CN103667174A - 一种用于处理生物样本的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于处理生物样本的组合物。该用于处理生物样本的组合物由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、pH值调节剂组成，其质量比为2.0-12.0：2.5-12.0：0-0.4：0-0.5。本发明提供的组合物在用于富集生物样本中的单个核细胞等时，在部分参数上超越了目前可商购获得的国内外同类产品，具有更高的安全性和有效性，为此类产品的临床转化创造了可能。

Description

一种用于处理生物样本的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于处理生物样本的组合物及液体介质，属于生物材料技术领域。
背景技术
利用离心法富集生物样本中的生物颗粒是生物学研究中应用最为广泛的一项技术。许多生物颗粒均可以通过离心法这一技术实现富集，例如，动物或植物的细胞、亚细胞结构、细菌、病毒或生物大分子等。这些在悬液中的生物样本在离心作用下的表现主要取决于生物样本的大小和密度，这可以通过斯托克斯方程（Stokes equation）得到解释。斯托克斯方程（见下式）描述了球形颗粒在液体介质中受到离心作用时运动速率的变化规律：
v = d 2 ( p 2 - p 1 ) × g 18 n
其中：d代表球形颗粒的直径，p2代表球形颗粒的密度，p1代表液体介质的密度，n代表液体介质的粘度，g代表离心力。
通过斯托克斯方程很容易得到如下结论：（1）沉降速率与颗粒大小成正比；（2）沉降速率和颗粒密度/液体介质的密度差成正比；（3）当颗粒和液体介质的密度相等时，颗粒的沉降速率为零；（4）沉降速率与液体介质的粘度成反比；（5）沉降速率与离心力成正比。
根据斯托克斯方程，离心法富集颗粒需要借助一种适宜材料的液体介质得以实现，在这种液体介质中，不同的生物颗粒由于其各自的颗粒大小、颗粒密度或其它理化及生物学特性不同而具有不同的表现，从而实现其各自的富集目的。依据生物颗粒在液体介质中的表现类型不同，可以将离心法富集生物颗粒分为差速离心和密度梯度离心，而密度梯度离心又可以进一步被分为速率-区带离心和等密度离心。
等密度离心法是一种在细胞生物学中广泛用于富集特定细胞的技术方案，其原理如上述由斯托克斯方程所得到的结论（3）中所阐释的那样：由于所选择的液体介质的密度等于或略大于欲富集的目的细胞，因此目的细胞在离心作用下，无论离心时间长短，都将无法穿透液体介质的界面沉到离心容器的底部，进而在液体介质的界面处（即平衡位置）得到富集。典型的等密度离心法是利用单次密度梯度离心法纯化血液或骨髓样本中的淋巴细胞，其中所采用的液体介质通常是含有聚蔗糖-碘化物组合配方的具有生理渗透压的水溶液。可商购获得的此类产品有很多种，例如通用电气医疗集团（GEHealthcare）的产品Ficoll-PaqueTMPLUS、西格玛集团（Sigma）的产品Histopaque1077TM等。这些常用的液体介质大多采用相同的主要原料作为配方，即聚蔗糖400（Ficoll 400）和泛影酸钠（Diatrizoate），这是20世纪70年代由Boyum等人逐渐建立并不断优化而得到的十分成功的配方体系。
选择这两种主要原料作为介质配方是有其深刻原因的，J Graham在他的著作Biological Centrifugation中详细总结了适合作为密度梯度介质的材料应具备的特性，包括（1）能够制备所需密度范围的足够的溶解度；（2）在所需密度范围内不形成高粘度的溶液；（3）当待分离的生物样本对渗透压敏感时，密度梯度介质既不高渗也不低渗；（4）可以调节pH值等参数与待分离的生物样本保持一致；（5）不影响样本的生物学活性；（6）无毒且不被细胞代谢；（7）不与离心管反应，且不影响检测过程；（8）容易从纯化的产品中去除；（9）价格低廉等。应当指出，没有一种产品可以同时满足上述全部特性，因此适用于不同生物样本的多种产品应运而生。例如，DNA的密度在1.50-1.80g/cm3之间，应选用高密度介质氯化铯或硫酸铯溶液等。聚蔗糖400和泛影酸钠的组合配方除了能提供足够的密度，又能够避免过高的粘度影响分离效率，因此成为了细胞纯化操作中构建密度梯度介质的一种良好选择。
具体而言，聚蔗糖400是一种化学合成的高分子聚合物，平均分子量约为400kD，可溶于水，其最大水溶液密度可高达1.23g/mL，大于血液或骨髓样本中密度最大的红细胞，适用性较广。此外，聚蔗糖400由于其多羟基大分子的特殊结构，可与红细胞表面吸附结合，破坏红细胞表面的电荷层，从而降低红细胞之间的静电斥力，并通过“桥联”模式促使红细胞出现缗钱状沉淀。聚蔗糖400这种促进红细胞聚集沉降的作用对于淋巴细胞的纯化是至关重要的。根据斯托克斯方程可知，红细胞发生聚集而得的聚集体由于其具有更大体积而显著加速了其沉降速度，这不仅大大提高了纯化效率，更重要的是对于数量占绝对多数的红细胞的去除而言，这种聚集沉降的作用保证了较高的淋巴细胞纯度，有效减少了红细胞的污染。然而，这种促进红细胞聚集沉降的作用也有其负面影响，盛佳等报道了高分子对于红细胞的这种聚集沉降作用随分子量变大而增强（盛佳等，红细胞聚集的生物力学基础，《力学进展》，1999年，第29卷，第1期），可知聚蔗糖400对于红细胞的这种聚集沉降作用较强，而过快的沉降会致使淋巴细胞等目的细胞陷入红细胞聚集体而发生目的细胞群的非特异性丢失，这也是离心法进行淋巴细胞纯化操作中低收率的一个原因。综上所述，红细胞的这种聚集应受到合理控制，高分子这种促进聚集的作用应在适宜的范围内，速度应适中。泛影酸钠是临床常用的一种小分子离子型碘对比剂，其与聚蔗糖400组合可以进一步为组合体系提供适宜的粘度和渗透压以提高纯化效率。
利用密度梯度介质完成淋巴细胞的富集是一项常规的实验操作，其一般步骤包括：（1）用一定比例的平衡盐溶液或生理盐水对血液或骨髓样本进行预稀释；（2）将稀释后的样本小心沿离心容器壁加入预装有密度梯度介质的离心容器中，保持样本与介质的界面清晰，不发生混合；（3）在一定温度和一定离心条件下进行离心，比如20°C时，离心力为400g的条件下离心30分钟；（4）小心从离心机中取出装有样品的离心容器，利用巴斯德吸管或移液管等装置吸取富集在样本和介质层交界面处的“白膜层”；（5）用一定比例的平衡盐溶液、生理盐水或细胞培养基洗涤得到的细胞产品，除去血小板、细胞碎片与部分死细胞，以及残余的密度梯度介质；（6）将得到的细胞悬液用于细胞培养等后续实验，在临床应用方面，特别是在细胞移植或成分输血的情况中，得到的细胞悬液可能将被直接输注入人体。
含有聚蔗糖400-泛影酸钠组合配方的在售的密度梯度介质产品已可以满足实验室生物学研究的大部分需要。然而，这种组合配方对目的细胞的生物学影响也是不可忽略的，特别是其对一些特定细胞表面抗原表达量的影响已在多篇文献中见诸报道。例如，Watson等人报道了聚蔗糖介质对嗜中性粒细胞表面抗原的影响（Watson F等人,Neutrophil function in whole blood and after purification:changes in receptor expression,oxidase activity and responsiveness to cytokines,Biosci.Rep.1992,12(2):123.）；Lundahl等人报道了通过聚蔗糖-泛影酸钠组合配方分离而得的单核细胞与通过氯化铵裂解而得的单核细胞相比，CD11b/CD18比例发生了显著改变（Lundahl J等人,Altered expression ofCD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures,J.Immunol.Methods.1995,180(1):93.）；又如Souques等人报道了通过聚蔗糖-泛影酸钠组合配方分离而得的单核细胞的CD16和CD62L表面抗原均发生了显著的过表达（Souques F等人,Modification of surface marker expression on CD 14 monocytes of allergic patients after lysisor Ficoll purification,J.Immunol.Methods.1997,204:153）。聚蔗糖400作为一种高分子量的聚合物，已具有较强的抗原性，能够引起致敏反应，这在在体实验中得到了明确证实，例如一些文献中报道了利用聚蔗糖400作为半抗原的载体，增强小鼠对弱抗原的免疫反应应答等。更重要的是，聚蔗糖400本身缺乏药用经验，其毒理学、代谢动力学等重要药学数据缺失。显而易见，含有聚蔗糖400的密度梯度介质如果用于临床用途时，所得的细胞产品中聚蔗糖400的残留量必须受到最严格的控制，避免其与细胞产品一同输注进入人体，产生进一步的不良后果，这一点在一些国家的法律法规中已有明确限制，例如，2011年5月美国药典（USP）<1043>中就细胞、基因和组织工程产品辅料（AncillaryMaterials for Cell,Gene,and Tissue-Engineered Products）制定了普遍适用的指导方针，其中有三点可以为我国在相同领域设定标准提供重要参考：（1）细胞、基因和组织工程辅料被定义为不在终产物中出现的物料，这要求辅料的使用应选取最小用量，且生产过程应使辅料的残留量最小化并形成高效的定量检定残留量的方法；（2）辅料按风险程度分级，治疗用药物、生物制品、医疗器械和植入材料属于低风险级别，即得到高度认证的产品；而没有临床应用经验的化学试剂级物料属于中等风险级别，残留量需得到更严格控制；动物源性提取物及有明确毒性的化学实体属于高等风险级别，残留量需得到更严格的控制；（3）推荐采用最低风险级别的产品，即采用的辅料选择得到认证的治疗产品，因为其受到很好的鉴定，具有备案的毒性资料，并严格按受控、备案的过程进行制备。据此，很容易做出判断，聚蔗糖400由于不是得到认证的治疗产品，其缺乏严格的管理标准，因此聚蔗糖400-泛影酸钠组合配方的密度梯度介质应被归为中等风险材料，经其处理的细胞终产品中的残留量需得到严格控制，而这对于细胞产品的生产而言，生产周期和成本无疑将大大增加。因此，筛选一种更为高效，特别是一种得到认证的治疗产品作为原料的密度梯度介质，将为密度梯度介质的临床应用提供安全性和法律依从性上的双重保障。
我国2009年颁布的《细胞移植治疗技术管理规范》中明确提出了纯化细胞所需试剂和器械均必须经食品药品监督管理部门审批，具有临床应用许可证。然而，目前仍没有一个可商购获得的产品宣称可以用于临床非诊断用途，聚蔗糖400对这类产品的临床应用转化产生了不可忽视的制约作用。
专利申请201110456878.2公开了一种用于单个核细胞分离的组合物及复方淋巴细胞分离介质，其是由分子量大于40kD的右旋糖酐、羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺组成的。该专利申请提供的组合物及分离介质的分离效果与常规分离介质没有显著性差异，但是，该专利申请提供的组合物和分离介质的配方较复杂，含有三种主要原料，这对于需要严格控制内毒素的此类产品而言，为其制备带来了巨大不便。胡文滨对无菌产品细菌内毒素的控制做了较为详细的总结（胡文滨，无菌产品细菌内毒素的控制，河北省科学院学报，2010年，第27卷，第4期）。在无菌产品细菌内毒素的控制中，用量较大的主要原料是携带内毒素的重要媒介，因此，无论对于主要原料的内毒素检测还是涉及主要原料的生产操作或设备载体均是重要的控制点。这说明，配方越复杂，涉及的主要原料种类越多，生产工艺中对于内毒素的控制将越困难，且生产成本将越高。这一配方的复杂性为其工业生产的转化带来了巨大障碍。造成这一问题的重要原因是基于专利申请201110456878.2中表明了如下带有偏见的认识：即该组合物和分离介质必须采用特定比例的两种功能分子（右旋糖酐和羟乙基淀粉）才能够提供适宜的红细胞凝集速度，并实现良好的淋巴细胞纯度和淋巴细胞回收率，并且，该专利申请特别指出这种适宜的红细胞凝集速度是两种分子中单一的某一种分子无法实现的。
综上所述，研发一种配方更为简单、生产工艺更为便捷、成本更低、且产品内毒素更容易控制的用于处理生物样本的组合物及液体介质是本领域亟待解决的问题之一，解决这一问题将为实现临床治疗用途的密度梯度介质的工业生产转化产生巨大推动作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于处理生物样本的组合物，通过将药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂和/或pH值调节剂相混合得到一种具有良好效果的用于生物颗粒富集的组合物。
本发明的目的还在于提供一种采用上述组合物制成的液体介质，其可以用于生物颗粒的富集纯化，是一种良好的用于生物颗粒富集的液体介质。
为达到上述目的，本发明首先提供了一种用于处理生物样本的组合物，其由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、pH值调节剂组成，其质量比为2.0-12.0：2.5-12.0：0-0.4：0-0.5；优选为3.5-12.0：3.5-12.0：0-0.3：0-0.4；更优选为5.0-12.0：5.0-11.0：0-0.25：0-0.4。
该用于处理生物样本的组合物也可以称为用于生物颗粒富集的组合物。
本发明还提供了一种用于处理生物样本的液体介质，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉2.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂2.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.4wt%、pH值调节剂0-0.5wt%和余量水组成；优选地，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉3.5-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂3.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.3wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成；更优选地，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉5.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂5.0-11.0wt%、渗透压调节剂0-0.25wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成。
该液体介质可以是由本发明所提供的上述组合物溶于水（优选注射用水）得到的，其主要用于生物颗粒的富集和分离，因此，也可以称为用于生物颗粒富集的液体介质。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述液体介质的pH值为5.0-7.5，优选为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述液体介质的渗透压为270-335mOsm/kg；更优选地，该液体介质的渗透压为280-320mOsm/kg。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述液体介质的密度为1.070-1.085g/mL；更优选地，该液体介质的密度为1.077-1.083g/mL。
对于本发明所提供的液体介质，通过在本发明所提供的范围内调整其成分组成可以使其具有不同的渗透压、密度等，以适应不同的生物样本以及需要分离的目的细胞。
羟乙基淀粉是一种临床最常用的血浆代用品，俗称706代血浆，是治疗和预防低血容量的首选药物，其结构通式如下：
Figure BDA00002111977900061
目前羟乙基淀粉按分子量可以分为20kD、40kD、130kD、200kD、450kD、480kD、600kD和680kD多种规格，目前在我国最常用的是20kD、40kD、130kD和200kD四种规格，平均摩尔取代度为0.4-0.7。本发明提供的组合物和液体介质所采用的药学上可接受的羟乙基淀粉可以为分子量在130kD以上的药学上可接受的羟乙基淀粉，以其来替代聚蔗糖400作为分离用组合物及液体介质的材料，既满足了原料是得到认证的治疗产品的要求，其又可以潜在地发挥与聚蔗糖400相同的生物学作用。羟乙基淀粉与糖原结构相似，可以通过与聚蔗糖400相似的作用机制发挥促进红细胞聚集沉降的作用。随着分子量增大，羟乙基淀粉对红细胞的聚集作用越强，例如平均分子量为450kD的羟乙基淀粉可用于白细胞的分离；且随着分子量增大，免疫原性也将增大。过强的聚集作用会导致前文所述的目的细胞陷入红细胞聚集体而发生目的细胞群的非特异性丢失。综上可知，适宜的红细胞聚集程度对于同时保证目的细胞的纯度和回收率至关重要。根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明所采用的药学上可接受的羟乙基淀粉是羟乙基淀粉200/0.5和/或羟乙基淀粉130/0.4等。
在本发明提供的上述组合物和液体介质中，所采用的药学上可接受的离子型碘对比剂可以是醋碘苯酸钠（Sodium Acetrizoate）、甲泛葡胺（Metrizamide）、泛影葡胺（Meglumine Diatrizoate）和泛影酸钠（Sodium Diatrizoate）等中的一种或几种的组合，其对应的化学结构式如下。优选地，上述离子型碘对比剂是泛影酸钠。
Figure BDA00002111977900071
泛影酸钠是一种临床用于血管造影的对比剂，化学名为2,4,6-三碘-3,5-二乙酰氨基苯甲酸钠，其化学结构特点决定其在水溶液中水解呈弱碱性。在含有泛影酸钠与羟乙基淀粉的混合水溶液（例如本发明提供的液体介质）中，两种组分的绝对量、相对比例以及水溶液的pH值、渗透压等因素都将对富集生物颗粒的效果产生直接影响。例如，嗜中性粒细胞的密度在1.080g/cm3左右，与单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的平均密度1.077g/cm3相比差别并不显著，为了在密度梯度介质中将其与单个核细胞有效区分开，密度梯度介质可以略高于生理渗透压，这样粒细胞受渗透压影响而轻微发生水分外流，细胞密度略微增高，这样即有效增加了纯化的分辨率。
在本发明提供的上述组合物和液体介质中，所采用的渗透压调节剂可以为无毒的药学上可接受的酸加成盐。上述无毒的药学上可接受的酸加成盐可以包括无机酸盐和/或有机酸盐等，其中，无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和磷酸氢盐等中的一种或几种的组合，有机酸盐包括乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、D-乳酸盐、L-乳酸盐、D-酒石酸盐、L-酒石酸盐、丙二酸盐、烟酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐和苯甲酸盐等中的一种或几种的组合；优选地，上述渗透压调节剂包括盐酸盐、磷酸氢盐、乙二胺四乙酸盐和碳酸盐等中一种或几种的组合；更优选地，上述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾等中的一种或几种的组合。
在本发明提供的上述组合物和液体介质中，所采用的pH值调节剂可以为无毒的药学上可接受的酸、多元酸的酸式盐和缓冲对（例如由两种物质组成的缓冲对）等中的一种或几种的组合；优选地，上述无毒的药学上可接受的酸可以包括无机酸和/或有机酸等，上述无机酸包括盐酸、硫酸、硝酸和磷酸等中的一种或几种的组合，上述有机酸包括甲酸、乙酸、富马酸、马来酸、苯磺酸、D-乳酸、L-乳酸、D-酒石酸、L-酒石酸、丙二酸、烟酸、苹果酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、葡糖酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸等中的一种或几种的组合，上述多元酸的酸式盐包括硫酸氢盐、碳酸氢盐和磷酸氢盐等中的一种或几种的组合，上述缓冲对包括甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸二氢钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、Tricine-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠和碳酸钠-碳酸氢钠等中的一种或几种的组合；优选地，上述pH值调节剂为盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、Tris-盐酸缓冲对、盐酸-甘氨酸缓冲对、乙酸、乙酸-乙酸钠缓冲对、乙二胺四乙酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对和Tricine-氢氧化钠缓冲对等中的一种或几种的组合。在缓冲对中，两种物质的摩尔比可以为1：1。
在上述的渗透压调节剂的实例中，有部分会对溶液的pH值产生较大影响，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸三钠等。上述的pH值调节剂的实例中，有部分会对溶液的渗透压产生较大影响，例如磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对、Tricine-氢氧化钠缓冲对、乙酸-乙酸钠缓冲对等。鉴于这两个参数交互式影响的作用，当某一种上述的渗透压调节剂或pH值调节剂拟按各自目的用途被使用时，可能会对另一种参数造成较大影响，这种影响应在实验中得到验证并在调节另一种被影响的参数时进行有效修正，即增加、降低另一种被影响的参数所涉及的原料用量，甚至不必加入相应原料的情况也是存在的。渗透压调节剂和pH值调节剂在制备过程中应被综合考虑：当加入某一种拟按其目的用途发挥作用的物质时，其可能发挥的实际影响并不局限于其目的用途，而可能还包含其它用途。这种情况的实例比如，当加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对用来将介质pH值由碱性调节至小于7时，介质的渗透压同时由低于生理渗透压升高至生理渗透压范围内，此时应根据具体情况减少渗透压调节剂的用量或可能不必再另外添加渗透压调节剂。这种交互影响的实例又比如，当加入天冬氨酸盐用来调节介质渗透压由低于生理渗透压至生理渗透压范围内时，介质的pH值同时有所降低，此时应根据具体情况增加或减少pH值调节剂的用量或可能不必再另外添加pH值调节剂。
本发明所提供的上述用于处理生物样本的液体介质是用于富集生物样本中的细胞的水溶液，这里的细胞是使用本发明提供的组合物的水溶液或液体介质，经过离心法操作后富集得到的目的细胞。作为优选，上述目的细胞可以是单个核细胞、嗜中性粒细胞、造血干细胞、间充质干细胞、单核细胞、树突细胞等。对于不同的生物样本或者目的细胞，液体介质可能采用不同的成分组成，以达到最佳的纯化效果，因此，该液体介质可以具有不同的理化参数及生物学参数，例如密度、渗透压、pH值等。
根据颗粒在液体介质中沉降的原理，影响目的细胞在液体介质（密度梯度介质）中分布的主要因素是颗粒密度与介质密度的差值。以单个核细胞为例，当目的细胞是平均密度为1.077g/cm3的单个核细胞时，介质密度也优选设置为1.077g/cm3左右，以实现单个核细胞在介质界面处的富集。又例如，当目的细胞是平均密度为1.083g/cm3的嗜中性粒细胞时，介质密度优选设置为1.083g/cm3左右，此时嗜中性粒细胞由于无法穿透介质层而与单个核细胞一起在介质界面处富集。可选地对所得到的细胞产品进行另外的操作以实现嗜中性粒细胞的进一步纯化。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉130/0.4、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉130/0.4、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的HCl，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钙、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.3wt%的氯化钙、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的盐酸-甘氨酸缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.3wt%的氯化钙、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸二钠，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.083g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
根据本发明的具体实施方案，优选地，以重量百分比计，本发明提供的液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的磷酸二氢钾，余量水；该液体介质的密度为1.083g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
前面所记载的关于液体介质的成分组成的优选范围、渗透压的优选范围、pH值的优选范围也适用于上述的十种液体介质。
根据本发明的具体实施方案，优选地，本发明提供的用于处理生物样本的液体介质为无菌的，并且，内毒素含量＜0.5EU/mL。
本发明还提供了上述用于处理生物样本的液体介质在生物颗粒富集，特别是细胞富集中的应用。
根据本发明的具体实施方案，优选地，上述应用是采用液体介质按照以下步骤进行生物颗粒富集：
（1）用平衡盐溶液或生理盐水对生物样本进行预稀释；
（2）将稀释后的生物样本加入预装有所述液体介质的离心容器中，保持生物样本与介质的界面清晰，不发生混合；
（3）在0°C-25°C下，使用400-800g离心力进行15-30分钟的离心处理；
（4）取出装有经过离心处理的生物样品的离心容器，利用巴斯德吸管或移液管吸取富集在生物样本和液体介质层交界面处的白膜层；
（5）用平衡盐溶液、生理盐水或细胞培养基在200-400g的离心力下对白膜层进行洗涤完成生物颗粒的富集，以除去血小板、细胞碎片与部分死细胞，以及残余的液体介质得到目的细胞，离心时间为5-10分钟。
根据本发明的具体实施方案，在步骤（1）中，所采用的平衡盐溶液可以是PBS、D-Hanks液，平衡盐溶液或生理盐水与生物样本的质量比可以控制为1：1。
根据本发明的具体实施方案，在步骤（2）中，稀释后的生物样本可以沿着离心容器的侧壁缓慢加入，保持生物样本与液体介质的界面清晰，不发生混合。
根据本发明的具体实施方案，在步骤（3）中，可以选用400g离心力进行30分钟离心处理，且离心转子为水平转子或角转子；优选地，离心转子为水平转子。
根据本发明的具体实施方案，在步骤（5）中，选用生理盐水对所得的产品进行洗涤，洗涤操作的离心力为400g，时间为5分钟。经过洗涤之后，所得到的产品（细胞悬液）可以用于细胞培养等后续操作。
使用本发明提供的组合物或液体介质用于富集细胞时，由于生物样本类型不同、目的细胞不同，所得到的富集效果也是有差异的。典型的富集效果将在实施例中得到详细描述，然而应当理解，实施例中组合物或液体介质的应用旨在举例说明，而非限制本发明的应用范围。本发明所提供的组合物或液体介质的应用可以在一定范围内进行迁移，这种应用上的迁移对本领域技术人员是很容易实现的，且是显而易见的。同时，本发明所提供的组合物和液体介质的具体成分组成均可以在一定的范围内进行调整，根据生物样本的不同，可以对其成分以及组成比例等进行调整，以得到优选的效果。例如，将本发明所提供的组合物或液体介质用于脐带血样本中造血干细胞的富集迁移至骨髓样本中造血干细胞的富集中；将组合物或液体介质用于外周血样本中淋巴细胞的富集迁移至小鼠或大鼠脾脏淋巴细胞的富集中。作为优选，本发明所提供的组合物或液体介质的应用对象是人的血液样本或组织样本。优选地，上述血液样本为外周血、脐带血或经血等，上述组织样本为骨髓等；更优选地，上述血液样本是经过EDTAK2、柠檬酸钠或肝素抗凝处理过的抗凝血液样本。
当本发明提供的组合物或液体介质用于外周血或脐带血样本中单个核细胞的富集（以实施例2的DH008为例）时，与对照组A（通用电气医疗集团（GE Healthcare）的产品Ficoll-Paque TM PLUS）相比，在表观效果、单个核细胞纯度、单个核细胞活率三项参数上均与对照组A无显著性差异，而在单个核细胞回收率的参数上超过对照组A，且结果具有统计学意义。单个核细胞回收率的显著提升可能由于分子量较小的羟乙基淀粉对红细胞的聚集作用比聚蔗糖400更为温和，这使得红细胞聚集体体积变小，有效降低了目的细胞被沉降中的红细胞聚集体捕获的概率，从而提升了目的细胞的回收率。这在对红细胞聚集体的形态学观察中得到了证实，如图1a和图1b所示（图1a代表Ficoll-PaqueTMPLUS，图1b代表实施例2中的DH008），含有羟乙基淀粉的液体介质所引发的红细胞聚集体比含有聚蔗糖400的配方在三维结构上更为简单，多为链状聚集体，从而降低了其对目的细胞的捕获。以上证明本发明提供的组合物及液体介质在富集单个核细胞的应用上具有与现有技术相当或更优的效果。
使用本发明组合物的液体介质DH007和DH008富集所得的单个核细胞参照GB/T16886.5-2003和GB/T 16175-1996进行体外细胞毒性试验后，其结果与对照组A无显著性差异。通过相对增殖度进行细胞毒性反应评定，DH007、DH008和对照组A均评定为0级，这证明发明所述的组合物和液体介质对于细胞是安全、无毒的。
本发明所提供的用于处理生物样本的组合物及液体介质是采用单一的功能性高分子材料——羟乙基淀粉，配合离子型碘对比剂、渗透压调节剂和/或pH值调节剂得到的。特别是，通过使用pH值调节剂较为精确的控制介质的pH值，实现了现有技术未良好解决的技术目标，即用单一的羟乙基淀粉替代聚蔗糖400，提供适宜的红细胞凝集速度，并实现良好的目的细胞纯度和回收率。本发明提供的组合物及液体介质的成分组成更为简单、安全，原料均为可商购获得的用于静脉注射的原料药，原料均受到很好的鉴定，具有备案的毒性资料，并严格按受控、备案的过程进行制备。此外，本发明产品的内毒素含量更容易在工业生产中得到有效控制，因此通过配方简化降低了生产成本，使之更易实现工业转化，有良好的应用前景。
本发明提供的组合物及液体介质在用于富集生物样本中的单个核细胞等时，在部分参数上超越了目前可商购获得的国内外同类产品，具有更高的安全性和有效性，为此类产品的临床转化提供了更为便利的条件。
附图说明
图1a和图1b分别为含有聚蔗糖400的介质与含有羟乙基淀粉200/0.5的介质对于红细胞聚集影响的比较结果图。
图2a和图2b为使用对照组A富集人外周血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果。
图2c和图2d为使用实施例2的DH008富集人外周血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果。
图3a和图3b为使用对照组A富集人脐带血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果。
图3c和图3d为使用实施例2的DH008富集人脐带血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果。
图4为使用实施例2的DH001-DH008富集人外周血中的单个核细胞的效果比较。
图5为使用实施例2的DH001-DH008富集人脐带血中的单个核细胞的效果比较。
图6a-图6c为使用实施例2的DH011富集人脐带血中的白细胞的典型流式细胞术评价结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1组合物及液体介质的配制通法
本实施例提供了一种用于处理生物样本的组合物及液体介质的配制方法，其包括以下步骤：
在温度为20-25°C、湿度小于60%的条件下，用万分之一精密度天平准确称量相应质量的固体原料或液体原料，置于一支50mL无菌离心管中，即得到用于处理生物样本的组合物；
将上述组合物充分溶解于相应质量的注射用水中，形成无色透明溶液；
在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到另一支50mL的无菌离心管中，即得到用于处理生物样本的液体介质，避光保存备用。
实施例2液体介质的组成
本实施例提供了一组液体介质，其组成如表1所示。其中，编号为DH001、DH002、DH003、DH004、DH006、DH007、DH008、DH010、DH011的液体介质为本发明提供的用于处理生物样本的液体介质，编号为DH005、DH009的液体介质为对比例。
表1液体介质的组成（以重量百分比计，余量为注射用水）
Figure BDA00002111977900141
其中，在DH003中，HCl代表的是浓度1M的盐酸，0.0088%代表的是盐酸中的溶质HCl在液体介质中所占的质量分数。
实施例3液体介质的理化及生物学参数的测定
在20°C，湿度小于60%的条件下，对实施例2提供的液体介质的理化及生物学参数进行测定，测试结果如表2所示：
参照美国药典（USP）<841>所述的方法进行密度测定；
参照《中华人民共和国药典》2010版附录所述的方法进行渗透压的测定；
参照《中华人民共和国药典》2010版附录所述的方法进行pH值的测定；
参照《中华人民共和国药典》2010版附录所述的方法进行无菌测定；
参照《中华人民共和国药典》2010版附录所述的方法进行细菌内毒素的测定。
表2液体介质的理化及生物学参数
Figure BDA00002111977900151
实施例4使用液体介质富集人外周血中的单个核细胞及其富集效果评价
使用实施例2给出的液体介质以及对照组A（通用电气医疗集团（GE Healthcare）的产品Ficoll-Paque TM PLUS，商购）对人外周血中的单个核细胞进行富集：
人外周血样本取自健康成年志愿者，志愿者年龄在20-40岁之间，性别不限；
使用商购获得的真空采血管收集外周血，真空采血管内预装有抗凝剂，抗凝剂选自EDTA K2、柠檬酸钠或肝素；
按照分析全血的常规操作，取少量全血进行红细胞裂解及适当稀释，进行镜下总白细胞计数及流式细胞术分析；
将5mL实施例2提供的液体介质或者对照组A装入15mL的无菌离心管中，将抗凝外周血与PBS溶液在50mL离心管中按1：1的质量比混合稀释；
将5mL稀释后的抗凝外周血用移液管小心加入上一步制备的装有实施例2提供的液体介质或者对照组A的离心管中，这一过程称为“载样”，其操作应注意维持血液样本和介质层的界面清晰分明，平稳地将血样铺在介质上，血样加入速度不可过快，应沿管壁缓缓加入等，这些操作要点是本领域技术人员所熟知的；
将完成载样的离心管放入装配有水平转子的低温离心机中，设置离心温度为20°C，离心力为400g，在此条件下离心30分钟；
将离心后的样品管平稳取出离心机，可以观察到血浆层和介质层界面处有“白膜层”，此即得到富集的目的细胞，白膜层越紧密集中，越容易从样本中完整移取出，并尽可能减少被带出的介质和血浆，因此，白膜层状态作为富集效果的一项评价指标，即表观效果评价；
用无菌巴斯德吸管将白膜层完整移取出并转移到一支15mL的无菌离心管中，加入10mL生理盐水形成均匀的细胞悬液，将其在20°C、离心力为400g的条件下离心5分钟完成第一次洗涤，将得到的细胞可选地进行第二次洗涤，操作同第一次洗涤。
对经过一次或两次洗涤得到的细胞进行台盼蓝染色、镜下细胞计数及流式细胞术分析，结合全血总白细胞数、流式细胞术结果，对单个核细胞的回收率、活率、纯度进行计算，作为富集效果的另外的评价指标，评价指标的建立参考通用电气医疗集团（GEHealthcare）出版的手册《单核细胞的分离》（手册编号：18-1152-69AC 2007-05）。使用实施例2提供的液体介质以及对照组A富集人外周血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果如表3及图2a-2d所示（图2a和图2b代表对照组A，图2c和图2d代表DH008）。
表3使用液体介质富集人外周血中的单个核细胞的富集效果评价(n=10)
Figure BDA00002111977900161
表3以及图4所示的富集效果的数据表明，DH004、DH007和DH008三个液体介质在富集人外周血中单个核细胞的富集效果上，在单个核细胞回收率这一参数上显著高于对照组A。DH005在单个核细胞回收率和单个核细胞纯度两个参数上均显著低于DH007和DH008，而DH005具有与DH007和DH008相同的羟乙基淀粉200/0.5和泛影酸钠的质量分数，这说明采用pH值调节剂将介质pH值调整到6.1-7.5能够实现相对更好的富集效果。
图2a-2d表示使用对照组A和DH008富集人外周血中单个核细胞的典型流式细胞术检测结果，采用CD45-FITC和CD14-PE荧光标记抗体（Biolegend公司）对所得的细胞进行双染完成检测。图2a和图2c对比说明DH008和对照组A对CD45+细胞群（白细胞群）的富集效果相当，图2b和图2d对比说明DH008和对照组A对粒细胞、单核细胞、淋巴细胞群的富集效果相当。图2a-2d通过细胞表型分析综合说明了DH008与对照组A在对人外周血中单个核细胞的富集上具有相当的作用效果。
实施例5使用液体介质富集人脐带血中的单个核细胞及其富集效果评价
使用实施例2给出的液体介质以及对照组A（通用电气医疗集团（GE Healthcare）的产品Ficoll-PaqueTMPLUS，商购）对人脐带血中的单个核细胞进行富集：
人脐带血样本来自健康足月新生儿，性别不限；
使用商购获得的一次性采血袋采集新鲜脐带血，一次性采血袋内预装有抗凝剂，抗凝剂为柠檬酸钠；
按照分析全血的常规操作，取少量全血进行红细胞裂解及适当稀释，进行镜下总白细胞计数及流式细胞术分析；
将5mL实施例2提供的液体介质或者对照组A装入15mL的无菌离心管中；
将抗凝脐带血与PBS溶液在50mL离心管中按1：1的质量比混合稀释；
将5mL稀释后的抗凝脐带血用移液管小心加入上一步装有实施例2提供的液体介质或者对照组A的离心管中，这一过程称为“载样”，其操作应特别注意维持血液样本和介质层的界面清晰分明，平稳地将血样铺在介质上，血样加入速度不可过快，应沿管壁缓缓加入等，这些操作要点是本领域技术人员所熟知的；
将完成载样的离心管放入装配有水平转子的低温离心机中，设置离心温度为20°C，离心力为400g，在此条件下离心30分钟；
将离心后的样品管平稳取出离心机，可以观察到血浆层和介质层界面处有“白膜层”，此即得到富集的目的细胞，白膜层越致密集中，越容易从样本中完整移取出，并尽可能减少被带出的介质和血浆，因此，白膜层状态作为富集效果的一项评价指标，即表观效果评价；
用无菌巴斯德吸管将白膜层完整移取出并转移到一支15mL无菌离心管中，加入10mL生理盐水形成均匀的细胞悬液，将其在20°C、离心力为400g的条件下离心5分钟完成第一次洗涤，将得到的细胞可选地进行第二次洗涤，操作同第一次洗涤。
对经过一次或两次洗涤得到的细胞进行台盼蓝染色、镜下细胞计数及流式细胞术分析，结合全血总白细胞数、流式细胞术结果，对单个核细胞的回收率、活率、纯度进行计算，作为富集效果的另外的评价指标。使用本发明所述组合物富集人脐带血中的单个核细胞的典型流式细胞术评价结果如表4及图3a-3d所示（图3a和图3b代表对照组A，图3c和图3d代表DH008）。
表4以及图5所示的富集效果的数据表明，DH004、DH007和DH008三个液体介质在富集人脐带血中单个核细胞的富集效果上，在单个核细胞回收率这一参数上显著高于对照组A。DH005在单个核细胞回收率和单个核细胞纯度两个参数上均显著低于DH007和DH008，而DH005具有与DH007和DH008相同的羟乙基淀粉200/0.5和泛影酸钠的质量分数，这进一步说明采用pH值调节剂将介质pH值调整到6.1-7.5能够实现更好的富集效果。
图3a-3d表示使用对照组A和DH008富集人脐带血中单个核细胞的典型流式细胞术检测结果，采用CD45-FITC和CD14-PE荧光标记抗体（Biolegend公司）对所得的细胞进行双染完成检测。图3a和图3c对比说明DH008和对照组A对CD45+细胞群（白细胞群）的富集效果相当，图3b和图3d对比说明DH008和对照组A对粒细胞、单核细胞、淋巴细胞群的富集效果相当。图3a-3d通过细胞表型分析综合说明了DH008与对照组A在对人脐带血中单个核细胞的富集上具有相当的作用效果。
表4使用液体介质富集人脐带血中的单个核细胞的富集效果评价(n=10)
Figure BDA00002111977900181
实施例6使用液体介质富集人脐带血中的白细胞及其富集效果评价
使用实施例2给出的液体介质对人脐带血中的白细胞进行富集：
人脐带血样本来自健康足月新生儿，性别不限；
使用商购获得的一次性采血袋采集新鲜脐带血，一次性采血袋内预装有抗凝剂，抗凝剂为柠檬酸钠；
按照分析全血的常规操作，取少量全血进行红细胞裂解及适当稀释，进行镜下总白细胞计数及流式细胞术分析；
将5mL实施例2提供的液体介质装入15mL的无菌离心管中；
将抗凝脐带血与PBS溶液在50mL离心管中按1：1的质量比混合稀释；
将5mL稀释后的抗凝脐带血用移液管小心加入上一步装有实施例2提供的液体介质的离心管中，这一过程称为“载样”，其操作应特别注意维持血液样本和介质层的界面清晰分明，平稳地将血样铺在介质上，血样加入速度不可过快，应沿管壁缓缓加入等，这些操作要点是本领域技术人员所熟知的；
将完成载样的离心管放入装配有水平转子的低温离心机中，设置离心温度为20°C，离心力为400g，在此条件下离心30分钟；
将离心后的样品管平稳取出离心机，可以观察到血浆层和介质层界面处有“白膜层”，此即得到富集的目的细胞，白膜层越致密集中，越容易从样本中完整移取出，并尽可能减少被带出的介质和血浆，因此，白膜层状态作为富集效果的一项评价指标，即表观效果评价；
用无菌巴斯德吸管将白膜层完整移取出并转移到一支15mL无菌离心管中，加入10mL生理盐水形成均匀的细胞悬液，将其在20°C，离心力为400g的条件下离心5分钟完成第一次洗涤，将得到的细胞可选地进行第二次洗涤，操作同第一次洗涤；
对经过一次或两次洗涤得到的细胞进行台盼蓝染色、镜下细胞计数及流式细胞术分析，结合全血总白细胞数、流式细胞术结果，对白细胞的回收率、活率、纯度进行计算，作为富集效果的另外的评价指标。使用实施例2提供的液体介质富集人脐带血中的白细胞的典型流式细胞术评价结果如表5及图6a-6c所示（图6a-6c代表DH011）。
表5所示的富集效果的数据表明，DH009、DH010和DH011这三个液体介质对人脐带血中的白细胞具有较好的富集效果，实现了较高的回收率和纯度。其中，DH009的白膜层较为松散，表观效果欠佳，这可能是由于其未调节pH值到6.1-7.5这一优选范围而造成的。图6a-6c表示使用DH011富集人脐带血中白细胞的典型流式细胞术检测结果，采用CD45-FITC和CD14-PE荧光标记抗体（Biolegend公司）对所得的细胞进行双染完成检测。图6a是DH011所得细胞的前向角和侧向角的散点图；图6b表示DH011所得细胞CD45+细胞群（白细胞群）的比例；图6c和图3d对比，特别说明了通过调高本发明液体介质的密度至1.083g/mL后，粒细胞群的富集效果得到了明显的增强。
表5使用液体介质富集人脐带血中的白细胞的富集效果评价(n=5)
Figure BDA00002111977900201
实施例7使用液体介质富集人脐带血中的单个核细胞的体外培养及效果评价
按照实施例5中所述的标准操作进行单个核细胞的富集；
将对照组A（通用电气医疗集团（GE Healthcare）的产品Ficoll-Paque TM PLUS，商购）对人脐带血进行富集得到的单个核细胞进行台盼蓝染色及细胞计数，使用完全培养基（CM）调整细胞浓度至1×106/mL；
调整细胞浓度后的单个核细胞悬液100μL小心加入96孔板中，设置完全培养基为阴性对照组，实验组添加10μL对照组A，每组设置5个平行样；
将实施例2中的液体介质DH007对人脐带血进行富集得到的单个核细胞进行台盼蓝染色及细胞计数，使用完全培养基（CM）调整细胞浓度至1×106/mL；
调整细胞浓度后的单个核细胞悬液100μL小心加入96孔板中，设置完全培养基为阴性对照组，实验组添加10μL实施例2中的液体介质DH007，每组设置5个平行样；
将实施例2中的液体介质DH008对人脐带血进行富集得到的单个核细胞进行台盼蓝染色及细胞计数，使用完全培养基（CM）调整细胞浓度至1×106/mL；
调整细胞浓度后的单个核细胞悬液100μL小心加入96孔板中，设置完全培养基为阴性对照组，实验组添加10μL实施例2中的液体介质DH008，每组设置5个平行样；
将96孔板置于37°C，5%CO2培养箱中培养48h后取出，加入10μL MTT工作液继续培养4h后加入100μL DMSO，振荡10min，使用酶联免疫检测仪在波长为570nm下测定其吸光光度值；
根据测得各样本组的吸光光度值，按公式计算每组样本的单个核细胞的相对增殖度（RGR）：RGR(％)=实验组吸光光度值/阴性对照组吸光光度值×100%。
表6所示的单个核细胞相对增殖度的数据表明，使用实施例2提供的液体介质DH007和DH008富集所得的单个核细胞参照GB/T 16886.5-2003和GB/T 16175-1996进行体外细胞毒性试验后，其结果与对照组A无显著性差异（t检验）。通过相对增殖度进行细胞毒性反应评定，DH007、DH008和对照组A均评定为0级，这证明本发明提供的组合物及液体介质对于细胞是安全、无毒的。
表6使用液体介质富集人脐带血中的单个核细胞的体外培养效果评价(n=5)

Claims (17)

1.一种用于处理生物样本的组合物，其由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、pH值调节剂组成，其质量比为2.0-12.0：2.5-12.0：0-0.4：0-0.5；优选为3.5-12.0：3.5-12.0：0-0.3：0-0.4；更优选为5.0-12.0：5.0-11.0：0-0.25：0-0.4。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为分子量在130kD以上的药学上可接受的羟乙基淀粉；优选地，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5和/或羟乙基淀粉130/0.4。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述药学上可接受的离子型碘对比剂为醋碘苯酸钠、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸钠中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中，所述渗透压调节剂为无毒的药学上可接受的酸加成盐。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中，所述pH值调节剂为无毒的药学上可接受的酸、多元酸的酸式盐和缓冲对中的一种或几种的组合。
6.一种用于处理生物样本的液体介质，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉2.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂2.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.4wt%、pH值调节剂0-0.5wt%和余量水组成；优选地，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉3.5-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂3.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.3wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成；更优选地，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉5.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂5.0-11.0wt%、渗透压调节剂0-0.25wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成。
7.根据权利要求6所述的液体介质，其中，该液体介质的pH值为5.0-7.5，优选为6.1-7.5。
8.根据权利要求6或7所述的液体介质，其中，该液体介质的渗透压为270-335mOsm/kg；优选地，该液体介质的渗透压为280-320mOsm/kg。
9.根据权利要求6或7所述的液体介质，其中，该液体介质的密度为1.070-1.085g/mL；优选地，该液体介质的密度为1.077-1.083g/mL。
10.根据权利要求6-9任一项所述的液体介质，其中，该液体介质为无菌的，并且，内毒素含量＜0.5EU/mL。
11.根据权利要求6-10任一项所述的液体介质，其中，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为分子量在130kD以上的药学上可接受的羟乙基淀粉；优选地，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5和/或羟乙基淀粉130/0.4。
12.根据权利要求6-11任一项所述的液体介质，其中，所述药学上可接受的离子型碘对比剂包括醋碘苯酸钠、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸钠中的一种或几种的组合。
13.根据权利要求6-12任一项所述的液体介质，其中，所述渗透压调节剂为无毒的药学上可接受的酸加成盐；优选地，所述无毒的药学上可接受的酸加成盐包括无机酸盐和/或有机酸盐，其中，所述无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和磷酸氢盐中的一种或几种的组合，所述有机酸盐包括乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、D-乳酸盐、L-乳酸盐、D-酒石酸盐、L-酒石酸盐、丙二酸盐、烟酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐和苯甲酸盐中的一种或几种的组合；更优选地，所述渗透压调节剂包括盐酸盐、磷酸氢盐、乙二胺四乙酸盐和碳酸盐中一种或几种的组合；更优选地，所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的一种或几种的组合。
14.根据权利要求6-13任一项所述的液体介质，其中，所述pH值调节剂为无毒的药学上可接受的酸、多元酸的酸式盐和缓冲对中的一种或几种的组合；优选地，所述无毒的药学上可接受的酸包括无机酸和/或有机酸，所述无机酸包括盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的一种或几种的组合，所述有机酸包括甲酸、乙酸、富马酸、马来酸、苯磺酸、D-乳酸、L-乳酸、D-酒石酸、L-酒石酸、丙二酸、烟酸、苹果酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、葡糖酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸中的一种或几种的组合，所述多元酸的酸式盐包括硫酸氢盐、碳酸氢盐和磷酸氢盐中的一种或几种的组合，所述缓冲对包括甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸二氢钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、Tricine-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠和碳酸钠-碳酸氢钠中的一种或几种的组合；更优选地，所述pH值调节剂为盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、Tris-盐酸缓冲对、盐酸-甘氨酸缓冲对、乙酸、乙酸-乙酸钠缓冲对、乙二胺四乙酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对和Tricine-氢氧化钠缓冲对中的一种或几种的组合。
15.根据权利要求6-14任一项所述的液体介质，其中，以重量百分比计，该液体介质具有以下组成和参数：
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉130/0.4、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉130/0.4、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的HCl，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钙、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.3wt%的氯化钙、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的盐酸-甘氨酸缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.3wt%的氯化钙、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸二钠，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.077g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的摩尔比为1：1的乙酸-乙酸钠缓冲对，余量水；该液体介质的密度为1.083g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5；或者，
该液体介质的组成为：2.0-12.0wt%的羟乙基淀粉200/0.5、2.5-12.0wt%的泛影酸钠、0-0.4wt%的氯化钠、0-0.5wt%的磷酸二氢钾，余量水；该液体介质的密度为1.083g/mL，渗透压为280-320mOsm/kg，pH值为6.1-7.5。
16.权利要求6-15任一项所述的用于处理生物样本的液体介质在生物颗粒富集中的应用；优选地，上述应用是采用所述液体介质按照以下步骤进行生物颗粒的富集：
（1）用平衡盐溶液或生理盐水对生物样本进行预稀释；
（2）将稀释后的生物样本加入预装有所述液体介质的离心容器中，保持生物样本与液体介质的界面清晰，不发生混合；
（3）在0°C-25°C下，使用400-800g离心力进行15-30分钟的离心处理；
（4）取出装有经过离心处理的生物样品的离心容器，利用巴斯德吸管或移液管吸取富集在生物样本和液体介质层交界面处的白膜层；
（5）用平衡盐溶液、生理盐水或细胞培养基在200-400g的离心力下对白膜层进行洗涤完成生物颗粒的富集，离心时间为5-10分钟。
17.根据权利要求16所述的应用，其中，所述生物样本为血液样本或组织样本；优选地，所述血液样本为外周血、脐带血或经血，所述组织样本为骨髓；更优选地，所述血液样本是经过EDTA K2、柠檬酸钠或肝素抗凝处理过的抗凝血液样本。
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