CN104894219B - 一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：1）参照GB 4789对待测食品样品进行稀释，得到1:10的样品匀液；向样品匀液中加入50‑65 wt%氨基三乙酸溶液，样品匀液与氨基三乙酸溶液体积比为5‑7:1，振荡，加入磷酸盐缓冲液或含0.05%吐温‑20的磷酸盐缓冲液后离心分层，弃上层；2）向经步骤1）处理后的样品添加免疫磁珠混合、振荡后，于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品进行洗涤；免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体制得；3）向洗涤后的样品添加磷酸盐缓冲液，振荡，涂于LB平板，培养观察。本发明检测方法操作简便、准确高效、成本低，同时富集两种目标菌，可将检测时间由72h缩短至25h。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术
沙门氏菌是肠杆菌科中主要的致病菌之一，畜禽感染沙门氏菌后可引起一系列疾病。食用感染的食品，会使人食物中毒。在我国，70%～80%的细菌性食物中毒事件都是由沙门氏菌引起的。因感染沙门氏菌而使人中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品。
金黄色葡萄球菌可引起多组织的感染，能够在人群中大范围传播而引发多种疾病，有时甚至会危及生命，如菌血症、心内膜炎和肺炎等。并且，金黄色葡萄球菌极易产生抗药性，特别是甲氧西林耐药株的大量出现，已经引起全球范围内的广泛关注。在许多国家由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居于第二或第三位，是主要的污染源，仅次于沙门氏菌属。
经过各国学者的多年研究，食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法日渐成熟，但其不足在在于：检测时间长、敏感度低、成本高，而且不能同步检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
发明内容
本发明目的旨在于提供一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。
基于以上目的，本发明采取以下技术方案：
一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1）参照GB 4789对待测食品样品进行稀释，得到1:10的样品匀液；向样品匀液中加入质量浓度为50-65%的氨基三乙酸溶液，样品匀液与氨基三乙酸溶液的体积比为5-7:1，振荡，加入磷酸盐缓冲液或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液后离心分层，弃上层；
2）向经步骤1）处理后的样品添加免疫磁珠混合、振荡后，于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品进行洗涤；所述免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体制得；
3）向洗涤后的样品中添加磷酸盐缓冲液，振荡，涂于LB平板，培养观察。
所述步骤2）中，洗涤操作为：加入洗涤液混合均匀后，置于磁力架上静置分层，弃上层，洗涤1-3次，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST缓冲液）。
步骤1）中采用超声波进行振荡，振荡温度为30-37℃，振荡时间为1-15min。
步骤2）中，下层样品与免疫磁珠按照1：1.5-2的体积比进行混合、振荡，振荡温度为25-60℃，振荡时间为15-60min。
所述磷酸盐缓冲液和含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.01mol/L。
所述待测食品为牛奶、鸡蛋、猪肉或速冻水饺。
链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
a）用0.01mol/L PBST缓冲液（pH 7.4，Tween-20）稀释沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体到1mg/ml；用无水DMSO配制10mg/ml生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液（BNHS溶液），BNHS溶液加入稀释的抗体中进行混合，BNHS溶液与稀释的抗体体积比为4:1，室温下，孵育，即得生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体。
b）加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，室温放置；
c）加入9.6μL 1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置4℃，置-20℃避光保存。
免疫磁珠制备时，高浓度的BNHS溶液会导致多个生物素分子结合在抗体上，因此可能会使所有抗体都被标记，较低的比率则会是使生物素化保持在最低限度，所以选择用无水DMSO配制10mg/ml BNHS；由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如Tween-20，将抗体溶液用PBST缓冲液透析，以除去未结合的生物素，防止在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，会抑制标记反应。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
1）氨基三乙酸对金属离子具有螯合作用，可以夺取酪蛋白胶素中的Ca2+，使其解离成小分子酪蛋白单体，从而克服样品在快速过滤富集过程中的阻碍作用，达到顺利、快速富集待检目标菌；
2）采用超声波进行振荡，能够促进样品匀液中的污物层被分散、乳化、剥离，提高处理效率；用PBS缓冲液进行洗涤，能够维持食品样品细胞的渗透压和pH，使食品样品不会因环境干扰发生改变；洗涤后进行离心，脱脂，达到去除杂质的目的；
3）采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠，提高了磁珠偶联效率。利用免疫磁珠同时捕获沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，在同步检测两种目标菌的同时还可将目标菌与样品中其它成分快速分离，以降低对检测准确性的干扰，有效避免或减少假阳性现象的发生。
4）本发明提供的检测方法操作简便、准确高效、成本低、安全环保，与传统分离培养法相比，利用免疫磁珠同时富集两种目标菌，可将检测时间由72h缩短至25h。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1 氨基三乙酸溶液的效果试验
将沙门氏菌标准菌株（CMCC 50115）和金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC6538）分别过夜培养后，按10倍梯度稀释，分别取10-4—10-9和10-4—10-10稀释度做免疫磁珠敏感性试验。将两个菌种培养液每个梯度的稀释液分别分成试验组和对照组两组，对照组加入质量浓度为65%的EDTA溶液，稀释液与EDTA溶液体积比为6:1，试验组加入质量浓度为50%的氨基三乙酸溶液，稀释液与氨基三乙酸溶液体积比为6:1，试验步骤如下：
1）取每一梯度稀释液100μL添加200μL免疫磁珠进行充分混匀，37℃缓慢振荡孵育20min，于磁力架上静置3min分层，弃上层，免疫磁珠为链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠，下层样品用500μL 0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.4，下同）洗涤，混合均匀后，于磁力架上静置3min，分层，弃上层，重复洗涤两次；
2）向洗涤后的样品种添加100μL 0.01mol/L PBS缓冲液，振荡，吸取100μL涂于LB平板，37℃培养24h，观察，计数。
沙门氏菌稀释液试验组和对照组试验结果见下表1，金黄色葡萄球菌稀释液试验组和对照组试验结果如下表2。
由表1可知，沙门氏菌培养液在稀释度为10-8时，对照组已经无法检出目标菌，而试验组依然能检出目标菌，试验组检测灵敏度底限为10-8，相应的细菌浓度为10cfu/mL，与对照组相比，加氨基三乙酸溶液处理后的沙门氏菌培养液检测结果高于对照组，敏感度高。
由表2可知，金黄色葡萄球菌培养液在稀释度为10-8时，对照组已经无法检出目标菌，而试验组在稀释度为10-9时依然能检出目标菌，试验组检测灵敏度底限为10-9，相应的细菌浓度为14cfu/mL，与对照组相比，加氨基三乙酸溶液处理后的金黄色葡萄球菌培养液检测结果高于对照组，敏感度高。
实施例2
一种牛奶中同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1）取待测牛奶样品25mL，加入225mL PBS缓冲液，振荡30s，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至7，得到样品匀液；向样品匀液中加入50.0ml 50 wt %氨基三乙酸溶液，37℃采用超声波进行振荡5min后（超声波频率20KHz），用0.01 mol/LPBS缓冲液洗涤后， 8000r/min下离心5min，分层，弃上层；
2）取100μL经步骤1）处理后的样品添加200μL免疫磁珠（为链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠）37℃混合、振荡20min后，于磁力架上静置2min分层，弃上层，下层样品用200μL 0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，充分混匀，于磁力架上静置2min分层，弃上层，重复洗涤一次；
3）向洗涤后的样品中添加100μL 0.01mol/L PBS缓冲液，振荡后，取100μL涂于LB平板，37℃培养观察。
实施例3
一种鸡蛋中同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1）用流水冲洗待测鸡蛋外壳，再用75%酒精棉球涂擦消毒，取25mL蛋液，加入225mLPBS缓冲液中，拍击式均质器拍打60s，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至7，得到样品匀液；向样品匀液中加入45.5mL 50wt%氨基三乙酸溶液，37℃采用超声波进行振荡5min后（超声波频率20KHz），用0.01mol/L PBST缓冲液洗涤2次， 8000r/min离心5min，分层，弃上层；
2）取100μL步骤1）处理后的样品添加200μL免疫磁珠（为链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠），37℃混合、振荡20min后，于磁力架上静置2min，分层，弃上层，下层样品用200μL 0.01mol/L PBST缓冲液（pH 7.0，下同）洗涤，充分混匀，于磁力架上静置2min，分层，弃上层；
3）向洗涤后的样品中添加100μL 0.01mol/L PBS缓冲液，振荡后，取100μL涂于LB平板，37℃培养观察。
实施例4
一种猪肉中同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其包括以下步骤：
1）无菌切取待测生猪肉25g，加入225mL磷酸盐缓冲液中，均质器拍打60s制成猪肉匀浆，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至7，得到样品匀液；向样品匀液中加入41.7mL 55wt%氨基三乙酸溶液，37℃采用超声波进行振荡5min后（超声波频率20KHz），用0.01mol/L PBS缓冲液洗涤后， 8000r/min离心5min，分层，弃上层；
2）取100μL经步骤1）处理后的样品添加200μL免疫磁珠（为链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠），37℃混合、振荡20min后，于磁力架上静置2min，分层，弃上层，下层样品加入200μL 0.01mol/L PBST缓冲液洗涤，充分混匀，于磁力架上静置2min，分层，弃上层，重复洗涤两次；
3）向洗涤后的样品中添加100μL 0.01mol/L PBS缓冲液，振荡后，取100μL涂于LB平板，37℃培养观察。
实施例5
一种速冻水饺中同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其包括以下步骤：
1）取待测速冻水饺25g，加入225mL磷酸盐缓冲液，均质粉碎30s，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至7，整个过程不超过10min，得到样品匀液；向样品匀液中加入38.5mL 60wt%氨基三乙酸溶液，37℃采用超声波进行振荡5min后（超声波频率20KHz），加入0.01mol/LPBS缓冲液洗涤后， 8000r/min离心5min，分层，弃上层；
2）取100μL经步骤1）处理后的样品添加200μL免疫磁珠（为链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠），37℃混合、振荡20min后，于磁力架上静置2min，分层，弃上层，下层样品加入200μL 0.01mol/L PBS缓冲液，充分混匀，于磁力架上静置3min，分层，弃上层，重复洗涤一次；
3）向洗涤后的样品中添加100μL 0.01mol/L PBS缓冲液，振荡后，取100μL涂于LB平板，37℃培养观察。
实施例6 对比试验
对实施例2-5中的食品样品进行同步取样，采用GB 4789.4或 GB 4789.10方法进行检测，进行平行对比试验，对比试验结果见表3。
由表3可知，本发明提供的方法对鸡蛋、牛奶、猪肉、速冻水饺等食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的检测效果明显优于现行国标方法。对沙门氏菌含量较低的样品（鸡蛋和速冻水饺），用国标法不能检出，而用本发明检测方法依然能检出。
与国标方法（GB 4789.4、GB 4789.10）相比，本发明提供的检测方法不用经过繁琐其耗时长的预增菌和选择性增菌过程，直接分离沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，操作简单，缩短了检测时间，并且该法准确度高、灵敏性强，样品经氨基三乙酸处理后，利用免疫磁珠可定量检出食品样品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
Claims (6)
1.一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）参照GB 4789对待测食品样品进行稀释，得到1:10的样品匀液；向样品匀液中加入质量浓度为50-65%的氨基三乙酸溶液，样品匀液与氨基三乙酸溶液的体积比为5-7:1，振荡，加入磷酸盐缓冲液或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液后离心分层，弃上层；
2）向经步骤1）处理后的样品添加免疫磁珠混合、振荡后，于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品进行洗涤，所述免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体制得；
3）向洗涤后的样品中添加磷酸盐缓冲液，振荡，涂于LB平板，培养观察；
链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
a）用0.01mol/L PBST缓冲液稀释沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体到1mg/ml；用无水DMSO配制10mg/ml生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液，BNHS溶液加入稀释的抗体中进行混合，BNHS溶液与稀释的抗体体积比为4:1，室温下，孵育，即得生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体；
b）加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，室温放置；
c）加入9.6μL 1mol/L NH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置4℃，置-20℃避光保存。
2.根据权利要求1所述同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤2）中，洗涤操作为：加入洗涤液混合均匀后，置于磁力架上静置分层，弃上层，洗涤1-3次，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤1）中采用超声波进行振荡，振荡温度为30-37℃，振荡时间为1-15min。
4.根据权利要求1-3任一所述同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤2）中，下层样品与免疫磁珠按照1：1.5-2的体积比进行混合、振荡，振荡温度为25-60℃，振荡时间为15-60min。
5.根据权利要求4所述同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液和含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.01mol/L。
6.根据权利要求5所述同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述待测食品为牛奶、鸡蛋、猪肉或速冻水饺。
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