KR20020038714A - 미생물의 검출 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혼합물(예를들어, 맥주)내 미생물(예를들어, 이스트)을 검출하는 개선된 방법에 관한다.
Description
본 발명은 혼합물(예를들어, 맥주)내 미생물, 특히 이스트 및 박테리아를 검출하는 개선된 방법에 관한다.
최종 생성물의 품질을 확보하기 위하여 혹종의 미생물의 존재를 테스트함으로써 맥주와 같은 음료 및 식품을 제조한다. 양조공정은 예를들어 25ml이상, 바람직하게는 예를들어 250ml 부피의 시료를 몇시간마다 공정 테스트할 것을 요할 수 있을 것이다. 미생물, 즉 이스트 및 박테리아를 포함할 수 있는 특정 제품은 이후 샘플에서 분리 및 테스트하여 특정 미생물의 존부를 측정하여야 한다. 이를 수행하기 위하여 사용되는 장치는 평균 공극 직경 0.45-0.2㎛의 편평 필터가 있고 리시버가 있는 Nalgene 필터 홀더 및 평균 공극 직경 0.45㎛의 편평 필터가 있는 Bibby 일회용 진공 필처 유니트를 포함한다(예를들어 Merck Laboratory Supplies Catalogue, 482페이지 참조). 이러한 장치는 최대 샘플 여과 부피가 100ml만이 허용되고 편평 표면적인 50㎠이며 사용하는 것이 복잡하여 샘플을 테스트하는데 30분까지 걸릴 수 있다. 일단 최대 부피를 거른 다음에는, 샘플 유체(예를들어, 라거)내 존재하는 단백질과 같은 특정 물질로 블록킹되므로 이후의 혹종의 여과단계가 세포 용균을 야기할 정도로 높은 압력을 요하여 미생물의 검출을 방해하고 나쁜 결과를 줄 것이다.
하기 상술하는 실험 결과에서 알 수 있듯이, 선행 장치는 본 발명 장치 및 방법 사용시 요구되는 것보다 실질적으로 더 많은 시간을 샘플에서 미생물을 분리 및 검출하는 데 필요로 한다. 또한, 차후 미생물의 회수 및 테스트가 본 발명으로는 비교적 간단하고 용이한데 그 까닭은 미생물이 용이하게 움직일 수 있는 "케이크"(비교적 압착되지 않은 특정 물질의 저밀도 블럭)로서 멤브레인 표면에 존재하여 멤브레인 틈새기로의 침입이 최소화되기 때문이다. 비교하면, 다른 장치들은 특정 물질이 단단한 "비스킷"(비교적 고도로 압착된 특정 물질의 고밀도 블럭)으로 존재하여 미생물 및 다른 특정 물질이 블록킹되어 멤브레인 틈새기에 갇히게 된다. 이러한 비스킷은 제거가 곤란하여 미생물 존재 테스트를 할 수 있도록 가공하는 것이 용이하지 않다. 또한, 고밀도 비스킷의 형성을 막음으로써 본 발명 장치는 저압에서 가동시킬 수 있다. 고압에서 가동될 경우, 박테리아의 용균이 일어날 수 있어 부정확한 결과가 나올 수 있다. 고압은 또한 박테리아의 변형을 야기하여 이들이 멤브레인을 통과하여 부정확한 결과를 내도록 할 수 있다.
본 발명은
i) 샘플 혼합물을 필터 장치의 샘플 유입구에 통과시키는 단계로서, 상기 필터 장치는 세제로 미리 처리된 여러개의 공동섬유 필터 멤브레인을 포함하고 있고, 상기 멤브레인에는 제1말단과 제2 말단이 있으며 외면 및 내면으로 한정된 루멘이 있고 상기 멤브레인의 제1 말단은 오픈되어 상기 샘플 유입구에 통하고 제2 말단으로부터의 흐름이 제한되어 상기 샘플 혼합물이 상기 멤브레인을 통하여 여과되어 상기 멤브레인의 루멘내 여과잔류물이 남게 됨
ii) 상기 멤브레인내 상기 여과잔류물을 재현탁시키는 단계; 및
iii) 상기 여과잔류물내 혹종의 미생물의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는, 샘플 혼합물로부터 미생물을 회수하는 방법을 제공한다.
재현탁 단계(ii)는 상기 멤브레인의 루멘을 통하여 용균제 용액을 통과시키는 것을 포함할 수 있을 것이다. 이것은 예를들어 장치의 한쪽 끝에 주사기를 부착시키고 멤브레인의 루멘을 통하여 용균 완충액을 통과시켜 행할 수 있을 것이고 또는 용균 용액내에 멤브레인을 위치시키고 장치에 부착되어 있는 주사기를 사용하여 용균 용액을 멤브레인의 루멘을 통하여 배출시킬 수 있을 것이다.
상기 멤브레인을 통하여 배타적으로 여과시킴으로써 상기 샘플 혼합물이 상기 필터 장치를 나올 수 있도록 상기 멤브레인의 제2 말단으로부터의 흐름은 제한된다.
선행 여과 장치 및 방법은 독일 제2135902호, 유럽 제302949호, 제WO94/00222호, 제WO84/00015호, 미국 제5863501호, 미국 제5814179호, 미국 제4501793호, 일본 제4-135478호(WPI 요약 1992-205001), 일본 제63-104615호(WPI 요약 1988-165566), 일본 제63-088007호(WPI 요약 1988-145060) 및 일본 제61-133105호(WPI 요약 1986-200908)의 것들을 포함한다. 그러나, 이들 중 어느 것도 제공할 수 있는 결과를 얻기 위하여 필요한 각 단계를 포함하는 본 발명 방법을 기술하거나 제안하고 있지 않다. 특히, 선행 기술은 여과잔류물을 더욱 단단한 "비스킷"보다는 재현탁가능한 "케이크"의 형태로 만드는 것을 제안하지 않고 있고 차후 공정 단계의 일부로서 제1 여과 단계의 여과잔류물을 재현탁시키는 것도 제안하고 있지 않다. 예를들어 일본 제63-104615호는 여러개의 다공성 공동 셀룰로즈 섬유를 포함하고 이들 중 한 말단은 충전재 물질에 포함되어 대기로 오픈되고 다른 말단은 봉입되는, 예를들어 유체에서 바이러스를 분리하는 장치에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 멤브레인을 세제로 미리 처리하여야 한다는 것도, 폴리프로필렌 멤브레인을 사용하여야 한다는 것도, 여과잔류물내에서 미생물, 특히 박테리아 및 이스트를 어떻게 용이하게 검출할 수 있을 것인지 또는 여과잔류물을 재현탁하여야 한다는 것에 대하여도 언급이 없다.
미생물 검출 단계는 의도하는 미생물을 검출하는 혹종의 검출 방법을 포함할 수 있을 것이다. 예를들어, 간단한 일반 미생물 테스트는 혹종의 미생물을 용균시켜 루시페라제 분석으로 방출된 혹종의 ATP를 검출하는 아래에 상술하는 ATP 테스트이다. 이와는 다르게, 미생물 특이 항체를 사용하거나 일반 배양액 상에 여과잔류물을 위치시켜 혹종의 미생물 군집의 생장을 검출할 수 있을 것이다.
세제로 멤브레인을 미리 처리하여(예를들어 이들에 세제를 플러싱시키고 임의로 이후 건조시킴) 멤브레인을 통과하는 혼합물의 유속이 상당히 증가됨을 발견하였다. 이것은 건조 처리시킨 멤브레인과 건조시킨 세제-처리된 멤브레인을 비교할 경우 특히 그러하다. 이렇게 증가된 유속은 미생물의 용균을 야기하거나 이들을 멤브레인 밖으로 강제 배출시키지 않고도 미생물을 확실히 수거할 수 있게 한다.
유용한 세제는 비이온성 세제, 특히 Tween 20, 더 특별하게는 20% Tween 20의 용액을 포함한다.
여러개의 공동섬유 필터 멤브레인을 사용하면 또한 편평 멤브레인을 가지는 전체적으로 유사한 치수(즉 크기)의 단일 장치에 의하여 제공되는 것에 비하여 여과가 일어날 수 있는 표면적이 비교적 커진다(일반적으로 3배 이상). 이로써 여하한 공극 차단이 일어나기 전에 비교적 많은 부피의 샘플을 여과하게 된다. 이것은 편평 필터 멤브레인을 빠르게 블록킹시킬 수 있는 다량의 특정 물질을 함유하는 농밀한 샘플(예를들어 흑맥주)에서 특히 유용하다.
필터 멤브레인의 정확한 성질 또한 중요한 것으로 밝혀졌는데, 세제로 미리 처리한 평균 공극 직경 0.2㎛의 시판되는 폴리프로필렌 공동섬유 멤브레인이 예를들어 평균 공극 직경 0.2㎛의 폴리설폰 멤브레인 보다 유속이 훨씬 큰 것으로 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 본 발명 구체예에서, 공동섬유 멤브레인은 폴리프로필렌 멤브레인일 수 있을 것이다. 당연히, 유사한 물리적 특성, 예를들어 멤브레인 표면 단위면적당 유사한 공극 면적을 가지는 것들과 같은 다른 멤브레인 또한 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용되는 공동섬유 멤브레인은 평균 공극 직경이 0.2㎛일 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 세제로 미리 처리시킨 여러개의 공동섬유 필터 멤브레인을 포함하는, 샘플 혼합물에서 미생물을 분리시키는 필터 장치를 제공하며, 상기에서 각 멤브레인은 루멘을 한정하는 내면 및 외면을 포함하고 각 멤브레인 말단의 한쪽은 오픈되어 필터 장치의 샘플 유입구와 통하고 다른 말단은 닫혀있다.
본 방법 및 장치를 사용하는 각각의 미생물 테스트는 여과 속도로 보충하여용이하게 하는데 - 아래의 실험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 다른 장치가 필요로 하는 시간안에, 종종 10배 이상 빨리 주어진 부피의 샘플 유액으로부터 특정 물질을 회수할 것을 고려한다.
본 발명은 또한 고도로 농밀한 혼합물을 여과할 경우에도, 주어진 샘플에 대한 결과를 일정하게 하는 중요한 이점을 제공한다 - 상이한 결과 세트 간에 99% 이상의 일관성을 용이하게 얻을 수 있다. 이것은 비교적 일정하지 않을 수 있는 편평 멤브레인을 사용하여 얻어지는 결과에 필적한다.
본 발명은 단지 필터 장치의 한 형태를 예시하기 위하여 제시한 첨부도면과 함께 하기하는 상세한 설명으로 더 명백해질 것이다.
도1은 본 발명의 제1의 장치 및 미생물 검출 방법에 사용하는 이의 용도를 나타낸다.
도2는 ATP 표준 곡선을 나타낸다. Y-축은 RLU(비교 광선 단위)이고 X-축은 ATP 몰수이다. 진한 다이아몬드 모양은 1:625 효소이고, 진한 사각형은 1:9 효소이며 진한 삼각형은 1:1 효소이다.
도3은P. damnosus의 Y-축은 총 RLU, X-축은 세포수이다. 진한 다이아몬드는 137099-1에 대한 것이고 진한 사각형은 037099-1에 대한 것이다.
도4는S. carlsbergensis에 대한 포획 표준 곡선을 나타낸다. Y축은 총 RLU이고 X-축은 세포수이다. 진한 사각형은 266099-1에 대한 것이고 진한 삼각형은 097099-1에 대한 것이다.
도5는A. pasteurianus에 대한 포획 농도 곡선을 나타낸다. 진한 다이아몬드는 147099-1에 대한 것이고 진한 원은 027099-1에 대한 것이다.
도6은 본 발명 제2 장치 및 미생물의 검출 방법에 사용하는 이의 용도를 나타낸다.
도7은 말단 캡을 통과하는 부분 및 칼라를 위에서 본 것을 나타낸다.
도8은 제2 장치를 사용하여 거른 맥주 샘플에서S. carlsbergensis의 검출을 나타낸다. Y-축은 RLU이고 X-축은 분석당 세포이다.
도9는 제2 장치를 사용하여 거른 맥주 샘플에서A. pasteurianus의 검출을 나타낸다. Y-축은 RLU이고 X-축은 분석당 세포이다.
도10은 제2 장치를 사용하여 거른 맥주 샘플에서P. damnosus의 검출을 나타낸다. Y-축은 RLU이고 X-축은 분석당 세포이다.
도11은 나타낸다.
도1에서 알 수 있는 바와 같이, 제1 필터 장치(10)는 평균 공극 직경 0.2㎛의 68 공동 폴리프로필렌 섬유 멤브레인(30)과 통하는 Luer 록 피팅(21)이 달린 샘플 유입구(20)를 포함함다. 멤브레인(30)의 오픈된 말단은 제자리에 고정되도록 UV-경화성 접착제(40)에 놓여진 다음 샘플 유입구(20)과 통할 수 있게 한다. 멤브레인(30)의 다른 끝은 이들을 막는 UV-경화성 접착제(41)에 놓여진다. 멤브레인(30)은 20% Tween 20으로 이루어지는 용액으로 플러싱한 다음 건조시켜 미리 처리하였다.
샘플 혼합물(60)을 포함하는 주사위(50)은 샘플 유입구(20)에 연결되어 샘플혼합물(60)은 멤브레인(30)을 통해 걸러져 여액(70)과 여과잔류물(71)이 된다. 멤브레인(30)은 이후 재현탁 용액(80)에 위치되고 주사의(50)의 플런저(90)를 빼내어 멤브레인(30)의 루멘내로 재현탁 용액(80)이 흐르게 함으로써 멤브레인(30)내 보유된 여과잔류물(71)을 재현탁시켜 주사위(50)로 끌어들인다.
여과잔류물(71)은 재현탁시켜 주사위(50)내로 수거한 다음 테스트할 수 있다. 표4에 상술한 바와 같이, 여러 길이의 멤브레인(30)을 가지는 여러가지 필터 장치가 제작되었다. 한 특정 구체예에서, 멤브레인(30)은 총 길이가 55mm인데 이중 40mm는 오픈되어 여과가 일어나는 표면을 제공할 수 있다. 멤브레인(30)은 여과가 일어날 수 있는 총 표면적 51.2㎠를 제공한다.
제2 필터 장치(100)는 평균 공극 직경 0.2㎛의 68 공동 폴리프로필렌 섬유 멤브레인(30)과 통하는 Luer 록 피팅(21)이 달린 샘플 유입구(20)을 포함한다. 샘플 유입구(20)에서, 멤브레인(30)의 말단들은 제자리에 고정되도록 UV-경화성 접착제에 유입된 다음 플러그(120)로 닫히는 출구(110)에 통할 수 있다. 멤브레인(30)은 5% Tween 20으로 이루어지는 용액으로 플러싱한 다음 건조시켜 미리 처리 하였다.
단계I(도6)에서 100ml 부피의 라거(60)를 튜브(140)을 통하여 100ml/min의 속도로 페리 펌프(130)에 의하여 장치(100)으로 펌핑한다. 장치(100)를 라거(60)로 채울때 플러그(120)이 출구(110)을 차단하여 멤브레인(30)의 공극들만이 장치(100)의 유일한 출구가 되어 라거(60)는 멤브레인(30)을 통하여 걸러져 여액은 폐수거 용기(150)에 수거되어 배출된다. 단계(II)에서, 187ml/min의 속도로튜브(140)을 통하여 400ml의 살균수(160)가 펌프되어 멤브레인(30)을 통하여 여과된 다음(플러그(120)는 제자리 유지) 폐용기(150)에 수거되어 배출된다. 물(160)이 장치(100)를 완전 통과하였을때 펌프(130)를 다시 10초간 가동시켜 공기를 튜브(140) 및 멤브레인(30)을 통하여 펌프하여 과량의 유체를 멤브레인(30)에서 제거한다. 이후 펌프(140)를 잠그고 장치(100)를 튜브(140) 및 펌프(130)에서 분리한다. 단계III에서 플러그(즉, 말단-캡)(120)을 제거하고 깨끗한 한 장의 티슈(도시하지 않음) 위에서 장치(100)을 두드려 과량의 유체(160)를 제거한다. 0.5ml의 용균 완충액 160(0.2M NaOH)을 함유하는 1ml들이 멸균 주사위(50)을 샘플 유입구(20)에 부착시킨 다음 분류 튜브(165)를 출구(110)에 부착시킨다. 액체(용균 완충액 160)가 분류 튜브(165)에서 보일때까지 주사위(50)의 플런저(55)를 조심스럽게 늦춘 다음 용균 완충액 160을 주사위(50)로 되돌리기 위하여 플런저(55)를 다시 밀어냄으로써 멤브레인(30)을 용균 완충액 160으로 재습윤시키는 단계를 포함하는 습윤/용균 단계를 수행한다. 습윤/용균 단계를 두번더 시행한다. 장치(100)를 멸균 1.5ml 튜브(170) 상에 붙잡아 두고 플런저(55)를 세번 늦춤으로써 납액체(160) 전부를 장치(100)로부터 분리한다. 단계 IV에서, 분류(165)를 장치(100)에서 분리하고 말단-캡(120)을 장치(100) 상에 두었다. 이후 플런저(55)를 다시 당겨 (멤브레인 상의 것을 포함하는) 용출액 전부를 수거한다. 이후 용출액을 튜브(170)에 옮긴다. 9방울의 중화 완충액(0.2M Tris 포스페이트)을 튜브(170)에 가한다. 튜브(170)에 뚜껑을 씌우고 튜브(170)을 2-3회 전환시켜 내용물을 혼합하였다. 최종적으로 단계V에서, Biotrace Unilite 발광계 및 SigmaBioluminescence 시약을 사용하여 샘플 상에서 ATP 분석을 하였다.
실험
ATP 분석
ATP 분석은 모두 알카리 변성/중화 방법에 따라 하였다.
살균한 에펜도르프에 50㎕ 2M 소듐 하이드록사이드를 넣고 200㎕의 샘플을 가한 다음 2-3회 피펫팅하여 혼합한다. 50㎕ 2M 트리스-포스페이트 완충액을 가하고 뒤집어 혼합한다(샘플 혼합).
100㎕ ATP 분석 혼합물(Sigma-Aldrich Ltd)을 적절히 희석하여 큐베트(Uni-Lite 큐베트)에 놓는다. 3분동안 정치한 다음 3초간 발광계(Uni-Lite)에서 배경광 출력을 읽는다. 배경광 출력을 측정한 다음 100㎕의 샘플 혼합물을 큐베트에 가하고 35초간 읽는다. 배경 치수 및 샘플 치수 간의 차이는 샘플내 ATP 존재에 기인한다.
멤브레인 포획
약 1x107의 S. carlsbergensis 세포를 함유하는 25ml의 라거를 필터 장치의 Luer 피팅에 25ml 주사기를 연결하여 각 장치에 통과시켰다. 이후 필터 장치를 10ml의 물로 세척하여 혹종의 과량의 라거를 제거하였다(라거는 ATP 분석에 다소 저해 효과를 가짐). 필터 장치의 멤브레인 부분을 살균수에 넣고 장치를 통하여 물을 분출시켜 혹종의 포획된 세포를 제거하여 수거된 농축물내 존재시킨다. 상기 기술한 바와 같은 ATP 분석을 수행하여 여액 및 농축물내 미생물 ATP의 존재를확인한다.
일정 포획
S.carlbergensis, A.pasteurianus또는P.damnosus의 하룻밤 배양액 10ml 중 1ml를 24ml의 라거에 가한 다음 스파이크시킨 샘플을 상기 기술한 바와 같이 필터 장치에 통과시켰다. 샘플의 여과 전후 미생물 ATP 수준을 비교함으로써 농축물에서 미생물의 회복율 %를 측정하였다. 단일 미생물 균주에 대하여 총 5개의 장치를 테스트하고 회복 정도간의 변화 계수를 측정하였다.
미생물 오염을 특정하는 대부분의 통상 및 신속 방법은 세포 ATP를 측정하는 것이다. 이것은 세포내 존재하는 ATP를 방출하기 위하여 세포막/세포벽의 분해(세포 용균)를 요한다. 방출된 ATP는 이후 기질 및 ATP를 빛을 포함하는 다수의 산물로 전환시키는 효소 반응을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 원칙을 기준으로 하는 다수의 ATP 테스트는 상업적으로 이용가능하다. ATP 생물발광 분석 키트(Sigma-Aldrich, Poole)는 세표 용균을 조장하는 어떤 완충액도 함유하지 않았다. 세포막 용균 조건은 세포 타입에 따라 달라짐을 유의하여야 한다. 본 연구는 제조 단계시 맥주에서 발견된 세포 타입에 집중된다. 이들은Acetobacter pasteurianus및Pedicoccus damnosus의 두 박테리아 균주 및 이스트 균주Saccharomyces carlsbergensis이다. 이스트 균주는 발효를 일으키는 출발 균주이므로 다를 수 있을 것이다. 대부분의 주류는Saccharomyces류에서 얻은 출발 균주를 사용하므로 이 균주를 테스트에서 사용할 수 있을 것이다.
세포 용균 방법
열 변성: 샘플을 10분간 끓인 다음 냉각시키고 pH를 조절한 다음 ATP 테스트를 하였다. 몇몇 세포는 내열성이다.
알카리 변성: 소듐 하이드록사이드와 같은 강 염기는 세포를 용균시킬 수 있다. 그러나, ATP 분석에 사용되는 루시퍼라제와 같은 효소는 거의 중성 pH에서 작용한다. 따라서, ATP 테스트 전에 샘플의 pH 조절을 하여야 한다. 염기의 농도로 세포 용균 정도를 측정할 수 있다.
세포 배양 용균 시약: 공개된 세포 용균 방법.
알카리 변성/산성 중화: 소듐 하이드록사이드(2M로 최적화)를 사용하여 세포를 용균시킨 다음 산성 완충액을 사용하여 소듐 하이드록사이드를 즉시 중화시켜 효소로 관능 손실됨 없이 샘플을 ATP 테스트에 직접 사용할 수 있게 한다.
여러가지 용균 방법의 결과를 표1에 나타내었는데 이는 개발된 알카리 변성/산성 중화 방법이 세포를 테스트 전에 생장 매질에서 분리시키지 않고도 모든 유기물의 세포 용균이 가능하다는 것을 보여준다.
ATP 표준 곡선
ATP 분석의 감도를 측정하기 위하여 농도 곡선으로 10-7-10-16몰의 ATP에 해당하는 ATP 표준을 측정하였다. 결과는 표2에 나타내었다.
본 발명 장치를 사용하여 샘플을 테스트할 경우 주어진 RLU를 ATP 표준 곡선과 비교할 수 있고 주어진 샘플내 존재하는 세포수를 측정할 수 있다. 단일 이스트 세포는 약 10-14몰의 ATP를 함유하는 반면 박테리아 세포에는 100배 미만의 ATP가존재한다.
멤브레인 포획
상이한 화학 조성 및 분자 크기의 단편의 멤브레인을 본 발명 장치의 제조에 사용하여 유사한 조건하에 본 연구에 포함되어 있는 미생물 포획력을 테스트하였다. 여러가지 공극 직경/분자량 단편을 가지는 폴리프로필렌 멤브레인을 사용하여 다수의 장치 포맷을 테스트하였다. 발명자는 포획할 수 있는 멤브레인 타입 및 포맷을 확인하여 저압에서 작동시킴으로써 샘플 응용시 세포 손상을 피한다. 실험에 사용된 Y-타입 장치(표2 참조)는 본 발명과 유사한데 샘플 유입구(20), Luer 피팅(21), 멤브레인(30) 및 UV-경화성 접착제(40)를 포함한다. 그러나, 이들은 각 멤브레인(30)이 각 말단이 오픈된 루프 형태이고 UV 경화성 접착제(40)내 포함되어 샘플 유입구(20)와 통할 수 있다는 점에서 본 발명 장치와 다르다.
장치내 멤브레인의 형태는 본 연구에 사용되는 모든 유기물의 포획력에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 멤브레인 분자량이 작을수록, 샘플을 장치에 통과시키는데 요구되는 압력이 커진다. 증가된 압력은 세포가 멤브레인을 통과하여(여과되어) 포획되지 않도록 세포 구조를 변경시키는 것으로 사료된다.
일정 포획
여과 장치로 미생물의 포획을 일정하게 하기 위한 연구를 하였다. 각 테스트에 대하여, 5개의 장치를 가지고 각 미생물의 포획력을 테스트하고 포획된 총 세포를 ATP 분석으로 측정하였다. 결과는 표3에 나타내었다.
포획 농도 곡선
각 유기물을 밤새 배양한 것을 10배 희석 분석함으로써 장치에 포획될 수 있는 세포수를 측정할 수 있었다. 각 유기물을 적절한 생장 매질 상에 두어 각 희석시 정확한 세포수를 측정하였다. 결과는 도3-5에 나타내었다.
모든 데이타 포인트는 삼중 장치를 사용하여 테스트하였고 각 샘플에 대하여 이중 ATP 테스트를 수행하였다. 데이타를 수정하여 유리 ATP 효과를 제거하였다. RLU 출력 증가는 저농도 샘플에서 검출될 수 있다. 이것은 감도 증가를 위해 변경된 효소 희석으로 인한 것이다.
오염물 검출/정량
총 표면적 51.2㎠의 68 멤브레인을 가지는 장치를 통하여 2.5 리터 라거를 여과할 수 있을지 여부를 알아보기 위하여 테스트하였다. 삼중 장치 상에서 이 부피는 멤브레인을 차단시키지 않고 필터를 통과하는 것으로 보여졌다. 여과될 수 있는 오염되지 않은 라거의 부피를 측정하기 위하여 장치의 표면적을 감소시켰다. 장치당 멤브레인의 수는 일정하게 유지하고 전체 길이를 변경시켰다. 각 크기의 세 장치를 테스트하여 결과를 표4에 나타내었다. 압력이 너무 커서 장치를 통과할 수 없게 되었을때 라거 샘플 응용을 종결시켰다.
추가 실험을 다음과 같이 수행하였다:
제2 여과 장치로 예시한 바와 같은 여과 장치(도6)를 사용하였다.
장치
1. 평균 공극 직경 0.2㎛인 폴리프로필렌 공동섬유 멤브레인(5% Tween 20으로 미리 처리함)
2. 압력 0.2bar, 디지탈 출력을 35.0으로 셋팅한, 수동 도포구 및 발치 스위치를 포함하는 Loctite(RTM) 21 반자동 컨트롤러
3. 타이머를 40초로 셋팅한 Bondmatic 850 UV 광원
4. 내경 7.0mm 및 외경 12.4mm의 칼라(도7, 200)(폴리카보네이트 막대)
5. 칼라를 수용하는 넓은 말단(내경 12.4mm) 및 Luer 주사기 노즐과 연결되는 좁은 말단(내경 4.1mm)을 가지는, 2mm 중합체 폴리프로필렌으로 제조한 Y-형 말단 캡(도7, 210).
여과 장치는 다음과 같이 제조하였다:
1. IPA(이소프로필렌 알콜)로 작동 표면을 모두 세정한다.
2. 적절한 수치의 길이의 폴리프로필렌 공동섬유 멤브레인으로 이루어지는 다발을 취하여 다발 주위에 복수개의 칼라를 위치시킨다.
3. 공동섬유 멤브레인 다발 말단에서 약 30mm 위치에서, 접착성 도포구를 멤브레인 다발의 중앙에 위치시켜 멤브레인 다발에 침투하도록 접착제를 도포하고 접착제가 멤브레인 전체에 도포되도록 노즐을 조작한다. 이 위치에서 다발의 외측에 접착제를 추가로 도포한다. 이후 칼라를 미끌어지게 하고 그 위치에서 멤브레인 상에서 회전시켜 접착제와 접촉하게 한다.
4. 접착제로 덮힌 다발 부위를 UV 광원하에 두어 접착제를 경화시킨다.
5. 앞의 칼라에서부터 다발을 따라 약 30mm 위치에서 (상기) 단계3에서 상술한 바와 같은 접착제를 도포한다. 먼저 접착제 상에서 슬라이딩 및 회전시킨 다음 서로 접촉하게 되도록 제2 칼라를 이렇게 하고 이후 1-2mm 이들을 이격시키고단계4를 반복한다.
6. 멤브레인 전체 길이가 제자리에 칼라를 가지도록 단계5를 반복한다.
7. 칼라쌍 사이에서 1-2mm 간격으로 섬유를 컷팅하여 여러개의 공동섬ㄷ유 장치를 두는데 섬유는 어느 말단이 오픈된 루멘을 가지고 외부의 어느 말단에서 칼라와 봉입된다.
8. 55℃에서 밤새 장치를 인큐베이팅시켜 남은 접착 단량체를 제거한다.
9. 한쌍의 말단-캡 및 장치 중 하나를 취하여 장치 칼라의 외면 주위 및 말단 캡의 내부 림에 loctite priomer 770을 둔다. 약 1분간 정치시킨 다음 각 칼라의 외면 주위에 loctite 패스트 셋 접착제 403을 가하고 붙을때까지 칼라 상에서 말단 캡을 강하게 누른다.
실험
먼저, (하기) 테스트 지시에 따라 본 발명 제2 장치를 사용하여 상기 테스트의 결과를 입증하였는데 검출 한계는 검출당Saccharomyces carlsbergensis에 대하여 30-100 세포,Acetobacter pasteurianus에 대하여 10000-20000 세포,Pediococcus damnosus에 대하여 1000 세포 초과였다. 큰 부피의 액체를 여과하는 시스템 용량은 최종 CIP(제자리 세정) 헹굼수의 위생 상태를 테스트할 수 있는 특별한 잠재성을 증명한다.
두번째로, 테스트를 다소 변경하여 맥주의 미생물 오염에 대한 감도를 증가시켰다. 이것은 여과된 맥주 샘플에서 얻은 소수의 포획된 미생물을 필터내 배양으로 얻었다. 24시간 인큐베이팅시킨 후, 여과된 맥주 1ml당 세포 하나를 검출할수 있었다. 이러한 결과는 양호한 것으로 현재 이용할 수 있는 다른 ATP를 베이스로 한 검출 시스템보다 더 사용하기 편하다. 또한, 본 발명 시스템은 종래의 평 베드 멤브레인 여과에 비하여 대량 부피의 맥주를 여과할 수 있어(아울러 흑맥주 여과 가능) 검출 한계가 증가된다는 이점이 있다. 업계에 공지된 아데닐레이트 키나제 검출 테스트를 이용한 필터내 배양을 할 필요 없이(또는 단기 배양 기간으로) 유사한 감도를 얻을 수 있을 것이다.
이 테스트는 특히 본 발명 용도에, 양조, 제약, 소프트-드링크 및 유지류 산업에서의 제조 공정에 있어 제자리 세정 테스트(CIP)가 포함됨을 보여준다. 또한, 본 발명은 맥주(비터, 라거 및 흑맥주 포함) 및 사이다 오염 테스트에 특히 적당하다.
여기서, ATP 검출을 수행하기 전에 소수의 세포를 함유하는 필터 장치를 영양 매질에서 인큐베이팅하는 효과를 조사하였다. 이 연구의 목적으로 상이한 유기물,Lactobacillus brevis(BSO 464)를 사용하였다. 이 유기물은 전에 다수의 ATP 검출 실험에 광범위하게 사용되었으므로 선택하였는데 따라서 결과를 다른 시스템에서 얻은 것과 용이하게 비교할 수 있다.
BSO464를 MRS 영양액내에서 정상 상태까지 생장시켰다. 현미경으로 세포수를 센 다음 살균 탈염수로 적절히 희석하여 1ml당 약 100개의 세포를 얻었다. 이 배양액 1ml를 사용하여 99ml의 라거에 접종하고 각 라거 샘플에 대하여 이것을 3회 수행하였다. 접종하지 않은 라거 대조구를 또한 셋팅하였다. 플레이트수를 세어 접종 정도를 체크하였다. 각 라거를 하기하는 바와 같이 여과하고 단계7까지테스트 지시를 따랐다.
이 단계후 장치를 튜브에서 떼어내고 살균 주사기를 사용하여 미세섬유의 내부를 MRS 영양액으로 채웠다. 주사기를 제거하고 제2의 살균 말단 캡을 장치의 말단에 위치시켜 장치내에 포획된 혹종의 유기물을 보유하였다. 이후 인큐베이팅 시간을 변화시키면서 전체 장치를 20ml의 MRS 영양액내에 함침시켰다. 인큐베이팅후, 장치를 조심스럽게 영양액에서 분리하여 말단 캡 하나를 제거하였다. 주사기를 사용하여 10ml의 살균 탈염수를 장치에 통과시켜 폐용기에 수거하였다. 이후 공기를 장치에 주사하여 과량의 액체를 멤브레인에서 제거하였다. 단계9의 각 프로토콜과 같이 (하기) 테스트 지시를 따랐다.
테스트 지시:
1. 봉입된 백에서 장치 및 튜브를 제거한다.
2. 187ml/min 또는 220rpm에서 작동할 수 있는 적절한 펌프 시스템에 튜브(튜브 내경 3.2mm, 외경 6.4mm)를 부착한다.
3. 장치 아래에 폐수거 용기를 놓는다.
4. 펌프를 100ml.min 또는 117rpm으로 셋팅한다.
5. 100ml의 라거(최대 1리터 통과 가능)를 통과시켜 여액이 폐용기로 가게 한다.
6. 펌프 셋팅을 187ml/min 또는 220rpm으로 조절하고 400ml의 살균(증류)수를 여과시켜 장치에서 과량의 라거를 씻어낸다.
7. 물 세척을 끝낸 후, 10초간 공기를 튜브에 통과시켜 멤브레인으로부터 과량의 유체를 제거한다.
8. 펌프를 끄고 장치 및 튜브를 펌프에서 떼어낸다.
9. 장치 말단-캡을 제거한다. 깨끗한 티슈 위에서 장치를 털어 과량의 유체를 제거한다.
10. 장치의 한 말단에 분류 튜브를 부착하고 다른 말단에 0.5ml 용균 완충액(0.2M NaOH)을 함유하는 1ml들이 살균 주사기를 위치시킨다.
11. 액체가 분류 튜브에 보일때까지 조심스럽게 주사기 플런저를 늦춘다. 용균 완충액이 주사기에 되돌아오도록 플런저를 다시 당겨 멤브레인을 용균 완충액으로 재습윤시킨다.
12, 단계 11을 두번 반복한다.
13. 살균 1.5ml 튜브 상에 장치를 유지하고 주사기 플런저를 세번 늦추어 장치에서 액체를 전부 제거한다.
14. 분류기를 제거하고 장치에 말단 캡을 씌운다. 주사기 플런저를 다시 당겨 용출액(멤브레인 상의 것 포함)을 전부 수거하고 이것을 1.5ml 튜브에 놓는다.
15. 즉시 9방울의 중화 완충액(0.2M 트리스 포스페이트)을 용출액을 함유하는 튜브에 가한다. 튜브의 뚜껑을 다시 씌우고 튜브를 2-3회 뒤집어주어 온건하게 혼합한다.
16. Biotrace UniLite 발광계 및 Sigma 생물발광(ATP 분석) 시약을 사용하여 샘플 상에서 ATP 분석을 하는데 ATP 분석은 하기와 같다.
ATP 분석:
1. 깨끗한 UniLite 큐베트에 50㎕의 ATP 분석 혼합물을 넣는다.
2. 실온에서 3분간 인큐베이팅한다.
3. 큐베트상에 UniLite HoldTight를 놓고 발광계 안에 넣는다. 뚜껑을 닫고 측정 버튼을 누른다. 10초 지연후 35초간 기계는 광 출력을 측정할 것이다.
4. 분석 혼합물만에 대한 RLU의 프린트아웃이 스크린에 나타날 것이고 인쇄된다. 이것은 분석 배경 리딩이고 30RLU보다 크지 않아야 한다. 리딩이 더 높으면 오염되었음을 지시하는 것이다.
5. 샘플 챔버에서 큐베트를 꺼내어 100㎕의 요출 샘플을 큐베트에 가하였다. 온건하게 흔들어 주어 혼합하여 큐베트를 샘플 챔버에 되돌려 놓았다.
6. 샘플 챔버를 닫고 측정 버튼을 늦춘다. 광 출력이 스크린에 나타나 출력된다.
결과
1. 초기 결과의 타당성
표5 및 도8은 분석당 약 30개의 이스트 세포(여과되는 맥주 샘플당 300개의 세포)가 본 시스템을 사용하여 용이하게 검출될 수 있음을 보인다. 이것은 분석당 30개의 이스트 세포가 접종되지 않은 라거 샘플에서 얻어지는 것과 용이하게 구별되는 RLU 출력을 내놓음을 말하는 것이다.
표6 및 도9는 분석당 3000개의A. pasteurianus세포가 배경 수준보다 훨씬 더 큰 평균 광 출력을 냄을 보인다. (믿을 수 있는) 검출 한계는 분석당 10000-20000A. pasteurianus세포인 것으로 사료된다.
표7 및 도10은 분석당 150개의P. damnosus세포가 배경 수준보다 훨씬 더 큰 평균 광 출력을 냄을 보인다. 믿을 수 있는 검출 한계는 분석당 1000개가 넘는P. damnosus세포인 것으로 사료된다.
2. 증명되지 않은 시스템
표8 및 도11은 본 발명 제2 장치를 사용하여 여과된 맥주내 소수의Lactobacillus brevis검출시 필터내 집적배양의 효과를 나타낸다. 결과는 본 발명 장치 및 테스트를 사용하여 여과후 24시간 필터내 집적배양으로 160개의L. brevis세포를 검출할 수 있음을 보인다. 소수의 스트레스하 유기물을 검출하기 위하여 집적배양 단계를 30-40시간 지속시키는 것이 바람직할 수 있을 것이다.
토의
필터내 집적배양 후, 24시간 인큐베이팅시킨 후 여과된 맥주 1ml당 약 1개의L. brevis세포(원 샘플내 분석당 1개 미만의 박테리아 세포에 해당)를 검출할 수 있었다. 그러나, 소수의 스트레스하 유기물을 검출하기 위하여 테스트하기 전에 30-40시간동안 집적배양을 지속시키는 "실" 상황에서 할 것이 추천될 것이다. 이 결과는 적어도 양호하며 현재 이용가능한 다른 ATP 베이스의 검출 시스템보다 사용하기 용이한 시스템이다. 또한, 본 발명 시스템은 종래의 평 베드 멤브레인에 비하여 많은 부피의 맥주를 여과할 수 있어(아울러, 흑맥주 여과 가능) 결과적으로 검출 한계가 증가되는 이점이 있다.
또한, 장치 설계는 샘플 및 추출 단계가 필터 장치에 포함되어 있어 ATP 베이스 검출 실행을 더 용이하게 함을 의미한다.
Claims (12)
- i) 샘플 혼합물을 필터 장치의 샘플 유입구에 통과시키는 단계로서, 상기 필터 장치는 세제로 미리 처리된 여러개의 공동섬유 필터 멤브레인을 포함하고 있고, 상기 멤브레인에는 제1말단과 제2 말단이 있으며 외면 및 내면으로 한정된 루멘이 있고 상기 멤브레인의 제1 말단은 오픈되어 상기 샘플 유입구에 통하고 제2 말단으로부터의 흐름이 제한되어 상기 샘플 혼합물이 상기 멤브레인을 통하여 여과되어 상기 멤브레인의 루멘내 여과잔류물이 남게 됨ii) 상기 멤브레인내 상기 여과잔류물을 재현탁시키는 단계; 및iii) 상기 여과잔류물내 혹종의 미생물의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 혼합물로부터 미생물을 회수하는 방법.
- 제1항에 있어서, 재현탁 단계(ii)가 상기 멤브레인의 루멘을 통하여 용균 제제 용액을 통과시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플 혼합물이 상기 멤브레인을 통한 여과에 의하여 배타적으로 상기 필터 장치로 배출되도록 상기 멤브레인의 제2 말단으로부터의 흐름이 제한되는 필터 장치.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 이스트를 포함하는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 박테리아를 포함하는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레인의 평균 공극 직경이 0.2㎛인 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레인이 폴리프로필렌을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레인이 폴리설폰인 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세제가 비이온성 세제를 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 세제가 Tween-20을 포함하는 방법.
- 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계(ii) 전에 12시간 이상상기 필터 장치내에서 상기 여과잔류물내 혹종의 미생물을 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 미생물을 상기 검출 단계(iii) 전에 24 또는 36시간 이상 배양하는 방법.
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