CN111912824A - 三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用 - Google Patents

三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。本发明通过提取产PSP藻类和不产PSP藻类在不同环境条件下生长的三维荧光光谱信息，运用Coif2小波函数提取实验藻类的特征峰，再用系统聚类法进行聚类分析，剔除异常谱，筛选标准谱，得到Coif2荧光特征标准谱库，依据该荧光特征标准谱库建立的判别函数对产PSP藻类和不产PSP藻类判别，判别正确率分别为77.3％和84.5％，正确率很高，基本实现了对产毒藻快速准确识别的目的。本发明首次提供了三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用的研究成果，其可应用于赤潮藻类识别传感器或便携式藻类荧光识别仪等方面。

Description

三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用
技术领域
本发明属于有毒微藻识别防治领域，具体涉及三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。
背景技术
赤潮是指水中的微生物由于水体环境及气候等原因大量繁殖导致水体变色的现象。近些年我国沿海的赤潮发生次数及面积有持续增加的趋势，经济损失严重。
根据赤潮的毒性特点，通常把赤潮分为三类，分别为无毒赤潮、鱼毒性赤潮和有毒赤潮。三类赤潮中，无毒赤潮发生的比例最高，这类赤潮不产毒素，鱼毒性赤潮产生的毒素只对鱼类造成影响，海洋中的其它生物通常不会对其富集，而有毒赤潮产生的毒素可以通过生物富集作用在贝类体内积累，人或其它动物因误食染毒的贝类而对健康造成危害。有毒赤潮主要由产毒的浮游或底栖的藻类形成，近年来，在我国的东海和长江口，多次发生有毒藻赤潮，近岸海产贝类的食用安全风险增加。
有毒赤潮产生的毒素主要有麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)、腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)、记忆缺失性贝毒(AmnesicShellfish Poisoning，ASP)、神经性贝毒(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)和西加鱼毒(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)等。
在所有的赤潮毒素中，麻痹性贝毒由于其分布广，毒性强而成为危害最大的生物毒素之一。产麻痹性贝毒的藻类主要集中在甲藻门，如膝沟藻属(Gonyaulax)、亚历山大藻属(Alexandrium)、裸甲藻属(Gymnodinium)。除了甲藻之外，其它门类的少数藻类也可以产PSP，如淡水藻中的蓝绿藻属，红藻和一些细菌。亚历山大藻属中的塔玛亚历山大藻(A.tamarense)、链状亚历山大藻(A.catenella)、微小亚历山大藻(A.minutum)是我国沿海产PSP的主要藻类。
麻痹性贝毒主要指石房蛤毒素(Sxatioxin，STX)及其衍生物，是一类小分子化合物，至今已经发现的麻痹性贝毒毒素成分已有57种。麻痹性贝毒为碱性极性化合物，易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于非极性溶剂。
已有一些检测PSP的方法，如生物检测法、免疫法、化学分析法，但这些方法存在准确性、灵敏性、重复性差的缺陷或需大型昂贵设备和专业操作人员及样品前处理复杂、时效性差等问题，无法在贝类毒素监测和管理中广泛应用。此外，目前还没有一种可用于产PSP藻活体细胞的毒性检测技术，严重制约贝类毒素的现场管理。
发明内容
本发明的首要目的在于提供三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库及其构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：发明人前期的研究表明，三维荧光光谱法能用于识别鱼毒性藻类，但是鱼毒性藻类产生的毒素为脂溶性物质，大多具有溶血活性，对鱼类和贝类有较强毒性，可导致大量鱼类和贝类死亡，而麻痹性贝类毒素为水溶性的四氢嘌呤类极性化合物，可阻塞神经细胞钠离子通道，具神经毒性，对人类生命健康有害但对贝类生长影响甚微。用于识别鱼毒性藻类的三维荧光光谱法无法识别产麻痹性贝类毒素微藻。发明人在经过不断摸索实验，发现三维荧光光谱法能用于识别产麻痹性贝类毒素微藻，从而得到如下发明成果：三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。
所述的三维荧光光谱法是通过分析产麻痹性贝类毒素的藻类和不产麻痹性贝类毒素的藻类在不同环境和生长期的三维荧光光谱信息，得到产麻痹性贝类毒素的藻类和不产麻痹性贝类毒素的藻类的荧光特征标准谱库；通过荧光特征标准谱库进行判别，得到产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数Y1和非产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数Y2；使用函数对未知藻判别时，若Y1>Y2，则该样品为产麻痹性贝毒藻类；若Y1<Y2，则该样品为不产麻痹性贝毒藻类。
所述的判别优选为fisher判别。
所述的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数优选如下：
Y1＝-46.386-42.689X1+29.633X2+38.062X3-23.566X4+18.515X5-62.314X6+113.554X7-21.858X8-82.376X9+80.203X10-77.093X11+1.300X12-58.742X13+120.682X14+83.833X15-39.123X16；
所述的不产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数优选如下：
Y2＝-44.176-76.571X1+1.686X2+90.317X3-5.525X4+6.664X5-36.751X6+110.785X7-29.284X8-81.617X9+80.310X10-126.495X11+23.164X12-26.276X13+101.033X14+68.028X15-40.200X16；
其中，X1-X16分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、22、45数据点的相对荧光强度值。
一种用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库，是通过上述应用构建得到，构建步骤如下：提取产麻痹性贝毒的藻类和不产麻痹性贝毒的藻类在不同环境条件(温度、光照强度、盐度)各生长期的三维荧光光谱信息，运用Coif 2小波函数提取实验藻类的荧光特征谱，再用系统聚类法进行聚类分析，筛选出具代表性的标准谱，得到用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库；构建步骤优选具体如下：
(1)测定微藻在不同温度、盐度和光照强度下各生长期的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到微藻细胞的三维荧光数据；其中，微藻包括产麻痹性贝毒微藻和不产麻痹性贝毒微藻；
(2)将步骤(1)获得的微藻细胞的三维荧光数据转换成TXT文件格式，采用Delaunay三角内插值法消除三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif 2小波分析，选取荧光特征谱；
(3)使用系统聚类法对经过步骤(2)处理后的藻类所有荧光光谱进行聚类分析，筛选具代表性的光谱，得到用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库。
步骤(1)中所述的生长期包括对数期、稳定期和衰亡期。
步骤(1)中所述的产麻痹性贝毒微藻的株数优选为5种(株)以上。
所述的产麻痹性贝毒微藻优选为微小亚历山大藻(Alexandrium minimum,台湾株)AMSY、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，大亚湾株)ATDY、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum，防城巷株)GCFC、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，香港株)ATHK和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella，南海株)ACSY。这些藻种经HPLC分析检测出PSP毒素。
步骤(1)中所述的不产麻痹性贝毒微藻的株数优选为21种(株)以上。
所述的不产麻痹性贝毒微藻优选为塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ1、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)PDCZ、利马原甲藻(Prorocentrum lima)PLCZ、利马原甲藻(Prorocentrum lima)PLCZ1、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)KMCZ、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)GCCZ、血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)ASCZ、杜氏盐藻(Dunaliella salina)DSCZ、亚心形爿藻(Platymonas subcordiformis)PSCZ、聚球藻(Synechococcus sp)SYCZ、黄绿等鞭金藻(Dictyocha galbana)IGCZ、海洋卡盾藻(Chattonella marina)CMHK、卵圆卡盾藻(Chattonella ovata)COHK、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)HACZ、小定鞭藻(Phaeocystis parvum)PPCZ、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)CDCZ、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)SCCZ、日本星杆藻(Asterionella japonica)AJCZ、尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschia pungens)PP1CZ、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)PTCZ。这些藻种经HPLC分析未检测出PSP毒素。
步骤(1)中所述的三维荧光数据优选为通过使用荧光分光光度计扫描获得，激发波长范围为400～600nm，发射波长范围为650～750nm，步长设置为5nm，狭缝宽度设置为10nm，扫描速度设置为30000nm/s，信号积分时间为0.004s，生长期隔天测一次。
步骤(1)中所述的光照强度优选为60μmol m-2s-1、120μmol m-2s-1和200μmol m-2s-1。
步骤(1)中所述的温度优选为16℃、22℃、28℃。
步骤(1)中所述的盐度优选为25‰、30‰、35‰。
步骤(2)中所述的采用Delaunay三角内插值法消除三维荧光光谱的瑞利散射优选通过metlab处理软件实现。
步骤(2)中所述的最大归一化的处理方法如下：
X*＝[Xn-Xmin]/[Xmax-Xmin]；
Xn：各个频点的荧光强度；
Xmax：荧光强度最大值；
Xmin：荧光强度最小值；
X*：归一化所得荧光光谱的相对强度值。
步骤(2)中所述的Coif 2小波分析优选通过metlab处理软件实现。
步骤(2)中所述的荧光特征谱优选为使用第4尺度分量的藻类荧光特征谱。
步骤(3)中所述的系统聚类法采用的聚类标准为5。
步骤(3)中所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库中的荧光特征标准谱优选为80条，其中产麻痹性贝类毒素微藻的荧光特征标准谱为22条。
所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用，优选具体包括如下步骤：
(A)依据所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif2荧光特征标准谱库建立判别函数，得到的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数设置为Y1，得到的不产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数设置为Y2；
(B)对未知藻类样本判别时，若Y1>Y2，则该未知藻为产麻痹性贝毒的微藻；若Y1<Y2，则该未知藻为不产麻痹性贝毒的微藻。
所述的判别函数是将所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif2荧光特征标准谱库中的荧光特征标准谱导入统计软件进行判别分析，用fisher判别法构建判别函数。
所述的统计软件优选为SPSS 19.0。
所述的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数优选如下：
Y1＝-46.386-42.689X1+29.633X2+38.062X3-23.566X4+18.515X5-62.314X6+113.554X7-21.858X8-82.376X9+80.203X10-77.093X11+1.300X12-58.742X13+120.682X14+83.833X15-39.123X16；
所述的不产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数优选如下：
Y2＝-44.176-76.571X1+1.686X2+90.317X3-5.525X4+6.664X5-36.751X6+110.785X7-29.284X8-81.617X9+80.310X10-126.495X11+23.164X12-26.276X13+101.033X14+68.028X15-40.200X16；
其中，X1-X16分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、22、45数据点的相对荧光强度值。
一种赤潮藻类识别传感器或便携式藻类荧光识别仪，可通过上述方法的应用设计得到，该设备能用于产PSP赤潮藻类的快速发现和识别，减少贝类食用安全的风险。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明发明人首次发现了三维荧光光谱法能用于识别产麻痹性贝类毒素微藻，本发明通过小波函数、系统聚类法、判别法等选择和应用，得到判别正确率较高的分类判别函数，具体阐述如下：
(1)本发明提供的标准谱库是通过将同一种藻类不同生长期、不同环境条件下的所有荧光特征谱使用聚类分析法进行聚类分析，剔除异常荧光特征谱，并将正确的荧光特征谱分为几类，取每类中1条特征谱进入标准谱库，换言之，标准谱库集中了不同生长期、不同环境因子下所有特征谱。因此，利用标准谱库构建的判别函数在运用其进行样品判别时误差较小，相对较准确。
(2)本发明以Coif 2小波函数Cf4分量荧光特征谱进行系统聚类法得到80条标准谱，对麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类判别，判别正确率为77.3％和84.5％，正确率很高，基本实现了对产毒藻快速准确识别的目的。
(3)本发明采用系统聚类法可以有效地将n个样本按照不同聚类分为不同类，而异常值则被单独聚为一类，系统聚类法的优点在于利用样本之间的距离最近原则进行聚类，排除了选取指标阈值带来的人为因素的影响，采用多因子样本进行聚类，能够消除采用单一因子给分类划分带来的片面性及误差。
(4)本发明利用三角形内插值法来去除荧光原始光谱的瑞利散射，可有效突出CDOM(有色溶解有机物，Colored Dissolved Organic Matter)的荧光信号，并且能够保留原有散射区域的信号，使波长和荧光强度的偏移维持在非常小的水平，从而使处理后的荧光信息与原始荧光信息之间的误差在测量误差范围内。
(5)本发明选择的Coiflet小波函数具有正交性，能很好地降低不同藻株的相似性，凸显出各自的特征荧光值，并且可以对数据进行正交分解。
(6)本发明使用fisher判别法进行判别，目的是得到体现分类的函数关系式，即判别函数，是在已知观测样本的分类和特征变量值的前提下，从中筛选出能提供较多信息的变量，并建立判别函数，使得到的判别函数在判别样本所属类别时的错判率最小。
附图说明
图1是塔玛亚历山大藻ATHK、微小亚历山大藻AMSY、链状亚历山大藻ACSY、塔玛亚历山大藻ATDY、链状裸甲藻GCFC和亚心形爿藻PSCZ等6株实验藻的Coif 2小波Cf4尺度分量标准谱图；其中横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度。
图2是东海原甲藻PDCZ、小定鞭藻PPCZ、尖刺拟菱形藻PP1CZ、海洋卡盾藻CMHK、塔玛亚历山大藻ATCZ和塔玛亚历山大藻ATCZ1等6株实验藻的Coif 2小波Cf4尺度分量标准谱图；其中横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度。
图3是黄绿等鞭金藻IGCZ、杜氏盐藻DSCZ、柔弱角毛藻CDCZ、赤潮异湾藻HACZ、米氏凯伦藻KMCZ和三角褐指藻PTCZ等6株实验藻的Coif 2小波Cf4尺度分量标准谱图；其中横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度。
图4是日本星杆藻AJCZ、中肋骨条藻SCCZ、利马原甲藻PLCZ、利马原甲藻PLCZ1、血红哈卡藻ASCZ和聚球藻SYCZ等6株实验藻的Coif 2小波Cf4尺度分量标准谱图；其中横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度。
图5是链状裸甲藻GCCZ和卵圆卡盾藻COHK等2株实验藻的Coif 2小波Cf4尺度分量标准谱图；其中横坐标为数据点，纵坐标为相对荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、实验方法
1、藻类的培养：
藻类的培养所用的是天然海水(pH 7.5±0.1，盐度27‰，由广州市黄沙水产市场购得)，使用0.45μm微孔滤膜过滤后，在121℃、15psi条件下灭菌25min，冷却到室温。用f/2改良配方配制藻类培养液，接种后置于人工气候箱中，温度25℃，光照强度150μmolm-2s-1，光暗循环L：D＝12：12条件下培养。每种藻设三个平行样，每隔一天固定的时间取样，加鲁格固定后，在显微镜下进行藻细胞计数，绘制生长曲线。
2、不同环境下藻类的荧光光谱测定：
设置光照强度为60μmolm-2s-1、120μmolm-2s-1、200μmolm-2s-1，温度为16℃、22℃、28℃，盐度为25‰、30‰、35‰三种环境因子。实验藻种在25℃，光暗循环L：D＝12：12，光照强度150μmolm-2s-1条件下培养，待其进入对数生长期后，重新接种藻液，进行藻类生长的单因子控制实验，每种因子分三组，每组三个平行。其中，当单因素变化时，其他培养条件不变，如光照强度变化，那么培养温度为22℃，盐度为25‰；如培养温度变化，光照强度为120μmolm-2s-1，盐度为25‰。绘制每种藻在不同环境条件下的生长曲线，确定藻类的生长期，并进行藻类PSP的HPLC检测和活体藻三维荧光光谱测定。
3、麻痹性贝毒的提取
将收集的藻液反复冻融(操作见“Selander E.Copepods induce paralyticshellfish toxin production in marine dinoflagellates[J].Proceedings of theRoyal Society B:Biological Sciences,2006.273(1594):1673-1680.”或是“Touzet N,et al.Influence of inorganic nutrition on growth and PSP toxin production ofAlexandrium minutum(Dinophyceae)from Cork Harbour,Ireland[J].Toxicon,2007.50(1):106-119”)，用超声破碎仪破碎藻细胞(50％功率，2s运行、2s停止，15min)，取破碎好的藻液镜检(破碎率＞95％)。4℃、11000g离心10min，取上清液，重复上述步骤，用10000道尔顿滤膜孔径的超滤离心管离心(4℃、7200g、10min)，取超滤液，于-20℃冰箱保存，用于毒素的HPLC分析。
4、麻痹性贝毒的HPLC检测
麻痹性贝毒的HPLC检测分析参考Oshima(Oshima Y,et al.Post-columnderivatization HPLC methods for paralytic shellfish poisons[J].Manual onHarmful Marine Microalgae.,1995:81-94.)建立的方法，并经Anderson(Anderson,D.M.,et al.Paralytic shellfish poisoning in southern China[J].Toxicon,1996.34(5):579-590)修改的HPLC柱后衍生法。分析过程中采取3种不同的洗脱液等梯度洗脱方式，分析STX类毒素使用2mmol/mL的庚基磺酸钠离子对的30mmol/mL的磷酸铵缓冲液作为流动相，pH用氨水调为7.1，在洗脱时加入100：5比例的乙腈；C类毒素使用2mmol/mL的四丁基磷酸氨溶液作为流动相，pH使用氨水调为6.1；分析GTX使用2mmol/mL的庚基磺酸钠离子对的10mmol/mL的磷酸铵缓冲液作为流动相，pH用氨水调至7.1。三类毒素分析过程中，柱后衍生系统的氧化剂均采用含有7mmol/mL高碘酸的50mmol/mL磷酸氢二钾缓冲液，pH用KOH溶液调为9.0；酸化剂为0.5mol/mL的醋酸溶液。洗脱液流动相流速设置为0.8mL/min，柱后衍生系统采用的流速为0.4mL/min，洗脱时柱温均设置为33℃，柱后衍生温度GTX毒素和STX毒素为75℃，C类毒素为65℃。进行HPLC分析时，为了防止因为样品峰的漂移及不同时间所测峰面积有变化而引起的误差，每隔4个样品，加入毒素标准品分析，确保所测样品PSP各成分和含量的准确性。
5、实验数据的分析处理
在进行HPLC分析时，根椐标准品的出峰时间及峰面积，对样品峰进行分析，确定PSP各成分及其峰面积。各成分定量的计算公式如下：单位藻液体积PSP含量为：
单位藻液体积PSP含量为：X＝VD÷(1000×VZ)×(VB×CB÷V1)；
单位藻细胞PSP量计算公式为：X1＝(VB×CB÷V1)×(VD÷VZ)÷N；
X为单位藻液体积PSP毒素含量(μmol/mL)；
VB为标准品峰面积；
CB为标准品中毒素的浓度(μmol/mL)；
V1为样品峰峰面积；
VZ为提取PSP时所取藻液体积(mL)；
VD为提取PSP时定容的体积(mL)；
X1为单位藻细胞PSP含量(μmol/细胞)；
N为单位藻液所含的藻细胞数(细胞/mL)；
计算出PSP各成分含量后，将各成分相加，得出样品中PSP的总量。
用Excel 2010版和origin软件绘图，用SPSS19.0软件进行数据分析处理。
6、用于三维荧光光谱测定的藻细胞密度确定
为防止藻细胞在密度高时会产生荧光自吸收现象，取对数生长末期藻液，用f/2培养液分别稀释5、10、20、30、50、70、100倍，分别用三维荧光仪测定各密度的三维荧光光谱，确定适于三维荧光分析的最高藻细胞密度。
7、藻类活体三维荧光原始光谱的提取：
在测量之前，首先打开荧光分光光度计(型号F4600，日立，日本)，为尽量确保藻类荧光光谱的稳定性和准确性，预热半个小时之后再开始使用。使用1cm的石英比色皿(为确保所有藻测量条件的一致性，整个实验过程使用同一个比色皿)，设置激发波长范围为400-600nm，发射波长范围为650-750nm，步长设置为5nm，狭缝宽度设置为10nm，扫描速度设置为30000nm/s，信号积分时间为0.004s。在微藻生长期，隔天测一次。将扫描所得的文件(格式为*FD3)转化为txt格式文件，活体藻类的荧光信息为一个二维矩阵(21×11)，对应400-600nm的激发波长和650-750nm的发射波长。
8、藻三维荧光光谱数据的预处理
(1)三维荧光光谱瑞利散射峰的去除：通过metlab处理软件，采用Delaunay三角内插值法去瑞利散射。
(2)数据的归一化处理：
X*＝[Xn-Xmin]/[Xmax-Xmin]；
Xn：各个频点的荧光强度；
Xmax：荧光强度最大值；
Xmin：荧光强度最小值；
X*：归一化所得荧光光谱的相对强度值。
二、实验材料
产麻痹性贝毒微藻为塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，香港株)ATHK、微小亚历山大藻(Alexandrium minimum，台湾株)AMSY、链状亚历山大藻(Alexandriumcatenella，南海株)ACSY、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum，防城巷株)GCFC和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，大亚湾株)ATDY。
不产麻痹性贝毒微藻为塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ1、东海原甲藻(P.donghaiense)PDCZ、利马原甲藻(P.lima)PLCZ、利马原甲藻(P.lima)PLCZ1、米氏凯伦藻(K.mikimotoi)KMCZ、链状裸甲藻(G.catenatum)GCCZ、血红哈卡藻(A.sanguinea)ASCZ、杜氏盐藻DSCZ、亚心形爿藻(P.subcordiformis)PSCZ、聚球藻(Synechococcus)SYCZ、黄绿等鞭金藻(I.galbana)IGCZ、海洋卡盾藻(C.marina)CMHK、卵圆卡盾藻(C.ovata)COHK、赤潮异湾藻(H.akashiwo)HACZ、小定鞭藻(P.parvum)PPCZ、柔弱角毛藻(C.debilis)CDCZ、中肋骨条藻(S.costatum)SCCZ、日本星杆藻(A.japonica)AJCZ、尖刺拟菱形藻(P.pungens)PP1CZ、三角褐指藻(P.tricornutum)PTCZ。
以上藻株均从暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室获得。
三、实验过程
(1)测定微藻细胞在不同温度、盐度和光照强度下各生长期的三维荧光，得到微藻细胞的三维荧光数据；其中，微藻细胞来源于上述产麻痹性贝毒微藻和不产麻痹性贝毒微藻；
(2)将步骤(1)获得的微藻细胞的三维荧光数据转换成TXT文件格式，采用Delaunay三角内插值法消除三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif 2小波分析，选取荧光特征谱；
(3)使用系统聚类法对经过步骤(2)处理后的藻类在不同环境因子下的对数期、稳定期、衰亡期的所有荧光光谱进行聚类分析，得到用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif2荧光特征标准谱库。
四、实验结果
1、Coif 2小波函数进行分解的尺度分量的选择
将归一化和去瑞利散射后的荧光数据导入metlab软件中，用Coif2小波函数进行分解，经过Coif2小波分解，荧光光谱信息被分到不同的尺度分量上，对尺度分量的选择标准是尽量使判别样品和参照样品在该尺度分量上有一定的差异性，从而提高判别效率，实验结果显示，以微小亚历山大藻(AMSY)为例，第1层和第2层尺度分量上的荧光值受到了高频噪声的污染，很难反映出藻类的真实荧光信息，从第3层尺度分量开始，荧光值受到的噪音污染开始逐渐减少，藻类真实的荧光特征开始显现，在尺度分量逐渐增加的过程中原本集中于低频部分的藻类荧光信息开始向高频段迁移，这使得第5尺度分量之后，藻类荧光的细微信息被高频段所湮没，不再明显。因此，选择3、4层的尺度分量用于藻类三维荧光特征谱的提取。
分别使用3、4尺度分量的藻类荧光特征谱分别对5株麻痹性贝毒藻类和21株非麻痹性贝毒藻类进行判别，判别率如表1～2所示，Coif小波函数的第3尺度分量Cf 3对麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类的判别率为16.7％和77.8％，第4尺度分量对麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类的判别率达76.9％以上，因此本实验选取Coif2小波的第4尺度分量进行分解和数据的判别分析。
表1Coif 2小波Cf3分量判别结果
PSP藻类样品 判别率(％) 非PSP藻类样品 判别率(％)
训练集样品 5 22.2％ 21 83.3％
测试集样品 5 16.7％ 21 77.8％
表2Coif2小波Cf4分量判别结果
PSP藻类样品 判别率(％) 非PSP藻类样品 判别率(％)
训练集样品 5 76.9％ 21 83.3％
测试集样品 5 76.9％ 21 83.3％
注：训练集样品为5株产PSP的微藻和21株不产PSP的微藻，测试集样品为5株产PSP的微藻和21株不产PSP的微藻的另一小组平行样品。
2、藻类Coif2小波函数Cf4分量的荧光特征谱
(1)分别测定实验藻类在16℃、22℃、28℃时对数期的三维荧光光谱特征，其中，1-24数据点是Coif2小波分析Cf4激发光谱，25-48数据点为发射光谱。将处理好的温度组Cf4尺度分量荧光光谱信息输入SPSS19.0软件进行判别分析，将产毒藻设为1，不产毒藻设为0，用fisher判别法进行判别，建立的判别函数如下：
Y1＝-32.647+148.744X1-165.712X2+31.817X3-45.073X4+122.040X5-98.597X6+35.789X7-38.98 8X8+32.567X9-115.529X10+60.172X11； (3-1a)
Y2＝-22.925+54.155X1-99.890X2+53.624X3-26.691X4+86.869X5-74.256X6+33.345X7-33.918X8+41.414X9-113.690X10+44.683X11； (3-1b)
其中，X1-X11分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、13、14、35数据点，Y1和Y2分别是产麻痹性贝毒的藻类和不产麻痹性贝毒的藻类的分类函数，使用函数对未知藻类判别时，若Y1＞Y2，则该样品为产毒藻；若Y1＜Y2，则该样品为非产毒藻。对数据进行F检验，所得值为：F(66；2107)＜0.01，两组之间差异明显，进行Wilk’s Lambda检验，两个判别函数显著性水平p＜0.01。判别率如下表所示(表3)，对麻痹性贝毒藻类判别率为84.1％，对非麻痹性贝毒藻类的判别率为93.3％。
表3Coif2小波Cf4分量判别结果
PSP藻类样品 判别率(％) 非PSP藻类样品 判别率(％)
训练集样品 15 100％ 63 88.9％
测试集样品 15 84.1％ 63 93.3％
(2)在室温条件(25℃)下，60μmolm-2s-1、120μmolm-2s-1、200μmolm-2s-1光照强度时，产麻痹性贝毒藻类在对数期产毒差异明显。将处理好的光照组Cf4尺度分量荧光光谱信息输入SPSS19.0软件进行判别分析，将产毒藻设为1，不产毒藻设为0，用fisher判别法进行判别，建立的分类判别函数如下：Y1＝-48.217-8.288X1-95.525X2+133.308X3-55.804X4+127.184X5-136.568X6+95.172X7-25.923X8-5.107X9-2.830X10-0.620X11-18.221X12+73.961X13； (3-2a)
Y2＝-53.600+25.123X1-168.835X2+187.948X3-58.280X4+146.022X5-174.032X6+127.895X7-32.015X8-61.320X9+78.578X10-41.592X11-29.123X12+102.241X13； (3-2b)
其中，X1-X13分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、13、14、16、19、20数据点，Y1和Y2分别是麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类的分类函数。使用函数对未知藻类判别时，若Y1>Y2，则样品为产PSP藻类；若Y1<Y2，则该样品为非PSP藻类。对数据进行F检验，所得值为：F(91；2077)<0.01，两组之间差异明显，进行Wilk’s Lambda检验，两个判别函数显著性水平p<0.01。判别率如表4所示，对麻痹性贝毒藻类判别率为80.0％，对非麻痹性贝毒藻类的判别率为93.7％。
表4藻类Coif2小波Cf4分量判别结果
PSP藻类样品 判别率(％) 非PSP藻类样品 判别率(％)
训练集样品 15 93.3％ 63 95.2％
测试集样品 15 80.0％ 63 93.7％
(3)不同盐度条件下藻类Coif 2小波Cf4分量荧光特征谱：在室温(25℃)下，分别收集不同盐度(25、30、35)时对数期实验藻的三维荧光信息，并用Coif 2小波提取Cf4尺度分量，建立藻的联合光谱。将处理好的盐度组Cf4尺度分量荧光光谱信息输入SPSS19.0软件进行判别分析，将产毒藻设为1，不产毒藻设为0，用fisher判别法进行判别，所建立的分类判别函数如下：
Y1＝-43.121-284.664X1+136.707X2+156.490X3-115.981X4+35.936X5+74.173X6-28.031X7+37.631X8-41.670X9-108.736X10+125.721X11-100.072X12； (3-3a)
Y2＝-22.517-180.091X1+3.078X2+176.740X3-54.975X4+52.392X5+1.830X6+3.876X7+1.868X8+14.877X9-75.630X10+60.901X11-21.536X12； (3-3b)
其中，X1-X12分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、13、14、16、46数据点，Y1和Y2分别是麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类的分类判别函数。使用函数对未知藻类判别时，若Y1＞Y2，则该藻产毒；若Y1＜Y2，则该藻不产毒。对数据进行F检验，所得值为：F(98；2090)＜0.01，两组之间差异明显，进行Wilk’s Lambda检验，两个判别函数显著性水平p＜0.01。判别率如表5所示，对麻痹性贝毒藻类判别率为93.3％，对非麻痹性贝毒藻类的判别率为96.8％。
表5藻类Coif 2小波Cf4分量判别结果
PSP藻类样品 判别率(％) 非PSP藻类样品 判别率(％)
训练集样品 15 96.8％ 63 100％
测试集样品 15 93.3％ 63 96.8％
综合光照组、温度组、盐度组的所有判别结果，用Coif 2小波函数Cf4分量特征谱库进行判别，对PSP藻类和非PSP藻类的平均判别率分别为85.8％和94.6％，平均综合判别率为91.0％，判别率较高，这表明，用Coif 2小波函数的Cf4尺度分量可实现PSP藻类和非PSP藻类的判别，三组不同环境条件下生长的藻类三维荧光特征谱建立判别函数的共同贡献点为第1、2、3、4、8、9、10、11、12、13、14数据点，共11个。
3、光照强度、盐度、温度等环境因子及藻类的生长周期都会对藻类的三维荧光光谱特征产生影响，而在提取三维荧光光谱信息的过程中，也会因为操作异常、仪器误差等因素干扰光谱，为了排除异常干扰，本步骤对光照强度、温度、盐度培养条件下的26株实验藻对数期、衰亡期、稳定期的三维荧光光谱采用系统聚类法进行聚类分析，剔除异常谱，保留特征谱，以提高特征光谱的代表性和判别正确率。按步骤2，在3组单因子变化实验中，提取26株藻类对数期、稳定期、衰亡期的三维荧光光谱信息。使用系统聚类法对在不同环境因子下的对数期、稳定器、衰亡期的藻类所有荧光光谱进行分析，剔除异常谱，得到藻类的标准谱，使用的聚类标准为5。
对Coif2小波Cf4荧光光谱进行聚类分析，以AMSY为例，如图1所示，在Y轴上，第1-9点分别为AMSY在不同温度条件的光谱，第10-18点为不同光照强度条件下的光谱，第19-27点为不同盐度条件下的荧光特征谱，由分析结果可以看出，AMSY的27条荧光特征谱被聚为9类，其中第1点为16℃、120μmolm-2s-1、盐度25对数期的荧光特征谱，第4点为16℃、120μmolm-2s-1、盐度25稳定期的荧光特征谱，第21点为盐度30、光照120μmolm-2s-1、温度22℃稳定期的荧光特征谱，第13点为光照强度120μmolm-2s-1、温度22℃、盐度25稳定期的荧光特征谱，为异常谱，应予以剔除，因此AMSY可以得到5个荧光标准谱。
按照上述分析方法对其余25株实验藻进行聚类分析，得到80个标准谱，其中产PSP藻类为22条(见图1～5)，如表6所示。
表6 Coif 2小波函数Cf4分量标准谱库
Figure BDA0002611612770000081
将得到的标准谱导入SPSS 19.0软件，用fisher判别法得到如下的分类判别函数：
Y1＝-46.386-42.689X1+29.633X2+38.062X3-23.566X4+18.515X5-62.314X6+113.554X7-21.858X8-82.376X9+80.203X10-77.093X11+1.300X12-58.742X13+120.682X14+83.833X15-39.123X16；
Y2＝-44.176-76.571X1+1.686X2+90.317X3-5.525X4+6.664X5-36.751X6+110.785X7-29.284X8-81.617X9+80.310X10-126.495X11+23.164X12-26.276X13+101.033X14+68.028X15-40.200X16；
其中，X1-X16分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、22、45数据点，Y1和Y2分别是产麻痹性贝毒藻类和非产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数，使用函数对未知藻判别时，若Y1>Y2，则该样品为PSP藻类；若Y1<Y2，则该样品为非PSP藻类；对数据进行F检验：(136；4726)<0.01，组间差异性显著，进行Wilk’s Lambda检验，两个判别函数显著性水平p<0.01。判别率如表7所示，对麻痹性贝毒藻类判别率为77.3％，对非麻痹性贝毒藻类的判别率为84.3％。
表7藻类的Coif2小波函数Cf4分量判别结果
Figure BDA0002611612770000091
对Coif 2小波函数Cf4分量荧光特征谱进行系统聚类法得到80条标准谱，对麻痹性贝毒藻类和非麻痹性贝毒藻类判别，判别正确率为77.3％和84.5％。其中判别错误的样本有十条，分别为ATDY、ACSY、ATCZ、SCCZ、ATCZ1、PDCZ，其中甲藻门中产毒藻ATDY中一条标准谱被错判为不产PSP藻类，ACSY的一条标准谱被错判为不产毒藻，东海原甲藻(PDCZ)错判为产毒藻，塔玛亚历山大藻属ATCZ、ATCZ1错判为产毒藻；硅藻门中中肋骨条藻(SCCZ)错判为产毒藻。但总体而言，本发明标准谱库及其判别函数在识别产毒藻的正确性上依然很高，实现了对产毒藻快速准确识别的目的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。
2.根据权利要求1所述的三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用，其特征在于：所述的三维荧光光谱法是通过分析产麻痹性贝类毒素的藻类和不产麻痹性贝类毒素的藻类在不同环境、不同生长期的三维荧光光谱信息，得到产麻痹性贝类毒素的藻类和不产麻痹性贝类毒素的藻类的荧光特征标准谱库；通过荧光特征标准谱库进行判别，得到产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数Y1和非产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数Y2；使用函数对未知藻判别时，若Y1>Y2，则该样品为产麻痹性贝毒藻类；若Y1<Y2，则该样品为不产麻痹性贝毒藻类。
3.根据权利要求2所述的三维荧光光谱法在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用，其特征在于：
所述的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数如下：
Y1＝-46.386-42.689X1+29.633X2+38.062X3-23.566X4+18.515X5-62.314X6+113.554X7-21.858X8-82.376X9+80.203X10-77.093X11+1.300X12-58.742X13+120.682X14+83.833X15-39.123X16；
所述的不产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数如下：
Y2＝-44.176-76.571X1+1.686X2+90.317X3-5.525X4+6.664X5-36.751X6+110.785X7-29.284X8-81.617X9+80.310X10-126.495X11+23.164X12-26.276X13+101.033X14+68.028X15-40.200X16；
其中，X1-X16分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、22、45数据点的相对荧光强度值。
4.一种用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库，其特征在于：是通过权利要求1～3任一项所述的应用构建得到；
所述的Coif 2荧光特征标准谱库的构建步骤如下：
(1)测定微藻在不同温度、盐度和光照强度下各生长期的三维荧光，激发波长为400～600nm，发射波长为650～750nm，得到微藻细胞的三维荧光数据；其中，微藻包括产麻痹性贝毒微藻和不产麻痹性贝毒微藻；
(2)将步骤(1)获得的微藻细胞的三维荧光数据转换成TXT文件格式，采用Delaunay三角内插值法消除三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif 2小波分析，选取荧光特征谱；
(3)使用系统聚类法对经过步骤(2)处理后的藻类所有荧光光谱进行聚类分析，筛选具代表性的光谱，得到用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库。
5.根据权利要求4所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库，其特征在于：
步骤(1)中所述的生长期包括对数期、稳定期和衰亡期；
步骤(1)中所述的产麻痹性贝毒微藻的株数为5株以上；
步骤(1)中所述的不产麻痹性贝毒微藻的株数为21株以上；
步骤(1)中所述的三维荧光数据通过使用荧光分光光度计扫描获得，激发波长范围为400～600nm，发射波长范围为650～750nm，步长设置为5nm，狭缝宽度设置为10nm，扫描速度设置为30000nm/s，信号积分时间为0.004s，生长期隔天测一次；
步骤(1)中所述的光照强度为60μmol m-2s-1、120μmol m-2s-1和200μmol m-2s-1；
步骤(1)中所述的温度为16℃、22℃、28℃；
步骤(1)中所述的盐度为25‰、30‰、35‰；
步骤(2)中所述的采用Delaunay三角内插值法消除三维荧光光谱的瑞利散射通过metlab处理软件实现；
步骤(2)中所述的最大归一化的处理方法如下：
X*＝[Xn-Xmin]/[Xmax-Xmin]；
Xn：各个频点的荧光强度；
Xmax：荧光强度最大值；
Xmin：荧光强度最小值；
X*：归一化所得荧光光谱的相对强度值；
步骤(2)中所述的Coif 2小波分析通过metlab处理软件实现；
步骤(2)中所述的荧光特征谱为使用第4尺度分量的藻类荧光特征谱；
步骤(3)中所述的系统聚类法采用的聚类标准为5。
6.根据权利要求5所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库，其特征在于：
所述的产麻痹性贝毒微藻为微小亚历山大藻(Alexandrium minimum,台湾株)AMSY、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，大亚湾株)ATDY、链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum，防城巷株)GCFC、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense，香港株)ATHK和链状亚历山大藻(Alexandrium catenella，南海株)ACSY；
所述的不产麻痹性贝毒微藻为塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)ATCZ1、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)PDCZ、利马原甲藻(Prorocentrum lima)PLCZ、利马原甲藻(Prorocentrum lima)PLCZ1、米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)KMCZ、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)GCCZ、血红哈卡藻(Akashiwosanguinea)ASCZ、杜氏盐藻(Dunaliella salina)DSCZ、亚心形爿藻(Platymonassubcordiformis)PSCZ、聚球藻(Synechococcus)SYCZ、黄绿等鞭金藻(Dictyocha galbana)IGCZ、海洋卡盾藻(Chattonella marina)CMHK、卵圆卡盾藻(Chattonella ovata)COHK、赤潮异湾藻(Heterosigma akashiwo)HACZ、小定鞭藻(Phaeocystis parvum)PPCZ、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)CDCZ、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)SCCZ、日本星杆藻(Asterionella japonica)AJCZ、尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschia pungens)PP1CZ、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)PTCZ；
所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库中的荧光特征标准谱为80条，其中产麻痹性贝类毒素微藻的荧光特征标准谱为22条。
7.权利要求4～6任一项所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用。
8.根据权利要求7所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用，其特征在于包括如下步骤：
(A)依据所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库建立判别函数，得到的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数设置为Y1，得到的不产麻痹性贝毒藻类的分类判别函数设置为Y2；
(B)对未知藻类样本判别时，若Y1>Y2，则该未知藻为产麻痹性贝毒的微藻；若Y1<Y2，则该未知藻为不产麻痹性贝毒的微藻。
9.根据权利要求8所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif 2荧光特征标准谱库在识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用，其特征在于：
所述的建立判别函数是将所述的用于识别产麻痹性贝类毒素微藻的Coif2荧光特征标准谱库中的荧光特征标准谱导入统计软件进行判别分析，用fisher判别法构建判别函数；
所述的产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数如下：
Y1＝-46.386-42.689X1+29.633X2+38.062X3-23.566X4+18.515X5-62.314X6+113.554X7-21.858X8-82.376X9+80.203X10-77.093X11+1.300X12-58.742X13+120.682X14+83.833X15-39.123X16；
所述的不产麻痹性贝毒藻类的微藻的分类判别函数如下：
Y2＝-44.176-76.571X1+1.686X2+90.317X3-5.525X4+6.664X5-36.751X6+110.785X7-29.284X8-81.617X9+80.
310X10-126.495X11+23.164X12-26.276X13+101.033X14+68.028X15-40.200X16；
其中，X1-X16分别代表第1、2、4、8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、22、45数据点。
10.一种赤潮藻类识别传感器或便携式藻类荧光识别仪，其特征在于：通过权利要求1～3任一项所述三维荧光光谱法在用于识别产麻痹性贝类毒素微藻中的应用设计得到。
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