JP5882177B2 - 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 - Google Patents

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Description

本発明は、検体に含まれる細胞の生体物質を回収する生体物質回収方法及び生体物質回収装置に関する。
従来、検体中の微生物の定量方法（計数方法）としては、微生物から抽出したＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を指標として定量することで微生物を間接的に計数する、いわゆるＡＴＰ測定法が知られている（例えば、特許文献１から３参照）。このＡＴＰ測定法は、サンプルに含まれる微生物にＡＴＰ抽出試薬を接触させることで微生物に内在するＡＴＰを抽出し、このＡＴＰに発光試薬を反応させた際の発光量に応じて微生物を計数する方法である。
このようなＡＴＰ測定法によれば、例えば平板培地で培養した微生物のコロニ数によって捕集した微生物を計数する計数方法では数日間を要するところ、微生物を捕集してからその計数までの時間を１時間ないし数時間程度に飛躍的に短縮することができる。
特開平１１−１５５５９７号公報 特開２００８−２４９６２８号公報 特開２００９−１３１１８６号公報
ところで、従来のＡＴＰ測定法ではＡＴＰ抽出試薬として、例えば塩化ベンザルコニウム等の界面活性剤が使用される。このようなＡＴＰ抽出試薬によれば、微生物の細胞膜を破壊することで微生物に内在するＡＴＰを抽出することができる。
しかしながら、微生物のＡＴＰ抽出試薬に対する耐性は、微生物の種類によって異なるために、例えばＡ種に属する微生物に対してはＡＴＰ抽出試薬が有効に作用してＡＴＰを抽出することができたとしても、これと異なるＢ種の微生物からは充分にＡＴＰが抽出できない場合がある。
したがって、ＡＴＰ測定法による従来の微生物の定量方法では、微生物の種類によってＡＴＰの収率にばらつきが生じて精度よく高感度で微生物の定量を行うことができない場合がある。よって、ＡＴＰ等の生体物質を微生物から回収する際に、微生物の種類にかかわらずに充分な量の当該生体物質を回収することができる生体物質回収方法等が望まれていた。
そこで、本発明は、微生物の種類にかかわらずに充分な量の当該生体物質を微生物から回収することができる生体物質回収方法及び生体物質回収装置を提供することにある。
前記課題を解決する生体物質回収方法は、微生物のＡＴＰを回収する生体物質回収方法であって、前記微生物を含む媒体から当該微生物を当該微生物の生理活性の低下が抑制される一定の第１の温度のもとで回収する回収工程と、この回収工程によって回収した前記微生物の細胞外に存在する遊離の前記ＡＴＰを一定の温度のもとで予め消去する消去工程と、この消去工程が行われた後、前記微生物を、前記第１の温度及び前記消去工程の温度よりも高い一定の第２の温度になるように昇温させる昇温工程と、一定の前記第２の温度のもとで前記微生物から前記ＡＴＰを抽出する抽出工程と、前記微生物から抽出した前記ＡＴＰを含む抽出液を、前記第２の温度よりも低い温度に降温する降温工程と、前記抽出液の所定量を前記第２の温度よりも低い温度のもとで回収する抽出液回収工程と、を有することを特徴とする。
また、前記課題を解決する生体物質回収装置は、微生物のＡＴＰを回収する生体物質回収装置であって、前記微生物を含む媒体から当該微生物を回収するとともに、当該微生物から前記ＡＴＰを抽出する回収容器と、この回収容器の温度を制御する温度制御機構と、を備え、前記温度制御機構は、前記媒体から一定の第１の温度で回収され、生理活性の低下が抑制された状態の前記微生物の細胞外に存在する遊離の前記ＡＴＰを一定の温度のもとで予め消去した後に、前記第１の温度よりも高い一定の第２の温度で当該微生物から前記ＡＴＰが抽出されるように前記回収容器の温度を制御し、さらに、前記微生物から抽出した前記ＡＴＰを含む抽出液の所定量が前記第２の温度よりも低い温度で回収されるように前記回収容器の温度を制御することを特徴とする。
本発明によれば、微生物の種類にかかわらずに微生物から生体物質を充分に回収することができる生体物質回収方法及び生体物質回収装置を提供することができる。
本発明の実施形態における生体物質回収装置の構成説明図である。 本発明の実施形態における生体物質回収方法の概略を示すフローチャートである。 本発明の実施形態における生体物質回収方法の概略を示すタイムチャートである。 （ａ−１）から（ａ−３）は、本発明の実施形態における生体物質回収方法が実施される際の、回収容器内の液位を示す回収容器の断面図である。（ｂ−１）から（ｂ−３）は、（ａ−１）から（ａ−３）に対応する場面でのフィルタ近傍の様子を拡大して示す模式図である。
次に、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
本実施形態の生体物質回収方法及び生体物質回収装置は、所定の第１の温度で微生物を含む媒体から当該微生物を回収し、回収した当該微生物の生体物質であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を、前記の第１の温度よりも高い第２の温度のもとに当該微生物から抽出して回収することを主な特徴とする。
以下では、本発明の実施形態に係る生体物質回収装置の全体構成について説明した後に、この生体物質回収装置の動作について説明しながら生体物質回収方法、及び回収した生体物質の定量原理について説明する。
＜生体物質回収装置＞
図１に示すように、生体物質回収装置１は、微生物（図示省略）を含む液状試料８ａから当該微生物を回収するとともに、当該微生物から生体物質であるＡＴＰを抽出する回収容器２１と、この回収容器２１の温度を制御する温度制御機構９と、を備えている。なお、微生物を含む液状試料８ａは、特許請求の範囲にいう「微生物を含む媒体」に相当する。
（回収容器）
回収容器２１は、ロート状に形成された本体２５の底部にフィルタ２６が設けられて構成されている。
この回収容器２１は、後記する濾過装置２の吸引ヘッド２３で吸引されることにより、フィルタ２６上に微生物を回収し、後記する液分注装置３１でＡＴＰ抽出試薬が分注されることにより微生物から生体物質を抽出し回収するものである。なお、この液分注装置３１は、特許請求の範囲にいう「分注機構」に相当する。
本実施形態でのフィルタ２６は、後記するように、親水性フィルタ２６ａ（図４（ｂ−１）参照）と、疎水性フィルタ２６ｂ（図４（ｂ−１）参照）の二枚重ねになっており、図１には図示しないが、二枚重ねの上側に親水性フィルタ２６ａが配置され、二枚重ねの下側に疎水性フィルタ２６ｂが配置されている。
このように構成されたフィルタ２６は、後記する吸引ヘッド２３を介して吸引しない限りは、本体２５に投入された液状試料８ａをフィルタ２６上に保持するようになっている。また、吸引ヘッド２３で吸引すると、フィルタ２６は、液状試料８ａのうち微生物（図示省略）をフィルタ２６上に残して、その液状成分を、フィルタ２６を介して吸引ヘッド２３側に排出できるようになっている。
ちなみに、回収容器２１は、生体物質回収装置１内に設けられる処理ステージ５の所定の位置、本実施形態では処理ステージ５に設けられた回収容器搭載部５ａに着脱自在に取り付けられることとなる。ちなみに、本実施形態での回収容器搭載部５ａは、アルミニウム合金等の良熱伝導材料で形成されている。
（濾過装置）
濾過装置２は、前記の回収容器２１と、吸引ヘッド２３と、吸引ヘッド２３を上下移動させる昇降機構２２と、吸引ヘッド２３を介して回収容器２１の内容物を真空引きする吸引ポンプ２４と、を備えている。
吸引ヘッド２３は、前記したように、昇降機構２２によって上下移動可能になっており、回収容器２１の内容物をフィルタ２６で濾過する場合には、昇降機構２２が吸引ヘッド２３を上昇させて吸引ヘッド２３と回収容器２１とを連結させることとなる。また、回収容器２１を処理ステージ５に取り付け、又は処理ステージ５から取り外す際には、昇降機構２２は、吸引ヘッド２３を下降させて吸引ヘッド２３と回収容器２１との連結を解くこととなる。
そして、このような吸引ヘッド２３から延出する配管Ｐ１の途中に設けられた前記吸引ポンプ２４が起動することで、前記したように、回収容器２１内の液状成分は、フィルタ２６、吸引ヘッド２３、及び吸引ポンプ２４を介して生体物質回収装置１の図示しない廃液貯留槽内に排出されることとなる。
ちなみに、吸引ポンプ２４の駆動及び停止、並びに昇降機構２２の駆動及び停止は、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄ及び昇降機構制御部３４ｅによって制御されることとなる。
（液分注装置）
液分注装置３１は、液分注ノズル３１ａと、この液分注ノズル３１ａに所定量の液体を吸引させ、又は排出させる分注ポンプ３１ｂと、生体物質回収装置１の筐体７内で液分注ノズル３１ａを三次元的に移動させるアクチュエータ３１ｃと、制御部３４のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂと、を備えている。
この液分注装置３１によれば、その液分注ノズル３１ａが、後記するＡＴＰ発光強度を測定する工程において、回収容器２１内に得られるＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−３）参照）の所定量を、次に説明するＡＴＰの定量機構３の構成要素である発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注するようになっている。また、液分注ノズル３１ａは、試薬ホルダ６のＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注するようになっている。
なお、液分注装置３１のアクチュエータ３１ｃによる液分注ノズル３１ａの三次元的な移動は、アクチュエータ制御部３４ａによるアクチュエータ３１ｃの所定の制御によって実現されることとなる。また、ＡＴＰ発光試薬８ｂ、ＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−３）参照）等の分注量の調節は、流量制御部３４ｂによる分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって実現されることとなる。
（温度制御機構）
温度制御機構９は、複数の要素からなり、回収容器２１を加熱するヒータ等の第１加熱手段１０と、回収容器２１の温度を検出し、この温度検出信号を出力する第１温度センサ１１と、この第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて第１加熱手段１０の発熱量を制御する温度制御部３４ｇと、を備えている。
第１加熱手段１０及び第１温度センサ１１は、回収容器搭載部５ａで回収容器２１に隣接するように配置され、回収容器２１の温度制御を精度よく行うことができるようになっている。
制御部３４の温度制御部３４ｇは、第１加熱手段１０に通電するように所定のインバータ等に指令を出力して、回収容器搭載部５ａに設けられた第１加熱手段１０を発熱させる。具体的には温度制御部３４ｇは、第１加熱手段１０で回収容器２１内の液状試料８ａを、前記の第１の温度となるように加熱して保温する。この際、制御部３４の温度制御部３４ｇは、回収容器搭載部５ａに設けられた第１温度センサ１１から出力され、温度検出信号入力部３４ｃを介して入力される温度検出信号に基づいて第１加熱手段１０をオンオフする。これにより回収容器２１内の液状試料８ａは、前記の温度範囲内となるように制御されることとなる。
制御部３４の温度検出信号入力部３４ｃは、インターフェース、Ａ／Ｄ変換部等で構成され、第１温度センサ１１からの温度検出信号を入力するようになっている。そして、温度制御部３４ｇでは、それが有している中央演算処理部（図示省略）、記憶部（図示省略）等が温度検出信号入力部３４ｃを介して入力する温度検出信号に基づいて協働することで、前記のように、第１加熱手段１０をオンオフするようになっている。
なお、第１加熱手段１０による発熱量の制御のタイミングは、後に詳しく説明する（図３参照）。
また、この温度制御部３４ｇは、後記するように、試薬ホルダ６のＡＴＰ抽出試薬８ｃを昇温させるヒータ等の第２加熱手段１２の発熱量をも制御するように構成されている。なお、このＡＴＰ抽出試薬８ｃは、特許請求の範囲にいう「生体物質抽出試薬」に相当する。
この際、温度制御部３４ｇは、ＡＴＰ抽出試薬８ｃの近傍で試薬ホルダ６に設けられた第２温度センサ１３から出力され、温度検出信号入力部３４ｃを介して入力される温度検出信号に基づいて第２加熱手段１２をオンオフする。これにより試薬ホルダ６のＡＴＰ抽出試薬８ｃは、後記する所定の温度範囲内となるように制御されることとなる。
なお、第２加熱手段１２及び第２温度センサ１３は、前記の温度制御部３４ｇとともに特許請求の範囲にいう「抽出試薬昇温機構」を構成している。
（ＡＴＰの定量機構）
本実施形態に係る生体物質回収装置１は、前記の回収容器２１、濾過装置２、液分注装置３１、及び温度制御機構９に加えて、生体物質であるＡＴＰの定量機構３を備えている。
ＡＴＰの定量機構３は、発光強度測定ユニット３２と、この発光強度測定ユニット３２から出力されるＡＴＰ発光強度の検出信号に基づいて微生物に含まれるＡＴＰを定量する制御部３４の演算部３４ｆと、を主に備えて構成されている。
発光強度測定ユニット３２は、後に詳しく説明するように、分注されたＡＴＰ抽出液と、ＡＴＰ発光試薬８ｂとを受け入れて発光反応させる発光用チューブ３２ｂと、これらの発光反応時のＡＴＰ発光強度を検出する光電子増倍管等を有する光検出部本体３２ａとを備えている。
そして、光検出部本体３２ａは、前記したように、発光用チューブ３２ｂにおけるＡＴＰ発光強度の検出信号を制御部３４の演算部３４ｆに出力することとなる。つまり、光検出部本体３２ａは、「ＡＴＰ抽出液中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号を出力することとなる。
演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａから出力される「ＡＴＰ抽出液中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号に基づいて、液状試料８ａ中の微生物に含まれるＡＴＰの量を演算して求める。なお、この演算部３４ｆのＡＴＰの量の演算手順については、後に詳しく説明する。
＜生体物質回収装置の動作＞
次に、生体物質回収装置１の動作について説明しながら生体物質回収方法、及び回収した生体物質の定量原理について説明する。ここでは図１及び図２を参照しながら説明する。図２は、本発明の実施形態における生体物質回収方法の概略を示すフローチャートである。
図１に示す生体物質回収装置１では、回収容器２１が処理ステージ５の回収容器搭載部５ａに配置され、次いでこの回収容器２１に検査対象となる液状試料８ａが注入された後、図示しない起動スイッチがオンにされることで制御部３４が次の手順を実行する。
制御部３４の温度制御部３４ｇは、回収容器２１の温度が第１の温度で維持されるように、回収容器保温工程を開始する（図２のステップＳ１参照）。つまり、温度制御部３４ｇは、第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて、回収容器２１の温度が常温よりも高く、かつ後記の第２の温度よりも低い第１の温度となるように第１加熱手段１０の発熱量を制御する。
なお、本実施形態での「第１の温度」としては、常温を超え、後記の第２の温度未満であれば特に制限はないが、回収容器２１の内容物の温度が、例えば３０℃といった、常温を超え、４０℃未満の温度範囲内で設定されることが望ましい。
次に、制御部３４の昇降機構制御部３４ｅは、吸引ヘッド２３を上昇させて回収容器２１と連結させるように昇降機構２２に指令を出力する。
また、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄは、吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物（液状試料８ａ）の濾過を開始する。これにより、フィルタ２６上に微生物が回収されることとなる（図２のステップＳ２）。
この際、液状試料８ａ中の液体成分は、吸引ヘッド２３側に排出され、液状試料８ａの液体成分に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰの大部分は、この液体成分とともに排出される。
次のステップＳ３では、回収容器２１内にＡＴＰ消去試薬が分注されて、微生物の細胞外に存在する、いわゆる遊離のＡＴＰが消去される。ちなみに、ＡＴＰ消去試薬は、試薬ホルダ６に配置されており、前記の液分注装置３１の液分注ノズル３１ａによって、試薬ホルダ６から回収容器２１に分注されることとなる。このＡＴＰ消去試薬の分注によって、遊離のＡＴＰは確実に消去されることとなる。
このＡＴＰ消去試薬としては、例えば、ＡＴＰ分解酵素が挙げられる。
次に、制御部３４の温度制御部３４ｇは、回収容器２１の昇温工程を開始する（図２のステップＳ４参照）。具体的には、温度制御部３４ｇは、第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて、回収容器２１の温度が予め定められた第２の温度となるように、第１加熱手段１０の発熱量を制御する。
なお、本実施形態での「第２の温度」としては、回収容器２１の内容物の温度が、例えば６０℃といった、４０℃を超え、１００℃未満の温度範囲内で設定されることが望ましい。
次に、第２の温度が維持されながら、回収容器２１内では微生物からＡＴＰを抽出するＡＴＰ抽出工程が実施される（図２のステップＳ５参照）。
具体的には、制御部３４は、第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて、回収容器２１の温度が第２の温度に達したと判断した際に、アクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂは、液分注ノズル３１ａが回収容器２１内に所定量のＡＴＰ抽出試薬８ｃを分注するように、アクチュエータ３１ｃ及び分注ポンプ３１ｂを制御する。
このＡＴＰ抽出試薬８ｃの分注によって、微生物に含まれるＡＴＰが抽出されて回収容器２１内にＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−３）参照）が生成することとなる。また、ステップＳ４で回収容器２１内に分注されたＡＴＰ消去試薬は、このＡＴＰ抽出試薬８ｃと接触することによって失活することとなる。
このＡＴＰ抽出試薬８ｃとしては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。中でも界面活性剤が望ましく、この界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。
次に、回収容器２１の降温工程が実施される（図２のステップＳ６参照）。具体的には、温度制御部３４ｇは、後記する予め定められた所定のタイミングで第１加熱手段１０をオフにする。これにより、回収容器２１は放熱によりその温度が低下していく。
この降温工程の実施直後の温度としては、特に制限はなく常温以上であればよいが、本実施形態では、前記第１の温度と同じ温度となるように降温工程が行われることを想定している。
そして、この降温工程を実施した後、温度制御部３４ｇは、回収容器２１の温度が一定に維持されるように制御する。つまり、本実施形態での温度制御部３４ｇは、第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて、回収容器２１の温度が予め定められた第１の温度となるように、第１加熱手段１０の発熱量を制御する。
次に、制御部３４は、第１温度センサ１１からの温度検出信号に基づいて、回収容器２１の温度が第１の温度にまで降下したと判断した際に、アクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂは、液分注ノズル３１ａが回収容器２１のＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−３）参照）の所定量を回収する（図２のステップＳ）。そして、液分注ノズル３１ａは、回収したＡＴＰ抽出液８ｄを発光用チューブ３２ｂに分注する。
次いで、液分注ノズル３１ａは、前記のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂによる制御で、試薬ホルダ６に配置されているＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する。
このＡＴＰ発光試薬８ｂとしては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
これにより、発光用チューブ３２ｂ内ではＡＴＰ抽出液中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとの発光反応によって発光を生じることとなる。
次に、制御部３４の演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａ（図１参照）がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する（ステップＳ８）。
そして、制御部３４は、予め記憶しているＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を示す検量線に基づいて、測定された前記の発光強度に対応するＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算することで、液状試料８ａ（媒体）中のＡＴＰが定量される（図２のステップＳ９）。このステップＳ９が行われることで、本実施形態に係る一連の生体物質回収方法の工程を含む生体物質の定量工程が終了する。
次に、本実施形態に係る生体物質回収方法の一連の工程の経過時間と、回収容器２１の温度変化との関係について説明する。次に参照する図３は、本発明の実施形態における生体物質回収方法の概略を示すタイムチャートである。なお、図３の縦軸は回収容器２１の温度Ｔ［℃］を表し、横軸は経過時間ｔ［ｍｉｎ］を表す。
図３に示すように、本実施形態に係る生体物質回収方法では、時刻ｔ１［ｍｉｎ］における「回収容器保温工程」の開始（図２のステップＳ１参照）、時刻ｔ２［ｍｉｎ］から時刻ｔ３［ｍｉｎ］までの「微生物の回収工程」（図２のステップＳ２参照）、時刻ｔ３［ｍｉｎ］から時刻ｔ４［ｍｉｎ］までの「ＡＴＰ消去工程」（図２のステップＳ３参照）、時刻ｔ４［ｍｉｎ］から時刻ｔ５［ｍｉｎ］までの「回収容器の昇温工程」（図２のステップＳ４参照）、時刻ｔ５［ｍｉｎ］から時刻ｔ６［ｍｉｎ］までの「ＡＴＰの抽出工程」（図２のステップＳ５参照）、時刻ｔ６［ｍｉｎ］から時刻ｔ７［ｍｉｎ］までの「回収容器の降温工程」（図２のステップＳ６参照）、及び時刻ｔ７［ｍｉｎ］から時刻ｔ８［ｍｉｎ］までの「ＡＴＰ抽出液の回収工程」（図２のステップＳ７参照）を有して構成されている。
また、図３には、「ＡＴＰ抽出液の回収工程」（図２のステップＳ７参照）に続く、生体物質定量方法としての、時刻ｔ８［ｍｉｎ］から時刻ｔ９［ｍｉｎ］までの「ＡＴＰ発光強度の測定工程」（図２のステップＳ８参照）と、時刻ｔ９［ｍｉｎ］から時刻ｔ１０［ｍｉｎ］までの「演算工程」（図２のステップＳ９参照）とを参考として追記している。
図３に示すように、時刻０［ｍｉｎ］から時刻ｔ１［ｍｉｎ］までの間は、第１加熱手段１０（図１参照）はオフになっており、回収容器２１の温度は、室温に維持されることとなる。この間に回収容器２１が処理ステージ５に配置され、回収容器２１には検査対象となる液状試料８ａが注入されることとなる。
次に、前記したように、時刻ｔ１［ｍｉｎ］に「回収容器保温工程」が開始して（図２のステップＳ１参照）、時刻ｔ２［ｍｉｎ］に回収容器２１の温度が第１の温度（Ｔ１）に達すると、前記の温度制御機構９によって回収容器２１の温度は、第１の温度（Ｔ１）に維持されることとなる。これにより、回収容器２１の内容物の温度も第１の温度（Ｔ１）と等しくなる。
そして、微生物を含む液状試料８ａ（図１参照）は、この第１の温度のもとで濾過装置２により濾過されて、微生物はフィルタ２６上に分離されて回収される（図２のステップＳ２参照）。
次に、液状試料８ａの濾過が終了する時刻ｔ３［ｍｉｎ］のタイミングで、ＡＴＰ消去工程（図２のステップＳ３参照）が開始する。ちなみに、この時刻ｔ３［ｍｉｎ］のタイミングは、例えば、吸引ヘッド２３内の圧力変化をモニタすることで決定することができる。また、時刻ｔ３［ｍｉｎ］のタイミングは、予めのシミュレーション試験で求められた濾過時間［差分ｔ３−ｔ２］［ｍｉｎ］に基づいて設定することもできる。また、回収容器２１内の内容物の液面を、例えば光学式の液面計（図示省略）で測定し、回収容器２１の内容物が空になったときを時刻ｔ３［ｍｉｎ］のタイミングとすることもできる。
このようなＡＴＰ消去工程は、第１の温度（Ｔ１）のもとで行われ、前記のように、回収容器２１内にＡＴＰ消去試薬が分注されることで実施される。ちなみに、本実施形態で回収容器２１内に分注されるＡＴＰ消去試薬の量が微量であることと、回収容器２１が第１加熱手段１０で加熱されているため、ＡＴＰ消去試薬の分注による第１の温度の変動は殆どない。なお、ＡＴＰ消去試薬を比較的に多く使用する場合には、予めＡＴＰ消去試薬の温度を第１の温度（Ｔ１）と同程度に昇温しておくことが望ましい。
このようなＡＴＰ消去工程の終了時刻ｔ４は、予めのシミュレーション試験で求められたＡＴＰ消去時間［差分ｔ４−ｔ３］［ｍｉｎ］に基づいて設定することもできる。ちなみに、ＡＴＰ消去工程の開始時刻ｔ３［ｍｉｎ］は、液分注ノズル３１ａがその初期位置（ホームポジション）から試薬ホルダ６に向かって移動を開始する時刻であり、シミュレーション試験で求められるＡＴＰ消去時間［差分ｔ４−ｔ３］［ｍｉｎ］には、液分注ノズル３１ａが初期位置から移動し、回収容器２１にＡＴＰ消去試薬を分注するまでの時間が含まれる。
次に、前記したように、時刻ｔ４［ｍｉｎ］に「回収容器の昇温工程」が開始して（図２のステップＳ４参照）、時刻ｔ５［ｍｉｎ］に回収容器２１の温度が第２の温度（Ｔ２）に達すると、前記の温度制御機構９によって回収容器２１の温度は、第２の温度（Ｔ２）に維持されることとなる。これにより、回収容器２１の内容物の温度も第２の温度（Ｔ２）と等しくなる。
そして、細胞外のいわゆる遊離ＡＴＰが消去されたフィルタ２６上の微生物には、ＡＴＰ抽出試薬８ｃがこの第２の温度のもとに分注される。この際、分注されるＡＴＰ抽出試薬８ｃは、「抽出試薬昇温機構」である第２加熱手段１２により加熱されている。そのため、ＡＴＰ抽出試薬８ｃが回収容器２１内に分注される際に、回収容器２１における第２の温度（Ｔ２）が維持されるようになっている。
このようなＡＴＰ抽出工程の終了時刻ｔ６は、予めのシミュレーション試験で求められたＡＴＰ抽出時間［差分ｔ６−ｔ５］［ｍｉｎ］に基づいて設定することもできる。ちなみに、ＡＴＰ抽出工程の開始時刻ｔ５［ｍｉｎ］は、液分注ノズル３１ａがその初期位置（ホームポジション）から試薬ホルダ６に向かって移動を開始する時刻であり、シミュレーション試験で求められるＡＴＰ消去時間［差分ｔ６−ｔ５］［ｍｉｎ］には、液分注ノズル３１ａが初期位置から移動し、回収容器２１にＡＴＰ抽出試薬を分注するまでの時間が含まれる。
次に、前記したように、時刻ｔ６［ｍｉｎ］に「回収容器の降温工程」が開始して（図２のステップＳ６参照）、時刻ｔ７［ｍｉｎ］に回収容器２１の温度が第１の温度（Ｔ１）に達すると、前記の温度制御機構９によって回収容器２１の温度は、第１の温度（Ｔ１）に維持されることとなる。これにより、回収容器２１の内容物の温度も第１の温度（Ｔ１）と等しくなる。
そして、前記のステップＳ５のＡＴＰの抽出工程で回収容器２１内に生成したＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−１）参照）は、前記の液分注装置３１によって回収されて、この第１の温度を維持しながら発光用チューブ３２ｂ（図１参照）に分注される（図２のステップＳ７参照）。そして、前記のとおり、このステップＳ７が行われることで、本実施形態に係る一連の生体物質回収方法の工程が終了し、その後、この工程に続いて、前記のＡＴＰ発光強度の測定工程（図２のステップＳ８参照）及び演算工程（図２のステップＳ９参照）が実施されることとなる。
次に、本実施形態に係る生体物質回収装置１、及び生体物質回収方法の奏する作用効果について説明する。次に参照する図４（ａ−１）から（ａ−３）は、本発明の実施形態における生体物質回収方法が実施される際の、回収容器内の液位を示す回収容器の断面図である。図４（ｂ−１）から（ｂ−３）は、図４（ａ−１）から（ａ−３）に対応する場面でのフィルタ近傍の様子を拡大して示す模式図である。
なお、図４（ｂ−１）から（ｂ−３）中、符号Ｂで示される微生物は、実際には、マイクロメーターサイズであり、ＡＴＰは、実際には分子レベルの大きさであって、図４（ｂ−１）から（ｂ−３）は、これらの相対的な大きさを示すものではない。
前記の微生物の回収工程（図２のステップＳ２）が開始される直前は、図４（ａ−１）に示すように、回収容器２１内は所定量（本実施形態では１０ｍＬであるがこれに限定されない）の液状試料８ａで満たされている。なお、図４（ａ−１）中、符号２６は、フィルタである。
そして、図４（ｂ−１）に示すように、フィルタ２６上に満たされる液状試料８ａには、微生物Ｂが含まれている。なお、図４（ｂ−１）中、符号２６ａは、前記のとおり親水性フィルタであり、符号２６ｂは、前記のとおり疎水性フィルタである。
ステップＳ２（図２参照）での濾過が終了してフィルタ２６上に微生物が回収されると、図４（ａ−２）に示すように、回収容器２１内は目視で空の状態となる。そして、フィルタ２６（２６ａ，２６ｂ）上には、図４（ｂ−２）に示すように、微生物Ｂが濾別されることとなる。
このステップＳ２の終了後、図示しない「ＡＴＰ消去工程」（図２のステップ３）、「回収容器の昇温工程」（図２のステップ４）が実施されると、図４（ａ−３）に示すように、回収容器２１内にＡＴＰ抽出試薬８ｃ（図１参照）が分注されて、微生物Ｂ（図４（ｂ−２））からＡＴＰが抽出される（図２のステップＳ５参照）。この際、回収容器２１内の液量は、図４（ａ−３）に示すように、ＡＴＰ抽出試薬８ｃの分注量に応じて増量する。
ちなみに、現実のＡＴＰ抽出試薬８ｃの分注量は僅かであり、作図の便宜上、図４（ａ−３）で示す液量は誇張して描いている。
そして、回収容器２１内には、図４（ｂ−３）に示すように、微生物（生菌）から抽出されたＡＴＰが含まれるＡＴＰ抽出液８ｄが生成することとなる。ちなみに、酵素系であるＡＴＰ消去試薬は、界面活性剤系であるＡＴＰ抽出試薬８ｃ（図１参照）と接触することで失活することとなる。これにより、ステップＳ３で使用されるＡＴＰ消去試薬が、ステップＳ８（図２参照）でのＡＴＰ発光強度の測定に影響を与えることは殆どない。
以上のような本実施形態の生体物質回収装置１及び生体物質回収方法によれば、ＡＴＰの抽出工程（図２のステップＳ５参照）を所定の昇温下（前記第２の温度）に行うので、液状試料８ａ（図４（ａ−１）参照）に含まれる微生物Ｂ（図４（ａ−１）参照）の種類にかかわらずに、当該微生物ＢのＡＴＰ抽出試薬８ｃ（図１参照）に対する耐性を低下させることができる。
これにより、微生物Ｂの細胞膜がＡＴＰ抽出試薬８ｃで破壊され易くなって、本実施形態の生体物質回収装置１及び生体物質回収方法は、従来よりも当該微生物ＢからのＡＴＰの抽出効率を一段と高めることができる。
したがって、本実施形態の生体物質回収方法を適用した生体物質の定量方法は、従来よりも精度よく高感度にＡＴＰを定量することができる。
また、本実施形態の生体物質回収装置１及び生体物質回収方法によれば、前記の第２の温度よりも低く、常温よりも高い第１の温度のもとで、液状試料８ａ（媒体）から微生物を回収するので（図２のステップＳ２参照）、液状試料８ａでの微生物Ｂの生理活性の低下が抑制される。
これにより、微生物Ｂに含まれるＡＴＰ量を維持することができるので、後のＡＴＰの抽出工程（図２のステップＳ５参照）において、ＡＴＰの回収量（収率）の低下を防止することができる。
したがって、本実施形態の生体物質回収方法を適用した生体物質の定量方法は、従来よりも精度よく高感度にＡＴＰを定量することができる。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は前記実施形態に限定されず、種々の形態で実施することができる。
前記実施形態では、回収容器２１の昇温工程（図２のステップＳ４参照）が実施される際に、第１加熱手段１０による発熱量を利用しているが、本発明では、第２加熱手段１２で加熱されたＡＴＰ抽出試薬８ｃを回収容器２１内に分注することで、微生物Ｂ（図４（ｂ−２）参照）が第２の温度となるように制御され（昇温され）、この第２の温度のもとに微生物ＢからＡＴＰが抽出される構成とすることができる。
また、前記実施形態では、第１加熱手段１０及び第２加熱手段１２として、ヒータ等の利用を想定しているが、本発明ではこれに代えて冷却機能を併せ持つペルチェ素子を利用することができる。これにより、制御の目標温度に達する時間をより短縮することができる。
また、前記実施形態では、発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ抽出液８ｄ（図４（ａ−３）参照）に対してＡＴＰ発光試薬８ｂを分注して発光反応を行わせているが、本発明は発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ発光試薬８ｂに対してＡＴＰ抽出液８ｄを分注して発光反応を行わせる構成とすることもできる。
前記実施形態での微生物としては、例えば、コリネバクテリウム、ミクロコッカス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、セレウス菌、枯草菌等のグラム陽性菌、シトロバクター、大腸菌、緑膿菌、セラチア菌等のグラム陰性菌、コウジカビ、アオカビ、アズキイロカビ、カンジタ菌等の真菌等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
なお、本発明は、枯草菌等の芽胞形成菌に適用する場合には、前記した試薬にアミノ酸、糖等の栄養形細胞変換試薬を含めることができる。
また、前記実施形態では、生体物質としてＡＴＰを想定しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、微生物Ｂから抽出したＤＮＡ、ＲＮＡ、ＮＡＤ等の生体物質に適用することもできる。
また、前記実施形態では、生体物質に生体物質発光試薬を反応させた際の発光強度を測定することを想定しているが、本発明は生体物質に励起光を照射して生じさせた蛍光に基づいて生体物質の定量を行うこともできる。
また、生体物質としてグラム陰性菌の細胞膜に含まれるエンドトキシンを定量する場合には、生体物質発光試薬としては、リムルスを使用することができる。
また、前記実施形態では、「微生物を含む媒体」として液状試料８ａを想定しているが、「微生物を含む媒体」は、例えばゲル状担体とすることもできる。このゲル状担体は、例えば、空気中を浮遊する微生物をゲル状担体で捕集した後、これを回収容器２１内に配置した状態でバッファ液等を加えて液状試料８ａとすることもできる。
ちなみに、ゲル状担体としては、例えば、常温から昇温することでゲルからゾルに相変化する材料で形成されるものが挙げられる。この材料としては、３０℃以上、４０℃未満で液化するものが望ましく、中でも、ゼラチン、ゼラチンとグリセロールの混合物、及びＮ−アクリロイルグリシンアミドとＮ−メタクリロイル−Ｎ´−ビオチニルプロピレンジアミンとの１０：１のコポリマーがさらに望ましい。
１ 生体物質回収装置
２ 濾過装置
３ 定量機構
５ 処理ステージ
５ａ 回収容器搭載部
６ 試薬ホルダ
７ 筐体
８ａ 液状試料（媒体）
８ｂ ＡＴＰ発光試薬
８ｃ ＡＴＰ抽出試薬（生体物質抽出試薬）
８ｄ ＡＴＰ抽出液
９ 温度制御機構
１０ 第１加熱手段
１１ 第１温度センサ
１２ 第２加熱手段
１３ 第２温度センサ
２１ 回収容器
２２ 昇降機構
２３ 吸引ヘッド
２４ 吸引ポンプ
２５ 本体
２６ フィルタ
２６ａ 親水性フィルタ
２６ｂ 疎水性フィルタ
３１ 液分注装置（分注機構）
３１ａ 液分注ノズル
３１ｂ 分注ポンプ
３１ｃ アクチュエータ
３２ 発光強度測定ユニット
３２ａ 光検出部本体
３２ｂ 発光用チューブ
３４ 制御部
３４ａ アクチュエータ制御部
３４ｂ 流量制御部
３４ｃ 温度検出信号入力部
３４ｄ 吸引ポンプ制御部
３４ｅ 昇降機構制御部
３４ｆ 演算部
３４ｇ 温度制御部
Ｐ１ 配管
Ｂ 微生物

Claims (4)

  1. 微生物のＡＴＰを回収する生体物質回収方法であって、
    前記微生物を含む媒体から当該微生物を当該微生物の生理活性の低下が抑制される一定の第１の温度のもとで回収する回収工程と、
    この回収工程によって回収した前記微生物の細胞外に存在する遊離の前記ＡＴＰを一定の温度のもとで予め消去する消去工程と、
    この消去工程が行われた後、前記微生物を、前記第１の温度及び前記消去工程の温度よりも高い一定の第２の温度になるように昇温させる昇温工程と、
    一定の前記第２の温度のもとで前記微生物から前記ＡＴＰを抽出する抽出工程と、
    前記微生物から抽出した前記ＡＴＰを含む抽出液を、前記第２の温度よりも低い温度に降温する降温工程と、
    前記抽出液の所定量を前記第２の温度よりも低い温度のもとで回収する抽出液回収工程と、
    を有することを特徴とする生体物質回収方法。
  2. 請求項１に記載の生体物質回収方法において、
    前記抽出液回収工程は、前記第１の温度が所定の時間維持される保温下に行われることを特徴とする生体物質回収方法。
  3. 微生物のＡＴＰを回収する生体物質回収装置であって、
    前記微生物を含む媒体から当該微生物を回収するとともに、当該微生物から前記ＡＴＰを抽出する回収容器と、
    この回収容器の温度を制御する温度制御機構と、
    を備え、
    前記温度制御機構は、前記媒体から一定の第１の温度で回収され、生理活性の低下が抑制された状態の前記微生物の細胞外に存在する遊離の前記ＡＴＰを一定の温度のもとで予め消去した後に、前記第１の温度よりも高い一定の第２の温度で当該微生物から前記ＡＴＰが抽出されるように前記回収容器の温度を制御し、
    さらに、前記微生物から抽出した前記ＡＴＰを含む抽出液の所定量が前記第２の温度よりも低い温度で回収されるように前記回収容器の温度を制御することを特徴とする生体物質回収装置。
  4. 請求項３に記載の生体物質回収装置において、
    前記温度制御機構は、前記ＡＴＰを含む抽出液の所定量が回収される際に、前記第１の温度が所定の時間維持されるように前記回収容器の温度を制御することを特徴とする生体物質回収装置。
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