CN1369003A - 微生物的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测混合物(如啤酒)中微生物(如酵母)的改进方法。

Description

微生物的检测
本发明涉及检测混合物(如啤酒)中的微生物、特别是酵母和细菌的改进方法。
食品和饮料如啤酒的生产都需要同时测试某些微生物的存在与否，以确保最终产品的质量。酿造工艺例如需要几乎每个小时都在线测试体积至少为25ml的样品，样品的体积优选例如是250ml。然后必须从样品中分离有可能包含微生物、即酵母和细菌的特定物质，并接着进行测试以确定特定微生物是否存在。用于实现该目的的装置包括具有平均孔径为0.45μm的扁平过滤器的Bibby一次性真空过滤器单元以及具有接受器的Nalgene过滤器保持器，该保持器具有平均孔径为0.45μm或者0.2μm的扁平过滤器(例如参见Merck Laboratory Supplies Catalogue1998，p.482)。此等装置仅能够过滤最大体积为100ml的样品，其扁平表面积为50cm2，而且由于其使用的复杂性需要30分钟来检测样品。一旦已经过滤了最大体积的样品，这些过滤器就会被样品流体(如陈贮啤酒)中存在的某些物质如蛋白质阻塞，而任何随后的过滤将需要非常高的压力，使得细胞溶解(lysis)，妨碍了微生物的检测，并产生错误的结果。
如以下详细描述的实验的结果所示，与使用本发明的装置和方法时所用的时间相比，现有技术的装置基本上需要更长的时间来分离并检测样品中的微生物。另外，在使用本发明的方法和装置时，随后回收并由此检测微生物较为简单而且容易，这是因为微生物以易于移动的“饼”(特定物质之相对未压实的低密度块)存在于膜的表面上，它们最小程度地侵入膜间隙中。相比较而言，特定物质在其他装置上以硬“饼干”(特定物质之相对高度压实的高密度块)的形式存在于膜表面上，微生物和其他特定物质阻塞并被捕集于膜间隙中。该饼干难以除去，而且使得难于处理以测试微生物的存在。另外，通过防止密实饼干的形成，本发明的装置能够在低的压力下运行。如果在更高的压力下运行，有可能发生细菌的溶解，这又会产生不正确的结果。高压也可导致细菌的变形，使它们由膜中通过，也会产生不正确的结果。
根据本发明，其提供一种用于由样品混合物中回收微生物的方法，其包括以下步骤：
(i)使所述样品混合物由过滤装置的样品入口通过，该过滤装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，所述膜具有第一和第二端部、外表面和限定空腔(lumen)的内表面，各所述膜的第一端部是开口的而且与所述样品入口连通，由第二端部出来的流体被限制住，使所述样品混合物由所述膜中过滤，在所述膜的所述空腔中留下过滤物(filtrand)；
(ii)重新悬浮在所述膜中的过滤物；以及
(iii)检测所述过滤物中是否存在任何微生物。
重新悬浮步骤(ii)可包括使溶胞剂(lysing agent)的溶液由所述膜的空腔中通过。这可例如通过以下方式完成：将针筒连接在上述装置的一个端部上，并使溶胞缓冲液由膜的空腔中通过，或者可将膜放置在溶胞溶液中，然后使用连接在装置上的针筒，将溶胞溶液抽入膜的空腔中。
由所述膜的第二端部出来的流体被限制住，使得所述样品混合物仅由所述膜过滤后才流出所述过滤装置。
现有技术的过滤装置和方法包括以下文献：GB 2135902、EP302949、WO 94/00222、WO 84/00015、US 5863501、US 5814179、US4501793、JP 4-135478(WPI摘要1992-205001)、JP 63-104615(WPI摘要1988-165566)、JP 63-088007(WPI摘要1988-145060)和JP 61-133105(WPI摘要1986-200908)。但是，上述文献中没有一个公开或者暗示了本发明的方法，而本发明的方法包括得到它们能够提供的结果所必须的各步骤。具体而言，现有技术没有暗示产生可重新悬浮的“饼”的形式的过滤物，相反，它们产生更密实的“饼干”形式的过滤物。而且它们都没有提示重新悬浮第一过滤步骤的过滤物作为随后处理步骤的一部分。例如，JP 63-104615公开了一种由流体中分离例如病毒的装置，其包括多个多孔中空纤维素纤维，这些纤维的一端嵌在填料中，并对大气是开口的，而另一端是封闭的。然而，该文献既没有提示膜应预先用洗涤剂进行处理，也没有提示应使用聚丙烯膜，而且没有提示可如何容易地在过滤物中检测微生物、特别是细菌和酵母，或者应重新悬浮过滤物。
微生物检测步骤可包括检测所希望的微生物的任何检测方法。例如，简单常规的微生物测试是如下详细描述的ATP测试，其中溶解任何微生物，然后使用荧光素酶分析法检测所释放的任何ATP。或者，可使用微生物特异性抗体，或者可将过滤物铺板在普通营养培养基上，然后检测任何微生物菌落的生长。
已发现用洗涤剂预先处理膜(例如用洗涤剂冲洗膜，然后任选地使膜干燥)可大大提高混合物由膜中通过的流率。在比较经洗涤剂处理的干燥膜和未经处理的干燥膜时，这尤为明显。该增加的流率确保了在收集微生物时不会使它们溶解或者迫使它们由膜中通过。
有用的洗涤剂包括非离子洗涤剂，特别是Tween20，更特别的是20％Tween20溶液。
在与由具有扁平膜以及类似总体积(尺寸)的单个装置所提供的表面积相比时，使用多个中空纤维过滤膜还提供了较大的进行过滤的表面积(通常至少大3倍)。这也使得在发生任何孔阻塞之前可以过滤相对更大体积的样品。对于包含大量可快速阻塞扁平过滤膜的特定物质的混浊样品(如烈性黑啤酒)，这是特别有用的。
还发现过滤膜材料的精确性质也是特别重要的。发现平均孔径为0.2μm并预先用洗涤剂处理的市售聚丙烯中空纤维膜，与平均孔径为0.2μm而且甚至也用洗涤剂预先处理的聚砜膜相比，允许更大的流率。因此，在本发明的优选实施方案中，中空纤维膜可为聚丙烯膜。当然，也可使用其他的膜，特别是那些具有类似物理特征(如单位膜表面积具有类似的孔面积)的膜。
本发明中使用的中空纤维膜可具有0.2μm的平均孔径。
根据本发明还提供用于由样品混合物中分离微生物的过滤装置，该装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，各膜具有外表面和限定一个空腔的内表面，各膜的一个端部是开口的而且与过滤装置的样品入口连通，而另一个端部是闭口的。
使用本发明的方法及装置测试微生物的难易程度可通过过滤速度来证实，这可由以下的实验结果看出。在使用本发明的方法及装置由给定体积的样品流体中回收特定物质时，所需要的时间仅是使用其他装置时所需要时间的几分之一，而且经常至少快10倍。
本发明还具有以下重要的优点：即使是过滤非常混浊的混合物时，对于给定的样品提供一致的结果，在不同组的结果之间可容易地实现至少99％的一致性。这与使用扁平膜时得到的较不一致的结果相比是非常有利的。
通过以下参考附图的描述，本发明将更为显而易见，但这些描述仅是示例性的用一个过滤装置的形式来进行，但绝不是对本发明范围的限制，在附图中：
图1显示了根据本发明的第一个过滤装置及其在检测微生物方法中的应用。
图2显示了ATP标准曲线。Y轴是RLU(相对光单位)，而X轴是ATP摩尔浓度。实心菱形表示1∶625酶，实心方形表示1∶9酶，而实心三角形表示1∶1酶。
图3显示了对P.damnosus的捕集(entrapment)浓度曲线。Y轴是总RLU，而X轴是细胞数。实心菱形是对于137099-1，而实心方形是对于037099-1。
图4显示了对S.carlsbergensis的捕集标准曲线。Y轴是总RLU，而X轴是细胞数。实心方形是对于266099-1，而实心三角形是对于097099-1。
图5显示了对A.pasteurianus的捕集浓度曲线。实心菱形是对于147099-1，而实心圆是对于027099-1。
图6显示了根据本发明的第二个过滤装置及其在检测微生物方法中的应用。
图7显示了由管端盖帽的截面图以及轴环(collar)的俯视图。
图8显示了使用上述第二个装置检测过滤啤酒样品中的S.carlsbergensis。Y轴是RLU，而X轴是每个分析中的细胞数。
图9显示了使用上述第二个装置检测过滤啤酒样品中的A.pasteurianus。Y轴是RLU，而X轴是每个分析中的细胞数。
图10显示了使用上述第二个装置检测过滤啤酒样品中的P.damnosus。Y轴是RLU，而X轴是每个分析中的细胞数。
图11显示了
由图1可以看出，第一过滤装置10包括具有Luer锁件21并与68个中空聚丙烯纤维膜30连通的样品入口20，所述纤维膜30的平均孔径为0.2μm。膜30的开口端嵌在可紫外固化的粘合剂40中，该粘合剂将纤维膜保持在原位并使它们与样品入口20连通。膜30的另一端嵌在可紫外固化的粘合剂41中，该粘合剂将该端封闭。用20％Tween20组成的溶液由膜30中冲洗，然后使其干燥，由此预先处理膜30。
在使用时，容纳样品混合物60的针筒50与样品入口20连通，样品混合物60由膜30过滤，形成滤液70和过滤物71。膜30接着放入重新悬浮溶液80中，向回抽拉针筒50的柱塞90，使得重新悬浮溶液80流入膜30的空腔中，以重新悬浮保留在膜30中的过滤物71，然后将其抽入针筒50中。
过滤物71重新悬浮并收集于针筒50后，就可对其进行测试。如表4详细描述的，已制得具有不同膜30长度的各种过滤装置。在一个具体的实施方案中，膜30总长为55mm，其中的44mm是开口的，而且能够提供进行过滤的表面。膜30可提供总共51.2cm2进行过滤的表面积。
第二过滤装置100包括具有Luer锁件21并与68个中空聚丙烯纤维膜30连通的样品入口20，所述纤维膜30的平均孔径为0.2μm。在样品入口20处，膜30的端部嵌在可紫外固化的粘合剂中，该粘合剂将纤维膜保持在原位并使它们与样品入口20连通。在出口110处，膜30的端部嵌在可紫外固化的粘合剂中，该粘合剂将该端部保持在原位并使它们与出口110连通，而出口被管塞120封闭。用5％Tween20组成的溶液由膜30中冲洗，然后使其干燥，由此预先处理膜30。
在使用时，在阶段I(图6)，通过Peri泵130以100ml/min的速率经由管140向装置100中泵入100ml体积的陈贮啤酒60。在装置100充满陈贮啤酒60时，阻塞出口110的管塞120使装置100的出口只能是膜30中的孔，而且陈贮啤酒60因此由膜30中过滤，而滤液收集在废液收集容器150中并弃掉。在阶段II，通过管140以187ml/min的速度泵入400ml的无菌水160，由膜30中过滤(管塞120仍在原位)并收集在废液容器150中，然后弃掉。当水160完全由装置100中通过时，使泵130继续运行10秒，以将空气由管140和膜30中泵出，并由膜30中除去过量的流体。关闭泵140，并使装置100与管140和泵130分开。在阶段III，移开管塞(如管端盖帽)120，并在一片清洁的卫生纸(未示出)上，使装置100开孔，以除去任何过量的流体160。将包含0.5ml溶胞缓冲液160(0.2M氢氧化钠)的1ml针筒50连接在样品入口20上，并使分流管165连接在出口110上。进行湿润/溶胞步骤，其包括小心地推压针筒50的柱塞55，直至液体(溶胞缓冲液160)出现在分流管165中，然后向后抽拉柱塞55，以便将溶胞缓冲液160抽回至针筒50中，由此用溶胞缓冲液160重新湿润膜30。湿润/溶胞步骤再进行两次。将装置100保持在无菌的1.5ml管170上并推压柱塞55共3次，由此从装置100中除去所有的液体160。在阶段IV中，从装置100上移走分流管165，并在装置100上装设管端盖帽120。向回抽拉柱塞55，以收集所有的流出液(包括在膜上的部分)。将流出液转移至管170中。在管170中加入9滴中和缓冲液(0.2M Tris磷酸盐)。在管170上设置盖子，并通过来回颠倒管170共2-3次，使其内容物混合。最后，在阶段V，使用Biotrace Unilite发光计和Sigma Bioluminescence试剂在样品上进行ATP分析。实验ATP分析
所有的ATP分析都是按照碱变性/中和法进行的。
在无菌的微量离心管(eppendorf)中放入50μl的2M氢氧化钠溶液，添加200μl的样品，然后通过移液2-3次进行混合。添加50μl的2M Tris-磷酸盐缓冲液，并通过颠倒进行混合(样品混合)。
在比色杯(Uni-Lite比色杯)中放入经过适当稀释的100μl的ATP分析混合物(Sigma-Aldrich Ltd.)。静置3分钟，然后在发光计(Uni-Lite)中读出35秒的背景光输出。确定背景光输出后，在比色杯中添加100μl的样品混合物，并读数35秒。背景与样品读数之间的差异是由于在样品中存在ATP。膜捕集
25ml包含约1×107个S.carlsbergensis细胞的陈贮啤酒由各装置中通过，其中25ml的针筒连接在过滤装置的Luer组件上。过滤装置用10ml水洗涤，以除去任何过量的陈贮啤酒(陈贮啤酒对ATP分析会产生轻微抑制性作用)。过滤装置的膜区域放入无菌水中，使水由装置中回冲，并除去所捕集的任何细胞，作为收集的浓缩物。如上所述进行ATP分析，以确定在滤液和浓缩物中是否存在微生物ATP。一致性捕集
在24ml的陈贮啤酒中加入S.carlbergensis、A.pasteurianus或者P.damnosus之10ml过夜培养物中的1ml，然后使添加后的样品由如上所述的过滤装置中通过。通过比较过滤前和过滤后的微生物ATP水平，测定浓缩物中微生物的％回收率。对单个微生物菌株总共测试5个装置，然后测定回收水平之间的变化系数。
测定微生物污染的最常见而且也是最快速的方法是测量细胞的ATP。这需要破碎细胞膜/壁(细胞溶解)，以释放细胞中存在的ATP。使用将底物(荧光素)和ATP转化为多种产物(包括光)的酶促反应，由此可测定所释放的ATP。然后可使用标准的发光计测量光的量。
多种基于以上原理的ATP实验试剂都是可市售得到的。ATP生物发光分析试剂盒(Sigma-Aldrich，Poole)不包含任何促进细胞溶解的缓冲剂。应注意的是，细胞膜溶解的条件随细胞类型而不同。本发明的研究主要集中于在啤酒的生产阶段存在于啤酒中的细胞类型。这包括两个细菌菌株--Acetobacter pasteurianus和Pedicoccus damnosus，以及一个酵母菌株Saccharomyces carlsbergensis。酵母菌株有可能是不同的，因为其是开始发酵的起始物菌株。大多数的酿造商都使用Saccharomyces科中的起始物菌株，因此该菌株可在本发明的测试中使用。细胞溶解方法
热变性法：样品煮沸10分钟，然后冷却，并在进行ATP测试前调节其pH。一些细胞是耐热性的。
碱变性法：强碱如氢氧化钠可溶解细胞。然而，在ATP分析中使用的酶如荧光素酶仅在接近中性的pH下才发挥功能。因此，样品的pH调节必须在ATP测试前进行。碱的浓度可决定细胞溶解的程度。
细胞培养物溶解剂：细胞溶解的已知方法。
碱变性/酸性中和：使用氢氧化钠(最佳为2M)，然后立即使用酸性缓冲剂中和氢氧化钠，由此使细胞溶解。在ATP测试中直接使用样品，酶的功能没有丢失。
各种溶胞方法的结果见表1所示，而且表明碱变性/酸性中和法能够使所有微生物的细胞都溶解，没有必要在测试前从生长培养基中除去细胞。ATP标准曲线
为测定ATP分析的灵敏度，在10-7至10-16mol的ATP范围，测定ATP标准物的浓度曲线。结果如图2所示。
使用本发明的装置进行样品测试时的RLU可与ATP标准曲线相媲美，而且可测定给定样品中的细胞数量。单个酵母细胞包含约10-14mol的ATP，而细菌细胞中存在的APT低100倍。膜捕集
在制造本发明的装置时使用不同化学组成及分子尺寸截止范围(cutoff)的膜，并在类似的条件下测试捕集研究中所涉及微生物的能力。测试多种形式的装置，其中使用具有各种孔径/分子量截止范围的聚丙烯膜。本发明的发明者已鉴别出能够捕集而且可在低压下运行的形式和膜类型，并由此避免了在使用样品时损坏细胞。实验中所用的Y型装置类似于本发明的装置，具有样品入口20、Luer组件21、膜30以及可紫外固化的粘合剂40。然而，它们与本发明装置的不同之处在于，各膜30是环形的，其中每一端都是开口的，并嵌于可紫外固化的粘合剂40中，而且能够与样品入口20连通。
已表明装置内膜的形状在捕集所有研究中所用的微生物的能力方面扮演重要的作用。膜分子量越小，使样品由装置中通过所需要的压力越大。增加的压力似乎改变了细胞结构，使得细胞由膜中通过(过滤)而且不被捕集。结果示于表2中。一致性捕集
进行研究，以确保过滤装置捕集微生物的一致性。对于每个实验，测试5个装置捕集各微生物的能力，并通过ATP分析测定所捕集的总细胞数。结果见表3所示。捕集浓度曲线
分析10倍稀释的各微生物过夜培养物，使得可以测定被装置捕集的细胞数量。各微生物铺板在合适的培养基上，以测定各稀释物的精确细胞数量。结果示于图3-5中。
对于各样品使用三组装置并进行两次ATP测试，以测试所有的数据点。数据已进行校正以除去游离ATP的影响。RLU输出的增加可在更低浓度的样品上进行检测。这是因为酶稀释度的改变，增加了敏感性。污染物检测/定量
进行测试，以测定2.5升的陈贮啤酒是否可由具有68个膜的装置中过滤，所述膜的总表面积为51.2cm2。在三组装置上，表明该体积可由过滤器中通过，不会对膜产生任何阻塞。增加装置的表面积，以测定可过滤而且未受污染的陈贮啤酒的体积。每个装置中膜的数量保持一致，并改变总的长度。测试各尺寸的三组装置，结果示于表4中。当压力变得过大而不能由装置中通过时，终止施加陈贮啤酒样品。如下进行其他的实验
使用由第二过滤装置(图6)表示的过滤装置。设备
1、平均孔径为0.2μm的聚丙烯中空纤维膜(预先用5％Tween20进行处理)
2、Loctite(RTM)21半自动控制器，其中有手持敷料器和脚动开关，压力设定为0.2bar，数字输出设定为35.0。
3、Bondmatic 850紫外光源，定时器设定为40秒。
4、内径为7.0mm、外径为12.4mm的轴环(图7，200)(聚碳酸酯棒)
5、Y形管端盖帽(图7，210)，其是由2mm聚丙烯聚合物制成的，宽端(内径为12.4mm)用于接纳轴环，而窄端(内径为4.1mm)用于与Luer针筒喷嘴连接。如下制备过滤装置：
1、用IPA(异丙醇)清洗所有工作表面。
2、取合适长度的聚丙烯中空纤维膜组成的束，在该纤维束周围放置多个轴环。
3、在距离中空纤维膜束端部约30mm的位置处，粘合剂敷料器的喷嘴放置在膜束的中心，然后涂敷粘合剂，使其渗透过膜束。操控喷嘴，以使粘合剂涂敷在该区域中的所有膜上。在该位置处另外涂敷粘合剂至膜束的外侧。然后滑动轴环，并在膜上旋转，其旋转位置可使其接触粘合剂。
4、将膜束中涂敷有粘合剂的截面放置在紫外光源下，以固化粘合剂。
5、在沿膜束距离前述轴环约30mm的位置处如(上述)步骤3所述涂敷粘合剂。在粘合剂上滑动并旋转第一和第二轴环，使得它们相互接触，然后使它们分开1-2mm，并重复步骤4。
6、重复步骤5，直至整个膜长度在原位产生轴环。
7、在一对轴环之间以1-2mm的缝隙切断纤维，产生多个中空纤维装置，纤维在各端都有开口空腔，而且用轴环在各端密封在外侧上。
8、在55℃下温育装置过夜，以除去任何残留的粘合剂单体。
9、取其中一个装置以及一对管端盖帽，在管端盖帽的内侧边缘以及装置轴环的外侧周围涂敷loctite priomer770。放置约1分钟，然后在各轴环的外侧周围涂敷Loctite快速固化粘合剂403，并将管端盖帽牢固地压在轴环上直至粘结住。实验
首先，如以下实验指示使用本发明的第二装置(图6)使上述测试的结果有效。每个分析中，对于Saccharomyces carlsbergensis的检测限为30-100个细胞，对于Acetobacter pasteurianus为10000-20000个细胞，而对于Pediococcus damnosus为大于1000个细胞。系统过滤大体积液体的能力表明其对于测试最终CIP(cleaning-in-place，原位清洗)冲洗水的卫生状况是特别合适的。
其次，略微改进该实验，以增加其对啤酒微生物污染的灵敏度。这可通过由过滤啤酒样品中捕集的低数量微生物的渗滤培养物(in-filterculture)来实现。在24小时的培养期后，可检测每ml过滤啤酒中的1个细胞。该结果至少是与目前基于ATP的其他检测系统一样好，但使用时更方便。另外，本发明的系统具有以下优点：与常规扁平床膜过滤(导致检测限的增加)相比，能够过滤更大体积的啤酒(以及过滤浓烈黑啤酒的能力)。还可实现类似的灵敏度，但无需在使用本领域已知的腺苷酸激酶检测实验时的渗滤培养(或者更短的培养期)。
测试具体地表明本发明的应用包括酿造、制药、软饮料和乳制品工业中制造工艺的原位清洗(CIP)测试。另外，本发明还特别适合于啤酒(包括苦啤酒、陈贮啤酒和浓烈黑啤酒)和苹果酒污染的测试。
在此，检查在进行ATP分析前在肉汤培养基中温育包含低细胞数量的过滤装置的作用。为此目的，使用不同的微生物--Lactobacillusbrevis(BSO 464)。选择该微生物的原因是，以前已广泛使用其用于多个ATP检测实验中，所以可容易地将结果与由其他系统得到的结果进行比较。
BSO464在MRS肉汤中生长至稳定期。在进行显微镜细胞计数后，在无菌去离子水中进行适当的稀释，以产生每ml约100个细胞。使用1ml该培养物以接种99ml的陈贮啤酒，对于每个陈贮啤酒样品进行上述实验3次。进行板计数，以检查接种水平。各陈贮啤酒如下进行过滤，并遵循实验指示至步骤7。
在该步骤后，由管中移走装置，并使用无菌针筒在微纤维的内部填充MRS肉汤。移走针筒，并在装置的该端上设置第二无菌管端盖帽，以将所捕集的任何微生物都保留装置内。整个装置浸没在20ml的MRS肉汤中，用于改变温育时间。在温育后，小心地将装置由肉汤中取出，并取下其中一个管端盖帽。使用针筒，使10ml的无菌去离子水由装置中通过，然后收集在废液容器内。使用针筒将空气注射入装置中，以由膜中除去过量的液体。由步骤9开始，每个实验规程都遵循以下实验指示。实验指示
1、由密封袋中取出装置和管。
2、将所述管连接在合适的泵系统上，该泵系统可以在187ml/min或者220rpm(管内径为3.2mm，外径为6.4mm)下运行。
3、在装置下放置废液收集容器。
4、将泵设定为100ml/min或者117rpm。
5、使100ml的陈贮啤酒通过(可通过最大1升)，并使滤液流入废液容器中。
6、调节泵的设置为187ml/min或者220rpm，然后通过过滤400ml的无菌(蒸馏)水由装置中洗出过量的陈贮啤酒。
7、当水洗涤完成后，使空气由管中通过10秒，以由膜中除去过量的流体。
8、关闭泵，并从泵上卸下装置和管。
9、取下装置的管端盖帽。在一片清洁的卫生纸上，使装置开孔，以除去任何过量的流体。
10、在装置的一端，连接一个分流管，在另一端设置包含0.5ml溶胞缓冲液(0.2M氢氧化钠)的1ml针筒。
11、小心地推压针筒柱塞，直至在分流管中出现液体。向回拉针筒柱塞，以将溶胞缓冲液抽回至针筒中，由此用溶胞缓冲液重新湿润膜。
12、重复步骤11两次。
13、将装置保持在无菌的1.5ml管上，然后推压针筒柱塞三次，由此从装置中除去所有的液体。
14、卸下分流管，并在装置上设置管端盖帽。向回抽拉针筒柱塞，以收集所有的流出物(包括在膜上的)，然后将其放入1.5ml管中。
15、立即添加9滴中和缓冲液(0.2M Tris-磷酸盐)至包含流出物的管中。重新放上管盖，然后通过颠倒管2-3次进行轻柔地混合。
16、使用Biotrace UniLite发光计和Sigma生物发光(ATP分析)试剂在样品上进行APT分析，其中ATP分析如下所述进行。ATP分析
1、在清洁的UniLite比色杯中放入50μl的ATP分析混合物。
2、在室温下温育3分钟。
3、在比色杯上放置UniLite HoldTight，然后放入发光计中，盖紧管盖，并按压测量按钮。10秒的延迟后，机器将测量光输出35秒。
4、在屏幕上将显示分析混合物单独时的RLU打印结果，并打印出来。这是分析背景读数，而且不应大于30RLU。更高的读数表示有污染存在。
5、由样品室中取出比色杯，然后在该比色杯中添加100μl的洗脱样品。轻轻地摇晃进行混合，然后将比色杯重新放入样品室中。
6、密封样品室，然后按压测量按钮。在屏幕上显示光输出并进行打印。结果1、早期结果的有效性
表5和图8表明，使用该系统可容易地检测出每个分析中约30个酵母细胞(或者每个过滤啤酒样品300个细胞)。也就是说，每个分析中30个酵母细胞所产生的RLU输出，可容易地与未经接种的陈贮啤酒样品时得到的结果区别开来。
表6和图9表明，每个分析中3000个A.pasteurianus细胞所产生的平均光输出远大于背景水平。该分析的(可靠)检测限是每个分析10000-20000个A.pasteurianus细胞。
表7和图10表明每个分析中150个P.damnosus细胞所产生的平均光输出远大于背景水平。该分析的可靠检测限是每个分析大于1000个P.domnosus细胞。2、改进的系统
表8和图11表明了渗滤富集培养对使用本发明的第二装置检测过滤啤酒中低数量的Lactobacillus brevis的影响。结果表明过滤后24小时的渗滤富集使得在使用本发明的实验及装置时可检测160个L.brevis细胞。为检测低数量的受压微生物，希望富集阶段持续30-40小时。讨论
通过进行渗滤富集培养，可在24小时的温育后检测每ml过滤啤酒中的约1个L.brevis细胞(这等于在原始样品中每个分析小于1个细菌细胞)。然而，推荐在“真实”的环境中，在进行实验前富集持续30-40小时，以检测低数量的受压微生物。该结果至少与目前基于ATP的其他检测系统一样好，但本发明的系统更易于使用。再者，本发明的系统具有以下优点：与常规扁平床膜过滤相比(这使得检测限增加)，能够过滤更大体积的啤酒(以及能够过滤浓烈黑啤酒)。另外，装置的设计表明样品和萃取阶段包含在过滤装置内，使得基于ATP的检测更易于进行。
                                   表1
    方法                     微生物菌株     时间
S.carlsbergensis A.pasteurianus  P.damnosus
热变性 发生细胞溶解 无细胞溶解 发生细胞溶解 20-25分钟
碱变性 发生细胞溶解 发生细胞溶解 如果从生长培养基取出细胞后才发生细胞溶解 15分钟
细胞培养物溶胞试剂 发生细胞溶解 无细胞溶解 如果从生长培养基取出细胞后才发生细胞溶解 不需要除去培养基后1分钟
碱变性/中和 发生细胞溶解 发生细胞溶解 发生细胞溶解 1分钟
                                  表2
  装置形状                    微生物菌株   膜分子截止范围
S.carlsbergensis A.pasteurianus   P.damnosus
    Y型     捕集     滤出     滤出    0.2微米
   线性     捕集     捕集     捕集    0.2微米
 Y型&线性     捕集     滤出     滤出    1000kD
 Y型&线性     捕集     滤出     捕集    500kD
 Y型&线性     滤出     滤出     滤出    300kD
             表3
变化系数(％)
S.carlsbergensis  11.1
 A.pasteurianus  12.5
 P.damnosus  5.7
                              表4
    膜长度   工作表面积   陈贮啤酒体积(平均)   标准偏差   变化系数(％)
    40mm   51.27cm2     2500ml(最小)     0     0
    30mm   38.45cm2     1400ml     180.28     12.9
    20mm   25.63cm2     513.3ml     23.09     4.4
    10mm   12.8cm2     150ml     0     0
表5：过滤啤酒样品中Saccharomyces carlsbergensis的检测
每100ml的细胞数 每个分析中的细胞数 RLU 平均值 标准偏差 ％CV
1.4×105 1.4×104 568074018260439  52476  10801  20.6％
1.4×104 1.4×103 738594788220  8361  1054  12.6％
1×103 1×102 121513611296  1291  73.2  5.67％
2.5×102 2.5×101 225110129  155  61.6  39.7％
空白 空白 121114120  118  3.79  3.21％
表6：过滤啤酒样品中Acetobacter pasteurianus的检测
每100ml的细胞数 每个分析中的细胞数 RLU 平均值 标准偏差 ％CV
4×107 4×106 40724387213715243999  40149  2735  6.81％
3.5×106 3.5×105 467936955509  4628  908  19.6％
2.7×105 2.7×104 938439319629  581  270  46.5％
3×104 3×103 401118196398  278  144  51.8％
2.5×103 2.5×102 133140148  140  7.51  5.36％
空白 空白 121114121  118  3.79  3.21％
表7：过滤啤酒样品中Pediococcus damnosus的检测
每100ml的细胞数 每个分析中的细胞数 RLU 平均值 标准偏差 ％CV
1×108 1×107 554737283044288  57530  14381  25％
6.6×106 6.6×105 4825436533623116  3917  811  21％
8.5×105 8.5×104 190139401512103920811554  2005  1014  50.6％
1.5×103 1.5×102 295356392131188243  268  99.6  37.2％
空白 空白 121114120  118  3.79  3.21％
                                  表8
温育时间 每100ml的cfu  RLU 平均值 标准偏差 ％CV
空白(48小时) ＜1  360219  290  99.7  34.4
8小时 160  318228299  282  47.4  16.8
16小时 160  276342294  304  34.1  11.2
20小时 160  238426694  453  229  50.6
24小时 160  110616871616  1470  317  21.6
40小时 160  141916184606  162361  30186  18.5
48小时 160  292361428411  360386  96202  26.7

Claims (12)

1、一种用于由样品混合物中回收微生物的方法，其包括以下步骤：
(i)使所述样品混合物由过滤装置的样品入口通过，该过滤装置包括多个已预先用洗涤剂处理过的中空纤维过滤膜，所述膜具有第一和第二端部、外表面和限定空腔的内表面，各所述膜的第一端部是开口的而且与所述样品入口连通，由第二端部出来的流体被限制住，使所述样品由所述膜中过滤，在所述膜的所述空腔中留下过滤物；
(ii)重新悬浮在所述膜中的过滤物；以及
(iii)检测所述过滤物中是否存在任何微生物。
2、如权利要求1所述的方法，其中，重新悬浮步骤(ii)包括使溶胞剂的溶液由所述膜的空腔中通过。
3、如权利要求1所述的方法，其中，由所述膜的第二端部出来的流体被限制住，使得所述样品混合物仅由所述膜过滤后才流出所述过滤装置。
4、如前述任一权利要求所述的方法，其中，所述微生物包括酵母。
5、如前述任一权利要求所述的方法，其中，所述微生物包括细菌。
6、如前述任一权利要求所述的方法，其中，所述膜的平均孔径为0.2μm。
7、如前述任一权利要求所述的方法，其中，所述膜包括聚丙烯。
8、如权利要求1-6之一所述的方法，其中，所述膜包括聚砜。
9、如前述任一权利要求所述的方法，其中，所述洗涤剂包括非离子洗涤剂。
10、如权利要求7所述的方法，其中，所述洗涤剂包括Tween20。
11、如前述任一权利要求所述的方法，其还包括在所述检测步骤(iii)之前培养所述过滤装置中所述过滤物中的任何微生物至少12小时的步骤。
12、如权利要求11所述的方法，其中，所述微生物在所述检测步骤(iii)之前培养至少24或者36小时。
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