CN1871338A - 液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置 - Google Patents

液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置 Download PDF

Info

Publication number
CN1871338A
CN1871338A CNA2004800009848A CN200480000984A CN1871338A CN 1871338 A CN1871338 A CN 1871338A CN A2004800009848 A CNA2004800009848 A CN A2004800009848A CN 200480000984 A CN200480000984 A CN 200480000984A CN 1871338 A CN1871338 A CN 1871338A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microorganism
liquid sample
mentioned
membrane
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800009848A
Other languages
English (en)
Inventor
田中孝二郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DML CO Ltd
Original Assignee
DML CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DML CO Ltd filed Critical DML CO Ltd
Publication of CN1871338A publication Critical patent/CN1871338A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/60—Chemiluminescent detection using ATP-luciferin-luciferase system

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，它能够除去游离的ATP、容易而迅速地从捕捉的微生物中提取ATP并检测提取所得ATP，微生物损失少且无需熟练也能高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。预先在第1注射器2中吸入凝集剂3，再吸入液体试样LS进行搅拌，然后立即在其前端安装1次过滤器5和2次过滤器6，过滤该混合液15，只取下2次过滤器6，预先用第2注射器7吸入洗涤液8清洗2次过滤器6。然后，用溶菌剂9装满2次过滤器6，反应约30秒钟，将反应液16挤出到检测用试管10，加入预先调制好的发光试剂(11a+11b)，安装连接器12轻轻搅拌，立即用光度计测定发光量。

Description

液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置
技术领域
本发明涉及能够以高灵敏度迅速而容易地检测那些采用通常的ATP法难以对微生物进行检测的固体食品、牛奶、乳制品等，含有大量游离ATP(体细胞ATP)的食品、水、化妆品等液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置。
背景技术
食品等中的微生物的检测一般采用标准琼脂平板法，但该方法直到能够检测为止需要24～48小时的所谓的较长的时间，因而发生微生物污染时，无法采取迅速的对策。此外，作为更简便而迅速的微生物检出方法，已知有使用光度计测定发光量来检测微生物中的三磷酸腺苷(ATP)的量，从而计算出微生物数的生物发光法(ATP法)。但是，该方法对于微生物数少的检体液的情况，例如，微生物数103～104个/ml以下在光度计的检测限以下就无法被检出。
另一方面，几乎所有的食品都含有非微生物来源的游离ATP，该游离ATP浓度很多情况会比来自微生物的ATP浓度高好几个数量级，如果不预先排除这一障碍，具有出现无法正确检测微生物中的ATP的问题。为解决这些问题，提出了过滤检体液或使用作为ATP分解酶的三磷酸腺苷双磷酸酶等预先将非微生物来源的游离ATP分解后再使用ATP法的方法。
但是为了使游离ATP在短时间内分解，检测试样中的ATP分解酶的浓度必须充分高，该分解酶的浓度过高时，就会产生后续工序中抑制来自所提取的微生物的ATP的发光，检测浓度显著下降的问题。
此外，也提出了过滤检体液，在过滤材料上捕捉其中含有的微生物，洗流过滤材料和附着在过滤材料上的微生物的ATP分解试剂以提甲亚砜的灭菌蒸馏水。
DMSO作为溶菌剂很优异，但灭菌蒸馏水中的DMSO的含有率过少，溶菌作用(ATP提取作用)也会急剧下降，且含有率过低会使发光量下降影响检测。为此，本发明人经过深入实验研究的结果，发现作为溶菌剂使用含有约15容量％～约20容量％的DMSO的灭菌蒸馏水时能够得到充分的溶菌作用，且不会降低发光量，在此认知基础上实现了本发明。
这样，制成一种液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，它能够容易且迅速地从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求15的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，作为过滤促进剂使用乙二胺四乙酸(EDTA)的碱金属盐，反式-1，2-环己二胺四乙酸(CyDTA)的碱金属盐，乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)的碱金属盐，二乙撑三胺五乙酸(DTPA)的碱金属盐，或氨基三乙酸(NTA)的碱金属盐。这里，作为碱金属优选钠或钾。
这些过滤促进剂是一般作为螯合剂使用的化合物，但与凝集剂联合使用时，一般为牛奶等液体试样中含有的矿物质如使钙形成螯合物(水溶性)容易过滤。上述的过滤促进剂的添加量根据使用的过滤促进剂或液体试样的种类而不同，不能一概而论，一般来讲每1ml液体试样1mg～20mg就足够了，当过滤促进剂为EDTA的钠盐时，每1ml市售牛奶1mg～20mg就足够了。
权利要求16的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法或检测装为，固体试样或高粘性试样与凝集剂混合前添加灭菌蒸馏水后，进行均化制成液体试样。
本发明所述的液体试样中的微生物的检测方法不仅可应用于象牛奶等这类的最初就是液体的试样，也可用于象食肉等的固体试样中的微生物量的检测。其时，添加灭菌蒸馏水后，进行均化制成液体试样。取微生物中的ATP的方法。但是该方法仅限用于容易过滤的食品试样(醇饮料或调味料汁等)，像市售牛奶或乳制品那样的、含有大量蛋白质或脂质、无脂肪固体成分的浊度高的试样，由于过滤困难而不适用此法。
也提出了稀释处理这种难以过滤的乳制品试样，检测其稀释液中的微生物ATP的方法。在该方法中，采取试样0.1ml，向其中加入处理液0.1ml，稀释液0.7ml，ATP消除剂0.1ml进行混合，从此混合物1.0ml中分取0.1ml到检测试管放置30分钟，然后添加发光试剂0.1ml，用光度计测定发光量。这种方法中，由于是检测0.01ml的所谓极微量的试样中的微生物ATP，发光量也极少。因此，如果试剂空白值不是比通常的发光量(RLU)50以下的低值，就无法得到正确的检测结果。因此出现需要检查所使用的处理液、稀释液、提取剂、高灵敏度发光试剂有无污染等诸多问题。
于是，本发明人在专利文献1中公开了以下方法，即，将食品试样与磷酸系凝集剂和乙二胺四乙酸盐等过滤促进剂混合，通过重力进行自然过滤后，将滤液用膜滤器减压过滤，捕捉浓缩滤膜上的试样中的微生物，用洗涤液洗涤滤膜上的非微生物来源的游离ATP，将其除去后，向微生物中加入ATP提取试剂(溶菌剂)，向提取液中加入发光试剂，通过检测产生的发光量检测食品中的微生物的方法。该方法能够比以往的方法更显著容易、迅速且高灵敏度地检测微生物。
【专利文献1】特开2003-284589号公报
发明内容
发明要解决的课题
但是，上述专利文献1所公开的方法中，由于使用了磷酸系凝集剂，若非熟练技术人员，有时在凝集反应时使蛋白质和微生物无差别地凝集，造成了试样中的微生物的损失，并且，提取ATP时磷酸系凝集剂覆盖住了微生物而使溶菌剂难以奏效，必须使用大量洗涤液来清洗，这有可能成为检查结果不稳定的主要原因。
因而，本发明的课题是提供一种液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法及检测装置，它可以除去游离的ATP，容易而迅速地从捕捉的微生物中提取ATP并检测所提取的ATP，完全无需用洗涤液清洗，或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，而且无需熟练，可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度稳定地检测试样中的微生物。
解决课题的手段
权利要求1的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒具备以下构成：采集液体试样的第1注射器，在上述第1注射器中使上述液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂，配有捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)微生物的1次膜滤器并能安装在上述第1注射器上的1次过滤器，配有捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器并能够安装在上述1次过滤器上的2次过滤器，能够安装在上述2次过滤器的前端的第2注射器，用于清洗上述2次膜滤器的洗涤液，溶解被上述2次膜滤器捕捉到的上述微生物并使ATP溶出的溶菌剂，收集上述溶出的ATP和溶菌剂的检测用试管，和使上述溶出的ATP发光的发光试剂。
权利要求2的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为在权利要求1的构成中还具备用于测定发光量的光度计，和用于使上述检测用试管的前端能够到达上述光度计的发光检测部而安装在上述检测用试管上的连接器。
权利要求3的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为在权利要求1或权利要求2的构成中还配备有用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂，或使用预先混入了上述过滤促进剂的物质作为上述凝集剂。
权利要求4的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为在权利要求1至权利要求3中任一项的构成中，上述1次膜滤器和上述2次膜滤器分别组装入上述1次过滤器和上述2次过滤器成为一体并在使用完毕后被弃去。
权利要求5的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法包括：将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合的工序，用1次膜滤器加压过滤或减压过滤以捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩的工序，和向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量的工序。
权利要求6的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法为在权利要求5的构成中，在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合的工序后，或在同一工序中同时追加加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂的工序。
权利要求7的发明所述的液体试样中的微生物的检测装置如下所述：将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合，用1次膜滤器加压过滤或减压过滤来捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物，将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩，向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量。
权利要求8的发明所述的液体试样中的微生物的检测装置如下所述：在权利要求7的构成中，在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合后或同时加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂。
权利要求9的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或液体试样中的微生物的检测方法或液体试样中的微生物的检测装置为在权利要求1至权利要求4中任一项或权利要求5或权利要求6或权利要求7或权利要求8的构成中，上述凝集剂使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水杨酸等羧酸，或壳聚糖，低聚壳聚糖。
权利要求10的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求1至权利要求9中任一项的构成中，上述1次膜滤器使用孔径约1μm～约10μm的过滤材料。
权利要求11的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求1至权利要求10中任一项的构成中，上述2次膜滤器使用具有孔径约0.1μm～约0.5μm的微细孔的多孔性高分子膜。
权利要求12的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求11的构成中，上述多孔性高分子膜由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纤维素、亲水性聚丙烯、尼龙、亲水性聚醚砜、或亲水性硼硅酸玻璃纤维中的任意高分子构成。
权利要求13的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求1至权利要求12中任一项的构成中，上述溶菌剂为含有二甲亚砜的灭菌蒸馏水。
权利要求14的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求13的构成中，上述溶菌剂为含有约15容量％～约20容量％的二甲亚砜的灭菌蒸馏水。
权利要求15的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为在权利要求3至权利要求14中任一项的构成中，上述过滤促进剂使用乙二胺四乙酸的碱金属盐，反式-1，2-环己二胺四乙酸的碱金属盐，乙二醇醚二胺四乙酸的碱金属盐，二乙撑三胺五乙酸的碱金属盐，或氨基三乙酸的碱金属盐。
权利要求16的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法或检测装置为在权利要求5至权利要求15中任一项的构成中，将固体试样或高粘性试样在与上述凝集剂混合前添加灭菌蒸馏水后进行均化制成上述液体试样。
发明效果
权利要求1的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒具备以下构成：采集液体试样的第1注射器，在上述第1注射器中使上述液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂，配有能捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物的1次膜滤器并能安装在上述第1注射器前端的1次过滤器，配有能捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器并能够安装在上述1次过滤器前端的2次过滤器，能够安装在上述2次过滤器的前端的第2注射器，用于清洗上述2次膜滤器的洗涤液，溶解被上述2次膜滤器捕捉到的微生物并使ATP溶出的溶菌剂，收集上述溶出的ATP和溶菌剂的检测用试管，和使上述溶出的ATP发光的发光试剂。
这样，通过以在第1注射器的前端安装1次过滤器，并在1次过滤器的前端安装2次过滤器的状态，在第1注射器中用凝集剂使液体试样中的蛋白质凝集后从第1注射器中挤出液体试样，使凝集的蛋白质和体细胞(内含ATP)被1次膜滤器捕捉，游离ATP透过1次膜滤器、2次膜滤器并从2次过滤器的前端被排出，只有微生物被2次膜滤器捕捉。此时，只取下2次过滤器，安装在新的第1注射器或第2注射器的前端，押出洗涤液，充分洗涤2次膜滤器后，将溶菌剂吸入到第2注射器内，将2次过滤器安装在第2注射器的前端，注入溶菌剂使之反应，溶解2次膜滤器捕捉到的微生物并使内部的ATP溶出。
将如此仅提取出了来自微生物的ATP的试样液收集到检测用试管中加入发光试剂，测定发光量。由此，能够在极短时间内正确地检测出液体试样中的微生物量。并且由于微生物的损失少，因而能够得到可靠性显著高的检查结果。并且，由于将这些必要的器具和试剂变成为试剂盒，装入专用容器搬运，即使在牧场或工厂、食品加工现场、化妆品开发现场等也能够在短时间内容易地检测微生物的量。
由此得到一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求2的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为在权利要求1的构成中还具备用于测定发光量的光度计，和用于使上述检测用试管的前端能够到达上述光度计的发光检测部而安装在上述检测用试管上的连接器。
光度计为无需熟练、任何人在任何地方均可以容易且正确地测定发光量的检测仪器，为使上述检测用试管的前端能够到达上述光度计的发光检测部必须在上述检测用试管上安装连接器。通过向权利要求1的构成中再加入上述装置，就能够在极短时间内正确地检测液体试样中的微生物量。且微生物的损失少，就可以得到可靠性显著高的检查结果。并且，由于将这些必要的器具和试剂变成为试剂盒，装入专用容器搬运，即使在牧场或工、食品加工现场、化妆品开发现场等也能够在短时间内容易地检测微生物的量。
由此得到一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求3的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为在权利要求1或权利要求2的构成中还配备有用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂，或使用预先混入上述过滤促进剂的物质作为上述凝集剂。这里，过滤促进剂可使用乙二胺四乙酸(EDTA)的钠盐等。通过用凝集剂使第1注射器中的液体试样中的蛋白质凝集后，或与凝集剂同时加入过滤促进剂，通过1次过滤器和2次过滤器即使是初学者也能在短时间内顺利地进行过滤处理，且在极短时间内正确地检测出液体试样中的微生物量。而且微生物的损失少，能够得到可靠性显著高的检查结果。并且，由于将这些必要的器具和试剂变成为试剂盒，装入专用容器搬运，即使在牧场或工厂、食品加工现场、化妆品开发现场等也能够在短时间内容易地检测微生物的量。
由此获得一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求4的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为上述1次膜滤器和上述2次膜滤器分别组装入入上述1次过滤器和上述2次过滤器成为一体并在使用完毕后被弃去的试剂盒。这样一来，节省了滤膜安装在过滤器上或从过滤器上取下的繁琐，可以更迅速地进行检测。并且，通过一次性使用随后弃取，可以提高测定精度从而进行可靠性高的测定。
从而制成一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求5的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法包括：将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合的工序，用1次膜滤器加压过滤或减压过滤以捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩的工序，和向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量的工序。
因此，通过用凝集剂使液体试样中的蛋白质凝集后用1次膜滤器加压过滤或减压过滤，再将滤液用2次膜滤器加压过滤或减压过滤，使凝集的蛋白质和体细胞(内含ATP)被1次膜滤器捕捉，游离ATP透过1次膜滤器、2次膜滤器被排出，只有微生物被2次膜滤器捕捉。此时，加入溶菌剂溶解被2次膜滤器捕捉到的微生物并使内部的ATP溶出，添加发光试剂，通过测定产生的发光量能够在极短时间内正确地检测液体试样中的微生物量。且微生物的损失少，因而能够得到可靠性显著高的检查结果。
此外，考虑到非微生物来源的游离ATP或其它的发光物质以影响检测的程度附着在2次膜滤器上的情况等，根据需要，也可以在加压过滤或减压过滤后加入用少量洗涤液清洗2次膜滤器。
由此实现一种液体试样中的微生物的检测方法，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求6的发明所述的液体试样中的微生物的检测方法为在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合的工序后，或中同时追加加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂的工序。即，作为凝集剂也可以使用预先添加了过滤促进剂的物质。这样得到一种液体试样中的微生物的检测方法，通过用凝集剂使液体试样中的蛋白质凝集后或同时加入过滤促进剂，采用1次膜滤器的加压过滤或减压过滤和采用2次膜滤器的加压过滤或减压过滤均可以在短时间内顺利地进行，因此能够在更短时间内高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求7的发明所述的液体试样中的微生物的检测装置如下所述：将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合，用1次膜滤器加压过滤或减压过滤来捕捉凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP和微生物，将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉微生物并透过游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩，向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量。
这样，通过用凝集剂使液体试样中的蛋白质凝集后用1次膜滤器加压过滤或减压过滤，再将滤液用2次膜滤器加压过滤或减压过滤，使凝集的蛋白质和体细胞(内含ATP)被1次膜滤器捕捉，游离ATP透过1次膜滤器、2次膜滤器被排出，只有微生物被2次膜滤器捕捉。此时，加入溶菌剂溶解被2次膜滤器捕捉到的微生物并使内部的ATP溶出，添加发光试剂，通过测定产生的发光量就能够在极短时间内正确地检测液体试样中的微生物量。且微生物的损失少，因而能够得到可靠性显著高的检查结果。
此外，考虑到非微生物来源的游离ATP或其它的发光物质以影响检测的程度附着在2次膜滤器上的情况等，根据需要，也可以在加压过滤或减压过滤后加入用少量洗涤液清洗2次膜滤器。
由此，得到一种液体试样中的微生物的检测装置，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求8的发明所述的液体试样中的微生物的检测装置为在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合后或同时加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂的装置。即，作为凝集剂也可以使用预先添加过滤促进剂的物质。由此得到一种液体试样中的微生物的检测装置，它通过在用凝集剂使液体试样中的蛋白质凝集后或同时加入过滤促进剂，使用1次膜滤器进行的加压过滤或减压过滤以及用2次膜滤器进行的加压过滤或减压过滤都能在短时间内顺利地进行，因而能在更短的时间内高灵敏度地稳定地检测出液体试样中的微生物。
权利要求9的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，作为凝集剂使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水杨酸等羧酸，或壳聚糖，低聚壳聚糖。这些凝集剂仅选择性使液体试样中的蛋白质凝固，此时微生物并不会凝固在其中，因而在检测中能够抑制微生物的损失使损失减少，并能够在极短时间内正确地检测出液体试样中的微生物量。
这样，制成一种液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，它能够容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，试样中的微生物的损失少，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求10的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，作为1次膜滤器使用孔径约1μm～约10μm的过滤材料。因而能够确实地捕捉凝固的蛋白质和体细胞，且使微生物和游离ATP确实地透过，并能够高精度地进行微生物量的检测。
权利要求11的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，2次膜滤器是具有孔径约0.1μm～约0.5μm的微细孔的多孔性高分子膜。因此，能只确实地捕捉微生物，且使游离ATP确实地透过，并能够高精度地进行微生物量的检测。
权利要求12的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，多孔性高分子膜是由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纤维素、亲水性聚丙烯、尼龙、亲水性聚醚砜、或亲水性硼硅酸玻璃纤维中的任何高分子构成的。
这些高分子构成的多孔性高分子膜能只确实地捕捉微生物，且使游离ATP确实地透过，能够高精度地进行微生物量的检测。
权利要求13的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置为，溶菌剂是含有二甲亚砜(以下也称“DMSO”)的灭菌蒸馏水。
本发明人经过深入实验研究的结果，发现作为溶菌剂使用表面活性剂系的化合物通过2次膜滤器时会发泡，不能顺利进行，使用有机溶剂系的化合物，尤其是DMSO的灭菌蒸馏水溶液时，可毫无问题的作为溶菌剂使用，在此认知基础上实现了本发明。
这样，制成一种液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，它能够容易且迅速地从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，且无需熟练也可以在食品生产现场或化妆品等开发现场检查的、高灵敏度地稳定地检测试样中的微生物。
权利要求14的发明所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装为，溶菌剂是含有约15容量％～约20容量％的二
由此制成了检测固体试样中的微生物量也能应用的能够液体试样中的微生物的检测方法或检测装置。
附图说明
图1表示本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测试剂盒的立体图。
图2(a)、(b)表示本发明实施方式1和实施方式2的液体试样中的微生物的检测方法的检测原理的模式图。
图3(a)、(b)、(c)、(D)、(e)、(f)表示本发明实施方式1和实施方式2的液体试样中的微生物的检测方法的步骤说明图。
图4为液体试样是市售牛奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例1的检测结果与比较例1相比较的示意图。
图5为液体试样是市售牛奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例2的检测结果示意图。
图6为液体试样是挤出的生奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例2的检测结果示意图。
符号说明
1  液体试样中的微生物的检测试剂盒
2  第1注射器
3  凝集剂
5  1次过滤器
5a 1次膜滤器
6  2次过滤器
6a 2次膜滤器
7  第2注射器
8  洗涤液
9  溶菌剂
10  检测用试管
11  发光试剂
12  连接器
13  光度计
BC  体细胞
FA  游离ATP
GPR 凝集的蛋白质
LS  液体试样
MO  微生物
PR  蛋白质
具体实施方式
以下参照附图说明本发明实施方式。
实施方式1
首先，参照图1至图6说明本发明实施方式1所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒、检测方法、检测装置。图1表示本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测试剂盒的立体图。图2(a)，(b)表示本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法或检测装置的检测原理模式图。图3(a)，(b)，(c)，(D)，(e)，(f)表示本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法的步骤说明图。图4为液体试样是市售牛奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例1的检测结果与比较例1相比较的示意图。图5为液体试样是市售牛奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例2的检测结果示意图。图6为液体试样是挤出的生奶时，本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法中实施例2的检测结果示意图。
本发明中作为液体试样没有特殊限制，可列举出食品中的牛奶或各种乳制品，蛋白质含量高的豆乳等，除此以外还可使用化妆品或水本身作为试样。并且固体试样或高粘度的试样在添加灭菌蒸馏水后，经均化可作为液体试样。
如图1所示，本实施方式1的液体试样中的微生物的检测试剂盒1具备：塑料制第1注射器2(容量3ml)、瓶装凝集剂3、收装1次膜滤器的聚丙烯制1次过滤器5，收装2次膜滤器的聚丙烯制2次过滤器6、塑料制第2注射器7(容量1ml)、瓶装洗涤液8、瓶装溶菌剂9、塑料制检测用试管10、装入容器的发光试剂溶解液11a和瓶装发光试剂粉末11b构成的发光试剂11、检测时安装在检测用试管10上的连接器12、以及装入安装了带有连接器12的检测用试管10的园筒部的测定发光量的光度计13。
然后，参照图2说明有关使用液体试样中的微生物的检测试剂盒1的本实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法的检测原理。如图2(a)所示，在牛奶等液体试样LS中除存在微生物MO外还混有游离ATP、FA、体细胞BC(内含ATP)、蛋白质PR等。因而如果不将这些物质从液体试样LS中除去，就不能正确地检测微生物MO的混入量。因此通过将仅使蛋白质PR凝集的凝集剂与液体试样LS混合发生反应，成为凝集的蛋白质GPR。
这里，作为仅使蛋白质PR凝集的凝集剂，有乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水杨酸等羧酸，还有壳聚糖，低聚壳聚糖等。这些凝集剂能够使蛋白质PR凝集，而此时微生物MO不会与之一起凝集，因此微生物MO的损失少。
因此，如图2(b)所示，通过使液体试样LS从连接1次过滤器5和2次过滤器6的装置中流过，在捕捉凝集的蛋白质GPR和体细胞BC并使游离ATP、FA和微生物MO透过的1次膜滤器5a中，凝集的蛋白质GPR和体细胞BC被捕捉而除去，在捕捉微生物MO使游离ATP、FA透过的2次膜滤器6a中微生物MO被捕捉，游离ATP、FA透过而被排出除去。然后，从2次膜滤器6a中取出微生物MO内的ATP加入发光试剂，通过测定发光量能够高精度地检测最初的液体试样LS中含有的微生物MO的量。
这里，1次膜滤器5a优选使用孔径约1μm～约10μm的滤膜。作为滤膜可使用例如，使用硼硅酸玻璃作为初滤膜的亲水性聚醚砜(2片为1个滤膜)、在聚酯无纺布上涂覆乙酸纤维素的滤膜、亲水性硼硅酸玻璃纤维、尼龙、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、乙酸纤维素、纤维素混合酯等。由于滤膜的孔径一定、压力强，通过使用滤膜作为1次膜滤器5a，能够稳定地进行检查。
此外，作为2次膜滤器6a的滤膜孔径约0.1μm～约0.5μm，优选使用具有孔径约0.2μm～约0.45μm的微细孔的多孔性高分子膜。作为多孔性高分子膜可以使用PTFE、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纤维素、亲水性聚丙烯、尼龙、亲水性聚醚砜、或亲水性硼硅酸玻璃纤维等高分子构成的分离膜。
采用上述滤膜过滤时，微生物MO在膜滤器6a上被捕捉、浓缩。对于该膜滤器6a和微生物MO来说，由于有时有非微生物MO来源的游离ATP、FA或发光物质附着，可根据需要将它们用洗涤液清洗除去。作为洗涤液可使用例如含60容量％～100容量％的乙醇的灭菌蒸馏水溶液或含1容量％～8容量％的DMSO(更优选4容量％～5容量％)的灭菌蒸馏水溶液等。
然后，应用本检测原理，参照图3说明本实施方式1的利用液体试样中的微生物的检测试剂盒1的微生物的检测方法的具体步骤。首先，如图3(a)所示，预先将规定量(2.1ml)的凝集剂3吸入到第1注射器2(容量3ml)，向试样杯14中加入液体试样LS再用第1注射器2吸入规定量(0.7ml)，再装入空气，用指压第1注射器2的前端搅拌5秒钟左右。凝集剂3的种类和添加量根据液体试样LS的种类而不同，例如，液体试样为市售牛奶的情况，添加相对于牛奶0.7ml的2.1ml比例的羧酸系凝集剂(苯甲酸等)时，凝集反应迅速进行。
然后，如图3(b)所示，搅拌后立即在第1注射器2的前端安装连接1次过滤器5和2次过滤器6的装置，缓慢地压住第1注射器2的注射器芯过滤该混合液15。过滤后，取下第1注射器2，马上吸入空气，再次通过将其安装连接1次过滤器5和2次过滤器6的装置送入空气，完全过滤滤膜内的试样。此时，如上所述，出现图2(b)所示的现象。
若能全量过滤，仅取下2次过滤器6，如图3(c)所示，用第2注射器7预先吸入洗涤液8，在第2注射器7的前端安装2次过滤器6、挤压第2注射器7的注射器芯，用洗涤液8清洗2次过滤器6。过滤后，取下第2注射器7，马上吸入空气，通过再次通过将其安装在2次过滤器6上送入空气，完全除去2次过滤器6内的洗涤液8。如果残留有洗涤液8，会使下一步的溶菌处理不完全而必须引起注意。
然后，如图3(d)所示，用第2注射器7预先吸入规定量(0.2ml)的溶菌剂9，安装2次过滤器6，将第2注射器7上下倒置，从下面向2次过滤器6内送入溶菌剂9，在2次过滤器6内装满溶菌剂9。接着，旋转2次过滤器6或对其一边轻轻振动一边以不充满溶菌剂9而向2次膜滤器6a流入的状态反应约30秒钟。反应后，如图3(e)所示，通过挤出反应液16到检测用试管10中，并将2次膜滤器6a上残留的反应液16也用空气挤出，使反应液完全收集在检测用试管10中。
然后，如图3(f)所示，预先将发光试剂粉末11b加入发光试剂溶解液11a，再加入调制好的规定量(0.1ml)的发光试剂11，安装好连接器12轻轻搅拌后，立即用光度计13测定发光量。发光试剂没有特殊限制，通常使用虫荧光素酶和虫荧光素。
(实施例1)
然后，根据本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测方法的实施例1具体说明本发明。
用于本实施例1和比较例的标准培养液为含有酵母提取物0.5％，胨1.5％，氯化钠0.5％，磷酸氢钾0.5％的溶液，发光试剂为以虫荧光素、虫荧光素酶和醋酸镁为主成分溶解在Tricine缓冲液的物质。
向20ml的标准培养液中加入少量生奶，对培养的物质进行离心分离，弃去培养液，向沉淀菌中加入确认为无菌的市售牛奶20ml剧烈搅拌。再将其用同样的市售牛奶分5步进行稀释，以它们作为试样。
作为膜滤器使用直径47mm、孔径10μm的1次膜滤器(材质：聚酯无纺布上涂覆有乙酸纤维素的滤膜)和直径25mm、孔径0.5μm的作为2次膜滤器的滤膜(材质：聚四氟乙烯)，分别用Lure接头连接滤器盖者。
使用10ml容量的注射器吸取试样3ml，再直接加入作为凝集剂的7ml的99.5％的乙醇，立即剧烈混合约10秒钟，用上述膜滤器过滤。此时，试样中的蛋白质等被1次膜滤器捕捉，微生物主要收集在2次膜滤器上，游离ATP作为滤液被排出。然后，打开滤器盖取出2次膜滤器，将其移入检测用试管，加入0.2ml的20％DMSO溶液放置1分钟后，加入发光试剂0.1ml用光度计测定发光量(RLU)。
另外，用标准培养法培养被分步稀释的上述各试样，检测微生物数。检测所得微生物数和发光量的关系如图4所示。横轴表示菌数(cfu/ml)，纵轴表示发光量(RLU)，均为对数轴。从此图中可知，通过本实施例1的液体试样中的微生物的检测方法，发光量(ATP浓度)和菌数在104个/ml以上时具有良好的比例关系。
[比较例]
作为比较例，向0.1ml各试样中加入0.2ml的20％的DMSO溶液放置1分钟，然后添加0.1ml发光试剂，用光度计测定发光量。
菌数和检测的发光量(ATP浓度)的关系如图4所示，用白色的方块作图表示。此时，菌数和发光量之间无相关关系。
从而通过本实施例1，它能够在简单操作下容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，此时，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，且微生物的损失少，能够得到可靠性显著高的检查结果。另外，本实施例1也可适用于浓度高的牛奶、乳制品或固体食品。可以在直到低浓度良好地测定含大量的蛋白质或矿物质而难于过滤的豆乳等食品中来自微生物的ATP。并且，在本实施例1中，由于1次膜滤器和2次膜滤器二者均使用了滤膜，因此能够进行稳定的检查，无需光度计以外的特别装置或技术，无需熟练也可以在生产现场进行检查。
(实施例2)
然后，参照图1至图3，根据本发明实施方式1的液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法的实施例2，具体说明本发明。本实施例2中使用上述的本实施方式1中的液体试样中的微生物的检测试剂盒1，检测微生物。
本实施例2所用标准培养液为含有酵母提取物0.5％，胨1.5％，氯化钠0.5％，磷酸氢钾0.5％的物质，发光试剂11为将以虫荧光素、虫荧光素酶和醋酸镁为主成分的粉末11b溶解在Tricine缓冲液11a中的物质。
向20ml的标准培养液中加入少量生奶，对培养的物质进行离心分离，弃去培养液，向沉淀菌中加入确认为无菌的市售牛奶20ml剧烈搅拌。再将其用同样的市售牛奶分5步进行稀释，以它们作为液体试样LS。并且，同样地向其中加入在牧场采集的挤出的生奶20ml剧烈搅拌，再用同样的生奶进行多步的稀释，也以它们作为液体试样LS。
首先，如图3(a)所示，预先用第1注射器2(容量3ml)吸入作为凝集剂的2.1ml苯甲酸3，向试样杯14中装入液体试样LS，用第1注射器2吸收0.7ml，再向其中装入空气，用手指挤压第1注射器2的前端搅拌5秒钟左右。接着，如图3(b)所示，搅拌后立即在第1注射器2的前端安装连接有1次过滤器5和2次过滤器6的装置，缓慢地挤压第1注射器2的注射器芯过滤该混合液15。过滤后，取下第1注射器2，马上吸入空气，通过再次安装连接了1次过滤器5和2次过滤器6的装置送入空气，使膜滤器内的试样全部被过滤。
若能全部被过滤，只取下2次过滤器6，如图3(c)所示，用第2注射器7预先吸入作为洗涤液的60容量％乙醇的灭菌蒸馏水溶液8，在第2注射器7的前端安装2次过滤器6，挤压第2注射器7的注射器芯，用洗涤液8清洗2次过滤器6。过滤后，取下第2注射器7，马上吸入空气，通过将其再次安装在2次过滤器6上送入空气，将2次过滤器6内的洗涤液8完全除去。
此外，在本实施例2中，说明了关于使用乙醇60容量％溶液作为洗涤液8的例子，另外也可以使用1容量％～8容量％的DMSO的灭菌蒸馏水溶液，更优选使用4容量％～5容量％的DMSO的灭菌蒸馏水溶液等作为洗涤液8。
然后，如图3(d)所示，预先用第2注射器7吸入0.2ml作为溶菌剂的20容量％的DMSO溶液9，安装2次过滤器6，将第2注射器7上下倒置由下面向2次过滤器6内送入溶菌剂9，将溶菌剂9装满至2次过滤器6内。接着，旋转2次过滤器6或对其一边轻轻振动一边以不充满溶菌剂9而向2次膜滤器6a流入的状态反应约30秒钟，如图3(e)所示，押出反应液16至检测用试管10，通过将2次膜滤器6a中残留的反应液16也用空气挤出，可以完全将反应液收集到检测用试管10中。
接着，如图3(f)所示，加入预先调制好的0.1ml发光试剂11，安装上连接器12轻轻搅拌后，立即用光度计13测定发光量。另外，用标准培养法培养分步稀释的上述各试样，检测微生物数。检测所得微生物数和发光量的关系，市售牛奶的情况如图5所示，生奶的情况如图6所示。此外，生奶与市售牛奶不同，为非无菌物，因此在空白状态下也能发光。图6表示以减去该空白发光量的值作为发光量。横轴表示菌数(cfu/ml)，纵轴表示发光量(RLU)，均为对数轴。由此图可知，通过本实施例2的液体试样中的微生物的检测方法，发光量(ATP浓度)和菌数在104个/ml以上时具有良好的比例关系。
从而通过本实施例2的液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法本实施例1，它能够在简单操作下容易且迅速地除去游离ATP，从捕捉到的微生物中提取ATP和检测提取所得ATP，此时，完全无需用洗涤液清洗或无需用大量洗涤液清洗，且微生物的损失少，能够得到可靠性显著高的检查结果。此外，本实施例2所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法也适用于浊度高的牛奶和乳制品试样或固体食品，并能够在直至低浓度下也良好地检测出来自含有大量蛋白质或矿物质的过滤困难的豆乳等食品中的微生物的ATP。并且，本实施例2中，由于1次膜滤器和2次膜滤器二者均装在盒子中可以使用完后扔掉，因此能够进行稳定的检查，无需光度计以外的特别装置或技术，无需熟练也可以在牧场或工厂等现场进行检查。
实施方式2
然后，参考图1至图3说明关于本发明实施方式2的液体试样中的微生物的检测试剂盒、检测方法、检测装置。本实施方式2所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒为，向图1所示的实施方式1的液体试样中的微生物的检测试剂盒中再追加过滤促进剂的装置。本实施方式2时用乙二胺四乙酸(EDTA)的钠盐作为过滤促进剂。此外，也可以向如图1所示的检测试剂盒1的瓶装凝集剂3中以规定比例预先混合EDTA的钠盐。EDTA的钠盐一般为作为螯合剂使用的化合物，与凝集剂联合使用时，牛奶等液体试样中含有的矿物质如钙成为螯合物(水溶性)，容易过滤。
因此，本实施方式2的微生物的检测方法的检测原理如图2所示，水溶性的螯合化合物与游离ATP、FA一起透过2次膜滤器6a被排除出系统外。因此，液体试样的过滤变得更加容易，检测时间也短缩了。
然后，应用该检测原理，参照图3说明本实施方式2的利用液体试样中的微生物的检测试剂盒的微生物的检测方法的具体步骤。首先，如图3(a)所示，预先将凝集剂3和作为过滤促进剂的EDTA的钠盐的混合剂以规定量2.1ml吸入到第1注射器2(容量3ml)中，向试样杯14中加入液体试样LS再用笫1注射器2吸入规定量(0.7ml)，再装入空气，用指压第1注射器2的前端搅拌5秒钟左右。凝集剂3的种类和添加量根据液体试样LS的种类而不同，例如，液体试样为市售牛奶的情况，添加相对于牛奶0.7ml的2.1ml比例的羧酸系凝集剂(苯甲酸等)时，凝集反应迅速进行。
或者，也可采用下述方法，即，只吸入规定量(2.1ml)的凝集剂3，再吸入液体试样LS搅拌后，立即加入作为过滤促进剂EDTA的钠盐，再用指压第1注射器2的前端搅拌5秒钟左右。接着，如图3(b)所示，搅拌后立即在第1注射器2的前端安装连接有1次过滤器5和2次过滤器6的装置，缓慢地挤压第1注射器2的注射器芯过滤该混合液15。过滤后，取下第1注射器2，马上吸入空气，通过再次将其安装在连接有1次过滤器5和2次过滤器6的装置送入空气，使膜滤器内的试样全部被过滤。此时，如上所述，出现图2(b)所示的现象。
若能全量过滤，只取下2次过滤器6，如图3(c)所示，预先用第2注射器7吸入洗涤液8，在第2注射器7的前端安装2次过滤器6挤压第2注射器7的注射器芯，用洗涤液8清洗2次过滤器6。过滤后，取下第2注射器7，马上吸入空气，通过再次将其安装在2次过滤器6上送入空气，将2次过滤器6内的洗涤液8完全除去。若洗涤液8残留，后续的溶菌处理将进行不完全须加以注意。
然后，如图3(d)所示，预先用第2注射器7吸入规定量(0.2ml)的溶菌剂9，安装2次过滤器6，将第2注射器7上下倒置从下面向2次过滤器6内送入溶菌剂9，用溶菌剂9装满2次过滤器6。接着，旋转2次过滤器6或对其一边轻轻振动一边以不充满溶菌剂9而向2次膜滤器6a流入的状态反应约30秒钟。反应后，如图3(e)所示，通过押出反应液16至检测用试管10中，并将2次膜滤器6a上残留的反应液16也用空气挤出，使反应液完全收集在检测用试管10中。
接着，如图3(f)所示，预先向发光试剂粉末11b中加入发光试剂溶解液11a，再加入调制好的规定量(0.1ml)的发光试剂11，安装连接器12轻轻搅拌后，立即用光度计13测定发光量。发光试剂没有特殊限制，通常使用虫荧光素酶和虫荧光素。
此外，关于如上所述的液体试样中的微生物的检测方法所用的检测装置，在上述各实施方式中，说明了使用检测试剂盒1或向检测试剂盒1中追加过滤促进剂的检测试剂盒，采用人工检测的例子。但该装置也能制成几乎不用人工的自动检测装置。
本发明的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测装置的其它部分的构成、形状、材质、大小、数量、连接关系等以及本发明所述的液体试样中的微生物的检测方法的其它工序并不限定于上述各实施方式。

Claims (16)

1.一种液体试样中的微生物的检测试剂盒，其特征在于，具备以下构成：
采集液体试样的第1注射器，
在上述第1注射器中使上述液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂，
配有能捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并可透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物的1次膜滤器并可安装在上述第1注射器上的1次过滤器，
配有能捕捉上述微生物并可透过上述游离ATP的2次膜滤器并可安装在上述1次过滤器上的2次过滤器，
能够安装在上述2次过滤器的前端的第2注射器，
用于清洗上述2次膜滤器的洗涤液，
溶解被上述2次膜滤器捕捉到的上述微生物并使ATP溶出的溶菌剂，
同时收集上述溶出的ATP和溶菌剂的检测用试管，和
使上述溶出的ATP发光的发光试剂。
2.权利要求1所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒，其特征在于，还具备：
用于测定发光量的光度计，和
用于使上述检测用试管的前端能够到达上述光度计的发光检测部而安装在上述检测用试管上的连接器。
3.权利要求1或2所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒，其特征在于，还具备用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂，或使用预先混入上述过滤促进剂的物质作为上述凝集剂。
4.权利要求1～3中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒，其特征在于，上述1次膜滤器和上述2次膜滤器分别安装入上述1次过滤器和上述2次过滤器成为一体并在使用完毕后被弃去。
5.一种液体试样中的微生物的检测方法，其特征在于包括：
将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合的工序，
加压过滤或减压过滤以用1次膜滤器捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物的工序，
将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉上述微生物并透过上述游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩的工序，和
向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量的工序。
6.权利要求5所述的液体试样中的微生物的检测方法，其特征在于，在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合的工序后，或在同一工序中同时追加加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂的工序。
7.一种液体试样中的微生物的检测装置，其特征在于：
将液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂混合，
加压过滤或减压过滤用1次膜滤器来捕捉上述凝集的蛋白质和体细胞并透过游离ATP(三磷酸腺苷)和微生物，
将滤液用具有比上述1次膜滤器更小孔径的能捕捉上述微生物并可透过上述游离ATP的2次膜滤器加压过滤或减压过滤使液体试样中的微生物在2次膜滤器的滤膜上被捕捉浓缩，
向该微生物中加入溶菌剂、向提取液中添加发光试剂，测定产生的发光量。
8.权利要求7所述的液体试样中的微生物的检测装置，其特征在于，在将上述液体试样与使该液体试样中的蛋白质凝集的凝集剂进行混合后或同时加入用于使过滤在短时间内进行的过滤促进剂。
9.权利要求1～4中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或权利要求5或6所述的液体试样中的微生物的检测方法或权利要求7或8所述的液体试样中的微生物的检测装置，其特征在于，上述凝集剂使用乙醇等脂肪醇，苯甲酸、水杨酸等羧酸，或壳聚糖，低聚壳聚糖。
10.权利要求1～9中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述1次膜滤器使用孔径约1μm～约10μm的过滤材料。
11.权利要求1～10中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述2次膜滤器为具有孔径约0.1μm～约0.5μm的微细孔的多孔性高分子膜。
12.权利要求11所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述多孔性高分子膜由聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、乙酸纤维素、亲水性聚丙烯、尼龙、亲水性聚醚砜、或亲水性硼硅酸玻璃纤维中的任何高分子构成。
13.权利要求1～12中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述溶菌剂为含有二甲亚砜的灭菌蒸馏水。
14.权利要求13所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述溶菌剂为含有约15容量％～约20容量％的二甲亚砜的灭菌蒸馏水。
15.权利要求3～14中任一项所述的液体试样中的微生物的检测试剂盒或检测方法或检测装置，其特征在于，上述过滤促进剂使用乙二胺四乙酸的碱金属盐、反式-1，2-环己二胺四乙酸的碱金属盐、乙二醇醚二胺四乙酸的碱金属盐、二乙撑三胺五乙酸的碱金属盐、或氨基三乙酸的碱金属盐。
16.权利要求5～15中任一项所述的液体试样中的微生物的检测方法或检测装置，其特征在于，将固体试样或高粘性试样在与上述凝集剂混合前添加灭菌蒸馏水后进行均化制成上述液体试样。
CNA2004800009848A 2004-11-30 2004-11-30 液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置 Pending CN1871338A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2004/017747 WO2006059359A1 (ja) 2004-11-30 2004-11-30 液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法及び測定装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1871338A true CN1871338A (zh) 2006-11-29

Family

ID=36564804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800009848A Pending CN1871338A (zh) 2004-11-30 2004-11-30 液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20060263773A1 (zh)
EP (1) EP1829958A1 (zh)
JP (1) JPWO2006059359A1 (zh)
CN (1) CN1871338A (zh)
WO (1) WO2006059359A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102288469A (zh) * 2011-08-16 2011-12-21 广东省梅州市药品检验所 一种祛风湿中成药中吡罗昔康的筛查方法及其使用的试剂盒
CN102460177A (zh) * 2009-05-15 2012-05-16 生物梅里埃有限公司 用于对培养试样容器进行自动地通风和取样的系统和方法
CN102917688A (zh) * 2010-06-10 2013-02-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新方法
CN103748208A (zh) * 2011-07-01 2014-04-23 恰根有限公司 生物分子分离中的过滤器模块
CN104894219A (zh) * 2015-06-29 2015-09-09 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法
CN104931711A (zh) * 2015-06-25 2015-09-23 马鞍山海普微奇生物科技有限公司 一种促进生物试剂与生物分子结合的方法和装置
CN107384756A (zh) * 2017-08-01 2017-11-24 云南中烟工业有限责任公司 一种烟用香精香料污染微生物的收集装置及方法
WO2019033946A1 (zh) * 2017-08-18 2019-02-21 杭州立昂科技有限公司 过滤出口注射器内分散多孔颗粒与液体的相互作用和分离
CN110031460A (zh) * 2019-05-10 2019-07-19 广西中医药大学 一种检测老年痴呆的试剂盒
CN113544254A (zh) * 2019-03-22 2021-10-22 株式会社日立高新技术 微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL1030525C2 (nl) * 2005-11-25 2007-05-29 Amiris B V Werkwijze voor het met luminescentie detecteren van ATP in een monster en een computerprogramma daarvoor.
US8158405B2 (en) * 2008-06-30 2012-04-17 General Electric Company Process for concentrating and processing fluid samples
CN103813845B (zh) * 2011-07-22 2016-08-17 生物梅里埃有限公司 从培养物离析微生物的方法和试剂盒
KR101751229B1 (ko) * 2015-08-17 2017-07-12 연세대학교 산학협력단 바타락탐계 항생제 분해효소 생성균 검출용 전처리 도구 및 상기 전처리 도구를 이용한 바타락탐계 항생제 분해효소 생성균 검출 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139031A (en) * 1989-09-18 1992-08-18 La Mina Ltd. Method and device for cytology and microbiological testing
JPH07110301A (ja) * 1993-10-12 1995-04-25 Toa Denpa Kogyo Kk 細胞のａｔｐ量測定方法及び装置
JP2001000170A (ja) * 1999-04-22 2001-01-09 Kikkoman Corp 検体検査用器具及び拭取検査用器具
US6395504B1 (en) * 2000-09-01 2002-05-28 New Horizons Diagnostics Corp. Use of phage associated lytic enzymes for the rapid detection of bacterial contaminants
FR2829500B1 (fr) * 2001-09-13 2003-12-12 Hemosystem Procede de concentration et de detection de germes pathogenes a partir de produits sanguins et/ou de leurs derives et dispositif pour le mettre en oeuvre

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102460177B (zh) * 2009-05-15 2016-02-03 生物梅里埃有限公司 用于对培养试样容器进行自动地通风和取样的系统和方法
CN102460177A (zh) * 2009-05-15 2012-05-16 生物梅里埃有限公司 用于对培养试样容器进行自动地通风和取样的系统和方法
CN102917688A (zh) * 2010-06-10 2013-02-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 新方法
CN103748208A (zh) * 2011-07-01 2014-04-23 恰根有限公司 生物分子分离中的过滤器模块
CN102288469A (zh) * 2011-08-16 2011-12-21 广东省梅州市药品检验所 一种祛风湿中成药中吡罗昔康的筛查方法及其使用的试剂盒
CN104931711A (zh) * 2015-06-25 2015-09-23 马鞍山海普微奇生物科技有限公司 一种促进生物试剂与生物分子结合的方法和装置
CN104894219A (zh) * 2015-06-29 2015-09-09 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法
CN104894219B (zh) * 2015-06-29 2018-01-05 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法
CN107384756A (zh) * 2017-08-01 2017-11-24 云南中烟工业有限责任公司 一种烟用香精香料污染微生物的收集装置及方法
CN107384756B (zh) * 2017-08-01 2023-09-15 云南中烟工业有限责任公司 一种烟用香精香料污染微生物的收集装置及方法
WO2019033946A1 (zh) * 2017-08-18 2019-02-21 杭州立昂科技有限公司 过滤出口注射器内分散多孔颗粒与液体的相互作用和分离
CN113544254A (zh) * 2019-03-22 2021-10-22 株式会社日立高新技术 微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置
CN113544254B (zh) * 2019-03-22 2024-01-02 株式会社日立高新技术 微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置
CN110031460A (zh) * 2019-05-10 2019-07-19 广西中医药大学 一种检测老年痴呆的试剂盒
CN110031460B (zh) * 2019-05-10 2021-07-20 广西中医药大学 一种检测老年痴呆的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006059359A1 (ja) 2006-06-08
EP1829958A1 (en) 2007-09-05
US20060263773A1 (en) 2006-11-23
JPWO2006059359A1 (ja) 2008-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5074485B2 (ja) 試料を調製するためのシステム及び方法
CN1871338A (zh) 液体试样中的微生物的检测试剂盒和检测方法和检测装置
CN1053741C (zh) 便于运送型采便容器
EP2217377B1 (en) Sample preparation for environmental sampling
US8685746B2 (en) Sample preparation container and method
CN101909756B (zh) 样品制备和收集系统及方法
US20100248215A1 (en) Sample preparation container and method
EP2461148B1 (en) Improved multifunctional specimen box
CN1218553A (zh) 检测污染物的方法
CN101158635A (zh) 一种用量子点检测细菌的方法
JP2006262891A (ja) 液体試料中の微生物の測定キット及び測定方法及び測定装置
CN1369003A (zh) 微生物的检测
CN1149628A (zh) 检测微生物的方法
CN1272426C (zh) 由液体样本中分离颗粒物质的方法和装置
CN1136446C (zh) 用于混合和加工标本样品的改进方法
JP4477474B2 (ja) 糞便懸濁ろ過用容器
CN101078031A (zh) 微流路系统
JP2007014239A (ja) 微生物検出方法および検出装置
US20070009984A1 (en) Churning methods for separating microorganisms from a food matrix for biodetection

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication