CN102128779A - 非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法 - Google Patents

非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法 Download PDF

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CN102128779A CN 201010595571 CN201010595571A CN102128779A CN 102128779 A CN102128779 A CN 102128779A CN 201010595571 CN201010595571 CN 201010595571 CN 201010595571 A CN201010595571 A CN 201010595571A CN 102128779 A CN102128779 A CN 102128779A
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邵建辉
楚建军
赵丙强
陈力
王欢
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Abstract

本发明涉及一种非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法。其包括样品采集与处理、藻类检测、滤除藻类、CDOM检测和结果输出与计算步骤。本发明中使用的鞘液是非外置鞘液，它是通过对样品进行初步处理和过滤去除其中的藻类之后直接使用，既省去了更换鞘液的麻烦，又避免了系统液流系统的生物污染；本发明能够同时对水中的藻类和有色可溶性有机物（CDOM）进行在线检测分析，能够对水质的富营养度进行预警，提前预防蓝藻水华的爆发；本发明的流式细胞术检测无论采用循环鞘液方式或非循环鞘液方式，都可以有效检测CDOM，并提高藻类检测结果的精确性；本发明在增加有限使用成本的条件下，有助于获取更多的水质信息。

Description

非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法
技术领域
本发明属于水质成分在线检测分析技术领域，涉及水中的藻类和有色可溶性有机物（Chromophoric dissolved organic matter，CDOM）的检测，具体地说是一种非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法。
背景技术
藻类指是原生生物界一类真核生物(有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类)。主要水生，无维管束，能进行光合作用。其中含有藻胆蛋白，其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体，由色素基团藻胆素和载体蛋白共价结合而成。它分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白四种，由于它们在不同藻类中的含量不同，致使有的藻类呈现红色，有的则为绿色。国内蓝藻中含有的蛋白以藻蓝蛋白为主，该蛋白的最大吸收峰在620nm附近，能发射强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率。
蓝藻水华是由于水体中氮、磷等营养物质大量累积，在气候条件适宜情况下，快速繁殖并在水面聚集而产生的自然灾害现象。蓝细菌为单细胞生物，个体比细菌大，一般直径或线度为3~15微米。蓝藻可在短时间内迅速繁殖，使水体透明度显著下降。蓝藻生长还加快了水体氧的消耗，使水体缺氧，导致鱼类和其它水生生物大量死亡，破坏生态功能和生物多样性。
此外，某些藻类本身含有藻毒素，会危及饮水安全。如蓝藻含有神经毒素，可通过食物链不断富集。人们吃了含有神经毒素的鱼类、螃蟹等，将加速人脑神经退化、肌肉萎缩，加大老人痴呆症发病风险；其中微囊藻毒素毒性非常强，将严重损害人的肝脏，导致肝癌。
湖泊是人类最重要的水资源之一，在湖泊周围也是我国人口和工业聚集区。因为人类活动的影响，湖泊的富营养化日趋严重，其直接后果就是蓝藻水华的发生，2007年太湖爆发的蓝藻水华严重影响了周边居民的正常生活。2009年山东境内多处湖水暴发蓝藻。今年9月湖北武汉东湖的子湖水果湖暴发大量蓝藻，沿湖行走就能闻到强烈臭味。同年江西南昌市军山湖水质明显变差，蓝藻暴发，连村民家养的牛都不愿意喝湖水了。蓝藻已成为我国湖泊、河流等水体的主要污染之一。
如何在蓝藻水华爆发前进行准确的预警变得非常重要。目前我国对蓝藻的监测主要采用显微计数、叶绿素含量测定、卫星遥感等技术。显微计数需要由专业人员操作，花费的时间长，过程复杂，并且分析样品的效率低。叶绿素含量测定是一种相对较快速简单的测量技术，但传统的测量方法多为现场抽滤后带回实验室抽提，然后进行分光光度计分析、荧光分光光度计分析或高效液相色普（HPLC）分析，但这种技术最快也需要1~2天才能获得结果。这两种方法均不能立即反映出水体中的藻类信息，而是要经过一段分析时间，从而降低了生物监测的时效性，大大影响有害蓝藻的监测/预警。卫星遥感具备监测范围广、数据多、不受地理位置和人为条件限制等优点，但其容易受天气条件影响，且往往需要藻类细胞累积到一定程度才能监测到，往往达不到预警的效果，而且费用高，数据分析复杂。南非的湖泊学家保罗·奥博郝斯特博士研究出一种可以预测有毒的蓝绿藻在淡水环境（如江河湖泊）中暴发的方法，其采用水蛭作为生物指示物，因为与某些大型无脊椎动物相反，水蛭可以在被蓝藻释放的有毒物质污染的水中生存，它们的存在往往是水质差的证明。如果水蛭出现在比较稠密的蓝藻周围，说明这种蓝藻极有可能是有毒的。但水蛭不能说明水体中的毒性水平到底有多高。同时这种方法需要专业的人员进行操作，耗时长，方法的通用性差。
要想在蓝藻水华爆发前进行准确的预警，对水中蓝藻含量进行连续监测是切实可行的途径。目前的连续监测主要依靠流失细胞仪来监测分析，流式细胞仪检测的基本原理为：根据流体动力学原理让液体中的颗粒（包括细胞）逐一通过激光束（检测区），激光照射到颗粒上会引起光的散射，如果颗粒（如藻细胞）含有色素还可以发出荧光，这些散射光和荧光被检测器收集后转换成电信号存储下来，并利用软件进行自动分析。水中的浮游植物细胞做为一个个颗粒，当然可以进行流式细胞计数，由此即可监测水中蓝藻的含量。
有色可溶性有机物（Chromophoric dissolved organic matter, CDOM）存在于所有水体中，又称黄质。它是溶解性有机物库的重要组成部分。由腐殖酸，芳烃聚合物等一系列物质组成，主要是土壤和水生植物降解的产物，在内陆水体和海湾沿岸CDOM以河流陆源排放为主，在远海CDOM浓度非常低，其来源主要是海水中低等植物残体腐烂降解后形成。由于有色可溶性有机物（CDOM）中含有丰富的碳、氮、磷等湖泊生源要素，在湖泊各种物理，化学和生物反应以及藻类暴发过程中都扮演了重要的角色。
有色可溶性有机物（CDOM）存在于所有水体中，其浓度不能直接测定，现在常用的检测方法是用355nm的波长的光照射CDOM，以其荧光数值作为浓度的单位。目前该测试只能在荧光分光光度计上完成，测试使用的专业设备不仅价格昂贵，而且体积庞大不能移动，测试结果不连续，不能实现对有色可溶性有机物的在线检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，该方法采用非外置鞘液作为系统的鞘流，检测简便、快速，可同时在线连续检测水质中的藻类和有色可溶性有机物（CDOM），对水体的富营养化进行预警检测，可以适用于野外的现场作业。
本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：
所述非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法包括如下步骤：
（1）样品采集与处理：用进样器采集水样，进样流速为1~2 cm/s，水样被进样器采集后，首先滤除粒径大于1mm的泥沙颗粒，然后在进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大的砂粒作为待检测颗粒，进入流动室，进行流式细胞计数和其它分析；对于粒径介于50~100 μm的砂粒而言，它们的沉降速率大于进样流速，因此不会被进样器吸入；
（2）藻类检测：步骤（1）中的待检测颗粒被不含任何颗粒的鞘液包裹着流过流动室，所述鞘液为非外置鞘液；鞘液包绕着待检测颗粒高速流动，组成一个圆形的流束，待检测颗粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过藻类检测区域；这个过程中，颗粒间的距离被拉开，当颗粒被与之呈90度角的激光束照射时，颗粒的散射光和荧光会被检测系统检测；所述检测系统检测颗粒的前向散射光（FWC）、侧向散射光（SWC）和多色荧光，这些光信号被检测系统收集储存以对不同类型的颗粒进行聚类分析；
（3）滤除藻类：在所述流动室内的藻类检测区域后设置一个过滤器，将已经被检测的藻类等物质滤除，滤液在流动室内继续流动并通过CDOM检测区域；
（4）CDOM检测：步骤（3）中的滤液流过CDOM检测区域，被波长为355nm的激光束照射，检测系统收集滤液在380~600nm的波长范围内的光吸收信号和荧光信号，并将信号输送到智能仪表；
（5）结果输出与计算：智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，计算吸光度D(λ)，然后结合光程路径r，根据下面的公式（1）计算获得波长λ未校正的吸收系数α(λ)′，该吸收系数α(λ)′用于表示CDOM的浓度；
α(λ)′=2.303D(λ)/r               （1）
式（1）中：λ为波长；α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，其单位为（m-1）；D(λ)为吸光度；r为光程路径，其单位为m。
作为本发明的进一步改进，由于上述步骤（3）中的滤液还有可能残留细小颗粒，可能会引起散射，所以需要对步骤（5）中获得的波长λ未校正的吸收系数α(λ)′进行校正，以消除滤液中可能残留细小颗粒而引起的散射效应，校正后获得波长λ的吸收系数α(λ)；校正根据下面的公式（2）进行；
α(λ)=α(λ)′-α(750)×λ/750              （2）
式（2）中：α(λ)为波长λ的吸收系数，α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，它们的单位都为（m-1）。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（2）中的藻类检测采用波长范围为300~800nm的激光束照射。
作为本发明的进一步改进，所述鞘液采用纯净水、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液的pH值范围在2~11之间。
本发明与现有技术相比：优点在于：
（1）本发明中使用的鞘液是非外置鞘液，它是通过对样品进行初步处理和过滤去除其中的藻类之后直接使用的，既省去了更换鞘液的麻烦，又避免了系统液流系统的生物污染；
（2）本发明能够同时对水中的藻类和有色可溶性有机物（CDOM）进行在线检测分析，在一次测量过程中，能够同时检测出藻类浓度和CDOM浓度，荧光值，吸收系数等参数，能够对水质的富营养度进行预警，提前预防蓝藻水华的爆发；
（3）本发明的流式细胞术检测无论采用循环鞘液方式或非循环鞘液方式，都可以有效检测CDOM，并提高藻类检测结果的精确性；
（4）本发明在增加有限使用成本的条件下，有助于获取更多的水质信息。
附图说明
图1是采用非外置鞘液流式细胞术在线检测藻类和有色可溶性有机物（CDOM）的流程示意图。
图2是采用非外置鞘液流式细胞术对水中的颗粒进行在线检测分析的结果图。
图3是采用非外置鞘液流式细胞术对水中的蓝藻进行在线检测分析的结果图。
图4是采用非外置鞘液流式细胞术在线对冬季水中的CDOM进行一个月的连续检测分析结果图。
图5是采用非外置鞘液流式细胞术在线对夏季水中的CDOM进行一个月的连续检测分析结果图。
图6是图4、图5中的分析结果对比情况示意图；图中，曲线1为冬季检测分析结果、曲线2为夏季检测分析结果。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明，下述实施例仅用于对本发明作进一步的举例说明，而不能理解为对说明书作出任何限定。
本发明采用流式细胞术对藻类和CDOM进行在线连续检测。检测对象中藻类中含有藻胆蛋白，其主要功能是作为光合作用的捕光色素复合体，由色素基团藻胆素和载体蛋白共价结合而成。它分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白四种，由于它们在不同藻类中的含量不同，致使有的藻类呈现红色，有的则为绿色。国内蓝藻中含有的蛋白以藻蓝蛋白为主，该蛋白的最大吸收峰在620nm附近，能发射强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率。检测对象中的有色可溶性有机物（CDOM）的检测是利用355nm 波长的激光束照射，收集滤液在380~600nm波长范围内的光吸收信号和荧光信号。相关研究表明，即便CDOM 来源和化学组成差异万千，CDOM 吸收与荧光强度均存在显著线性关系，因此可以利用其荧光强度和吸收的线性关系，反演得到CDOM 吸收系数。
如图1所示，本发明的一个实施例的具体操作如下：
（1）样品采集与处理：用进样器采集水样，进样流速为1~2 cm/s，水样被进样器采集后，首先滤除粒径大于1mm的泥沙颗粒，然后在进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大的砂粒作为待检测颗粒，进入流动室，进行流式细胞计数和其它分析；对于粒径介于50~100 μm的砂粒而言，它们的沉降速率大于进样流速，因此不会被进样器吸入。
（2）藻类检测：步骤（1）中的待检测颗粒被不含任何颗粒的鞘液包裹着流过流动室，所述鞘液为非外置鞘液，鞘液选用纯净水；鞘液包绕着待检测颗粒高速流动，组成一个圆形的流束，待检测颗粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过藻类检测区域；这个过程中，颗粒间的距离被拉开，当颗粒被与之呈90度角的激光束照射（激光束采用波长为488nm的激光束）时，颗粒的散射光和荧光会被检测系统检测；所述检测系统检测颗粒的前向散射光（Forward Scatter ，FWC），根据前向散射光（FWC）的信号可以得到水体中颗粒物大小的信息，检测获得的二维点图如图2所示，由图中可以看出：检测水样中的藻类直径集中10μm以下，在10~20μm的较少。因藻类中含有的藻红蛋白在激光照射下会有黄绿色荧光产生，通过检测样品通过流动室后产生的荧光信号（Fluorescence Light）和前向散射光信号（Forward Scatter），可以检测出水体中蓝藻的相关信息，检测获得的二维点图如图3所示，由图中可以看出：蓝藻具有较强的荧光。
（3）滤除藻类：在所述流动室内的藻类检测区域后设置一个过滤器，将已经被检测的藻类等物质滤除，滤液在流动室内继续流动并通过CDOM检测区域；
（4）CDOM检测：步骤（3）中的滤液流过CDOM检测区域，被波长为355nm的激光束照射，检测系统收集滤液在380~600nm的波长范围内的光吸收信号和荧光信号，并将信号输送到智能仪表；
（5）结果输出与计算：智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，计算吸光度D(λ)，然后结合光程路径r，根据下面的公式（1）计算获得波长λ未校正的吸收系数α(λ)′，该吸收系数α(λ)′用于表示CDOM的浓度；
α(λ)′=2.303D(λ)/r               （1）
式（1）中：λ为波长；α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，其单位为（m-1）；D(λ)为吸光度；r为光程路径，其单位为m。
（6）校正计算：由于上述步骤（3）中的滤液还有可能残留细小颗粒，可能会引起散射，所以需要对步骤（5）中获得的波长λ未校正的吸收系数α(λ)′进行校正，以消除滤液中可能残留细小颗粒而引起的散射效应，校正后获得波长λ的吸收系数α(λ)；校正根据下面的公式（2）进行；
α(λ)=α(λ)′-α(750)×λ/750           （2）
式（2）中：α(λ)为波长λ的吸收系数，α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，它们的单位都为（m-1）。
本发明在冬季和夏季分别对太湖水质的CDOM进行了连续一个月的在线连续检测，检测及计算结果如表1和表2所示：
表1：冬季（2010年1月20号~2010年2月20号）
天数 波长（λ） 吸光度（D） 光程路径（r）/m 未校正吸收系数α(λ)′ 校正后吸收系数α(λ)
1 355 0.010117 0.01 2.33 2.31
2 355 0.010161 0.01 2.34 2.32
3 355 0.010855 0.01 2.5 2.48
4 355 0.010942 0.01 2.52 2.5
5 355 0.01129 0.01 2.6 2.58
6 355 0.011376 0.01 2.62 2.6
7 355 0.011854 0.01 2.73 2.71
8 355 0.012375 0.01 2.85 2.83
9 355 0.012853 0.01 2.96 2.94
10 355 0.014025 0.01 3.23 3.21
11 355 0.014807 0.01 3.41 3.39
12 355 0.014937 0.01 3.44 3.42
13 355 0.015415 0.01 3.55 3.53
14 355 0.015241 0.01 3.51 3.49
15 355 0.015719 0.01 3.62 3.6
16 355 0.01624 0.01 3.74 3.72
17 355 0.01663 0.01 3.83 3.81
18 355 0.016978 0.01 3.91 3.89
19 355 0.017108 0.01 3.94 3.92
20 355 0.018324 0.01 4.22 4.2
21 355 0.018541 0.01 4.27 4.25
22 355 0.018888 0.01 4.35 4.33
23 355 0.019887 0.01 4.58 4.56
24 355 0.020278 0.01 4.67 4.65
25 355 0.020582 0.01 4.74 4.72
26 355 0.018845 0.01 4.34 4.32
27 355 0.018367 0.01 4.23 4.21
28 355 0.018107 0.01 4.17 4.15
29 355 0.017716 0.01 4.08 4.06
30 355 0.017369 0.01 4 3.98
31 355 0.016674 0.01 3.84 3.82
以检测天数为横轴、吸收系数为纵轴，生成图4，分析图4可知：水质的有色可溶性有机物吸收系数的变化范围在2.31~4.72之间，最高值出现在24日左右。
表2：夏季（2010年7月20号~2010年8月20号）
天数 波长（λ） 吸光度（D） 光程路径（r）/m 未校正吸收系数α(λ)′ 校正后吸收系数α(λ)
1 355 0.0108 0.01 2.5 2.48
2 355 0.0108 0.01 2.51 2.49
3 355 0.0108 0.01 2.5 2.48
4 355 0.0110 0.01 2.54 2.52
5 355 0.0113 0.01 2.62 2.6
6 355 0.0118 0.01 2.72 2.7
7 355 0.0122 0.01 2.82 2.8
8 355 0.0131 0.01 3.02 3
9 355 0.0144 0.01 3.32 3.3
10 355 0.0165 0.01 3.82 3.8
11 355 0.0183 0.01 4.22 4.2
12 355 0.0187 0.01 4.32 4.3
13 355 0.0196 0.01 4.52 4.5
14 355 0.0200 0.01 4.62 4.6
15 355 0.0217 0.01 5.02 5
16 355 0.0235 0.01 5.42 5.4
17 355 0.0239 0.01 5.52 5.5
18 355 0.0244 0.01 5.62 5.6
19 355 0.026 0.01 6.02 6
20 355 0.0265 0.01 6.12 6.1
21 355 0.0274 0.01 6.32 6.3
22 355 0.0285 0.01 6.57 6.55
23 355 0.0287 0.01 6.61 6.59
24 355 0.0292 0.01 6.73 6.71
25 355 0.0289 0.01 6.67 6.65
26 355 0.0280 0.01 6.47 6.45
27 355 0.0275 0.01 6.34 6.32
28 355 0.0270 0.01 6.23 6.21
29 355 0.026 0.01 6.05 6.03
30 355 0.0264 0.01 6.1 6.08
31 355 0.026 0.01 6.17 6.15
以检测天数为横轴、吸收系数为纵轴，生成图5，分析图5可知：水质的有色可溶性有机物吸收系数的变化范围在2.48~6.71之间，最高值出现在下旬中期，并且随着气温的升高，吸收系数的变化幅度趋缓。
图6对上述的图4和图5结合对比，由图中可见：夏季检测水体的吸收系数均值在4.36±0.91m-1,冬季在一个月时间内连续检测水体的吸收系数均值在3.28±0.92m-1。可以看出随着季节的变化，CDOM的吸收系数有比较明显的变化。

Claims (5)

1. 非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）样品采集与处理：用进样器采集水样，进样流速为1-2 cm/s，水样被进样器采集后，首先滤除粒径大于1 mm的泥沙颗粒，然后在进样器内部经过筛选排除空气和砂粒，余下的浮游植物、浮游动物和与它们密度相差不大的砂粒作为待检测颗粒，进入流动室，进行流式细胞计数和其它分析；对于粒径介于50~100 μm的砂粒而言，它们的沉降速率大于进样流速，因此不会被进样器吸入； 
（2）藻类检测：步骤（1）中的待检测颗粒被不含任何颗粒的鞘液包裹着流过流动室，所述鞘液为非外置鞘液；鞘液包绕着待检测颗粒高速流动，组成一个圆形的流束，待检测颗粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过藻类检测区域；这个过程中，颗粒间的距离被拉开，当颗粒被与之呈90度角的激光束照射时，颗粒的散射光和荧光会被检测系统检测；所述检测系统检测颗粒的前向散射光、侧向散射光和多色荧光，这些光信号被检测系统收集储存以对不同类型的颗粒进行聚类分析；
（3）滤除藻类：在所述流动室内的藻类检测区域后设置一个过滤器，将已经被检测的藻类等物质滤除，滤液在流动室内继续流动并通过CDOM检测区域；
（4）CDOM检测：步骤（3）中的滤液流过CDOM检测区域，被波长为355nm的激光束照射，检测系统收集滤液在380~600nm的波长范围内的光吸收信号和荧光信号，并将信号输送到智能仪表； 
（5）结果输出与计算：智能仪表根据接收到的光吸收信号和荧光信号，计算吸光度D(λ)，然后结合光程路径r，根据下面的公式（1）计算获得波长λ未校正的吸收系数α(λ)′，该吸收系数α(λ)′用于表示CDOM的浓度；
α(λ)′=2.303D(λ)/r               （1）
式（1）中：λ为波长；α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，其单位为（m-1）；D(λ)为吸光度；r为光程路径，其单位为m。
2.如权利要求1所述的非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于：对步骤（5）中获得的波长λ未校正的吸收系数α(λ)′进行校正，以消除滤液中可能残留细小颗粒而引起的散射效应，校正后获得波长λ的吸收系数α(λ)；校正根据下面的公式（2）进行；
α(λ)=α(λ)′-α(750)×λ/750              （2）
式（2）中：α(λ)为波长λ的吸收系数，α(λ)′为波长λ未校正的吸收系数，它们的单位都为（m-1）。
3.如权利要求1所述的非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的藻类检测采用波长范围为300~800nm的激光束照射。
4.如权利要求1所述的非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于：所述鞘液采用纯净水、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
5.如权利要求4所述的非外置鞘液流式细胞术在线分析藻类和有色可溶性有机物的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液的pH值范围在2~11之间。
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