CN103813845A

CN103813845A - 从培养物离析微生物的方法和试剂盒

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Publication number: CN103813845A
Application number: CN201280046148.8A
Authority: CN
Inventors: 琼斯·海曼; 约翰·沃尔什; 罗尼·鲁宾逊; 克里斯托弗·龙西克
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-07-20
Also published as: US20130045532A1; US10774300B2; EP2734280A4; EP3434759A1; WO2013016211A1; EP2734280A1; CN103813845B

Abstract

本发明涉及用于分离、积聚、表征和/或识别已知在测试样品中存在或可能在测试样品中存在的微生物的方法和试剂盒。本发明的方法包括可选择地裂解可能在测试样品中存在的非微生物细胞和/或微粒，随后是后续的用于微生物的离析和/或积聚的过滤步骤。本发明的试剂盒可以包括至少一个用于微生物的离析和/或积聚的过滤膜或集成的过滤和样品转移装置。

Description

从培养物离析微生物的方法和试剂盒

发明领域

本发明涉及用于从样品离析、积聚和/或纯化微生物的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及用于通过过滤从液体样品（例如培养基或血液培养物）离析、积聚和/或纯化微生物的方法和试剂盒。

发明背景

生物流体中的病原性微生物的检测应当在最短的可能的时间内进行，特别是在败血症的情况下，对于败血症来说，死亡率仍然是高的，虽然具有宽范围的为医生可用的抗生素。生物活性剂例如微生物在患者的体液特别是血液中的存在通常使用血液培养瓶来确定。血流感染与高的发病率和死亡率相关联，而培养和随后的生物化学识别和抗生素易感性测试的当前诊断方法，可以耗费几日来进行。通常，经验的疗法基于临床症状来开始，并且测试结果仅当初始的疗法失败时影响临床决定。在阳性血液培养物结果之后前几个小时内，优选地在一个小时内，表征血流感染的能力将显著地促进所提供的诊断信息的临床相关性。分子扩增方法已经被提出以满足这个需要，但是还有对该方法的严重的挑战。阳性血液培养物肉汤本身代表具有用于多种快速识别（ID）测试中的潜力的微生物的天然扩增种群。

传统的自动化的表型ID测试，例如

Phoenix^TM以及系统，或手动的表型测试例如API，要求微生物应当在合适的生长期中并且不干涉介质和血液制品以提供可靠的结果。这些系统使用在铺板的培养基（plated media）上从阳性肉汤生长18-24小时的菌落。然而，在为了获得更快的结果的努力中，某些实验室已经报道使用这些系统，且从阳性血液培养瓶离析微生物。这些直接从瓶的测试不是对于所有的微生物（例如革兰氏阳性球菌）都合适的，没有被测试制造商验证，并且通常耗费3-8小时以提供结果。迫切地需要更快的并且更宽泛地专一性测试，以在阳性培养结果之后前几个小时内，优选地在一个小时内，向医师提供临床上有关的结果。

质谱法具有允许非常迅速地识别微生物的潜力，但是可能遭遇来自在液体微生物培养基中以及在临床样品例如血液或其组合中存在的许多化合物的干扰。最普遍地采用的用于直接地从阳性血液培养物肉汤回收微生物的方法是两步骤差速离心以及在血清分离管中离心。

其他的用于分离、表征和/或识别微生物的方法已经被描述，包括：

在美国专利第7,070,739号中，提出了用于通过直接地从体液或均质化组织二维超离心来提取、分离和纯化微生物（包括病毒）的方法。在第一离心步骤中，除去所有的具有高于待被识别的微生物的沉降速度的沉降速度的颗粒。在第二超离心步骤中，使用专门的锯齿状的离心管，在被填充的液体中使用等密度条带，以形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术可以用于通过光散射或使用核酸专一性染料的荧光来检测被分带的颗粒，以及用于回收非常小体积的被分带的颗粒以用于通过质谱法表征病毒蛋白亚单位和完整的病毒颗粒以及通过荧光流动细胞计数确定核酸块和由限制性内切酶产生的片段的块二者。

EP0533912A描述了用于透析流体和尿液的样品预处理设备和方法。该专利申请描述了大孔径大小的预过滤器用于除去典型的尿沉渣例如血细胞、上皮细胞、脱落物、黏液和晶体的用途。存在的任何细菌通过预过滤器并且被捕获在第二下游过滤器上。被捕获的细菌然后通过手动地拆卸堆叠装置来取得。

美国专利申请公布第2007/0175278号描述了使用液体培养基来培养感兴趣的样品，包括例如血液、尿液、粪便、静脉内导管等等，工业生产线、水体系、食品产品、化妆品产品、药物产品和法医样品。随后，微生物可以通过本领域中已知的方法例如通过离心而被从液体介质收获。已浓缩的微生物可以然后被传递至载体材料，可选择地在干燥之后，以获得振动光谱。该专利申请讨论了各种用于识别和分类微生物的方法，包括振动光谱学，例如拉曼光谱学。

然而，这些方法当尝试从某些临床测试样品（例如复杂的样品，例如含有血液的培养基）分离和表征微生物时具有几个缺点。在含有血液的培养基的情况下，所得到的微生物制剂经常含有污染性的红血球、血小板、脂类颗粒、血浆酶和细胞碎屑，这可以导致差的结果。这些方法还是非常劳动密集的并且不安全的，这是由于可以导致对使用者潜在地危险的病原体的气溶胶暴露的步骤。

共同转让的美国专利申请公布第2010/0120085号被并入本文，描述了用于分离、表征和/或识别测试样品中的微生物的方法。方法描述了样品制备程序，该程序包括选择性裂解步骤以及后续的用于从测试样品离析和纯化未知的微生物以用于使用质谱法识别微生物的分离步骤。该申请还描述了使用过滤来从测试样品离析和纯化未知的微生物。

然而，对与快速识别技术例如质谱法兼容的改进的用于从临床测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的样品制备方法和试剂盒仍然存在需要。本文描述的方法和装置产生对于分析，例如通过质谱法，特别是对于MALDI-TOF MS分析来说最佳的清洁的浓缩的微生物样品。

发明概述

本发明涉及用于从测试样品（例如培养基）离析、积聚和/或纯化微生物的方法和试剂盒。然后，已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物可以被用于多种直接测试应用（例如光谱、质谱、分子、免疫、胶乳测试等等）。

在一个方面，本发明涉及从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的方法，包括：

（a）获得已知含有微生物或可能含有微生物的测试样品；

（b）可选择地裂解所述测试样品中的非微生物细胞和/或微粒，产生已裂解的样品；以及

（c）通过使用过滤膜和/或过滤装置的过滤从所述测试样品或所述已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物。

在一个实施方案中，已离析的或已积聚的微生物的样品可以被分析或询问以用于微生物的表征和/或识别。通常，任何本领域中已知的用于未知的微生物的表征和/或识别的手段都可以被使用。例如，已离析的和/或已积聚的微生物的样品可以使用光谱询问，例如基于微生物的内在特性（例如固有荧光）或组成分子的振动结构（例如拉曼光谱）的光谱询问来分析或询问。在另一个实施方案中，已离析的或已积聚的微生物可以通过质谱法（例如MALDI-TOF-MS）来分析。

在另一个方面，本发明涉及从血液培养物离析、积聚和/或纯化微生物的方法，包括：

（a）获得来自已知含有微生物或可能含有微生物的血液培养物的样品；

（b）可选择地裂解所述样品中的非微生物细胞和/或微粒以产生已裂解的样品；

（c）通过使用过滤膜和/或过滤装置的过滤从所述已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物。

在又一个方面，本发明涉及一种用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒，包括，在已包装的组合中：

（a）可选择的选择性裂解溶液或缓冲剂，其用于已知在测试样品中存在或可能在测试样品中存在的非微生物的选择性裂解；

（b）至少一种过滤膜，其具有小至足以防止微生物通过过滤器但是允许样品中的其他组分（例如已裂解的非微生物细胞和/或碎屑）通过过滤器的孔径大小；以及

（c）至少一种洗涤缓冲剂，其用于洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物样品。

在一个实施方案中，试剂盒还可以包括裂解步骤能够在其内进行的容器（例如管）。在又一个实施方案中，过滤装置可以是具有可重复使用的过滤器保持器的侧臂真空瓶或具有滤液储器的歧管，该歧管可选择地具有多个可重复使用的端口或过滤器保持器。在还其他实施方案中，试剂盒还可以包括另外的用于过滤的部件，例如，试剂盒可以包括一个或多个管、夹具、阀或真空阱。在另一个实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个具有内置过滤膜的一次性过滤器单元。在这些一次性过滤器单元中，过滤可以通过真空源或通过离心来实现。在还另一个实施方案中，试剂盒还可以包括真空源、真空系统或离心机。

在另一个方面，本发明涉及一种用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒，包括，在已包装的组合中：

（b）至少一个集成的过滤和样品转移装置，其用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物并且用于后续的微生物的收获和转移；以及

附图简述

图1示出了根据本发明的方法的示意图。方法包括以下步骤：（1）获得测试样品；（2）选择性地裂解可能在样品中存在的非微生物；（3）离析、积聚和/或纯化微生物；（4）使用洗涤缓冲剂洗涤已离析的微生物；以及（5）可选择地收获或收集已离析的微生物（例如使用微拭子（micro-swab））。

图2示出了可以在本发明的方法或试剂盒中使用的示例性过滤装置（侧臂真空瓶）的照片。

图3示出了可以在本发明的方法或试剂盒中使用的包括具有多个可重复使用的端口或过滤器保持器的过滤器歧管的过滤装置的另一个可能的实施方案的示意图。

图4A示出了根据本发明的集成的过滤和样品转移装置的第二设计构思的前视图。图4B示出了装置的横截面图并且图4C示出了装置的第一端部的详细的视图。

图5A示出了在图3中图示的集成的过滤和样品转移装置的分解图并且图5B示出了装置的第一端部的详细的视图。

图6示出了用图4-5的集成的过滤和样品转移装置促进的包括裂解步骤、分离步骤和转移步骤的方法的示意图。

发明的详细描述

定义。

如本文所使用的，“一个（a）”、“一个（an）”或“该（the）”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。

还如本文所使用的，“和/或”指代并且包括相关联的列出的条目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以两者取一（“或”）解释时组合的缺乏。

此外，如本文使用的，术语“约”，当关于可测量的值例如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度和类似的时，意指包括指定的量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。

如本文所使用的，术语“微生物”意图包括通常是单细胞的，可以在实验室中繁殖和处理的生物，包括但不限于，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、寄生虫和柔膜细菌。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性实例包括以下的属的细菌：假单胞菌属（Pseudomonas）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏菌属（Shigella）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷白氏杆菌属（Klebsiella）、沙雷氏菌属（Serratia）、变形杆菌属（Proteus）、弯曲菌属（Campylobacter）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、摩根氏菌属（Morganella）、弧菌属（Vibrio）、耶尔森菌属（Yersinia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、养单胞菌属（Stenotrophomonas）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、无色杆菌属（Achromobacter）、梭菌属（Fusobacterium）、普氏菌属（Prevotella）、布兰汉氏球菌属（Branhamella）、奈瑟菌属（Neisseria）、伯克氏菌属（Burkholderia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、哈夫尼菌属（Hafnia）、爱德华菌属（Edwardsiella）、气单胞菌属（Aeromonas）、莫拉氏菌属（Moraxella）、布氏杆菌属（Brucella）、巴氏杆菌属（Pasteurella）、普罗维登斯菌属（Providencia）和军团菌属（Legionella）。本发明的革兰氏阳性细菌的非限制性实例包括以下的属的细菌：肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、李斯特菌属（Listeria）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、丙酸菌属（Propionibacterium）、梭菌属（Clostridium）、拟杆菌属（Bacteroides）、加德纳菌属（Gardnerella）、考克氏菌属（Kocuria）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、微球菌属（Micrococcus）、分支杆菌属（Mycobacteria）和棒状杆菌属（Corynebacteria）。本发明的酵母和霉菌的非限制性实例包括以下的属的那些：假丝酵母属（Candida）、隐球菌属（Cryptococcus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、青霉菌属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）、红酵母属（Rhodotorula）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、酵母菌属（Saccharomyces）和毛孢子菌属（Trichosporon）。本发明的寄生虫的非限制性实例包括以下的属的那些：锥体虫属（Trypanosoma）、巴倍虫属（Babesia）、利什曼原虫属（Leishmania）、疟原虫属（Plasmodium）、丝虫属（Wucheria）、布鲁格丝虫属（Brugia）、盘尾属（Onchocerca）和耐格里属（Naegleria）。本发明的柔膜细菌的非限制性实例包括以下的属的那些：支原体属（Mycoplasma）和脲原体属（Ureaplasma）。

在一个实施方案中，如本文更详细地描述的，来自样品或生长介质的微生物可以被“分离”或“离析”。如本文所使用的，术语“分离”意图涵盖任何已经从其最初状态或从生长介质或培养基被移除、浓缩或以其他方式分出的微生物的样品。例如，根据本发明，可以通过本领域中已知的手段（例如通过质谱法）将微生物和非微生物或非微生物组分分开（例如作为分离的微生物样品或块），如果不这样，非微生物或非微生物组分就干扰未知的微生物的任何后续的表征和/或识别。该术语可以包括被收集在固体表面（例如过滤膜）上的微生物的层。因此，已分离的微生物样品（或微生物的块或薄膜）可以包括比最初的样品更浓缩或以其他方式从最初的样品分出的微生物和/或其组分的任何聚集体或层，并且范围可以从微生物的紧密堆积密实块至微生物的扩散层。可以以分离的形式或样品被包含的微生物组分包括但不限于，在任何组合中的纤毛、鞭毛、菌毛和被膜。与微生物分开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）、尿管型或晶体和/或其任何组分。如本文所使用的，术语“离析”意图涵盖任何已经从其最初状态或从生长或培养介质至少部分地纯化的微生物的样品，以及任何包含在其中的非微生物或非微生物组分。例如，根据本发明，可以通过本领域中已知的手段（例如通过质谱法）将微生物和非微生物或非微生物组分离析开（例如作为已离析的样品），如果不这样，非微生物或非微生物组分可以干扰未知的微生物的任何后续的表征和/或识别。与微生物分开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）和/或其任何组分。

在一个实施方案中，如本文更详细地描述的，来自样品或生长介质的微生物可以被“积聚”或“捕获”在过滤材料（例如过滤膜）中或上。如本文所使用的，术语“积聚”或“捕获”意图涵盖任何已经被压缩或沉积为微生物的块或膜的微生物样品。例如，来自样品的微生物可以通过过滤在过滤材料（例如过滤膜）上被压缩或沉积为块或膜。该术语包括在过滤（例如真空过滤）之后在过滤材料（例如过滤膜）的表面上的微生物（和/或其组分）的聚集体。可以被包含在微生物的已压缩的或已沉积的块中的微生物组分包括但不限于，在任何组合中的纤毛、鞭毛、菌毛和被膜。根据本发明，可以例如通过质谱法将微生物从非微生物或非微生物组分压缩或沉积为块（例如作为实质上纯化的微生物块），如果不这样，非微生物或非微生物组分可以干扰未知的微生物的任何后续的表征和/或识别。与微生物离析开或分开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）和/或其任何组分。

如本文所使用的，术语“分析所述已离析的或已积聚的样品”意图涵盖所有的熟知的用于分析、询问、获得或以其他方式获取可以用于微生物（例如未知的微生物）的表征和/或识别的测量结果或数据的方法或手段。例如，已离析的或已积聚的微生物的块可以通过光谱方法来分析或询问，例如基于微生物的内在特性（例如固有荧光）或组成分子的振动结构（例如拉曼光谱）。在另一个实施方案中，已离析的或已积聚的微生物的块可以通过质谱法方法（例如MALDI-TOF-MS）来分析或询问，以用于获取可以用于未知的微生物的表征和/或识别的测量结果或数据，如在下文更详细地讨论的。

详细描述

以其最简单的形式，本发明的方法涉及三步骤过程：（1）获得已知含有微生物或可能含有微生物的测试样品；（2）可选择的裂解步骤，其用于所述样品中的非微生物细胞和/或微粒的选择性裂解以产生已裂解的样品；以及（3）过滤步骤，其用于离析、积聚和/或纯化任何可能在测试样品中的微生物。可选择地，已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物可以在过滤步骤之后被收获或收集，例如使用微拭子。

在本发明的方法中涉及的步骤，从获得样品至微生物的离析、积聚和/或纯化，可以在非常短的时间范围中进行以获得临床上有关的可付诸行动的信息（actionable information）。在某些实施方案中，本发明的方法可以在小于约60分钟内，例如在小于约50、40、30、20、10、5分钟内进行。

方法可以用于离析、积聚和/或纯化任何微生物，如本文描述的。在一个实施方案中，微生物是细菌。在另一个实施方案中，微生物是酵母。在还另一个实施方案中，微生物是霉菌。在一个另外的实施方案中，微生物是寄生虫。在另一个实施方案中，微生物是柔膜体。此外，本发明的方法可以是完全自动化的，由此减少处理传染性材料和/或污染样品的风险。

在一个实施方案中，样品和裂解溶液或缓冲剂被混合并且然后被温育持续足以使细胞膜裂解和增溶的时间，例如约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或60秒，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20分钟或更长，例如约1秒至约20分钟，约1秒至约5分钟，或约1秒至约2分钟。在另一个实施方案中，样品和裂解溶液被温育约30秒至约5分钟，或约1分钟至约3分钟。温育时间将取决于裂解溶液的强度，例如清洁剂和/或酶的浓度。通常，较温和的裂解溶液将需要更多的时间和样品的更大的稀释度以完全使非微生物细胞增溶。裂解溶液的强度可以基于已知在样品中或被怀疑在样品中的微生物来选择。对于更易于裂解的微生物，温和的裂解溶液可以被使用。裂解可以在约0℃至约60℃、约15℃至约40℃、约20℃至约40℃或约30℃至约40℃的温度下发生。

本发明的方法中的下一个步骤（例如在样品已经被裂解之后的步骤，如果进行裂解或溶解步骤的话）是分离、离析和/或积聚步骤。分离、离析和/或积聚步骤可以被进行以从样品的其他组分（例如非微生物或其组分）分离和离析或纯化微生物并且将微生物积聚或捕获为可以用于后续的测试（例如用于表征和/或识别）的块。分离、离析和/或积聚不必须是完全的，即，不要求发生100%分离。全部需要的仅是，微生物从样品的其他组分的分离、离析和/或积聚应足以允许微生物的分析或询问，而没有来自其他组分的很大的干扰。例如，分离/离析可以导致是至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、或99%纯的或更高的已积聚的或已捕获的微生物块。

过滤步骤通过使液体样品通过过滤器来进行，该过滤器具有将微生物保留在过滤器上但是允许样品中的其他组分（例如已裂解的非微生物细胞和/或碎屑）通过过滤器的孔径大小。用于该目的合适的过滤器是由随机成层纤维组成并且具有约0.05至约1.0μm的孔径大小或约0.1至约0.8μm的孔径大小的深度过滤器。这样的基质材料包括但不意图限于，棉花、玻璃纤维、编织材料例如布、尼龙、或其他聚合物材料。本发明的方法可以使用任何过滤装置或系统来实践，包括其中真空被用于将液体抽过过滤器的实验室装置。一个示例性过滤装置和系统在图2-4中示出。

根据本发明，分离、离析和/或积聚步骤作为过滤步骤被进行，其允许微生物从可能在样品中存在的其他组分分离、离析和/或积聚（例如微生物可以被积聚或捕获在过滤材料（例如过滤膜）上）。根据本实施方案，样品的其他组分（例如可能在样品介质中存在的非微生物或其组分）通过过滤材料。因此，该过滤步骤从样品中的材料离析、分离和/或积聚微生物，样品中的材料例如介质、细胞碎屑和/或其他可以干扰微生物的任何后续的测试例如分析或询问用于表征和/或识别（例如通过质谱法）的组分。

因此，本公开内容描述了用于微生物的离析、积聚和/或纯化的通过过滤步骤促进的快速地从样品（例如阳性液体培养物）处理微生物的方法。现在参照图1，示出了示例性的用于分离/离析、捕获和积聚和可选择的收获的方法。如在图1中示出的，该方法涉及以下的步骤：（1）获得已知含有或可能含有微生物的测试样品（例如阳性血液培养物）（被标记为步骤1）；（2）将选择性裂解溶液或缓冲剂加入测试样品中以选择性地裂解任何在测试样品中存在的非微生物细胞，由此产生已裂解的样品（步骤2）；（3）将已裂解的样品转移至具有过滤材料的过滤装置并且将真空施加于过滤装置，由此将已裂解的样品经过过滤材料（例如过滤膜）过滤，由此在过滤材料上离析、积聚和/或纯化微生物（步骤3）；（4）使用洗涤缓冲剂洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物（步骤4）；以及（5）可选择地收获已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物，例如使用微拭子。

在一个实施方案中，用于从血液培养物离析、积聚和/或纯化微生物的方法包括以下的连续的步骤：

（1）将血液培养物样品（例如来自阳性血液培养瓶的2ml样品）转移至容器或管；

（2）将选择性裂解溶液或缓冲剂（例如1ml的裂解溶液）加入容器或管中；

（3）混合血液培养物样品和裂解溶液（例如通过将管涡旋）；

（4）温育样品（例如在室温持续2min）以形成已裂解的样品；

（5）将已裂解的样品应用于过滤膜，同时将真空从真空源抽过过滤材料以在过滤膜上离析、积聚或纯化微生物；

（6）将至少一种洗涤缓冲剂应用于过滤膜；并且允许完全地通过膜；以及

（10）可选择地从过滤材料收获已离析的、已积聚的或已纯化的微生物（例如使用转移装置）。

在另一个实施方案中，集成的过滤和样品转移装置，例如，如在标题为“Methods for the Isolation,Accumulation,Characterization and/orIdentification of Microorganisms using a Filtration and Sample TransferDevice”的共同待审的美国临时专利申请系列第61/424,418号（其被并入本文）中公开的，可以在本发明的方法中使用。简要地，过滤和样品转移装置可操作为用于通过真空过滤从测试样品分离、捕获和积聚微生物以及后续的将已捕获的和已积聚的微生物（例如作为块或膜）转移至测试载玻片或板，用于微生物的分析或询问（例如通过质谱法）。在一个实施方案中，过滤和样品转移装置包括具有中空的长形的主体（例如圆柱形的、六边形的、或相似形状的长形的中空的管）的集成的过滤和样品转移装置，中空的长形的主体具有设置有或盖有过滤材料（例如过滤膜）的第一端部以及适于连接至真空系统或装置的第二端部。中空的圆柱形的主体可以由玻璃、塑料、金属或其他材料制造。

根据本实施方案，方法涉及将微生物捕获和积聚在过滤材料上或中，以及后续的将已积聚的微生物转移至载玻片或目标板，用于质谱分析。现在参照图6，示出了示例性的用于分离/离析、捕获和积聚微生物以及后续的转移微生物用于质谱分析的方法。如在图6中示出的，该方法涉及以下的步骤：（1）获得已知含有或可能含有微生物的测试样品（例如阳性血液培养物）（被标记为步骤1）；（2）选择性地裂解测试样品中的非微生物细胞，由此产生已裂解的样品（步骤2）；（3）将过滤和样品转移装置（如在本文中在别处描述的）浸没入已裂解的样品中（步骤3）；（4）将真空施加于过滤和样品转移装置，由此将已裂解的样品向上过滤经过过滤器，由此将微生物捕获在集成的过滤和转移装置的过滤材料上（步骤4）；（5）将过滤和转移装置转移至洗涤流体或缓冲剂，用于洗涤过滤器（步骤5）；（6）通过在过滤和转移装置中施加或抽动真空，由此将洗涤流体或缓冲剂向上抽过过滤器来洗涤过滤器，并且从而洗涤任何被捕获在过滤材料上的微生物（步骤6）；（7）将过滤和转移装置转移至MALDI-TOF目标板（在下文更详细地描述）（步骤7）；（8）将微生物沉积在MALDI-TOF目标板的表面上（例如使用拍毛技术）（步骤8）；（9）将基质溶液加入在板上的微生物样品中（在下文更详细地描述）（步骤9）；以及（10）使用MALDI-TOF获取微生物样品的质谱（如下文描述的）（未示出）。

测试样品。

可以通过本发明的方法和试剂盒从其离析、积聚和/或纯化微生物的测试样品包括微生物存在和/或生长在其中或可以被怀疑在其中的临床样品和非临床样品二者，以及日常地或偶尔地被测试微生物的存在的材料的样品。所利用的样品的量可以极大地变化，这是由于方法的通用性和/或灵感性。样品制备可以通过本领域的技术人员已知的许多技术来进行，尽管本发明的优点中的一个是复杂的样品类型（例如血液、体液和/或其他的不透明的物质）可以直接地利用系统来测试，具有很少的或没有大量的预处理。在一个实施方案中，从培养物取得样品。在另一个实施方案中，从微生物培养物（例如血液培养物）取得样品。在另一个实施方案中，样品被怀疑或已知含有在其中的微生物。

可以被测试的临床样品包括任何类型的通常在临床的或研究的实验室中被测试的样品，包括但不限于，血液、血清、血浆、血液组分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓穿刺液、骨匀浆、痰、抽出物、拭子和拭子残渣、其他体液和类似物。在另一个实施方案中，临床样品可以被培养，并且培养物样品可以被使用。

本发明在研究以及兽医应用和医疗应用方面得到应用。可以从其获得临床样品的合适的受试者通常是哺乳动物受试者，但是可以是任何动物。如本文所使用的术语“哺乳动物”包括但不限于，人、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物（例如大鼠或小鼠）等等。人受试者包括新生儿、婴儿、青少年、成年和老年受试者。可以从其获得样品的受试者包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼。

可以被测试的非临床样品还包括物质，包括但不限于，食品产品、饮料、药物、化妆品、水（例如饮用水、非饮用水和废水）、海水压载物、空气、土壤、污水、植物材料（例如种子、叶、茎、根、花、果实）、血液制品（例如血小板、血清、血浆、白血球部分等等）、供体器官或组织样品、生物战样品、和类似物。方法也特别地良好地适合于工业设置中的用于监测污染水平的实时测试、过程控制、质量控制和类似的。在另一个实施方案中，非临床样品可以被培养，并且培养物样品可以被使用。

在本发明的一个实施方案中，从具有或被怀疑具有微生物感染的受试者（例如患者）获得样品。在一个实施方案中，受试者患有或被怀疑患有败血症，例如菌血症或真菌血症。样品可以是直接地来自受试者的血液样品。样品可以来自从患者的血液样品生长的血液培养物，例如血液培养物。血液培养物样品可以来自阳性血液培养物，例如指示微生物的存在的血液培养物。在某些实施方案中，在阳性血液培养物转化为阳性之后的短时间内，例如在约6小时内，例如在约5、4、3、或2小时内，或在约60分钟内，例如约55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5分钟内从阳性血液培养物取得样品。在一个实施方案中，从微生物在对数生长期中的培养物取得样品。在另一个实施方案中，从微生物在静止期中的培养物取得样品。

在某些实施方案中，为了帮助粘附的微生物例如从吸附剂颗粒的回收，用于含有吸附剂的样品的熟知的预处理步骤可以被使用。例如，表面活性剂（例如Tween80）可以被加入并且样品可以被涡旋。在其他实施方案中，样品还可以被声处理以分解生物膜并且释放完整的微生物。实例包括结合于木炭颗粒的金黄色葡萄球菌（S.aureus）。

在本发明的一个实施方案中，样品的体积应当大至足以产生可以然后被分析或询问以用于在进行本发明的方法的分离/离析步骤之后表征和/或识别（例如通过质谱法）所述微生物的已离析的和/或已积聚的微生物的样品或微生物的块。合适的体积将取决于样品的源以及样品中的微生物的预期水平。例如，阳性血液培养物将含有比待被测试污染的饮用水样品高的每体积的微生物的水平，所以与饮用水样品相比，更小的体积的血液培养基可以被需要。通常，样品大小可以是小于约50ml，例如小于约40、30、20、15、10、5、4、3、或2ml。在某些实施方案中，样品大小可以是约1ml，例如约0.75、0.5、或0.25ml。在以微尺度进行分离的某些实施方案中，样品大小可以是小于约200μl，例如小于约150、100、50、25、20、15、10、或5μl。在某些实施方案中（例如当样品被预期包含少数量的微生物时），样品大小可以是约100ml或更多，例如约250、500、750、或1000ml或更多。

试剂盒。

本发明还涉及用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒。以其最简单的形式，本发明的试剂盒将包括：（1）可选择的裂解溶液或缓冲剂，其用于已知在测试样品中存在或可能在测试样品中存在的非微生物的选择性裂解；（2）用于离析、积聚和/或纯化任何可能在测试样品中的微生物的过滤膜和/或装置；以及（3）至少一种洗涤缓冲剂。

在另一个实施方案中，本发明还涉及用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒，其中试剂盒包括至少一个集成的过滤和样品转移装置，如在本文中在别处公开的。根据本实施方案的试剂盒将包括：（1）可选择的裂解溶液或缓冲剂，其用于已知在测试样品中存在或可能在测试样品中存在的非微生物的选择性裂解；（2）至少一个集成的过滤和样品转移装置，其用于离析、积聚和/或纯化任何可能在测试样品中的微生物；以及（3）至少一种洗涤缓冲剂。

可选择地，试剂盒可以包括用于选择性地裂解或溶解可能在测试样品中存在的非期望的细胞和/或微粒例如血细胞和/或组织细胞的选择性裂解溶液或缓冲剂。细胞和/或微粒可以被裂解或溶解以允许从样品的其他组分分离和/或离析微生物。从其他组分分离和/或离析微生物防止在任何后续的直接测试应用期间的干扰，例如用于微生物的表征和/或识别的分析或询问（例如通过质谱法）或在血液培养物肉汤上的宽范围微生物PCR的性能。然而，如果非微生物细胞不被预期在样品中存在或不被预期干扰任何后续的测试，那么裂解步骤可以不需要被进行。

通常，选择性裂解溶液可以用于裂解或溶解可能在测试样品中存在的非微生物细胞。然而，在某些实施方案中，特定的类别的微生物的选择性裂解可以是期望的并且因此可以根据本文描述的方法来进行并且如本领域中熟知的。例如，一类别的非期望的微生物可以被选择性地裂解，例如酵母被裂解而细菌不被裂解，或反之亦然。在另一个实施方案中，期望的微生物被裂解以分离微生物的特定的亚细胞组分，例如细胞膜或细胞器。在一个实施方案中，所有的非微生物细胞都被裂解。在其他实施方案中，非微生物细胞的一部分被裂解，例如足以防止干扰询问步骤的细胞。细胞的裂解可以通过本领域中已知有效选择性地裂解细胞同时裂解或不裂解微生物的任何方法来进行，包括但不限于裂解溶液的加入、声处理、渗透压休克、化学处理和/或其组合。

裂解溶液是能够裂解细胞例如非微生物细胞（例如通过增溶或溶解真核细胞膜）和/或微生物细胞的溶液。在一个实施方案中，裂解溶液可以包含一种或多种清洁剂，可选择的一种或多种酶，或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合，并且还可以包含另外的剂。在一个实施方案中，清洁剂可以是非变性裂解清洁剂，例如

X-100、

X-100-R、

X-114、NP-40、

C-100、X-100、

CA630、Arlasolve^TM200、

96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、和单十二烷基九乙二醇醚（C12E9，聚多卡醇）。可选择地，变性裂解清洁剂可以被包含，例如十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14、和C7BzO。可选择地，增溶剂还可以被包含，例如

98、

58、

35、

80、

20、

L64、

P84、非清洁剂磺基甜菜通常，非变性清洁剂和增溶剂以高于它们的临界胶束浓度（CMC）的浓度被使用，而变性清洁剂可以以低于它们的CMC的浓度被加入。例如，非变性裂解清洁剂可以以约0.010%至约10%，例如约0.015%至约1.0%，例如约0.05%至约0.5%，例如约0.10%至约0.30%的浓度（在使用样品稀释之后的最终浓度）被使用。在另一个实施方案中，包含通过醚键键合于疏水烷烃或烯烃“尾”基团的亲水聚氧乙烯“头”基团的清洁剂可以是优选的。这些清洁剂使用形式C_xE_y的符号来共同地指定，其中“x”等于烷烃或烯烃链中的碳的数量，而“y”是聚氧乙烯链中的氧乙烯单体（CH₂CH₂O）的数量。其中x在10-20的范围内并且y在8-12的范围内的这种类型的清洁剂是优选的。甚至更优选的是其中x在12-18的范围内并且y在9-11的范围内的这种类型的清洁剂。例如，烷烃-聚氧乙烯或烯烃-聚氧乙烯清洁剂可以选自由以下组成的组：

97、

96V、

C-100、

X-100、单十二烷基九乙二醇醚（聚多卡醇），或其组合。

可以在裂解溶液中使用的酶包括但不限于，消化核酸和其他污染膜的材料的酶（例如蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、神经氨酸酶、多糖酶、

和

）。可以被使用的其他添加剂包括但不限于，还原剂例如2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）和稳定剂例如镁、丙酮酸盐、以及湿润剂。裂解溶液可以以任何适合于裂解期望的细胞的pH被缓冲，并且将取决于多种因素，包括但不限于，样品的类型、待被裂解的细胞和所使用的清洁剂。在某些实施方案中，pH可以在约2至约13，例如约6至约13，例如约8至约13，例如约10至约13的范围内。合适的pH缓冲剂包括任何能够将pH保持在期望的范围内的缓冲剂，例如约0.05M至约1.0MCAPS。对于某些样品类型（例如尿液），对于不想要的细胞和/或微粒的裂解，最佳的pH可以是约2至约8。

在本发明的实践中所涵盖的裂解溶液的另外的细节和描述在于2009年10月30日提交的标题为“Methods for Isolation and Identification ofMicroorganisms”的共同待审的美国专利申请系列第12/589,929号（现在作为US2010/0129857A1被公布）中被公开，其内容通过引用并入本文。

试剂盒还可以包括至少一个过滤材料（例如过滤膜）和/或装置以离析、积聚和/或纯化任何可能在测试样品中的微生物。通常，任何具有保留微生物的至少某些部分并且允许裂解产物通过的孔径大小的过滤材料可以在本发明的实践中使用。在本发明的实践中使用的过滤材料可以包括本领域中熟知的过滤膜或深度过滤器。在一个实施方案中，过滤膜将具有约0.1μm至约30.0μm，或约0.1μm至约10.0μm，或约0.1μm至约1.0μm的孔径大小。示例性的膜可以包括聚醚砜（PES）膜（例如，Express PLUS（Millipore，Billerica,MA）和

200、450、MachV（Pall-Gelman，Port Washington,NY））。其他的可能的过滤材料可以包括HT（聚砜）、GN

（混合纤维素酯）、

FP Verticel（PVDF），全部来自Pall-Gelman（Port Washington,NY）、以及Nuclepore（聚碳酸酯），来自Whatman（Kent,UK）。示例性的深度过滤器材料可以包括类型GF/F、GF/C和GMF150（玻璃纤维，Whatman）、GD/X组合过滤器（Whatman）、旋转过滤器（例如，VectaSpin，Whatman）、无注射器过滤器（例如，mini-UniPrep，Whatman）、（玻璃纤维，Pall-Gelman）、AP15（玻璃纤维，Millipore）、以及多种纤维素、聚酯、聚丙烯或其他纤维或微粒过滤器，只要过滤介质可以保持足够数量的目标微生物以使分析成为可能。在另一个实施方案中，带电荷的或改性的微粒或纤维过滤材料，例如带ζ电荷的膜，可以被使用。在又一个实施方案中，过滤过程可以由离心（例如来自Whatman的VectaSpin过滤器）或由正压力（例如来自Whatman的Mini-UniPrep装置）来驱动。

在又一个实施方案中，如在本文中在别处在之前讨论的，可以包括一个或多个集成的过滤和样品转移装置，其可操作为通过真空过滤从测试样品分离、捕获和积聚微生物以及后续将已捕获的和已积聚的微生物（例如作为块或膜）转移至测试载玻片或板，用于微生物的分析或询问（例如通过质谱法）。在一个实施方案中，过滤和样品转移装置包括具有中空的长形的主体（例如圆柱形的、六边形的、或相似形状的长形的中空的管）的集成的过滤和样品转移装置，中空的长形的主体具有设置有或盖有过滤材料（例如过滤膜）的第一端部或尖端以及适于连接至真空系统或装置的第二端部。在一个优选的实施方案中，过滤材料（例如过滤膜）定位为毗邻于集成的过滤和样品转移装置的第一端部或尖端并且从集成的过滤和样品转移装置的第一端部或尖端延伸。例如，过滤材料可以在长形的主体的第一端部或尖端的外部（即从长形的主体的第一端部或尖端延伸或突出）。本发明的申请人已经发现，从集成的过滤和样品转移装置的第一端部延伸或突出的过滤材料的使用允许任何已离析的和/或已积聚的微生物的转移，例如通过将样品涂抹或点涂在板或载玻片上。

图4-5图示了包括具有第一端部15和第二端部16的中空的长形的圆柱形的管或主体14的集成的过滤和样品转移装置12。第一端部15设置有或盖有过滤材料17，过滤材料17操作为当真空或吸力被施加于集成的过滤和样品转移装置12时捕获或积聚微生物。在一个优选的实施方案中，过滤材料17毗邻于长形的圆柱形的管或主体14的第一端部或尖端15并且在其外部（即从其延伸或从其突出）。集成的过滤和样品转移装置12的第一端部15还可以包括锥形部分18和向外展开的或平坦的尖端19。在其他实施方案中，第二端部16可以设置有球形物或柱塞以提供用于过滤的吸力。还如示出的，在一个可能的实施方案中，中空的圆柱形形状的主体可以被吸附剂10填充或装填，如上文讨论的。根据本实施方案，吸附剂本身可以提供毛细管作用或芯吸力，毛细管作用或芯吸力提供流体流动用于过滤。

在一个实施方案中，中空的长形的主体由玻璃制造。在另一个实施方案中，中空的长形的主体由刚性的或半刚性的塑料材料例如聚丙烯（PP）、聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或其他塑料材料制造。通常，集成的过滤和样品转移装置包括具有约0.5mm至约10mm，约1mm至约5mm，或约1.5mm至约3mm的过滤尖端直径的长形的大体上圆柱形的主体。在另一个实施方案中，圆柱体的桶可以向外展开至甚至更大直径以能够容纳甚至更大体积的滤液。过滤和转移装置可以具有约2cm至约20cm，约3cm至约15cm，或约4cm至约10cm的长度。在一个实施方案中，集成的过滤和样品转移装置包括具有约1.5mm至约3mm的直径以及约4cm至约10cm的长度的长形的圆柱形的主体。在另一个实施方案中，集成的过滤和样品转移装置包括具有约0.5cm³至约10cm³，约1cm³至约5cm³，或约1.5cm³至约3.5cm³的内部体积的长形的圆柱形的主体。在又一个实施方案中，集成的过滤和样品转移装置包括具有约1.5mm至约3mm的直径以及约4cm至约10cm的长度（或约0.9cm³至约4.7cm³的体积）的长形的圆柱形的主体。

在一个实施方案中，集成的过滤和样品转移装置的中空的长形的圆柱形的管可以被吸附剂填充或装填。将吸收剂材料装填在膜后方在两个方面是有帮助的。第一，其提供支撑物，这允许膜略微地突出超出尖端，申请人已经发现这允许将微生物从过滤材料（例如过滤膜）更有效地转移至载玻片或目标板。第二，在过滤和转移装置中使用吸附剂还允许吸附已经通过过滤材料的裂解产物（即培养基和/或细胞材料）。此外，申请人已经发现，装填材料提供在样品裂解产物和过滤膜之间的清楚的分离区域，由此防止裂解产物滤液在洗涤期间和之后返回与膜接触的再混合，从而防止清洁的微生物的再污染。通常，任何已知的吸附剂材料可以被使用。例如，在一个实施方案中，吸附剂可以是聚酯、玻璃或纤维素纤维或微粒材料。在另一个实施方案中，吸附剂可以是吸附树脂、硅胶、水凝胶、聚丙烯酸或聚丙烯酰胺衍生物、植物胶、分子筛、沸石、或本领域的技术人员熟知的其他吸附剂。

根据本发明，集成的过滤和样品转移装置的第一端部或尖端设置有或盖有过滤材料（filter material）（或过滤材料（filtration material））。例如，如在本文中在别处讨论的，过滤材料（例如过滤膜）定位为毗邻于集成的过滤和样品转移装置的第一端部或尖端并且从集成的过滤和样品转移装置的第一端部或尖端延伸。通常，任何具有保留微生物的至少某些部分并且允许裂解产物通过的孔径大小的过滤材料可以在本发明的实践中使用。在本发明的实践中使用的过滤材料可以包括本领域中熟知的过滤膜或深度过滤器。在一个实施方案中，过滤膜将具有约0.1μm至约30.0μm，或约0.1μm至约10.0μm，或约0.1μm至约1.0μm的孔径大小。示例性的膜可以包括聚醚砜（PES）膜（例如，200、

450、

MachV（Pall-Gelman，Port Washington,NY）、Millipore Express

（Millipore））。其他的可能的过滤材料可以包括HT（聚砜）、GN（混合纤维素酯）、

（Nylon）、FP Verticel（PVDF），全部来自Pall-Gelman（Port Washington,NY）、以及Nuclepore（聚碳酸酯），来自Whatman（Kent,UK）。示例性的深度过滤器材料可以包括类型GF/F、GF/C和GMF150（玻璃纤维，Whatman）、

（玻璃纤维，Pall-Gelman）、AP15（玻璃纤维，Millipore）、以及多种纤维素、聚酯、聚丙烯或其他纤维或微粒过滤器，只要过滤介质可以保持足够数量的目标微生物以使分析成为可能。在另一个实施方案中，带电荷的或改性的微粒或纤维过滤材料，例如带ζ电荷的膜，可以被使用。

试剂盒将还包括至少一种用于在过滤材料上洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物或微生物块的洗涤缓冲剂。洗涤缓冲剂可以用于通过“洗涤”走可能在测试样品中存在的其他组分（例如介质、介质组分、细胞碎屑、非微生物或其组分）来进一步分离、离析或纯化已积聚的或已捕获的微生物。如本领域的技术人员将容易地意识到的，洗涤缓冲剂的使用允许或帮助洗涤走如果不以这种方式那么就可能干扰后续的测试（例如质谱分析）的介质、介质组分、细胞碎屑、非微生物或其组分（或使其通过过滤材料）。洗涤缓冲剂还可以用于快速地中和裂解溶液的碱性的pH。通常，任何已知的洗涤缓冲剂可以被包括在试剂盒中。例如，洗涤缓冲剂可以是蒸馏水。在另一个实施方案中，洗涤缓冲剂可以是能够保持适合于微生物的pH的pH缓冲剂，例如磷酸盐、MOPS或TRIS缓冲剂。例如，洗涤缓冲剂可以是0.01M至约0.2M磷酸盐溶液，pH6.0至7.5。

此外，试剂盒还可以包括过滤装置、真空源和/或真空接口。过滤装置可以适于附接至真空源或真空系统，真空源或真空系统可操作为提供用于过滤的真空（即用于真空过滤）。通常，任何本领域中已知的用于将过滤和样品转移装置连接于真空系统的手段可以被使用。例如，过滤和转移装置可以借助于简单的真空管而被连接于真空系统，如本领域中熟知的。例如，试剂盒可以包括具有可重复使用的过滤器保持器的侧臂真空瓶（见图2-3，数字30）或具有滤液储器和多个可重复使用的过滤器保持器（见图3，数字34）的歧管（见图3，数字32）。在还其他实施方案中，试剂盒还可以包括另外的用于过滤的部件，例如，试剂盒可以包括一个或多个管、夹具、阀或真空阱。在另一个实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个具有内置过滤膜的一次性过滤装置。在这些一次性装置中，过滤可以由真空源或由离心驱动。

试剂盒还可以包括裂解步骤能够在其内进行的容器（例如管）。容器可以是任何具有足以容纳测试样品以及可选择的裂解溶液的体积的容器。在一个实施方案中，容器可以是管。在另一个实施方案中，在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms”的有关的美国专利申请系列第12/589,969号（现在作为US2010/0120133A1被公布）中公开的分离装置可以被包括在试剂盒中。容器的体积可以是约0.1ml至约25ml，例如，约1ml至约10ml，例如，约2ml至约8ml。如果以微尺度进行裂解步骤和后续的离析或分离步骤，那么容器的体积可以是约2μl至约100μl，例如，约5μl至约50μl。容器可以具有附接的封闭装置或可以是有螺纹的以接收封闭装置（例如帽），使得容器可以在使用期间被密闭地密封。封闭部的存在减少操纵微生物的风险以及污染样品的风险，所述微生物是或可能是传染性的和/或危险的。

在一个实施方案中，试剂盒可以包括，在已包装的组合中：

（a）包含Brij97（Sigma）和CAPS（Alfa Aesar）的选择性裂解溶液，例如一个60ml瓶的选择性裂解溶液；

（b）至少一个过滤膜，例如包括50×0.45μm过滤膜（Millipore ExpressPLUS）的包装；

（c）包含在含有NaCl的磷酸盐缓冲剂（Na₂PO₄）中的Brij97清洁剂的第一洗涤缓冲剂，例如一个200ml瓶的洗涤缓冲剂；以及

（d）包含去离子水的第二洗涤缓冲剂，例如一个200ml瓶的去离子水。

可选择地，试剂盒还可以包括以下中的一个或多个：至少一个用于从过滤材料（或过滤膜）收获或收集微生物的装置（例如拭子或刮刀）；至少一个用于实施裂解步骤的容器（例如管）；和/或至少一个用于将样品或已裂解的样品转移至过滤膜和/或过滤装置的移液吸管。

通常，试剂盒可以被配置为处理任何数量的测试样品（即用于从任何具体数量的测试样品离析、积聚和/或纯化微生物）。例如，试剂盒可以被配置为处理（离析、积聚和/或纯化微生物）约1至约1000个测试样品，约10至约500个测试样品，或约10至约100个测试样品。在另一个实施方案中，试剂盒可以被配置为处理约10至约80个测试样品，约20至约60个测试样品，或约50个测试样品。

Claims

1.一种用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒，包括，在已包装的组合中：

（a）可选择的选择性裂解缓冲剂，其用于已知在测试样品中存在或可能在测试样品中存在的非微生物的选择性裂解；

（b）至少一种过滤材料，其具有小至足以防止微生物通过过滤器但是允许所述样品中的其他组分（例如已裂解的非微生物细胞和/或碎屑）通过所述过滤器的孔径大小；以及

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括选择性裂解缓冲剂，并且其中所述选择性裂解缓冲剂包含一种或多种清洁剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述一种或多种清洁剂选自由以下组成的组：

X-100、X-100-R、

X-114、NP-40、

C-100、

X-100、

CA630、Arlasolve^TM200、

96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚（C12E9，聚多卡醇）、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14、C7BzO、98、

58、

35、80、20、

L64、

P84、非清洁剂磺基甜菜碱（NDSB201）、两亲高分子（PMAL-C8）、和甲基-β-环糊精。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述清洁剂是包含结构Cx/Ey的聚氧乙烯清洁剂，其中x在10-20的范围内并且y在8-12的范围内。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述裂解溶液还包含含有一种或多种蛋白酶和/或一种或多种核酸酶的酶组合物。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述过滤材料具有约0.1μm至约30.0μm的孔径大小并且其中所述过滤材料选自由以下组成的组：聚醚砜（PES）膜（例如，Express PLUS、

200、

450、MachV）、HT

（聚砜）、GN

（混合纤维素酯）、

FP Verticel（PVDF）、Nuclepore（聚碳酸酯）、玻璃纤维型GF/F、GF/C和GMF150、

AP15、GD/X组合过滤器（Whatman）、旋转过滤器（例如，VectaSpin，Whatman）、无注射器过滤器（例如，Mini-UniPrep，Whatman）、纤维素、聚酯、聚丙烯以及其他纤维或微粒过滤器。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述过滤材料包括具有内置过滤膜的一次性过滤装置。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述洗涤缓冲剂选自由磷酸盐缓冲剂、MOPS和TRIS缓冲剂组成的组。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括所述裂解步骤能够在其内进行的一个或多个容器。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括过滤装置并且其中所述过滤装置包括具有可重复使用的过滤器保持器的侧臂真空瓶，或其中所述过滤装置包括具有滤液储器和多个可重复使用的过滤器保持器的歧管。

11.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括真空源。

12.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于从所述过滤材料收获或收集微生物的装置并且其中用于收获或收集微生物的所述装置包括拭子或刮刀。

13.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配置为处理约1至约500个测试样品。

14.一种用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的试剂盒，包括，在已包装的组合中：

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述集成的过滤和样品转移装置包括中空形状的主体，所述中空形状的主体具有设置有或盖有过滤材料的第一端部以及适于连接至真空系统或装置的第二端部。

16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述集成的过滤和样品转移装置包括具有设置有或盖有过滤材料的第一端部、以及第二端部的中空形状的主体，并且其中所述装置还包括被容纳在所述中空形状的主体内的吸附剂材料，其中所述吸附剂通过毛细管作用或芯吸力提供被动过滤。

17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括选择性裂解缓冲剂，并且其中所述选择性裂解缓冲剂包含一种或多种清洁剂。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述一种或多种清洁剂选自由以下组成的组：

X-100、

X-100-R、

X-114、NP-40、C-100、

X-100、CA630、Arlasolve^TM200、

96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、单十二烷基九乙二醇醚（C12E9，聚多卡醇）、十二烷基硫酸钠、N-月桂基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐、十六烷基三甲基溴化铵、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜碱-14、C7BzO、

98、

58、

35、

80、

20、

L64、

19.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述过滤材料选自由以下组成的组：聚醚砜（PES）膜（例如，Express PLUS、

200、

450、

MachV）、HT

（聚砜）、GN

（混合纤维素酯）、FP Verticel（PVDF）、Nuclepore（聚碳酸酯）、玻璃纤维型GF/F、GF/C和GMF150、

20.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述洗涤缓冲剂选自由磷酸盐缓冲剂、MOPS和TRIS缓冲剂组成的组。

21.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括所述裂解步骤能够在其内进行的一个或多个容器。

22.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括过滤装置并且其中所述过滤装置包括具有可重复使用的过滤器保持器的侧臂真空瓶，或其中所述过滤装置包括具有滤液储器和多个可重复使用的过滤器保持器的歧管。

23.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括真空源。

24.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于从所述过滤材料收获或收集微生物的装置并且其中用于收获或收集微生物的所述装置包括拭子或刮刀。

25.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配置为处理约1至约500个测试样品。