ES2216926T3 - Deteccion de microorganismos. - Google Patents
Deteccion de microorganismos.Info
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Abstract
Un procedimiento para recuperar microorganismos de una mezcla de muestra, que comprende las etapas de: i) hacer pasar dicha mezcla de muestra a través de la entrada de muestra de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca que se han tratado previamente con un detergente, teniendo dichas membranas un primer y un segundo extremo, y una superficie externa y una superficie interna que definen una luz, estando el primer extremo de cada una de dichas membranas abierto y en comunicación con dicha entrada de muestra y estando el flujo desde el segundo restringido de tal modo que dicha mezcla de muestra se filtra a través de dichas membranas, dejando un retenido en dicha luz de dichas membranas; ii) resuspender dicho retenido en dichas membranas; y iii) detectar la presencia de cualquier microorganismo en dicho retenido.
Description
Detección de microorganismos.
La presente invención se refiere a procedimientos
mejorados para detectar microorganismos, en particular levaduras y
bacterias en mezclas (por ejemplo cerveza).
La producción de alimentos y bebidas tales como
cerveza va acompañada por el ensayo de la presencia de ciertos
microorganismos con el fin de garantizar la calidad del producto
final. El proceso de fermentación puede, por ejemplo, requerir el
ensayo en línea cada pocas horas de una muestra que tiene un volumen
de al menos 25 ml, y preferiblemente, de volúmenes de muestra de por
ejemplo 250 ml. El material en forma de partículas que puede incluir
microorganismos, a saber, levaduras y bacterias, se debe separar de
la muestra y ensayarse seguidamente para determinar la presencia o
ausencia de microorganismos específicos. Los dispositivos usados
para conseguir esto incluyen la unidad de filtro de vacío desechable
Bibby que está dotada de un filtro plano con un diámetro medio de
poro de 0,45 \mum y los soportes de filtro Nalgene con receptores,
que están dotados de un filtro plano con un diámetro medio de poro
de 0,45 \mum o 0,2 \mum (véase, por ejemplo, el Catálogo de
suministro para laboratorios de 1998 de Merck, página 482). Dichos
dispositivos permiten la filtración de volúmenes de muestra máximos
de solo 100 ml, tienen un área de la superficie plana de 50 cm^{2}
y pueden necesitar hasta 30 minutos para ensayar una muestra debido
a su complejidad de uso. Una vez que se ha filtrado el máximo
volumen, éstos se bloquean por el material en forma de partículas
tales como proteínas presentes en el fluido de muestra (por ejemplo,
cerveza tipo Lager) y cualquier filtración posterior requeriría
presiones tan elevadas que causarían la lisis celular, evitando la
detección de los microorganismos y dando lugar a resultados
falseados.
Como se demuestra por los resultados de los
experimentos detallados más adelante, los dispositivos de la técnica
anterior necesitan sustancialmente más tiempo para separar y
detectar microorganismos de una muestra que el necesario usando los
dispositivos y procedimientos de la presente invención. Además, la
posterior recuperación de, y por tanto ensayo de, microorganismos es
relativamente simple y fácil con la presente invención puesto que
los microorganismos están presentes en forma de una "torta"
fácilmente extraíble (un bloque de material en partículas de baja
densidad relativamente poco comprimido) sobre la superficie de las
membranas, con una incursión mínima en los intersticios de la
membrana. En comparación, otros dispositivos presentan material en
forma de partículas en forma de una "galleta" dura (un bloque
de material en forma de partículas de alta densidad relativamente
muy comprimido) sobre una superficie de la membrana, microorganismos
y otro material en forma de partículas que bloquea y está retenido
en los intersticios de la membrana. Esta galleta es difícil de
extraer y difícil de procesar para permitir su ensayo para
determinar la presencia de microorganismos. Además, evitando la
formación de una galleta densa, los dispositivos de la presente
invención pueden operar a una menor presión. Si se opera a presiones
mayores, puede producirse la lisis de bacterias, dando lugar a su
vez a resultados incorrectos. Una presión elevada puede causar
también distorsión de bacterias, permitiéndolas pasar a través de la
membrana y dando lugar a resultados incorrectos.
Conforme a la presente invención, se proporciona
un procedimiento para recuperar microorganismos de una mezcla de
muestra, que comprende las etapas de:
- i)
- hacer pasar dicha mezcla de muestra a través de la entrada de muestra de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca que se han tratado previamente con un detergente, teniendo dichas membranas un primer y un segundo extremo, y una superficie externa y una superficie interna que definen una luz, estando el primer extremo de cada una de dichas membranas abierto y en comunicación con dicha entrada de muestra y estando el flujo desde el segundo restringido de tal modo que dicha mezcla de muestra se filtra a través de dichas membranas, dejando un retenido en dicha luz de dichas membranas;
- ii)
- resuspender dicho retenido en dichas membranas; y
- iii)
- detectar la presencia de cualquier microorganismo en dicho retenido.
La etapa (ii) de resuspensión puede comprender
hacer pasar una solución de un agente de lisado a través de la luz
de dichas membranas. Esto se puede realizar por ejemplo, fijando una
jeringa a un extremo del dispositivo y haciendo pasar un tampón de
lisis a través de la luz de las membranas, o se pueden colocar las
membranas en una solución de lisis y, usando una jeringa fijada al
dispositivo, puede extraerse la solución de lisis a las luces de
las membranas.
Estando el flujo desde dicho segundo extremo de
dichas membranas restringido de tal modo que dicha mezcla de muestra
sale de dicho dispositivo de filtro exclusivamente por filtración a
través de dichas membranas.
Los dispositivos y procedimientos de la técnica
anterior incluyen los de los documentos GB 2135902, EP 302949, WO
94/00222, WO 84/00015, US 5863501, US 5814179, US 4501793, JP
4-135478 (WPI Abstract 1992-205001),
JP 63-104615 (WPI Abstract
1988-165566), JP 63-088007 (WPI
Abstract 1988-145060) y JP
61-133105 (WPI Abstract
1986-200908). Sin embargo, ninguno de estos describe
o sugiere los procedimientos de la presente invención que incluyen
cada una de las etapas necesarias para obtener los resultados que
éstos son capaces de proporcionar. En particular, la técnica
anterior no sugiere producir un retenido en forma de una
"torta" resuspendible en lugar de una "galleta" más
sólida, ni sugiere resuspender el retenido de una primera etapa de
filtración como parte de una posterior etapa de procesado. Por
ejemplo, el documento JP 63-104615 describe un
dispositivo para separar, por ejemplo, virus de fluidos, que
comprende una pluralidad de fibras de celulosa huecas porosas,
estando un extremo de estas inmerso en un material de relleno y
abierto a la atmósfera, y estando el otro extremo sellado. No
obstante, no se sugiere que las membranas se tratarán previamente
con un detergente, ni se sugiere que se usarán membranas de
polipropileno, ni se sugiere la forma en que microorganismos, en
particular bacterias y levaduras, pueden detectarse fácilmente en el
retenido o que el retenido se resuspenderá.
Otra técnica anterior relevante incluye el
documento JP 07227297.
La etapa de detección de microorganismos puede
comprender cualquier procedimiento de detección que detecte los
microorganismos deseados. Por ejemplo, un ensayo sencillo para un
microorganismo es el ensayo de ATP descrito más adelante, en el que
se lisa cualquier microorganismo y se detecta el ATP liberado usando
un ensayo de luciferasa. Como alternativa, se pueden usar
anticuerpos específicos para microorganismos, o se puede cultivar el
retenido en un medio de cultivo nutriente general y detectarse el
crecimiento de cualquier colonia de microorganismo.
Mediante el tratamiento previo de las membranas
con un detergente (por ejemplo, insuflando un detergente a través de
las mismas y opcionalmente dejando que éstas se sequen después) se
ha encontrado que el caudal de la mezcla a través de las membranas
se incrementa en gran medida. Esto se cumple particularmente cuando
se comparan membranas tratadas con detergente secadas con membranas
no tratadas secas. Este mayor caudal asegura que los microorganismos
son recogidos sin provocar su lisis o sin forzarlos a través de las
membranas.
Detergentes útiles incluyen detergentes no
iónicos, en particular Tween 20, más particularmente, una solución
de Tween 20 al 20%.
El uso de una pluralidad de membranas de filtro
de fibra hueca proporciona también un área de la superficie
relativamente grande (de forma típica de al menos tres veces) a
través de la cual puede tener lugar la filtración, cuando se compara
con el área de la superficie proporcionada por un dispositivo
sencillo de dimensiones generes similares (es decir, tamaño) que
tiene una membrana plana. Esto también permite el filtrado de un
volumen relativamente grande de muestra antes de que se produzca
bloqueo alguno de los poros. Esto es particularmente útil con
muestra turbias (por ejemplo, cerveza tipo Stout) que contienen
grandes cantidades de materia en forma de partículas que pueden
bloquear rápidamente las membranas de filtro plano.
La naturaleza exacta del material de la membrana
de filtro también se ha encontrado que es importante - se ha
descubierto que membranas de fibra hueca de polipropileno
disponibles de forma comercial que tienen un diámetro medio de poros
de 0,2 \mum pretratadas con detergente permiten caudales mucho
mayores que, por ejemplo, membranas de polisulfona que tienen un
diámetro medio de poros de 0,2 \mum, incluso cuando también se han
pretratado con detergente. Así, en una realización preferida de la
presente invención, la membrana de fibra hueca puede ser una
membrana de polipropileno. Naturalmente, también se pueden usar
otras membranas, en particular, las que tienen similares
características físicas, por ejemplo, un área similar de poros por
área unitaria de la superficie de membra-
na.
na.
Las membranas de fibra hueca usadas en la
presente invención pueden tener un diámetro medio de poros de 0,2
\mum.
También se proporciona conforme a la presente
invención un dispositivo de filtro para separar microorganismos de
una mezcla de muestra, que comprende una pluralidad de membranas de
filtro de fibra hueca que se han pretratado con un detergente,
teniendo cada membrana una superficie externa y una superficie
interna que definen una luz, estando uno de los extremos de cada
membrana abierto y en comunicación con una entrada de muestra del
dispositivo de filtro y estando el otro extremo cerrado.
La facilidad para ensayar microorganismos usando
los procedimientos y dispositivos se ve suplementada por la
velocidad de filtración como se puede apreciar a partir de los
resultados experimentales más adelante, la presente invención
posibilita la recuperación de material en forma de partículas de un
volumen dado de fluido de muestra en una fracción del tiempo
requerido por otros dispositivos y que es frecuentemente al menos
diez veces más rápido.
La presente invención también proporciona la
importante ventaja de proporcionar resultados consistentes para una
muestra dada, incluso cuando se está filtrando una mezcla muy turbia
- puede conseguirse fácilmente al menos una consistencia del 99%
entre diferentes grupos de resultados. Esto se puede comparar
favorablemente con los resultados obtenidos usando membranas planas
que pueden ser relativamente inconsistentes.
La invención será más evidente a partir de la
siguiente descripción, con referencia a las diversas figuras de los
dibujos adjuntos que muestran, únicamente a modo de ejemplo, una
forma del dispositivo de filtro.
En las Figuras:
La Figura 1 muestra un primer dispositivo
conforme a la presente invención y su uso en un procedimiento de
detección de microorganismos;
La Figura 2 muestra una curva patrón de ATP. El
eje Y es URL (unidades relativas de luz) y el eje X son los moles de
ATP. Las formas de rombos sólidos indican enzima 1:625, los
cuadrados sólidos indican enzima 1:9 y los triángulos sólidos
indican enzima 1:1;
La Figura 3 muestra curvas de concentración
retenida para P damnosus. El eje Y son las URL totales y el
eje X es el número de células. Los rombos sólidos son para
137099-1 y los cuadrados sólidos son para
037099-1;
La Figura 4 muestra curvas de concentración
retenida para S. carlsbergensis. El eje Y son las URL
totales y el eje X es el número de células. Los cuadrados sólidos
son para 266099-1, y los triángulos sólidos son para
097099-1;
La Figura 5 muestras curvas de concentración
retenida para A. pasteurianus. Los rombos sólidos son para
147099-1 y los círculos sólidos son para
027099-1;
La Figura 6 muestra un segundo dispositivo
conforme a la presente invención y su uso en un procedimiento de
detección de microorganismos;
La Figura 7 muestra una sección a través de un
tapón de extremo y una vista desde arriba de un anillo;
La Figura 8 muestra la detección de S.
carlsbergensis en muestras de cerveza filtrada usando el segundo
dispositivo. El eje Y son las URL y el eje X es el número de
células por ensayo;
La Figura 9 muestra la detección de A.
pasteurianus en muestras de cerveza filtrada usando el segundo
dispositivo. El eje Y son las URL y el eje X es el número de
células por ensayo;
La Figura 10 muestra la detección de P.
damnosus en muestras de cerveza filtrada usando el segundo
dispositivo. El eje Y son las URL y el eje X es el número de células
por ensayo;
La Figura 11 muestra
Como se puede apreciar de la Figura 1, un primer
dispositivo 10 de filtro comprende una entrada 20 de muestra dotada
de una conexión 21 de ajuste Luer que comunica con membranas 30 de
fibra hueca de polipropileno 68 que tienen un diámetro medio de poro
de 0,2 \mum. Los extremos abiertos de las membranas 30 están
inmersos en un adhesivo 40 curable por radiación UV que las mantiene
en posición y permite que se comuniquen con la entrada 20 de
muestra. Los otros extremos de las membranas 30 están inmersos en el
adhesivo 41 curable por radiación UV que cierra los mismos. Las
membranas 30 se han pretratado lavando con una solución formada por
Tween 20 al 20% a través de las mismas y luego dejándolas secar.
En uso, la jeringa 50 que contiene la mezcla 60
de muestra está conectada a una entrada 20 de muestra y la mezcla 60
de muestra se filtra a través de las membranas 30 proporcionando el
filtrado 70 y el retenido 71. Las membranas 30 se disponen
seguidamente en una solución 80 de resuspensión y se tira del émbolo
90 de la jeringa 50, provocando un flujo de solución 80 de
resuspensión hacia la luz de las membranas 30 para resuspender el
retenido 71 que ha quedado en las membranas 30 y extrayéndolo a la
jeringa 50.
Una vez se ha resuspendido el retenido 71 y
recogido en la jeringa 50 puede ensayarse. Como se detalla en la
Tabla 4, se han producido diversos dispositivos de filtro que tienen
diferentes longitudes de membrana 30. En una realización específica,
las membranas 30 tienen una longitud total de 55 mm, 40 mm de los
cuales están abiertos y pueden proporcionar una superficie a través
de la cual puede tener lugar la filtración. Las membranas 30
proporcionan un área de superficie total de 51,2 cm^{2} a través
de los cuales puede tener lugar filtración.
El segundo dispositivo 100 de filtro comprende
una entrada 20 de muestra dotada de una conexión 21 de ajuste Luer
que comunica con membranas 30 de fibra hueca de polipropileno 68 que
tienen un diámetro medio de poro de 0,2 \mum. En la entrada 20 de
muestra, los extremos de las membranas 30 están inmersos en adhesivo
curable por radiación UV que las mantiene en su posición y permite
que se comuniquen con la entrada 20 de muestra. En la salida 110,
los extremos de las membranas 30 están inmersos en un adhesivo
curable por radiación UV que las mantiene en su posición y permite
que se comuniquen con la salida 110, que está cerrada por el tapón
120. Las membranas 30 se han pretratado lavando con una solución
formada por Tween 20 al 5% a través de las mismas y luego dejándolas
secar.
En uso, en la Etapa I (Figura 6) se bombea un
volumen de cerveza tipo Lager 60 por una bomba peristáltica 130 a un
caudal de 100 ml/minuto a través del conducto flexible 140 al
dispositivo 100. Cuando el dispositivo 100 se llena con la cerveza
tipo Lager 60, el tapón 120 que bloquea la salida 110 hace que la
única salida del dispositivo 120 sean los poros de las membranas 30
y por tanto la cerveza tipo Lager 60 se filtra a través de las
membranas 30 y el filtrado se recoge en el recipiente 150 de
recogida de residuos y se desecha. En la Etapa II, se bombean 400 ml
de agua 160 estéril a través del conducto flexible 140 a 187
ml/minuto, se filtra a través de las membranas 30 (el tapón 120
permanece en su posición) y se recoge en el recipiente 150 de
residuos y se desecha. Cuando el agua 160 ha terminado de pasar a
través del dispositivo 100, la bomba 130 se deja funcionando durante
otros 10 segundos con el fin de bombear aire a través del conducto
flexible 140 y las membranas 30 para eliminar el exceso de fluido
de las membranas 30. La bomba 140 se desconecta seguidamente y se
separa el dispositivo 100 del conducto flexible 140 y la bomba 130.
En la Etapa III, el tapón (es decir, el tapón de extremo) 120 se
retira y, sobre un fragmento limpio de tela (no mostrado), el
dispositivo 100 se drena para eliminar el fluido 160 en exceso. Se
conecta entonces una jeringa 50 estéril de 1 ml que contiene 0,5 ml
de tampón de lisis (NaOH 0,2 M) a la entrada 20 de muestra y un
conducto flexible 165 de comunicación fijado a la salida 110. Se
lleva a cabo una etapa de humectación/lisis que comprende empuja
cuidadosamente el émbolo 55 de la jeringa 50 hasta que es visible
líquido (tampón de lisis 160) en el conducto flexible 165 de
comunicación y, seguidamente, se vuelve a tirar del émbolo 55 con el
fin de extraer tampón de lisis 160 de vuelta a la jeringa 50,
rehumectando de este modo las membranas 30 con tampón de lisis 160.
La etapa de humectación/lisis se lleva a cabo dos veces más. Todo el
líquido 160 se retira entonces del dispositivo 100 manteniendo el
dispositivo 100 en un tubo 170 estéril de 1,5 ml y empujando el
émbolo 55 tres veces. En la Etapa IV, se retira la comunicación 165
del dispositivo 100 y se coloca el tapón de extremo 120 en el
dispositivo 100. Se vuelve a tirar del émbolo 55 para recoger todo
el eluato (incluyendo el que está en las membranas). El eluato se
transfiere seguidamente al tubo 170. Se añaden entonces al tubo 170
9 gotas de tampón de neutralización (tris fosfato 0,2 M). Se coloca
entonces una tapa en el tubo 170 y su contenido se mezcla
invirtiendo el tubo 170 de dos a tres veces. Finalmente, en la Etapa
V se lleva a cabo un ensayo de ATP en la muestra usando un
luminómetro Biotrace Unilite y reaccionantes de Bioluminiscencia
Sigma.
Todos los ensayos de ATP se llevaron a cabo
siguiendo el procedimiento de desnaturalización/neutralización
alcalina.
En una centrífuga estéril Eppendorf se colocan 50
\mul de hidróxido sódico 2M, se añaden 200 \mul de muestra y se
mezclan pipeteando 2 a 3 veces. Se añaden 50 \mul de tampón Tris
fosfato 2M y se mezcla por inversión (mezcla de muestra).
Se colocan 100 \mul de mezcla de ensayo de ATP
(Sigma-Aldrich Ltd.) en la dilución apropiada en una
cubeta (cubeta Uni-Lite). Se deja reposar durante 3
minutos y luego se lee la señal salida luminosa de fondo en un
luminómetro (Uni-Lite) durante 35 segundos. Después
de haber determinado la señal luminosa de fondo se añaden 100
\mul de la mezcla de muestra a la cubeta y se lee durante 35
segundos. La diferencia entre las lecturas de fondo y de muestra se
debe a la presencia de ATP en la muestra.
Se hicieron pasar a través de cada dispositivo
mediante conexión de una jeringa de 25 ml al ajuste Luer del
dispositivo de filtro 25 ml de cerveza tipo Lager que contiene
aproximadamente 1 x 10^{7} células de S. carlsbergensis. El
dispositivo de filtro se lavó a continuación con 10 ml de agua para
eliminar cualquier exceso de cerveza (la cerveza tipo Lager tiene
un ligero efecto inhibidor sobre el ensayo de ATP). La región de
membrana del dispositivo de filtro se colocó entonces en agua
estéril, se realizó un lavado de agua a través del dispositivo y
todas las células retenidas se separaron y estaban presentes en el
concentrado recogido. Se llevaron a cabo ensayos de ATP como el
descrito antes para determinar la presencia de ATP microbiano en el
filtrado y el concentrado.
Se añadió 1 ml de un cultivo de una noche de 10
ml de S. carlsbergensis, A. pasteurianus o P. damnosus
a 24 ml de cerveza tipo Lager y la muestra inoculada se hizo pasar a
través de un dispositivo de filtro como el descrito antes. Se
determinó la recuperación porcentual de microorganismos en el
concentrado comparando los niveles de ATP microbiano en las muestras
antes y después de la filtración. Se ensayaron un total de cinco
dispositivos en una única cepa microbiana y el coeficiente de
varianza se determinó entre los niveles recuperados.
El procedimiento más común y rápido para
determinar la contaminación microbiana es la medida del ATP celular.
Esto requiere la ruptura de la membrana/pared celular (lisis
celular) con el fin de liberar el ATP presente en la célula. El ATP
liberado se puede determinar usando una reacción enzimática que
convierte un sustrato (luciferina) y ATP en una serie de productos
que emiten luz. La cantidad de luz puede medirse usando un
luminómetro convencional.
Están disponibles de forma comercial una serie de
ensayos de ATP basados en el principio anterior. El kit de ensayo
por bioluminiscencia de ATP (Sigma-Aldrich, Poole)
no contiene ningún tampón que favorezca la lisis celular. se
apreciará que las condiciones para la lisis de la membrana celular
difieren en función del tipo de célula. El presente estudio se
centra en los tipos de células que se han encontrado en cervezas
durante las etapas de producción. Estas son dos cepas bacterianas,
Acetobacter pasteurianus y Pedicoccus damnosus y una
cepa de levadura Saccharomyces carlsbergensis. La cepa de
levadura puede diferir puesto que esta es la cepa de partida para
que se produzca la fermentación. La mayoría de las fábricas de
cervezas usan una cepa de partida que procede de la familia de
Saccharomyces y por ello se puede usar en los ensayos esta
cepa.
Desnaturalización térmica: La muestra se
llevó a ebullición durante 10 minutos, se dejó enfriar y se ajustó
su pH antes de llevar a cabo el ensayo de ATP. Algunas células son
resistentes al calor.
Desnaturalización alcalina: Una base
fuerte tal como hidróxido sódico puede lisar las células. Sin
embargo, enzimas tales como la luciferasa usadas en el ensayo de ATP
funcionan a pH casi neutro. Por tanto, se deberá llevar a cabo antes
del ensayo de ATP un ajuste de pH de la muestra. La concentración de
base puede determinar el grado de lisis celular.
Reaccionante de lisis del cultivo celular:
Un procedimiento publicado para la lisis celular.
Desnaturalización alcalina/neutralización
ácida: La lisis celular se consigue usando hidróxido sódico
(optimizado a 2M) seguido por la neutralización inmediata del
hidróxido sódico usando un tampón ácido, dejando que la muestra se
use directamente en el ensayo de ATP sin pérdida funcional para la
enzima.
Los resultados de los diferentes procedimientos
de lisis se dan en la Tabla 1 y muestran que el procedimiento de
desnaturalización alcalina/neutralización ácida desarrollado puede
producir la lisis celular de todos los organismos sin que las
células deban retirarse del medio de crecimiento antes del
ensayo.
Para determinar la sensibilidad del ensayo de ATP
se determinó una curva de concentración para un patrón ATP que
variaba de 10^{-7} a 10^{-16} moles de ATP. Los resultados se
muestran en la Figura 2.
Las URL dadas cuando se ensayan las muestras
usando los dispositivos de la presente invención se pueden comparar
con la curva patrón de ATP y se puede determinar el número de
células presentes en una muestra dada. Una única célula de levadura
contiene aproximadamente 10^{-4} moles de ATP mientras que una
célula bacteriana tiene 100 veces menos ATP presente.
Se usaron membranas de diferente composición
química y separación de tamaño molecular en la fabricación de
dispositivos de la presente invención y se ensayaron en condiciones
similares para determinar su capacidad para retener los
microorganismos implicados en el estudio. Se ensayaron una serie de
formatos de dispositivo usando membranas de polipropileno que tenían
diversos diámetros de poro/separaciones de peso molecular. Los
autores de la invención han identificado un formato y tipo de
membrana que puede retener y funciona a baja presión, evitando de
este modo daños a las células durante la aplicación de la muestra.
Los dispositivos tipo Y usados en los experimentos (véase la Tabla
2) son similares a los de la presente invención, que tienen una
entrada 20 de muestra, un ajuste Luer 21, membranas 30 y adhesivo 40
curable por radiación UV. Sin embargo, éstos se diferencian de los
dispositivos de la presente invención porque cada membrana 30 está
en una formación en bucle con cada extremo abierto, estando inmersas
en adhesivo 40 curable por radiación UV y pudiéndose comunicar con
la entrada 20 de muestra.
La configuración de la membrana en el dispositivo
demostró que tenía una función importante en la capacidad de retener
todos los organismos usados en el estudio. A menor peso molecular de
la membrana, mayor presión se necesitaba para permitir el paso de la
muestra a través del dispositivo. La mayor presión parecía alterar
la estructura celular de modo que las células pasaban a través de
la membrana (se filtraban) y no quedaban retenidas. Los resultados
se dan en la Tabla 2.
Se llevaron a cabo estudios para garantizar que
la retención o atrapamiento de microorganismos por el dispositivo de
filtro era consistente. Para cada ensayo se ensayaron cinco
dispositivos para determinar su capacidad para retener cada uno de
los microorganismos y el número total de células retenidas se
determinó por el ensayo de ATP. Los resultados se dan en la Tabla
3.
Se analizan diluciones a una décima parte de un
cultivo de una noche de cada organismo permitiendo determinar el
número de células que pueden ser retenidas por el dispositivo. Cada
organismo se sembró en el medio de crecimiento apropiado para
determinar el número exacto de células de cada dilución. Los
resultados se muestran en las Figuras 3 a 5.
Se ensayaron todos los puntos de datos usando
dispositivos por triplicado y ensayos de ATP por duplicado llevados
a cabo sobre cada muestra. Los datos se han corregido para eliminar
los efectos del ATP libre. Se pueden detectar incrementos en la
lectura de URL en muestras de menor concentración. Esto se debe a la
dilución de enzima que está alterada para proporcionar un aumento en
la sensibilidad.
Se llevaron a cabo ensayos para determinar si 2,5
litros de cerveza tipo Lager se pueden filtrar a través del
dispositivo que tiene 68 membranas con un área de la superficie
total de 51,2 cm^{2}. En dispositivos por triplicado, este
volumen mostró que pasaba a través del filtro sin bloqueo alguno de
la membrana.
Se llevó a cabo una reducción del área de la
superficie del dispositivo para determinar el volumen de cerveza
tipo Lager no contaminada que se podía filtrar. El número de
membranas por dispositivo se mantuvo constante y se modificó la
longitud total. Se ensayaron tres dispositivos de cada tamaño y los
resultados se presentan en la Tabla 4. La aplicación de muestra de
cerveza tipo Lager se terminó cuando la presión se hizo demasiado
elevada para pasar a través del dispositivo.
Se llevaron a cabo los siguientes experimentos
adicionales:
Se usaron los dispositivos de filtración
ilustrados por el segundo dispositivo de filtración (Figura 6).
1. Membranas de fibra hueca de polipropileno con
un diámetro medio de poros de 0,2 \mum (pretratadas con Tween 20
al 5%).
2. Controlador semiautomático Loctite (RTM) 21
que incorpora un aplicador manual e interruptor de pedal con presión
fijada a 2000 Pa y salida digital hasta 35,0.
3. Fuente de radiación UV Bondmatic 850, con
programador fijado hasta 40 segundos.
4. Anillos (Figura 7, 200) (barra de
policarbonato) con un diámetro interno de 7,0 mm y un diámetro
externo de 12,4 mm.
5. Tapones de extremo en Y (Figura 7, 210)
realizados en polímero de polipropileno de 2 mm con un extremo ancho
(diámetro externo 12,4 mm) para recibir los anillos y un extremo
externo (diámetro interno 4,1 mm) para la conexión con boquilla de
jeringa Luer.
Los dispositivos de filtración se prepararon como
sigue:
1. Se limpian todas las superficies de trabajo
con IPA (alcohol isopropílico).
2. Se toma un haz formado por un número apropiado
de longitudes de membranas de fibra hueca de polipropileno, se
coloca una pluralidad de anillos alrededor del haz.
3. A una posición aproximadamente 30 mm desde el
extremo del haz de membranas de fibra hueca, se coloca la boquilla
del aplicador de adhesivo en el centro del haz de membranas y se
aplica adhesivo de forma que penetra a través del haz de membranas y
se manipula la boquilla de forma que el adhesivo se aplica a todas
las membranas en el área. Se aplica además adhesivo a la cara
externa del haz en la posición. Se desliza a continuación un anillo
y se hace girar sobre las membranas en la posición tal que entra en
contacto con el adhesivo.
4. Se coloca la sección cubierta de adhesivo del
haz bajo la fuente de radiación UV para curar el adhesivo.
5. Se aplica adhesivo como se describe en la
Etapa 3 (anterior) en una posición aproximadamente 30 mm a lo largo
del haz desde el anillo anterior. Se deslizan y hacen girar sobre el
adhesivo el primer y luego segundo anillo tal que están en contacto
entre sí y luego se separan entre ellos 1-2 mm y se
repite la etapa 4.
6. Se repite la etapa 5 hasta que toda la
longitud de la membrana tiene anillos colocados.
7. Se cortan las fibras en el hueco de
1-2 mm entre las parejas de anillos para producir
una pluralidad de dispositivos de fibra hueca, teniendo las fibras
luces abiertas en cualquier extremo y estando selladas en su cara
externa en el otro extremo con un anillo.
8. Se incuban los dispositivos a 55ºC durante la
noche para eliminar cualquier monómero que quede de adhesivo.
9. Se toma uno de los dispositivos y una pareja
de tapones de extremo, se aplica priómero Loctite 770 al borde
interno de los tapones de extremo y alrededor de la cara externa de
los anillos del dispositivo. Se deja aproximadamente 1 minuto y
luego se aplica adhesivo 403 de endurecimiento rápido Loctite
alrededor de la cara externa de cada anillo y se presionan los
tapones de extremo firmemente sobre los anillos hasta que están
unidos.
En primer lugar los resultados de los ensayos
anteriores se validaron usando el segundo dispositivo de la
invención (Figura 6) siguiendo las Instrucciones del Ensayo (a
continuación), y el límite de detección para Saccharomyces
carlsbergensis fue de 30-100 células por ensayo,
para Acetobacter pasteurianus fue de
10000-20000 células por ensayo y para Pediococcus
damnosus fue mayor que > 1000 células por ensayo. La
capacidad del sistema para filtrar grandes volúmenes de líquidos
demuestra su particular potencial para ensayar el estado de higiene
de aguas de aclarado de CIP (limpieza in situ) finales.
En segundo lugar, el ensayo se modificó
ligeramente para aumentar su sensibilidad a la contaminación
microbiana de cervezas. Esto se consiguió mediante el cultivo en el
filtro de un bajo número de microorganismos retenidos de muestras de
cerveza filtradas. Después de un período de incubación de 24 horas
fue posible detectar 1 célula por ml de cerveza filtrada. Este
resultado es al menos tan bueno como, y el sistema es más
conveniente de usar que, otros sistemas de detección basados en ATP
disponibles en la actualidad. Además, el sistema de la invención
tiene la ventaja de que puede filtrar mayores volúmenes de cerveza
(y la capacidad de filtrar cerveza tipo Stout) comparados con la
filtración de membrana en lecho plana convencional, lo cual da lugar
a un límite mayor de detección. Se puede conseguir una sensibilidad
similar sin la necesidad de cultivo en el filtro (o con períodos de
cultivo más cortos) mediante el uso de ensayos de detección de
adenilato quinasa conocidos en la técnica.
Los ensayos muestran en particular que los usos
de la presente invención incluyen ensayos de limpieza in situ
(CIP) para procesos de fabricación en las industrias de elaboración
de cerveza, farmacéuticas, de bebidas refrescantes y lácteas.
Además, la presente invención también es particularmente adecuada
para ensayos de contaminación de cerveza (incluyendo cervezas
Bitter, tipo Lager y tipo Stout) y sidra.
Aquí, se examinó el efecto de incubar en medio de
cultivo los dispositivos de filtro que contienen un bajo número de
células antes de llevar a cabo el ensayo de ATP. A los efectos de
este estudio se usó un organismo diferente, Lactobacillus
brevis (BSO 464). Se eligió este organismo puesto que se ha
usado ampliamente con anterioridad para numerosos estudios de
detección de ATP, por lo que los resultados se pueden comparar
fácilmente con los obtenidos a partir de otros sistemas.
Se reprodujo BSO 464 hasta fase estacionaria en
medio MRS. Después de realizar un recuento celular al microscopio,
se llevaron a cabo diluciones apropiadas en agua desionizada estéril
para dar aproximadamente 100 células por ml. Se usó 1 ml de este
cultivo para inocular 99 ml de cerveza tipo Lager, esto se llevó a
cabo por triplicado para cada muestra de cerveza tipo Lager. También
se prepararon controles de cerveza tipo Lager sin inocular. Se
realizaron los recuentos en placa para verificar los niveles de
inoculación. Cada cerveza tipo Lager se filtró como se describe más
adelante y se siguieron las instrucciones del ensayo hasta la etapa
7.
Después de esta etapa se retiró el dispositivo
del conducto flexible y se usó una jeringa estéril para llenar el
interior de las microfibras con medio MRS. La jeringa se retiró y se
colocó en este extremo un segundo tapón de extremo estéril del
dispositivo para retener los organismos retenidos en el dispositivo.
Todo el dispositivo se sumergió en 20 ml de medio MRS durante
diversos tiempos de incubación. Después de la incubación, se extrajo
cuidadosamente el dispositivo del medio y se retiró uno de los
tapones de extremo. Usando una jeringa, se hicieron pasar 10 ml de
agua desionizada estéril a través del dispositivo y se recogieron en
un recipiente de agua. Se inyectó a continuación aire en el
dispositivo usando la jeringa para eliminar el líquido en exceso de
la membrana. Las Instrucciones del ensayo (a continuación) se
siguieron como protocolo desde la etapa 9.
- 1.
- Se retira el dispositivo y el conducto flexible de la bolsa sellada.
- 2.
- Se fija el conducto flexible a un sistema de bomba apropiado que pueda funcionar a 187 ml/minuto o 220 rpm (conducto flexible de 3,2 mm de diámetro interno y 6,4 mm de diámetro externo).
- 3.
- Se coloca un recipiente de recogida de residuos bajo el dispositivo.
- 4.
- Se ajusta la bomba a 100 ml/minuto o 117 rpm.
- 5.
- Se hacen pasar 100 ml de cerveza tipo Lager (puede pasar a su través un máximo de 1 litro) y se deja filtrar para que vaya al recipiente.
- 6.
- Se ajusta la bomba a 187 ml/minuto o 220 rpm y se elimina por lavado el exceso de cerveza tipo Lager del dispositivo filtrando 400 ml de agua estéril (destilada).
- 7.
- Cuando el lavado con agua se completa, se deja pasar aire a través del conducto flexible durante 10 segundos para eliminar el exceso de fluido de la membrana.
- 8.
- Se desconecta la bomba y se retira el dispositivo y conducto flexible de la bomba.
- 9.
- Se retira el tapón de extremo del dispositivo. En un trozo limpio de tejido, se drena el dispositivo para eliminar cualquier fluido en exceso.
- 10.
- Se une a un extremo del dispositivo un fragmento de conducto flexible de comunicación y en el otro extremo se coloca una jeringa estéril de 1 ml que contiene 0,5 ml de tampón de lisis (NaOH 0,2 M).
- 11.
- Cuidadosamente se empuja el émbolo de la jeringa hasta que es visible líquido en el conducto flexible de comunicación. Se vuelve a tirar del émbolo con el fin de extraer el tampón de lisis de nuevo a la jeringa, rehumectando de este modo las membranas con el tampón de lisis.
- 12.
- Se repite la etapa 11 dos veces.
- 13.
- Se retira todo el líquido del dispositivo manteniendo el dispositivo sobre un tubo estéril de 1,5 ml y empujando el émbolo de la jeringa tres veces.
- 14.
- Se retira la comunicación y se coloca el tapón de extremo en el dispositivo. Se tira de nuevo del émbolo de la jeringa para recoger todo el eluato (incluyendo el de las membranas) y se coloca este en el tubo de 1,5 ml.
- 15.
- Inmediatamente se añaden 9 gotas de tampón de neutralización (Tris fosfato 0,2 M) al tubo que contiene el eluato. Se reemplaza la tapa del tubo y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo 2 a 3 veces.
- 16.
- Se lleva a cabo un ensayo de ATP sobre la muestra usando un luminómetro Biotrace UniLite y reaccionantes de bioluminiscencia de Sigma (ensayo de ATP), siendo el ensayo de ATP como sigue.
- 1.
- En una cubeta UniLite limpia se colocan 50 \mul de mezcla de ensayo de ATP.
- 2.
- Se incuba a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- 3.
- Se coloca sobre la cubeta UniLite Hold Tight y se coloca en el luminómetro, se cierra la tapa y se pulsa el botón de medida. Después de un período de 10 segundos el aparato medirá la lectura de luz durante 35 segundos.
- 4.
- En pantalla aparecerá una relación de URL para la mezcla de ensayo y se proporciona una copia impresa. Esta es la lectura de fondo del ensayo y no será mayor que 30 URL. Una lectura mayor indica contaminación.
- 5.
- Se retira la cubeta de la cámara de muestra y se añaden 100 \mul de la muestra de eluato a la cubeta. Se mezcla suavemente agitando y se devuelve la cubeta a la cámara de muestra.
- 6.
- Se cierra la cámara de muestra y se pulsa el botón de medida. La lectura de luz se presenta en la pantalla y se imprime.
La Tabla 5 y la Figura 8 muestran que se pueden
detectar fácilmente usando el sistema aproximadamente 30 células de
levadura por ensayo (o 300 células por muestra de cerveza
filtrada). Es decir, que 30 células de levadura por ensayo dan una
lectura de URL fácilmente distinguible de la obtenida de muestras de
cerveza no inoculadas.
La Tabla 6 y la Figura 9 muestran que 3000
células de A. pasteurianus por ensayo dan una lectura media
de luz mucho mayor que el nivel de fondo. El límite de detección
(fiable) del ensayo parece estar en 10000-20000
células de A. pasteurianus por ensayo.
La Tabla 7 y la Figura 10 muestran que 150
células de P. damnosus por ensayo dan una lectura media de
luz mayor que el nivel de fondo. El límite de detección fiable del
ensayo parece ser > 1000 células de P. damnosus por
ensayo.
La Tabla 8 y la Figura 11 muestran el efecto del
cultivo de enriquecimiento en el filtro sobre el límite de detección
para números bajos de Lactobacillus brevis en cerveza
filtrada usando el segundo dispositivo de la presente invención. Los
resultados muestran que el enriquecimiento en el filtro 24 horas
después de la filtración permite la detección de 160 células de
L. brevis usando el ensayo y dispositivo de la presente
invención. Con el fin de detectar números bajos de organismos bajo
un estresor puede ser deseable que la etapa de enriquecimiento dure
30 a 40 horas.
Llevando a cabo el cultivo de enriquecimiento en
el filtro fue posible detectar aproximadamente 1 célula de L.
brevis por ml de cerveza filtrada (que es igual a menos de 1
célula bacteriana por ensayo en la muestra original) después de una
incubación de 24 horas. Sin embargo, sería recomendable en una
situación "real" que el enriquecimiento durara 30 a 40 horas
antes de llevar a cabo el ensayo con el fin de detectar bajos
números de organismos bajo un estresor. Este resultado es al menos
tan bueno y el sistema más fácil de usar que otros sistemas de
detección basados en ATP disponibles en la actualidad. Además, el
sistema de la presente invención tiene la ventaja de que puede
filtrar mayores volúmenes de cerveza (y la capacidad de filtrar
cerveza tipo Stout) comparados con la filtración en membranas en
lecho plano, lo cual da como resultado un mayor límite de
detección.
Por otro lado, el diseño del dispositivo
significa que la muestra y etapas de extracción están contenidas en
el dispositivo de filtro, haciendo que la detección basada en ATP
sea más fácil de realizar.
Claims (12)
1. Un procedimiento para recuperar
microorganismos de una mezcla de muestra, que comprende las etapas
de:
- i)
- hacer pasar dicha mezcla de muestra a través de la entrada de muestra de un dispositivo de filtro que comprende una pluralidad de membranas de filtro de fibra hueca que se han tratado previamente con un detergente, teniendo dichas membranas un primer y un segundo extremo, y una superficie externa y una superficie interna que definen una luz, estando el primer extremo de cada una de dichas membranas abierto y en comunicación con dicha entrada de muestra y estando el flujo desde el segundo restringido de tal modo que dicha mezcla de muestra se filtra a través de dichas membranas, dejando un retenido en dicha luz de dichas membranas;
- ii)
- resuspender dicho retenido en dichas membranas; y
- iii)
- detectar la presencia de cualquier microorganismo en dicho retenido.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de resuspensión (ii) comprende hacer pasar una
solución de un agente de lisis a través de la luz de dichas
membranas.
3. Un dispositivo de filtro según la
reivindicación 1, en el que el flujo a través de dicho filtro desde
dicho segundo extremo de dichas membranas está restringido de tal
modo que dicha mezcla de muestra sale de dicho dispositivo de filtro
exclusivamente por filtración a través de dichas membranas.
4. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos microorganismos
comprenden levadura.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos microorganismos
comprenden bacterias.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichas membranas tienen un
diámetro medio de poro de 0,2 \mum.
7. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha membrana comprende
polipropileno.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha membrana comprende
polisulfona.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho detergente comprende un
detergente no iónico.
10. Un procedimiento según la reivindicación 7,
en el que dicho detergente comprende Tween 20.
11. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además antes de dicha
etapa de detección (iii) la etapa de cultivar todos los
microorganismo en dicho retenido en dicho dispositivo de filtro
durante un período de al menos 12 horas.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dichos microorganismos se cultivan durante al menos 24 a
36 horas antes de dicha etapa de detección (iii).
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