CN104316505A - 用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建和应用 - Google Patents

用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建和应用 Download PDF

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CN104316505A CN201410648240.2A CN201410648240A CN104316505A CN 104316505 A CN104316505 A CN 104316505A CN 201410648240 A CN201410648240 A CN 201410648240A CN 104316505 A CN104316505 A CN 104316505A
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朱伟胜
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Abstract

本发明公开一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建和应用。通过对鱼毒性藻类在不同生长期和环境因子调控下的溶血活性与变化及叶绿素三维荧光光谱的研究，大样本非鱼毒性藻类的叶绿素三位荧光光谱为对照，筛选三维荧光光谱分析和判别方法，提取与鱼毒性藻类及其溶血活性密切相关的荧光特征谱，通过聚类方法，筛选鱼毒性藻类和非鱼毒性藻类的三维荧光光谱库；并以此为基础，分别建立了识别鱼毒性藻类的Fisher判别函数和判别鱼毒性藻类溶血活性强弱的函数。利用上述判别函数获得的判别结果更加稳定、准确和可靠。通过本发明的方法实现了对现场赤潮水体的鱼毒性藻类及其溶血活性很高的正确诊断识别作用。

Description

用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建和应用
技术领域
本发明涉及一种标准光谱库的构建，特别涉及一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法和应用。
背景技术
随着我国沿海经济和社会快速发展，远洋运输能力不断增强，沿海水域富营养化和外来生物物种急剧增加，有毒、有害赤潮呈不断上升的趋势，给我国近岸水产养殖业的持续稳定发展和海产品食用安全构成巨大威胁。近年来，我国沿海几乎每年都会发生鱼毒性藻类赤潮，给海产养殖造成巨大经济损失，如2012年4～5月间发生在福建和浙江沿海的米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)赤潮，造成养殖的鲍鱼和大黄鱼大量死亡，经济损失高达20多亿元，1997年10月发生在广东饶平柘林湾的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)赤潮，使该湾养殖的鱼类全部死亡，损失达6千万人民币。鱼毒性赤潮藻类可产生包括醣酯类和超氧化物在内的多种溶血性物质，且有毒藻产生的毒素与藻细胞株系及生长的环境条件密切相关，因此，传统的毒素化学分析、生物测定和藻类形态分类等方法很难快速确定鱼毒性赤潮藻类的毒性及其毒力大小，严重影响赤潮灾害应急管理措施的执行。因此，迫切需要建立一种快速、准确的鱼毒性藻类及其毒力的识别诊断技术，以实现有害赤潮的早期预警和应急监测管理。
三维荧光光谱法是近二十年发展起来并趋于成熟的荧光分析技术。该方法具有检测速度快、简单易携、高灵敏度的特点。目前被广泛应用于油种鉴别、水体检测以及中药鉴别等分析领域。中国专利(申请号201210005410.6)和文献(鱼毒性藻类及其溶血活性的三维荧光光谱识别研究.桓清柳等.光谱学与光谱分析,2013,33(2)：399-403；鱼毒性藻类溶血活性的三维荧光特征。桓清柳，江天久.中国海洋湖沼学会藻类学分会第八次会员大会暨第十六次学术讨论会，2011)公开了一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用，该方法介绍了一种利用三维荧光技术检测鱼毒性藻类溶血活性的方法。该方法通过调控鱼毒性藻类米氏凯伦藻(karenia mikimotoi)、海洋卡盾藻(chattonella marina)及卵圆卡盾藻(chattonella ovata)和20多种非鱼毒性藻培养液中的铁离子浓度，测量这些微藻在该条件下各生长期的溶血毒素与三维荧光光谱，通过Coif2小波分析发现，鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的荧光特征谱差异主要集中在第1～10个数据点(波长λem＝650～680nm)和35～47个数据点(波长λem＝725～750nm；λex＝400～425nm)的荧光强度变化。利用该波段的藻类荧光强度及其对应的溶血活性值进行Fisher判别函数分析，对鱼毒性藻类的正确判别率为91.7％，非鱼毒性藻类的正确判别率高达100％，对具中等溶血活性(≥10HU，20HU)藻类的正确判别率为70％，而对低活性(10HU)和高活性(≥20HU)藻类的正确判别率均达80％以上。此方法开创性地将三维荧光技术应用有鱼毒性藻类识别，但因所建立模型的数据库仅为3种鱼毒性的藻类，营养因子仅选取了铁离子，建立的三维荧光光谱库数据有限，因而该方法仅是一种初步研究结果，对赤潮现场水体中鱼毒性藻类的正确判别率不高(平均约65％)。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法得到的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，包括以下步骤：
(1)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品在不同生长期、不同温度、不同盐度和不同光照强度调控下的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；
(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；
(3)在波长λEx＝575～600nm，波长λEm＝650～675nm出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在λEx＝575～600nm，波长λEm＝650～675nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；
(4)采用系统聚类法对步骤(2)中得到的荧光特征谱进行聚类分析，获得尺度分量标准谱，组成藻类的Coif2小波尺度分量标准谱库，即得到用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库；
(5)将步骤(4)得到的尺度分量标准谱库进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为：
y1＝-4.75+27.96x1-16.06x2-10.97x3-14.51x4+13.27x5+19.39x6-6.90x7+7.34x8-6.15x9-0.67x10+5.85x11；
y2＝-8.75+46.68x1-47.71x2-11.04x3-24.40x4+15.33x5+22.16x6-12.05x7+10.32x8-9.48x9+3.32x10+10.86x11；
其中x为自变量值，即步骤(4)获得的尺度分量标准谱的荧光强度；y是鱼毒性藻类或非鱼毒性藻类的分类函数值；
当检测样品时，分别计算y1和y2值，比较y1和y2值，若y1>y2，则该藻类为鱼毒性藻类，反之则为非鱼毒性藻类。
步骤(1)中所述的不同生长期为对数期、稳定期和衰亡期；
步骤(1)中所述的不同温度优选为15～30℃；更优选为15、25和30℃；
步骤(1)中所述的不同盐度中的氮磷比优选为(1～128)：1；更优选为1:1、16:1、128:1；
步骤(1)中所述的不同光照强度优选为20～100μmol m-2s-1；更优选为20、60和100μmolm-2s-1；
步骤(1)中所述的发射波长优选为650～675nm；
步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6.5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13.0进行Fisher判别，最后通过Origin8.0制图，得到荧光特征谱。
步骤(4)中所述的尺度分量标准谱库中与溶血活性值对应的标准谱，设定藻类的溶血活性>20Hu为强毒性，>10Hu，≤20Hu为中毒性，<10Hu为弱毒性。以此为基础，利用鱼毒性藻类Ca3-Ex与Ca3-Em联合光谱图中35～47数据点(波长λEx＝575～600nm；λEm＝650～675nm)建立藻类溶血活性低、中和高的Fisher判别函数：
Y1＝-63.914+221.28X1-500.26X2+384.15X3-308.08X4-244.55X5+536.80X6-224.65X7+745.07X8-706.21X9+4.20X10+188.60X11；
Y2＝-7.17+26.99X1-78.97X2+78.72X3-77.86X4-1.50X5+71.80X6-13.61X7+109.37X8-160.93X9+20.65X10+51.86X11；
Y3＝-29.60+269.10X1+28.48X2-366.60X3-42.28X4-4.50X5+288.46X6+58.94X7+106.06X8-314.22X9+71.22X10+40.75X11；
其中X为自变量值，即尺度分量标准谱的荧光强度；Y为测得的藻类溶血活性的分类函数值；
当检测样品时，分别计算Y1、Y2和Y3值，分别代表藻类溶血活性低、中和高的分类函数值，取大者为其Y，作为判别样品溶血活性高低的依据，如当Y3大于Y1和Y2时，则该样品为高溶血活性藻类；
所述的鱼毒性藻类优选为米氏凯伦藻(东海株)、海洋卡盾藻(香港株)、卵圆卡盾藻(香港株)、球形棕囊藻(汕头株)、赤潮异弯藻(东海株)、小定鞭藻双胞旋沟藻和剧毒卡尔藻等；
步骤(4)中所述的标准谱库包括6种有毒藻类的24条标准谱，30种对照组藻类113条标准谱，共137条Coif2小波尺度分量标准谱；
步骤(5)所述的Fisher判别优选通过SPSS13.0进行；
一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库，通过上述构建方法制备得到。
所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库在鉴别鱼毒性藻类上的应用。
本发明的原理：
溶血毒素是大多数鱼毒性赤潮藻类产生的一类毒素，被认为是引起鱼类死亡的重要原因之一，该毒素以鱼腮为靶器官，改变其细胞膜的通透性，从而造成鳃组织损伤，导致鱼类死亡。溶血毒素是藻类的次生代谢产物，主要为糖脂类、糖甙类、大环内酯类和多不饱和脂肪酸类化合物等。糖脂类是藻类光合作用的次级产物，受光合作用调控，虽然藻类溶血毒素的生物合成机制还不清楚，但从溶血毒素的光敏性及糖脂类在生物体内的生化作用方面考虑，其与藻类的光合系统存在一定的关联，通过了解藻类叶绿素光合作用的特征和变化，就可能对藻类是否产毒及其毒素活性的高低作出判别。三维荧光光谱能同时承载叶绿素的激发光谱、发射光谱和荧光强度，全面反应色素体特征及其生理变化，因此，可以通过对藻类三维荧光光谱的分析，了解鱼毒性藻类的三维荧光光谱特征，并以此识别赤潮水体中鱼毒性藻类和判断其溶血活性的高低。
多种环境因子(温度、盐度、光照强度等)和营养因子(可溶性氮、磷总量及比例等)可影响鱼毒性藻类的溶血活性和叶绿素三维荧光光谱，可通过对这些因子的调控，考察不同生长期的鱼毒性藻类和非鱼毒性藻类的三维荧光光谱变化和溶血活性的变化，揭示鱼毒性藻类的三维荧光光谱特征，并以此建立鱼毒性藻类三维荧光光谱库。从理论上讲，光谱库越丰富，其识别能力越强，但另一方面，数据越多，其运算处理也更复杂，影响Fisher判别函数的建立，因此，需要通过聚类分析等技术对该谱库进行优化，筛选出适量的具代表性的光谱，并以此构建鱼毒性藻类三维荧光光谱识别的标准光谱库。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过对我国典型的鱼毒性藻类在不同生长期和环境因子调控下的溶血活性与变化及叶绿素三维荧光光谱的研究，了解鱼毒性藻类的产毒特征性及其三维荧光光谱的特征变化；以多种类，大样本非鱼毒性藻类的叶绿素三位荧光光谱为对照，筛选三维荧光光谱分析和判别方法，提取与鱼毒性藻类及其溶血活性密切相关的荧光特征谱，通过聚类方法，筛选鱼毒性藻类和非鱼毒性藻类的三维荧光光谱库，并以此为基础，构建立高识别率的判别函数。与现有技术相比(“鱼毒性藻类及其溶血活性的三维荧光光谱识别研究”，桓清柳等，2013，光谱学与光谱分析，33(2)399-403)；“鱼毒性藻类溶血活性的三维荧光特征”，桓清柳等，2011，中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集)，本发明所用的鱼毒性藻类除米氏凯伦藻、海洋卡盾藻和卵圆卡盾藻外，还使用了我国沿海主要的鱼毒性藻类球形棕囊藻(汕头株)、赤潮异弯藻(东海株)和小定鞭藻，对照组增加了包括硅藻、甲藻和隐藻在内的30种无鱼毒性藻类，且考虑了不同环境条件各生长期藻类的三维荧光光谱及鱼毒性藻类溶血活性的变化，因而构建的光谱库更具代表性，以此为基础建立的鱼毒性藻类及其溶血活性判别函数也更具代表性，其判别结果也更加稳定、准确和可靠。
(2)本发明在现有技术的基础上，充分考虑了环境因子对藻类不同生长期的三维荧光光谱和藻类产毒能力的影响，通过调控对藻类生长和产毒的主要环境和营养因子，如光照强度、温度、氮和磷营养盐的浓度及比率，增加了鱼毒性藻类种类，并以30种无溶血活性的藻类为对照，确定鱼毒性藻类的三维荧光特征光谱为第35～47的数据点(波长λEm＝725～750nm；λEx＝400～425nm)(删除了第1～10个数据点(波长λEm＝650～680nm))，并利用聚类分析的方法，优化藻类三维荧光光谱库，从3000多条微藻三维荧光光谱中筛选出137条Coif2小波的尺度分量标准谱，并以此构建用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准谱库，运用该谱库，分别建立了识别鱼毒性藻类的Fisher判别函数和判别鱼毒性藻类溶血活性强弱的函数，前者对鱼毒性藻类和非鱼毒性藻类的判别正确率分别为83.3％和76.6％，对鱼毒性藻类溶血活高低的判别正确率分别为100％和75％，经对2011年10月28日～11月5日在珠海香洲海域赤潮现场采集的双胞旋沟藻(Cochlodinium geminamm)水体测定分析，并以兔血红细胞测定其溶血活性为对照，发现两者结果均显示该次赤潮为高鱼毒性赤潮。用同样2种方法对从东海海域分离的剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)进行分析，都证明该藻为鱼毒性藻类，但溶血活性较低，说明本方法对现场赤潮水体的鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的判别有很高的正确诊断识别作用，判别率达100％。鱼毒性藻类的溶血活性判别结果基本与实测结果相符合。
附图说明
图1是6种藻类CMHK、KMEC、PGEC、COHK、HAEC和PPEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a1为海洋卡盾藻(香港株)(CMHK)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a2为米氏凯伦藻(东海株)(KMEC)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a3为球形棕囊藻(汕头株)(PGEC)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a4为卵圆卡盾藻(香港株)(COHK)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a5为赤潮异弯藻(东海株)(HAEC)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a6为小定鞭藻(PPEC)的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图2是6种藻类ACEC、AJEC、ATEC、CCEC、CCMP40和CCMP42的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a7为ACEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a8为AJEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a9为ATEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a10为CCEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a11为CCMP40的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a12为CCMP42的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图3是6种藻类CCMP43、CDEC、CFEC、DFEC、DSEC和GCEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a13为CCMP43的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a14为CDEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a15为CFEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a16为DFEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a17为DSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a18为GCEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图4是6种藻类GSEC、HCEC、IGEC、NSEC、PDEC和PLEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a19为GSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a20为HCEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a21为IGEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a22为NSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a23为PDEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a24为PLEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图5是6种藻类PMEC、GIEC、NPEC、PSEC、PTEC和RSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a25为PMEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a26为GIEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a27为NPEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a28为PSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a29为PTEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a30为RSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图6是6种藻类SCEC、SGEC、SOEC、STEC、SYEC和TSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图；
其中，a31为SCEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a32为SGEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a33为SOEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a34为STEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a35为SYEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图，a36为TSEC的Coif2尺度分量识别特征谱的聚类图。
图7是由Coif2小波分解得到的6种藻类CMHK、KMEC、PGEC、COHK、HAEC和PPEC的尺度分量标准谱；
其中，A1为CMHK的尺度分量标准谱，A2为KMEC的尺度分量标准谱，A3为PGEC的尺度分量标准谱，A4为COHK的尺度分量标准谱，A5为HAEC的尺度分量标准谱，A6为PPEC的尺度分量标准谱。
图8是由Coif2小波分解得到的6种藻类STEC、CFEC、GSEC、TSEC、PMEC和PDEC的尺度分量标准谱；
其中，A7为STEC的尺度分量标准谱，A8为CFEC的尺度分量标准谱，A9为GSEC的尺度分量标准谱，A10为TSEC的尺度分量标准谱，A11为PMEC的尺度分量标准谱，A12为PDEC的尺度分量标准谱。
图9是由Coif2小波分解得到的6种藻类CCMP42、CCMP40、CCMP43、PTEC、GCEC和ACEC的尺度分量标准谱；
其中，A13为CCMP42的尺度分量标准谱，A14为CCMP40的尺度分量标准谱，A15为CCMP43的尺度分量标准谱，A16为PTEC的尺度分量标准谱，A17为GCEC的尺度分量标准谱，A18为ACEC的尺度分量标准谱。
图10是由Coif2小波分解得到的6种藻类DSEC、SYEC、HCEC、ATEC、GIEC和SOEC的尺度分量标准谱；
其中，A19为DSEC的尺度分量标准谱，A20为SYEC的尺度分量标准谱，A21为HCEC的尺度分量标准谱，A22为ATEC的尺度分量标准谱，A23为GIEC的尺度分量标准谱，A24为SOEC的尺度分量标准谱。
图11是由Coif2小波分解得到的6种藻类RSEC、DFEC、PSEC、NPEC、AJEC和SCEC的尺度分量标准谱；
其中，A25为RSEC的尺度分量标准谱，A26为DFEC的尺度分量标准谱，A27为PSEC的尺度分量标准谱，A28为NPEC的尺度分量标准谱，A29为AJEC的尺度分量标准谱，A30为SCEC的尺度分量标准谱。
图12是由Coif2小波分解得到的6种藻类CDEC、CCEC、IGEC、SGEC、PLEC和NSEC的尺度分量标准谱；
其中，A31为CDEC的尺度分量标准谱，A32为CCEC的尺度分量标准谱，A33为IGEC的尺度分量标准谱，A34为SGEC的尺度分量标准谱，A35为PLEC的尺度分量标准谱，A36为NSEC的尺度分量标准谱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下生物材料在文献“鱼毒性藻类及其溶血活性的三维荧光光谱识别研究.光谱学与光谱分析，2013,33(2)：399-403”中公开：米氏凯伦藻(东海株)(Karenia mikimotoi)、卵圆卡盾藻(香港株)(Chattonella ovata)、东海原甲藻(东海株)(Prorocentrum donghaiense)和锥状斯氏藻(东海株)(Scrippsiella trochoidea)。海洋卡盾藻(香港株)(Chattonella marina)在文献“海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离[J].生态科学,2008,27(6)：457-462”中公开。赤潮异弯藻(东海株)(Heterosigma akashiwo)在文献“东海赤潮异弯藻Heterosigmaakashiwo的形态特征及其分子序列分析[J].海洋学研究,2011,(3)”中公开。球形棕囊藻(汕头株)(Phaeoecystis globosa)在文献“实验室培养球形棕囊藻溶血毒素的提取分离及其生成特征[J].热带亚热带植物学报,2005,13(1):25-28”中公开。小定鞭藻(Prymnesium parvum)在文献“小定鞭藻毒素的分离与鉴定[J].水生生物学报，1996,1(20):42-48”中公开。以下生物材料在文献“基于色素荧光的浮游藻识别测定技术研究[D].中国海洋大学,2012”中公开：微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、利马原甲藻(Prorocentrum lima)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)、夜光藻(Noctiluca scintillans)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、日本星杆藻(Asterionella japonica)和聚球藻(Synechococcus sp.)。以下生物材料在文献“多小波在浮游植物群落组成荧光测定技术中的应用[D].中国海洋大学,2010”中公开：叉状角藻(Ceratium furca)和尖刺菱形藻(Nitzschia pungens)。以下生物材料在文献“链状亚历山大藻环境条件响应基因的筛选及我国北黄海海域微型藻的分离鉴定[D].中国海洋大学,2009”中公开：链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)和链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)。条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)在文献“温度和盐度对条纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)生长的影响”中公开。圆鳞异囊藻(Heterocapsacircularisquama)在文献“异囊藻赤潮生物及其对渔业的影响[J].河北渔业,2005,(2):15-16.”中公开。桂氏骨条藻(Skeletonema grevillei)在文献“厦门港骨条藻属Skeletonema(Bacillariophyta)物种多样性及周年变化的研究[D].中国科学院研究生院(海洋研究所),2012”中公开。以下生物材料在文献“温度和硅胁迫对三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum生长和脂肪酸组成的初步研究[D].中国海洋大学,2010”中公开：三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)。以下生物材料在文献“基于小波分析的东海浮游植物种类荧光光谱识别技术研究[D].中国海洋大学,2008”中公开：盐沼隐藻(Rhodomonas salina)和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)。亚心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis)在文献“亚心形四爿藻氢酶的稳定性及初步纯化[J].生物工程学报,2010,26(7):1003-1008”中公开。小等刺硅鞭藻(Dictyocha fibula Ehrenberg)在文献“烟台套子湾海域秋季浮游植物群落的初步研究[J].海洋通报,2011,30(4):425-429”中公开。双胞旋沟藻(Cochlodinium geminamm)在文献“广东珠海双胞旋沟藻Cochlodinium geminatum赤潮事件分析[J].热带海洋学报,2010,(1)”中公开。剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)在文献“东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析[J].植物学报,2011,(2)”中公开。栅藻(Scenedesmus sp.)在文献“产油藻株Scenedesmus sp胞外碳酸酐酶活性及光合作用活性的研究[J].可再生能源，2012,30(11).”中公开。隐藻(Cryptomonas sp.)在文献“磷、铁营养盐的交互作用对隐藻(Cryptomonas sp.)生长影响的初步研究[J].海洋科学进展,2006,(1):43-47.”中公开。隐藻(Cryptomonas sp.)CCMP40、隐藻(Cryptomonas sp.)CCMP42和隐藻(Cryptomonassp.)CCMP43均购自美国国家海洋藻种保藏中心。
实施例1
(1)分别培养6种鱼毒性藻类和30种非鱼毒性藻类(见表1)，CMHK和COHK分别由香港城市大学和香港渔农护理署提供，其它藻种均取自暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室。
表136种藻类的信息表
中文全称 英文全称 缩略词
东海原甲藻(东海株) Prorocentrum donghaiense PDEC
微小原甲藻 Prorocentrum minimum PMEC
利马原甲藻 Prorocentrum lima PLEC
叉状角藻 Ceratium furca CFEC
链状亚历山大藻 Alexandrium catenella ACEC
塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense ATEC
具刺膝沟藻 Gonyaulax spinifera GSEC
条纹环沟藻 Gyrodinium instriatum GIEC
锥状斯氏藻(东海株) Scrippsiella trochoidea STEC
夜光藻 Noctiluca scintillans NSEC
米氏凯伦藻(东海株)* Karenia mikimotoi KMEC
链状裸甲藻 Gymnodinium catenatum GCEC
圆鳞异囊藻 Heterocapsa circularisquama HCEC
柔弱角毛藻 Chaetoceros debilis CDEC
旋链角毛藻 Chaetoceros curvisetus CCEC
中肋骨条藻 Skeletonema costatum SCEC
桂氏骨条藻 Skeletonema grevillei SGEC
日本星杆藻 Asterionella japonica AJEC
尖刺菱形藻 Nitzschia pungens NPEC
三角褐指藻 Phaeodactylum tricornutum PTEC
海洋卡盾藻(香港株)* Chattonella marina CMHK
卵圆卡盾藻(香港株)* Chattonella ovata COHK
赤潮异弯藻(东海株)* Heterosigma akashiwo HAEC
小等刺硅鞭藻 Dictyocha fibula Ehrenberg DFEC
球等鞭金藻 Isochrysis galbana IGEC
球形棕囊藻(汕头株)* Phaeoecystis globosa PGEC
小定鞭藻* Prymnesium parvum PPEC
聚球藻 Synechococcus sp. SOEC
盐沼隐藻 Rhodomonas salina RSEC
隐藻 Cryptomonas sp. PSEC
隐藻 Cryptomonas sp. CCMP40
隐藻 Cryptomonas sp. CCMP42
隐藻 Cryptomonas sp. CCMP43
杜氏盐藻(盐生杜氏藻) Dunaliella salina DSEC
亚心形四爿藻 Tetraselmis subcordiformis TSEC
栅藻 Scenedesmus sp. SYEC
*表示鱼毒性藻类
①培养基的制备：先将自然海水用0.45μm微孔滤膜过滤，收集1.2L滤液于2L锥形瓶中，121℃、15psi下灭菌25min，冷却到室温，然后加入f/2培养液改良配方(如表2所示)，根据下表得到的培养基铁离子浓度为1×10-5mol/L。
表2f/2培养基
表3f/2微量元素储备液
表4f/2维生素储备液
②培养条件：实验藻类(表1)在室内温度25℃恒温条件下以f/2培养基培养，所有藻种培养条件相同。取对数生长末期的藻类，用0.1mL浮游植物计数框进行藻细胞计数并计算细胞浓度，接种后的初始浓度为约2000个细胞/mL，进行藻类生长的单因子调控实验(表5，6，7)。分三组，每组三个平行，同时测定藻类的溶血毒素活性及叶绿素三维荧光光谱。置于人工气候箱中培养18天，光暗循环为L:D＝12:12。
表5不同温度下藻类的生长调控实验
温度(℃) 光照(μmol m-2s-1) 营养盐的氮磷比*
1 15 60 16:1
2 25 60 16:1
3 30 60 16:1
*浓度缩小5倍的f/2培养基
表6不同光照下藻类的生长调控实验
光照(μmol m-2s-1) 温度(℃) 营养盐的氮磷比*
1 20 25 16:1
2 60 25 16:1
3 100 25 16:1
*浓度缩小5倍的f/2培养基
表7不同氮磷限制下藻类生长的调控实验
营养盐氮磷比* 温度(℃) 光照(μmol m-2s-1)
1 1:1 25 60
2 16:1 25 60
3 128:1 25 60
*浓度缩小5倍的f/2培养基
(2)提取溶血毒素以及测定：取不同培养阶段，根据不同藻类的生长期不同【对数期(培养第4～29天)、稳定期(培养第12～30天)以及衰亡期】的藻细胞，按如下方法抽提溶血毒素：藻液经3000×g离心10min后收集藻细胞(尽量吸干水分)，用甲醇(甲醇用量为藻液体积的1/1000)重新悬浮藻细胞，冰浴条件下超声波细胞破碎(破碎条件：开2s，关1s，共10min，超声频率20KHz)获得藻细胞破碎液。将细胞破碎液通过循环水式多用途真空泵和旋转蒸发仪，真空干燥成固体状后溶解于适量的甲醇中(甲醇体积用量为藻液体积的1/1000)，然后10000g离心10min，上清即为甲醇提取的粗溶血毒素溶液，4℃下贮存备用。
采用的洋地黄皂甙(digitonin)溶血活性测定方法。洋地黄皂甙作为溶血毒素的标准物测定藻细胞中的溶血毒素活性。配制10.0μg/mL的标准洋地黄皂甙水溶液，如表8所示，向8个试管中加入柠檬酸等渗盐溶液(氯化钠1.706g，柠檬酸钠4.336g，葡萄糖9.036g用蒸馏水溶解，柠檬酸调pH至7.0，定容至500mL)、体积百分比0.5％的兔血红细胞溶液以及洋地黄皂甙水溶液，使6个试管中的洋地黄皂甙的浓度分别为0.5，0.75，1.00，1.25，1.5，1.75μg/mL。
表8溶血活性标准曲线梯度配制表
1 2 3 4 5 6
0.5％的兔血红细胞溶液(mL) 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6
10.0μg/mL的洋地黄等渗液(mL) 0.1 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
柠檬酸等渗盐溶液(pH7.0)(mL) 0.3 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05
最终浓度(μg/mL) 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 1.75
将各2mL实验体系于37℃水浴30min后，3000×g离心5min，上清液用Shimadzu UV-1206型分光光度计在波长540nm处测定其吸光度值，即溶血透光度。每个浓度3个平行，以甲醇溶液为负对照，以全溶血溶液为正对照。以洋地黄皂甙水溶液的终浓度为横坐标，以溶血百分数为纵坐标作图，得到标准曲线。1个溶血单位(1HU)是指在2mL上述实验体系中(含溶血毒素、兔血红细胞溶液和等渗盐溶液的混合溶液)使兔血红细胞溶解50％所需溶血毒素的剂量浓度。
向离心管中加入1.6mL体积百分比0.5％的兔血红细胞溶液、0.30mL柠檬酸等渗盐缓冲液，然后加入甲醇提取的粗溶血毒素溶液0.10mL至2mL实验体系，于37℃水浴30min，离心取上清液用Shimadzu UV-1206型分光光度计检测其吸光度值OD540nm。每个浓度3个平行，以甲醇溶液为负对照，以全溶血溶液为正对照。根据洋地黄皂甙的标准曲线，换算其溶血百分数。该溶血毒素的溶血活性按照每个藻细胞的溶血活性(HU/cell)和每升培养液的溶血活性(HU/L)计算。
溶血活性的计算方程为：
Hu = A w - A b A c &times; 100 - b a &times; EC 50 &times; 20
Hu--------溶血活性(Hu/L)；
Aw--------样品的吸光度值；
Ab--------阴性对照的吸光度值；
Ac--------阳性对照的吸光度值；
EC50-----半溶血时的洋地黄皂苷浓度；
a---------标准曲线的斜率；
b---------标准曲线的截距；
20--------反应体系为2mL，而测定的样品为0.1mL，所以要乘20。
同一个样品三个平行样检测时，相对标准偏差为10％。
(3)藻细胞的荧光测定：
扫描仪器为F4600荧光分光光度计(日立公司Hitachi)，在测藻细胞溶血毒素的同时，检测藻类的三维荧光(分析条件：激发和发射狭缝为10nm，扫描速度30000nm/s；激发波长的扫描范围为400～600nm，扫描间隔为5nm；发射波长的扫描范围为650～750nm扫描间隔为5nm)。为抑制噪音干扰，每个样平行测定三次，取平均值作为该样品的荧光光谱。
数据分析利用Matlab6.5，Spss13.0及Origin8.0。首先将仪器扫描所得的三维荧光光谱转换成TXT文件数据格式，每个三维光谱由一个21行11列的二维矩阵表示。根据Delaunay三角形方法，通过Matlab6.5软件消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射。将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱。结果显示米氏凯伦藻(东海株)、海洋卡盾藻(香港株)、卵圆卡盾藻(香港株)、球形棕囊藻(汕头株)、赤潮异弯藻(东海株)或小定鞭藻的荧光光谱强度变化主要集中在λEx＝575～600nm，波长λEm＝650～675nm(如图1所示，横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度，其中1～40数据点代表发射波长650～750nm，41～79数据点代表激发波长400～600nm)；而对照组的30种非鱼毒性藻类在上述波长范围内荧光强度无明显变化(见图2～图6)。
本发明通过对鱼毒性藻类在不同生长期(对数期、稳定期和衰亡期)和环境因子(光照、温度和氮磷限制)调控下的溶血活性变化及叶绿素三维荧光光谱的研究，了解鱼毒性藻类的产毒特征及其三维荧光光谱的变化；以多种类，大样本非鱼毒性藻类的叶绿素三位荧光光谱为对照，筛选三维荧光光谱分析和判别方法，提取与鱼毒性藻类及其溶血活性密切相关的荧光特征谱，建立高识别率的判别函数；
根据鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的联合荧光特征谱，发现鱼毒性藻类的荧光强度在35～47数据点(波长λEx＝575～600nm；λEm＝650～675nm)随溶血活性的改变而发生明显的变化，而非鱼毒性藻类的荧光强度在此波段变化不明显，故将此波段作为识别鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类及鱼毒性藻类单个细胞溶血活性高低的特征谱。
(4)采用系统聚类法对步骤(3)中得到的荧光特征谱进行聚类分析，获得尺度分量标准谱，组成藻类的Coif2小波尺度分量标准谱库；
为准确的表达鱼毒性藻类的荧光特征，并获得鱼毒性藻类具有特征代表性的标准谱，本发明发采用系统聚类法对每种藻类在不同培养条件下获得的测试集样本的所有尺度分量荧光特征谱进行聚类分析。特征谱相似度衡量标准采用欧氏距离。根据藻类荧光特征谱受到光照、温度、营养盐及生长期的影响，可以将荧光特征谱聚为不同的类别，然后取每一类中的平均特征谱作为该种藻类的一条标准谱。由此可以确定每一种藻类的荧光特征标准谱及其数目。由于在不同环境条件下生长的藻类荧光光谱存在较大差异，故聚类分析所得的特征谱数均不少于一条。当藻类的荧光特征谱因存在取样或测量等误差时，以相近的特征谱作为补充，这样就不会造成藻类特征谱的缺失。在聚类分析过程中，为了消除不同藻类特征谱间的强度差异，对每条特征谱都作了最大值归一化处理。
对由Coif2小波分解得到的藻类识别特征谱进行聚类分析。从CMHK的尺度分量特征谱的聚类结果(见图1-a1)可以看出，图中Y轴的第1-21分别表示不同条件下(见表9)海洋卡盾藻香港株的识别特征谱。其中“1”表示在对数期，15℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例为16:1；“2”表示在对数期，25℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例16:1；“3”表示在对数期，30℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例16:1，以此类推(见表9)。按照上述分类标准，可以将特征谱分为5类。其中第3，19，11，20，6条谱为第一类，第17，10条谱归为第二类，第18，12条谱为第三类，第1，7条谱为第四类，剩余的为第五类。这样CMHK可以得到5条标准谱(见图7-A1)。
如图1-a2所示，KMEC的第一类、第三类及第七类均只有一条谱，分别为第21条、第3条谱及第19条谱(分别属于25℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例为128:1培养下的衰亡期的测量谱，30℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例为16:1培养下的对数期的测量谱及25℃，光照60μmol m-2s-1，营养盐比例为128:1培养下的稳定期的测量谱)，而分别与它们相同第6、13条、第17、20条及第1、2条谱均能很好的聚为一类，所以，这两条谱为测量异常谱，应该予以去除，这样KMEC可以得到5条标准谱(见图7-A2)。
PGEC在聚类过程中(见图1-a3)，第3，7，10，11，12，14，16，20条谱均各自聚为一类，可能由于培养液浓度过低或测量异常而产生多条异常谱，去除这些异常谱后，PGEC可得到4条标准谱(见图7-A3)。同时COHK也得到4条标准谱(见图1-a4、图7-A4)，其中9，18，20为异常谱应予以去除。一般而言，生长期、光照及温度稳定性越高且与其它藻类荧光特征差异越大的藻类所需的标准谱的数目越少。HAEC与PPEC均得到三条标准谱(见图1-a5、a6，图7-A5、A6)，说明赤潮异弯藻(东海株)与小定鞭藻的荧光稳定性较高。
在30种无溶血活性的鱼毒性藻类的标准谱库中，STEC的荧光稳定性最强，从聚类分析图(图6-a34)中可以看出得到2条标准谱(见图8-A7)，CFEC得到2条标准谱(见图3-a15、图8-A8)。PDEC(图4-a23、图8-A12)，PTEC(图5-a29、图9-A16)，PSEC(图5-a28、图11-A27)，NPEC(图5-a27、图11-A28)，PLEC(图4-a24、图12-A35)，AJEC(图2-a8、图11-A29)，DSEC(图3-a17、图10-A19)，HCEC(图4-a20、图10-A21)，CDEC(图3-a14、图12-A31)，RSEC(图5-a30、图11-A25)，SGEC(图6-a32、图12-A34)均得到3条标准谱。NSEC(图4-a22、图12-A36)，IGEC(图4-a21、图12-A33)，PMEC(图5-a25、图8-A11)，SCEC(图6-a31、图11-A30)，DFEC(图3-a16、图11-A26)，SOEC(图6-a33、图10-A24)，SYEC(图6-a35、图10-A20)，CCMP42(图2-a12、图9-A13)和GSEC(图4-a19、图8-A9)均得到4条标准谱，TSEC(图6-a36、图8-A10)，CCMP40(图2-a11、图9-A14)，CCMP43(图3-a13、图9-A15)，GCEC(图3-a18、图9-A17)，ACEC(图2-a7、图9-A18)，ATEC(图2-a9、图10-A22)，GIEC(图5-a26、图10-A23)和CCEC(图2-a10、图12-A32)均得到5条标准谱。
6种有毒藻类得到24条标准谱，30种对照组藻类113条标准谱，共获得137条尺度分量标准谱，分别组成这些藻的Coif2小波尺度分量标准谱库。根据具溶血活性的鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的标准谱库，找出鱼毒性藻类特有的特征谱，从而判别出鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类。所获得的各种藻类的Coif2小波尺度分量荧光标准谱如图7～图12所示。
表9与标准谱对应的藻类培养条件
组 温度(℃) 光照(μmol m-2s-1) 氮磷限制(氮磷比) 生长期
1 15 60 16:1 对数期
2 25 60 16:1 对数期
3 30 60 16:1 对数期
4 25 20 16:1 对数期
5 25 100 16:1 对数期
6 25 60 1:1 对数期
7 25 60 128:1 稳定期
8 15 60 16:1 稳定期
9 25 60 16:1 稳定期
10 30 60 16:1 稳定期
11 25 20 16:1 稳定期
12 25 100 16:1 稳定期
13 25 60 1:1 稳定期
14 25 60 128:1 稳定期
15 15 60 16:1 衰亡期
16 25 60 16:1 衰亡期
17 30 60 16:1 衰亡期
18 25 20 16:1 衰亡期
19 25 100 16:1 衰亡期
20 25 60 1:1 衰亡期
21 25 60 128:1 衰亡期
(5)步骤(4)的6种鱼毒藻类及30种非鱼毒藻类获得的137条Coif2小波的尺度分量标准谱。根据鱼毒性藻类的荧光强度在35～47数据点(波长λEx＝575～600nm；λEm＝650～675nm)随溶血活性的改变而发生明显的变化，而非鱼毒性藻类的荧光强度在此波段无明显变化的特点，以此波段作为识别两者的特征谱。利用137条标准谱进行Fisher判别，得鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的Fisher判别函数：
y1＝-4.75+27.96x1-16.06x2-10.97x3-14.51x4+13.27x5+19.39x6-6.90x7+7.34x8-6.15x9-0.67x10+5.85x11；
y2＝-8.75+46.68x1-47.71x2-11.04x3-24.40x4+15.33x5+22.16x6-12.05x7+10.32x8-9.48x9+3.32x10+10.86x11；
式中x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10和x11分别代表数据点35，36，37，38，39，40，42，43，44，45和47的相对荧光强度，y1和y2分别代表鱼毒性藻类和非鱼毒性藻类的分类函数值。经F检验，显著性水平(91，5525.92)<0.10，组间差异显著。经Wilk’s Lambda检验，上两式判别函数的显著性水平p<0.05。以上式分别计算藻液样品的函数值，当y1>y2时，该藻类判为鱼毒性藻类，反之，为非鱼毒性藻类。随机选取平行样测试集中的135份样本进行判别检验表明，鱼毒性藻类的判别正确率为83.3％，非鱼毒性藻类的判别正确率为76.6％。
表10鱼毒性藻类与非鱼毒性藻类的分类结果
(6)步骤(4)得到的标准谱库与溶血活性值对应的24条谱，设定藻类的溶血活性>20Hu为强毒性，>10Hu，≤20Hu为中毒性，<10Hu为弱毒性。以此为基础，利用六种鱼毒性藻类Ca3-Ex与Ca3-Em联合光谱图中35～47数据点(波长λEx＝575～600nm；λEm＝650～675nm)建立藻类溶血活性低、中和高的Fisher判别函数：
Y1＝-63.914+221.28X1-500.26X2+384.15X3-308.08X4-244.55X5+536.80X6-224.65X7+745.07X8-706.21X9+4.20X10+188.60X11；
Y2＝-7.17+26.99X1-78.97X2+78.72X3-77.86X4-1.50X5+71.80X6-13.61X7+109.37X8-160.93X9+20.65X10+51.86X11；
Y3＝-29.60+269.10X1+28.48X2-366.60X3-42.28X4-4.50X5+288.46X6+58.94X7+106.06X8-314.22X9+71.22X10+40.75X11；
式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9和X10分别代表数据点35，36，37，38，39，40，42，43，44，45和47的相对荧光强度；Y1、Y2、Y3分别代表藻类溶血活性的低、中和高的分类函数值。经F检验，显著性水平(45，4361)<0.10，组间差异显著。经Wilk’sLambda检验，上三式判别函数的显著性水平p<0.05。利用上述Fisher判别函数分别计算出藻液样品的函数值后，比较各函数值，函数值最大者即为所属分类。随机选取平行样测试集8份低溶血活性(<10Hu)、8份中等溶血活性(>10Hu,≤20Hu)和8份高溶血活性(>20Hu)共24份样本进行判别检验。结果显示，溶血活性低、中和高的判别正确率分别为75.0％、27.5％和100％。
表11六种鱼毒性藻类溶血活性的分类结果
应用实施例1
根据实施例1得到的标准图谱库和Fisher判别函数对鱼毒性藻类进行验证。
试验藻类为双胞旋沟藻(Cochlodinium geminamm)(已在文献“欧林坚,张玉宇,李扬等.广东珠海双胞旋沟藻Cochlodinium geminatum赤潮事件分析[J].热带海洋学报,2010,(1).”中公开)为鱼毒性藻类，毒性范围为>20Hu，在设定范围内属于高毒性。
利用Coif2小波分析后获取双胞旋沟藻的相对荧光值并以此进行鱼毒性与非鱼毒性判别，第一，第三，第五天获取特征谱对应的数据点35，36，37，38，39，40，42，43，44，45，47所对应的数值分别为第一天：35(0.0515)，36(0.0530)，37(0.0463)，38(0.0522)，39(0.1501)，40(0.1806)，42(0.1767)，43(0.1703)，44(0.1604),45(0.1786)，47(0.1229)；第三天：35(0.0982)，36(0.0948)，37(0.0925)，38(0.0928)，39(0.2105)，40(0.2521)，42(0.2456)，43(0.2428)，44(0.2416),45(0.2376)，47(0.2395)；第五天：35(0.4822)，36(0.4828)，37(0.4820)，38(0.4782)，39(0.6221)，40(0.6241)，42(0.6442)，43(0.6492)，44(0.7372),45(0.4811)，47(0.7298)。将上述数值分别代入方程y1和方程y2，第一天得到y1＝0.289；y2＝-4.581；同理，第三天得到y1＝1.655；y2＝-2.52；第五天y1＝8.842；y2＝-1.487。由于第一，第三，第五天所得结果y1均大于y2，可判定双胞旋沟藻为具溶血活性的鱼毒性藻类。
同理，经Coif2小波分析后获取的数据对鱼毒性藻类溶血活性高低进行判别，第一，第三，第五天测得的荧光光谱经Coif2小波分解后，数据点35，36，37，38，39，40，42，43，44，45，47对应的数据分别为第一天：35(0.0515)，36(0.0530)，37(0.0463)，38(0.0522)，39(0.1501)，40(0.1806)，42(0.1767)，43(0.1703)，44(0.1604)，45(0.1786)，47(0.1229)；第三天：35(0.0982)，36(0.0948)，37(0.0925)，38(0.0928)，39(0.2105)，40(0.2521)，42(0.2456)，43(0.2428)，44(0.2416),45(0.2376)，47(0.2395)；第五天：35(0.4822)，36(0.4828)，37(0.4820)，38(0.4782)，39(0.6221)，40(0.6241)，42(0.6442)，43(0.6492)，44(0.7372)，45(0.4811)，47(0.7298)。
将上述数值代入方程Y1、方程Y2和方程Y3，得到第一天Y1＝-17.261；Y2＝2.826；Y3＝64.209；第三天Y1＝5.286；Y2＝7.494；Y3＝23.615；第五天Y1＝-19.997；Y2＝3.685；Y3＝33.403。所得结果显示，Y3>Y2>Y1，可初步判断双胞旋沟藻溶血活性为高毒性。
应用实施例2
根据实施例1得到的标准图谱库和Fisher判别函数对鱼毒性藻类进行验证。
试验藻类为剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum，KVEC)(已在文献“王红霞,陆斗定,黄海燕等.东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析[J].植物学报,2011,(2).”中公开；)，由国家海洋局第二海洋研究所陆定斗教授提供，为鱼毒性藻类，毒性范围为>10Hu，≤20Hu，在设定范围内属于中毒性。
该藻三维荧光光谱经Coif2小波分析后，获取第一，第三，第五天特征谱对应的数据点35，36，37，38，39，40，42，43，44，45，47所对应的荧光值，分别为第一天：35(0.7435)，36(0.7724)，37(0.7581)，38(0.7738)，39(0.5585)，40(0.4812)，42(0.5367)，43(0.5332)，44(0.6218)，45(0.4454)，47(0.8070)；第三天：35(0.3601)，36(0.3997)，37(0.3658)，38(0.4076)，39(0.3112)，40(0.3016)，42(0.3131)，43(0.3236)，44(0.3660)，45(0.3181)，47(0.5629)；第五天：35(0.8453)，36(0.8208)，37(0.8282)，38(0.8083)，39(0.5846)，40(0.6192)，42(0.6326)，43(0.6359)，44(0.6982)，45(0.5618)，47(0.9745)。
将上述数值分别带入方程y1和方程y1，获得第一天y1＝1.64；y2＝-15,536；，第三天y1＝5.908；y2＝-10.274；第五天y1＝16.293；y2＝-9.899。由第一，第三，第五天所得结果可知y1>y2，可初步判定剧毒卡尔藻为鱼毒性藻类。
将上述数值带入方程Y1、方程Y2和方程Y3，获得第一天Y1＝-119.583；Y2＝-12.964；Y3＝-24.459；第三天Y1＝-29.821；Y2＝-69.03；Y3＝18.544；第五天Y1＝-4.136；Y2＝7.386；Y3＝-5.010。判定结果为中、高、中，故该藻溶血活性应为中高毒，与实测结果基本一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品在不同生长期、不同温度、不同盐度和不同光照强度调控下的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；
(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；
(3)在波长λEx＝575～600nm，波长λEm＝650～675nm出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在λEx＝575～600nm，波长λEm＝650～675nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；
(4)采用系统聚类法对步骤(2)中得到的荧光特征谱进行聚类分析，获得尺度分量标准谱，组成藻类的Coif2小波尺度分量标准谱库，即得到用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库。
2.根据权利要求1所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：还包括如下步骤：
(5)将步骤(4)得到的尺度分量标准谱库进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为：
y1＝-4.75+27.96x1-16.06x2-10.97x3-14.51x4+13.27x5+19.39x6-6.90x7+7.34x8-6.15x9-0.67x10+5.85x11；
y2＝-8.75+46.68x1-47.71x2-11.04x3-24.40x4+15.33x5+22.16x6-12.05x7+10.32x8-9.48x9+3.32x10+10.86x11；
其中x为自变量值，即步骤(4)获得的尺度分量标准谱的荧光强度；y是鱼毒性藻类或非鱼毒性藻类的分类函数值；
当检测样品时，分别计算y1和y2值，比较y1和y2值，若y1>y2，则该藻类为鱼毒性藻类，反之则为非鱼毒性藻类。
3.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的尺度分量标准谱库中与溶血活性值对应的标准谱，利用鱼毒性藻类Ca3-Ex与Ca3-Em联合光谱图中35～47数据点建立藻类溶血活性低、中和高的Fisher判别函数：
Y1＝-63.914+221.28X1-500.26X2+384.15X3-308.08X4-244.55X5+536.80X6-224.65X7+745.07X8-706.21X9+4.20X10+188.60X11；
Y2＝-7.17+26.99X1-78.97X2+78.72X3-77.86X4-1.50X5+71.80X6-13.61X7+109.37X8-160.93X9+20.65X10+51.86X11；
Y3＝-29.60+269.10X1+28.48X2-366.60X3-42.28X4-4.50X5+288.46X6+58.94X7+106.06X8-314.22X9+71.22X10+40.75X11；
其中X为自变量值，即尺度分量标准谱的荧光强度；Y为测得的藻类溶血活性的分类函数值；
当检测样品时，分别计算Y1、Y2和Y3值，分别代表藻类溶血活性低、中和高的分类函数值，取大者为其Y，作为判别样品溶血活性高低的依据；
所述的35～47数据点的波长为λEx＝575～600nm，λEm＝650～675nm。
4.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的不同生长期为对数期、稳定期和衰亡期。
5.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的不同温度为15～30℃；
步骤(1)中所述的不同盐度中的氮磷比为(1～128)：1；
步骤(1)中所述的不同光照强度为20～100μmol m-2s-1。
6.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的发射波长为650～675nm。
7.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6.5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13.0进行Fisher判别，最后通过Origin8.0制图，得到荧光特征谱。
8.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(5)所述的Fisher判别通过SPSS13.0进行。
9.根据权利要求1或2所述的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库的构建方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的标准谱库包括6种有毒藻类的24条标准谱，30种对照组藻类113条标准谱，共137条Coif2小波尺度分量标准谱。
10.通过权利要求1～9任一项所述的构建方法得到的用于识别鱼毒性藻类的三维荧光标准光谱库在在鉴别鱼毒性藻类上的应用。
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