CN104498397A - 获取无菌微囊藻纯种的方法 - Google Patents

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施丽梅
黄亚新
孔繁翔
龚伊
卢亚萍
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Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明提供了一种获取无菌微囊藻的方法。在微囊藻的纯化过程中，依次采用超声波打散藻与细菌细胞之间的粘附、利用流式细胞仪分选技术分选微囊藻、通过分部收集或者划线纯化的方法获得无菌的微囊藻。

Description

获取无菌微囊藻纯种的方法
技术领域
发明属于生物技术领域，涉及微生物的分离纯化过程，特别是涉及原核微囊藻培养中去除污染细菌的方法，有效解决了难以获得微囊藻无菌培养液的现状，为微囊藻的分子生物学、生理学等特性研究提供了材料。
背景技术
微囊藻是形成蓝藻水华的优势藻种，其形成的水华具有发生广泛，面积大，产生毒素的特点。水华微囊藻严重影响水体水质，引起了越来越多科学家的关注。
微囊藻的胞外产物富含多糖、蛋白质等有机物质，因而是细菌聚集的热点生态位。无论是在野外还是在室内培养过程中，微囊藻都不可避免的带有大量污染的细菌，为微囊藻的生理、分子生物学等研究带来了阻碍。因而去除微囊藻培养中的细菌室研究深入微囊藻生物学特性的重要步骤。
目前去除微囊藻中细菌的方法有紫外照射、使用抗生素等方法。然而，微囊藻和细菌同属于原核生物，这些方法的使用容易引起微囊藻细胞的损伤，甚至发生变异，而且残留的细菌可能产生抗性，为后续微囊藻的研究产生了较大的影响。在分离培养无菌微囊藻的过程中，也有直接采用划线方法进行，但是由于微囊藻细胞的胶鞘中含有多糖类物质，容易粘附细菌，需要经过很多次的划线才能挑选出无菌微囊藻，这种方法非常缓慢，而且工作量很大，也不能高效快速的得到无菌的微囊藻。
因此，需要更加安全有效的方法去除微藻中的细菌。
发明内容
本发明公开了一种去除微囊藻培养中附着细菌或者污染细菌的方法。该方法根据藻与细菌所具有不同的细胞特性，通过流式细胞仪分选技术，可以快速有效的减少并去除微囊藻培养中的细菌，获得无菌微囊藻，从而用于微囊藻分子、生理等特点的研究。
本发明所采用的技术方案如下：
微囊藻培养液中细菌去除的方法，其特征在于首先打散微囊藻与细菌之间的粘附，其次通过流式细胞仪分选技术，以及分部收集，可以获得微囊藻的无菌培养。
本发明所述的方法，其特征在于，采用如下步骤进行微囊藻的纯化：
（1）调节微囊藻培养液浓度
（2）超声处理培养液
（3）采用流式细胞仪对微囊藻进行多次分选，初步获得微囊藻的纯培养。
（4）进一步采用分部收集或者划线法纯化，从而获得无菌微囊藻。
本发明所述的方法，，其特征在于，步骤（1）所述细胞浓度为104-105个/ml。
本发明所述的方法，，其特征在于，步骤（2）所述的超声处理条件为: 超声波频率20-45 kHz, 功率为30W，工作3s-5s，共三次
本发明所述的方法，，其特征在于，步骤（3）在流式细胞仪中进行。
本发明所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
①低功率超声波打散：破坏微囊藻与污染细菌之间的粘附，采用低功率30 W的超声波方法，达到不破坏藻细胞，但是将聚集的细胞分散开。工作3 s，间歇3s，打散，镜检。
②流式细胞仪的灭菌处理：首先用70%乙醇冲洗除去流式细胞仪管道中的细菌，然后采用PBS冲洗半小时，并作为分选鞘液。其次，开紫外照射工作台，已达到无菌工作状态。
③流式分选：通过侧向散射光（SSC，依据BD公司2.49um的nile小球，圈定约3um的区域），并通过荧光3 通道（FL3,激发波长为488nm，功率为80mW,微囊藻自带的叶绿素a红色荧光信号），将待处理的微囊藻培养液以低速率200-300个细胞/秒进样。根据所圈定的范围，收集微囊藻细胞，采用无菌BG11培养基进行收集，作为初次分选微囊藻。
④将第一次分选液作为待分选的培养液，按照同样的设置进行，收集为二次分选液，以此类推，一般获得三次分选培养液，可将绝大部分细菌去除。
⑤将第三次分选液通过分部收集或者在BG11固体培养基上划线培养，可以获得无菌微囊藻。其中分部收集可立即获得微量的无菌微囊藻；划线培养一般需要一个月的时间能获得微囊藻无菌藻落，然后再转接无菌BG11液体培养基培养。
本发明所带来的有益效果为：
可以高效快速的得到无菌微囊藻，并且不会对藻细胞造成不可恢复的伤害。对于需要微量的无菌微囊藻进行分子生物学的研究，使用本发明，只需要一天就能获得。
附图说明：
图1 微囊藻培养中的显微镜检照片；
图2 经过流式细胞仪初次分选后的微囊藻的显微图片；
图3经过流式细胞仪三次分选后的微囊藻的显微图片；
图4 流式细胞仪分选门的设定。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明所述工艺以及材料进行详细说明。
具体操作步骤如下：
①首先经过低功率超声波打散的方法，将粘附于微囊藻细胞的细菌与微囊藻细胞分离开。所选用的超声波频率20-45 kHz, 功率为为30 W,工作3s-5s，共三次。通过DAPI染色，显微镜镜检检测，以不破坏藻细胞，但是使粘附的细胞分散开为目标。
②其次，稀释微囊藻培养液，浓度约为104-105cells/ml。
③预先采用75%的乙醇冲洗流式细胞仪的管道，然后采用PBS冲洗半小时，并作为分选鞘液。打开紫外照射流式细胞仪的工作台，达到无菌状态。并准备好接收所分选微囊藻的无菌BG11培养基。
④设置分选条件：根据微囊藻具有叶绿素a自发荧光而细菌没有，选择荧光3 通道（FL3,激发波长为488nm，功率为80mW）叶绿素a 荧光；根据微囊藻细胞大小一般在2.5um以上，而细菌大小一般小于1um，设定侧向散射光（SSC，依据BD公司2.49um的nile小球，圈定约3um的区域，将待处理的微囊藻培养液以低速率200-300个细胞/秒进样。根据所圈定的范围（图4，P1），收集微囊藻细胞，作为初次分选微囊藻。
⑤将初次分选微囊藻再进样到流式细胞仪，采用相同的条件进行分选，收集微囊藻细胞，作为二次分选微囊藻，以此类推。在此过程中，微囊藻中的细菌会大幅减少，一般经过第三次分选可以获得无菌微囊藻。此外，在本步骤中，可以将第三次分选微囊藻收集在不同的试管中，即分部收集，或者采用一次划线培养的方法，即可以获得无菌的微囊藻藻落。
由图可知，通过三次分选，原本含有细菌的微囊藻不断纯化，最终获得了无菌微囊藻纯种。

Claims (6)

1.获取无菌微囊藻纯种的方法，其特征在于,首先打散微囊藻与细菌之间的粘附，其次通过流式细胞仪分选技术，以及分部收集，可以获得微囊藻的无菌培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用如下步骤进行蓝藻的纯化：
（1）调节微囊藻培养液浓度
（2）超声处理培养液
（3）采用流式细胞仪对微囊藻进行2次以上分选，初步获得微囊藻的纯培养
（4）进一步采用分部收集或者划线法纯化，从而获得无菌微囊藻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述细胞浓度为104-105个/ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的超声处理条件为: 超声波频率20-45 kHz，功率为30 W，工作3s-5s，共三次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）在流式细胞仪中进行。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
①低功率超声波打散：破坏微囊藻与污染细菌之间的粘附，采用低功率30 W的超声波方法，达到不破坏藻细胞，但是将聚集的细胞分散开；
工作3 s，间歇3s，打散，镜检；
②流式细胞仪的灭菌处理：首先用70%乙醇冲洗除去流式细胞仪管道中的细菌，然后采用PBS冲洗半小时，并作为分选鞘液；
其次，开紫外照射工作台，以达到无菌工作状态；
③流式分选：通过侧向散射光（SSC，依据BD公司2.49um的nile小球，圈定约3um的区域），并通过荧光3 通道（FL3,激发波长为488nm，叶绿素a 荧光），将待处理的微囊藻培养液以低速率200-300个细胞/秒进样；
根据所圈定的范围，收集微囊藻细胞，采用无菌BG11培养基进行收集，作为初次分选微囊藻；
④将第一次分选液作为待分选的培养液，按照同样的设置进行，收集为二次分选液，以此类推，一般获得三次分选培养液，可将绝大部分细菌去除；
⑤将第三次分选液通过分部收集或者在BG11固体培养基上划线培养，可以获得无菌微囊藻；
其中分部收集可立即获得微量的无菌微囊藻；划线培养一般需要一个月的时间能获得微囊藻无菌藻落，然后再转接无菌BG11液体培养基培养。
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