢性粒细胞性白血病的诊断和治疗提供了新的思路，对建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病模型，对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。

Description

一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株及其制备方法

技术领域

本发明属于白血病细胞株技术领域，具体涉及一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1及其制备方法。

背景技术

白血病细胞株在白血病的基础研究中具有重要的地位，采用细胞株在体外进行实验及动物模型的构建，不仅能从分子、基因水平深入研究肿瘤发生和发展机理，而且对临床的早期诊断、药物筛选和治疗具有重要意义。

目前国内外文献报道，并常用于白血病诊断及治疗研究的白血病细胞株包括：人早幼粒急性白血病细胞株HL-60、人慢性髓系白血病细胞株K562等。

人不典型慢性粒细胞性白血病（英文全称，简称aCML），为慢性白血病中的一种罕见类型，起病缓慢，早期多无明显症状，往往在体格检查或其他疾病就诊时偶然发现脾肿大或白细胞异常，早期诊断困难。目前临床也没有较佳的治疗方案，预后差，中位生存年龄仅14-25个月。骨髓细胞染色体核型异常可高达80%，最常见的是+8和del(20q)，20-40%的患者演变为急性白血病，其余患者常死于骨髓衰竭。到目前为止，对aCML的治疗经验很少，尚无满意的治疗方法。目前报道应用地西他滨治疗aCML，7例患者中有4例获得血液学改善，主要不良反应是重度骨髓抑制。

因此，筛选并获得稳定的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株，建立体外的aCML模型，将对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，本发明另一目的在于提供该人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法及其应用。

本发明的第一方面，是提供了一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明人从一名不典型慢性粒细胞性白血病（aCML）患者的骨髓中获得该白血病细胞株的原代细胞。

本发明应用体外细胞培养技术建立人髓系细胞株，采用细胞株作为实验对象，分析细胞的形态学、遗传学、免疫表型、裸鼠致瘤率等特点，为进一步研究aCML的发病机制及治疗提供有效且稳定的细胞模型。

本发明的第二方面，是提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法，该方法包括以下步骤：

1.原代培养：

抽取该患者骨髓1-5ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液加入10-30ml锥形离心管中，升至室温（18-25℃）；将离心管倾斜45°，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上1cm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心15-30分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10-20mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10-20min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入IMDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培养箱内。

2.传代：

将在IMDM完全培养基中的悬浮细胞，培养于培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代：在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，弃上清，加入IMDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入培养皿。

3.冻存和复苏

冻存：冻存前24小时更换新鲜的IMDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，加入含IMDM完全培养基，调整细胞浓度为1*10⁶～2*10⁶/ml，分装细胞悬液至EP管，每管为1ml细胞悬液，大约1*10⁶～2*10⁶个细胞数，再次离心，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，细胞沉淀加入1-3ml冻存液，吹打均匀，移入无菌冻存管，4℃30分钟，-20℃60分钟，-80℃过夜，次日移入液氮。

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10-20min,弃去上清液，细胞沉淀加IMDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿，置37℃，5%CO₂，95%湿度的CO₂培养箱中培养。

本发明涉及的培养液配方如下：

IMDM完全培养基（即含20%胎牛血清的IMDM完全培养基）：IMDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml，链霉素100ug/ml。

IMDM培养基：可购自Sigma公司12440(高糖，添加L-谷氨酰胺及丙酮酸钠)。

冻存液（使用前现配）：细胞冻存液含90%的胎牛血清和10%的DMSO。

本发明的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，能在体外长期生长和无限传代，细胞生长状态良好，呈单细胞悬浮生长，不依赖任何细胞生长因子和基质细胞而持续生长，能耐受冻存和复苏，该细胞株携带有47，xx,+8/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）,目前国内外文献均未有报道该类细胞株。

目前在中国典型培养物保藏中心保藏的是本发明培养的第55代、第60代NT-1细胞株。

本发明的NT-1细胞株通过细胞形态学、免疫分型检测，证实是一株髓系的白血病细胞株，该细胞株倍增时间为72小时，增殖速度中等，细胞周期检测显示S期细胞所占比例为20.28%，G1期细胞所占比例为77.79%，G2期细胞所占比例为1.93%，由此可见，NT-1细胞株生长旺盛。PCR检测NT-1细胞株有p53基因的突变，扩增片段测序结果显示4号外显子第215位碱基存在点突变，由CCC-CGC,相应的氨基酸由脯氨酸变成了精氨酸。

选取D8S1179、D21S11、D18S51、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D7S820、D18S51、vWA、TPOX、X/Y、D5S818、FGA等16个STR位点，有15个位点基因型与原代细胞的信号相一致，证明NT-1细胞株与患者基因型为同一来源，排除了细胞株之间污染的可能。

经裸鼠致瘤实验证实本发明的NT-1细胞株具有致瘤性，将同等数量的细胞接种6只Balb/c裸鼠（3雄3雌），一个月后4只形成了大小不等的肿瘤，剥离肿瘤，行病理切片、瑞氏染色、免疫分型等检查，证实了肿瘤与NT-1细胞株的一致性，是真正的白血病细胞株。

本发明的第三方面，是提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病动物模型中的应用。

提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

以及，提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。

本发明对aCML的诊断和治疗提供了新的思路，对建立体外的aCML模型，对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2013年8月1日

保藏编号：CCTCC NO：C2013103

分类命名：人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1

附图说明

图1为NT-1细胞株的瑞氏染色电镜图。

细胞大小不一(20-30微米),圆形或椭圆形；胞核圆形或椭圆形，部分核折叠、扭曲、凹陷，核染色质部分呈细粒状，部分呈疏松网状，可见不规则核仁，部分胞浆无颗粒，部分胞浆伴细沙状颗粒，胞浆呈灰蓝色，偶见空泡。

图2为NT-1细胞株的生长曲线，NT-1细胞增殖能力中等，用CCK-8试剂盒制成的标准曲线及生长曲线，其倍增时间为72小时。

其中A是NT-1细胞株的标准曲线，B是NT-1细胞株的生长曲线。

图3为NT-1细胞株的细胞周期。

图4为NT-1细胞株的染色体核型分析图，核型如下：47，xx,+8/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）。

图5为NT-1细胞株在裸鼠体内形成的肿瘤组织HE染色（A）及pox染色(B)。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。

实施例1：人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的获得

1.原代培养

抽取该患者骨髓2ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液（购自上海普飞公司）加入15ml锥形离心管中，升至室温（18-25℃）；将离心管倾斜45度角，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上1cm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min,离心20分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入IMDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培养箱内。

2.传代

该细胞为悬浮细胞，培养于10CM培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代：在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,弃上清，加入IMDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入10cm培养皿。

3.冻存和复苏

冻存：冻存前24小时更换新鲜的IMDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,弃上清，加入IMDM完全培养基，调整细胞浓度为2*10⁶/ml,分装细胞悬液至EP管，每管为1ml细胞悬液，大约2*10⁶个细胞数，再次离心，1500r/min,弃上清，细胞沉淀加入1.5ml冻存液悬浮，移入无菌冻存管，将冻存管口封严，贴上标签，注明细胞种类、冻存日期、冻存者。4℃30分钟，-20℃60分钟，-80℃过夜，次日移入液氮。

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10min,弃去上清液，细胞沉淀加5ml IMDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿,置37℃，5%CO₂，95%湿度的CO₂培养箱中培养。

目前中国典型培养物保藏中心保藏的是我们培养的第55代、第60代NT-1细胞株。

本发明涉及的培养液配方如下：

IMDM完全培养基：IMDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml,链霉素100ug/ml。

IMDM培养基：购自Sigma公司12440型号(高糖，添加L-谷氨酰胺及丙酮酸钠)。

冻存液（使用前现配）：细胞冻存液含90%的胎牛血清和10%的DMSO（购自南京凯基公司）。

实施例2：人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的生长及遗传特性鉴定

1.细胞形态学观察

取一定数量的细胞转移入1.5ml离心管（EP管），1500r/min,离心5分钟，弃2/3上清，剩余细胞悬液吹打均匀后涂片，行瑞氏染色，细胞大小不一(20-30微米)，圆形或椭圆形；胞核圆形或椭圆形，部分核折叠、扭曲、凹陷，核染色质部分呈细粒状，部分呈疏松网状，可见不规则核仁，部分胞浆无颗粒，部分胞浆伴细沙状颗粒，胞浆呈灰蓝色，偶见空泡（见图1）。

2.NT-1细胞株生长曲线

制作标准曲线：

（1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；

（2）按1/2比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，做5个细胞浓度梯度，每组设3个复孔；

（3）接种后培养4小时，然后加CCK8试剂继续培养一段时间，等颜色发生明显变化后，用酶标仪进行测定，得到O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线（图2A）。

细胞增殖检测：

（1）在96孔板中配制100微升的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5%CO₂的条件下)；

（2）向每孔加入10微升CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。

（3）将培养板在培养箱内分别孵育24、48、72、96、120、144小时。4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，得到一条时间与OD值之间的生长曲线，其倍增时间为72小时（图2B）。

3.NT-1细胞株的细胞周期

取对数生长期NT-1细胞1×10⁶，约1ml,离心，弃上清，加-20℃保存的冰乙醇混匀固定，4度过夜，离心，弃上清，PBS洗涤2次，RNase作用15分钟，加PI(碘化丙啶)、精胺作用15分钟，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，上机检测（流式细胞仪），分析结果显示：S期细胞所占比例为20.28%，G1期细胞所占比例为77.79%，G2期细胞所占比例为1.93%，由此可见，NT-1细胞生长旺盛（见图3）。

4.NT-1细胞株的免疫表型

细胞株体外培养8个月后取对数生长期细胞应用流式细胞仪（FCM）进行检测，直接免疫荧光法标记细胞，流式细胞计数仪5000个细胞，测定百分率。检测单克隆抗体T系抗原CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8；B系抗原CD10、CD19、D20、CD22；髓系抗原D13、CD14、CD15、CD33、MPO；巨核系抗原CD41、CD61；干细胞抗原CD34、HLA-DR、CD117以及CD16/56、CD25、CD203等，所有单抗均为BD公司产品。NT-1细胞主要表达髓系、自然杀伤系抗原，干细胞祖标记CD34表达呈阳性，而T和B淋系的标志抗原达表阴性（见表1）。

表1：免疫表型

5.NT-1细胞的遗传学分析

取对数生长期细胞进行染色体检查，染色体标本制备和R显带按照苏州附属第一人民医院血液实验室常规方法（薛永权，过宇，介绍一种改良的骨髓细胞染色体热变性姬姆萨R显带法，《中华医学检验杂志》，1986,9:247.）。染色体异常按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2005）》的有关规定加以识别和描述，NT-1细胞的核型为：47，xx,+8/47，xx，idem，t（5；12）（q31；p13）（见图4）。

实施例3：人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的动物实验

取4周龄Balb/c裸鼠6只（3雄3雌，购自南通大学动物实验中心），收集对数生长期NT-1细胞，调整细胞浓度为2×10⁸/ml,每只裸小鼠于右侧背部皮下注射100微升，观察注射部位肿瘤生长情况，饲养1个月后，注射部位有大小不等肿块形成,约在0.7×0.8～1.1×1.8cm²，用颈椎脱臼法将裸鼠处死，分离裸小鼠实体肿瘤组织，常规固定，石蜡包埋、切片，HE染色（见图5A）。无菌条件下分离裸小鼠实体肿瘤组织，用眼科剪刀剪碎，碾磨后100目和200目滤网过滤，将所得细胞悬液收集至无菌心管，加入适量IMDM培养基。1500r/min,离心5分钟，弃上清，再加入适量IMDM培养基，吹打、混匀后1500r/min离心5分钟，弃上清，调整细胞浓度，离心后涂片，行pox染色观察细胞形态（见图5B），细胞大小不一,圆形或椭圆形，胞核圆形或椭圆形，部分核折叠、扭曲、凹陷,POX染色阳性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法，该方法包括以下步骤：

A、原代培养：

抽取该患者骨髓1-5ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液加入10-30ml锥形离心管中，升至室温；将离心管倾斜，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上1cm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心15-30分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10-20mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10-20min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入IMDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培养箱内；

B、传代：

将在IMDM完全培养基中的悬浮细胞，培养于培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代；在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，弃上清，加入IMDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入培养皿；

C、冻存和复苏

冻存：冻存前24小时更换新鲜的IMDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，加入含IMDM完全培养基，调整细胞浓度为1×10⁶～2×10⁶/ml，分装细胞悬液至EP管，每管为1ml细胞悬液，大约1×10⁶～2×10⁶个细胞数，再次离心，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，细胞沉淀加入1-3ml冻存液，吹打均匀，移入无菌冻存管，4℃30分钟，-20℃60分钟，-80℃过夜，次日移入液氮；

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10-20min,弃去上清液，细胞沉淀加IMDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿，置37℃，5%CO₂，95%湿度的CO₂培养箱中培养；

所述的IMDM完全培养基的配方为：IMDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素100ug/ml。

3.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病动物模型中的应用。

4.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。

5.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。

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