JP4690787B2 - 微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法に係り、特に、大気中に浮遊する微生物を捕集してその微生物を検知する微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法に好適なものである。

室内の空中浮遊菌を捕集する従来のポータブル型空中浮遊菌サンプラとして、特開２０００−１２５８４３号公報（特許文献１）に開示されたものがある。このポータブル型空中浮遊菌サンプラは、大気中に浮遊する微生物などによる汚染状態を調べ管理するために用いられるものであり、複数孔を有するノズルと、該ノズルを保持するノズル保持部材と、前記ノズルの下流に位置し培地を収納するシャーレを支持するシャーレ支持部と、空気流を形成するファンとを有するものである。このポータブル型空中浮遊菌サンプラを用いて大気を吸引し、シャーレに設けた培地に微生物を高速で衝突させて培地上に微生物を捕集するようになっている。

また、取り扱いが容易で安価、かつ試料から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化できる分析チップを備えた従来の小型・可搬式の分析装置として、特開２００５−６５６０７号公報（特許文献２）に開示されたものがある。この分析装置に用いる遺伝子処理チップは、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、試料と溶解液とを混合した液が導入され、遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、溶離液により溶離された遺伝子が導入される反応部と、を備えて構成されている。

その分析方法は次の通りである。まず、試料にカオトロピックイオンを含む溶液を混合し、対象となる遺伝子を包んでいるウィルスや細胞の膜をカオトロピックイオンの働きにより溶解して破壊する。溶解後の混合物にシリカを加え、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカを特異的に結合させる。この遺伝子−シリカ結合物を高濃度のエタノールで洗浄して試料に含まれる蛋白質やカオトロピックイオンを除去する。洗浄後に、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカ結合物に加え、遺伝子をシリカから溶離する。この溶離した遺伝子にプライマ、ＤＮＡ合成酵素および四種類の基質（ｄＮＴＰ）等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子を増幅する。予め上記試薬と共に蛍光色素を注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出する。

特開２０００−１２５８４３号公報 特開２００５−６５６０７号公報

上述した特許文献１には、ポータブル型空中浮遊菌サンプラを用いて、シャーレに設けた培地上に微生物を捕集することが開示されているが、この培地上に捕集した微生物を検知する方法については開示されていない。特許文献１ではシャーレに設けた培地上に微生物を捕集することから考えて、この培地上で微生物を培養して微生物が増殖するかを観察する、いわゆる培養法による検知方法が用いられると見受けられるが、その場合には、微生物の培養に通常２〜７日間と長期間を要するという問題がある。

近年では、微生物の遺伝子を増幅し、その遺伝子を検出することで目的微生物の有無を早期に判別する遺伝子検知方法も取り入れられている。例えば、炭そ菌やセレウス菌などの細菌は、周囲に水分が少なく、栄養が枯渇した状況になると、数時間内で芽胞を形成する。この芽胞は、非常に固い殻状の物質であり、熱、化学物質、紫外線等に強い抵抗力を持つため、適切な芽胞の処理が必要である。しかしながら、この芽胞処理や細菌からの遺伝子抽出の工程が、従来ではすべて手操作で行われていたため、操作が非常に煩雑で検査者が限定される上に、検査者に感染の恐れがあること、さらには手操作で使用する反応容器やピペット等がすべて汚染された廃棄物となり、二次汚染の恐れも懸念されると共に、手操作による分析精度の不安定化を招くおそれがあった。

一方、特許文献２の分析装置に用いられる遺伝子処理チップは、遺伝子を含む試料が注入口より供給されて用いられるものである。従って、この遺伝子処理チップは、試料を捕集する時から用いられるものではなく、捕集から遺伝子処理へ移行する操作上の使い勝手については配慮されていなかった。

また、特許文献２では、１つの遺伝子処理チップで全ての遺伝子処理工程を行うものであるため、遺伝子処理チップが大型化し、分析装置の大型化を招くと共に、高価になってしまうという問題があった。同一試料および同一の分析装置を用いて複数回の分析を行って分析精度を向上を図る場合に、全処理工程を再度行うことが必要で分析に長時間かかってしまうと共に、高価な遺伝子処理チップを複数用いることによりコストアップが嵩むために、複数回の分析で分析精度を向上することが実用上困難となっていた。

本発明の目的は、使い勝手が良好で、迅速にしかも精度良く微生物の検知が可能な微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、使用する機器を小形、安価にしつつ、迅速および安全性を確保して精度良く微生物の検知が可能な微生物検知方法を提供することにある。

前述の目的を達成するための本発明の第１の態様は、大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した板状の基板とを備えた微生物検知チップであって、前記基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、前記捕集材は、濃度が２〜５％の寒天であり、且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されており、前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部に接続されている構成としたものである。

係る本発明の第１の態様におけるより好ましい具体的構成例は次の通りである。
（１）前記捕集材収納部は、微生物を含む大気を取り入れる開口面を有する浅い凹部で形成されると共に、その開口面に対向する底部に前記捕集材を収納し、前記開口面は前記捕集材に微生物が付着された状態でシール材により封止されていること。
（２）前記（１）において、前記試薬保管槽から前記捕集材収納部に試薬が送液される状態における前記捕集材収納部の上部が外部に開口する空気穴に連通されていること。
（３）前記捕集材収納部は前記基板の中央部に配置され、前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されていること。
（４）前記（３）において、前記複数の試薬保管槽は、細長い微細流路で形成され、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になるチップポートに接続されていること。
（５）細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知用として用いられるものであり、前記試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する試薬保管槽と、細胞壁破壊液を保管する試薬保管槽と、カオトロピックイオンを保管する試薬保管槽とを有すること。
（６）前記基板および前記捕集材を焼却可能な素材で形成されていること。

また、前述の目的を達成するための本発明の第２の態様は、捕集機と、捕集チップおよび分析チップからなる微生物検知チップと、分析装置とを備えた微生物検知システムであって、前記捕集チップは、大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した薄い板状の捕集チップ基板とを備え、前記捕集材は、濃度が２〜５％の寒天であり、且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されており、前記捕集チップ基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、前記捕集機は、前記捕集チップを装着した状態で、前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させるものであり、前記分析チップは薄い板状の分析チップ基板を備え、前記分析チップ基板は、前記捕集チップで前処理された試料を貯留する試料溜めと、微生物の検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、前記分析装置は、前記捕集チップを設置した状態で前記捕集チップによる前処理を行わせると共に、前記分析チップを設置した状態で前記分析チップによる後処理を行わせるものである。

係る本発明の第２の態様におけるより好ましい具体的構成例は次の通りである。
（１）前記捕集機と前記分析装置とは兼用して構成されていること。
（２）前記捕集機は、大気を導入するためのノズルと、このノズルの出口側に設けられた捕集室と、前記捕集チップを着脱する機構と、捕集室に導かれた空気を上記ノズルと反対側に排気するための排気部とを有するものであり、前記ノズル孔の内径は４〜１５ｍｍの範囲内にあること。
（３）前記分析チップが前記分析装置に縦置きに設置されること
（４）前記捕集チップの複数の試薬保管槽は、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になる複数のチップポートに接続され、前記分析装置は、前記捕集チップの各チップポートに接続される複数の流路を有する分析装置基板と、前記分析装置基板の複数の流路から前記捕集チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給する流体供給機構とを備えていること。
（５）前記（４）において、前記分析チップの複数の試薬保管槽は外部との接続口になるチップポートに接続され、前記分析装置基板は前記分析チップの各チップポートに接続される複数の流路を有し、流体供給機構は前記分析装置基板の複数の流路から前記分析チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給するように構成されていること。

また、前述の目的を達成するための本発明の第３の態様は、濃度が２〜５％の寒天であり且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、微生物を付着された前記微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知処理を行う微生物検知方法である。

さらには、前述の別の目的を達成するための本発明の第４の態様は、濃度が２〜５％の寒天であり且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた第１の微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、微生物を付着された前記第１の微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第１の微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知前処理を行い、試料溜めと検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽と反応槽とを備えた第２の微生物検知チップを前記試料溜めに前記検知前処理をした試料を充填した状態で分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第２の微生物検知チップの試料溜めの試料および複数の試薬保管槽内の試薬を前記反応槽に順次供給することにより微生物検知後処理を行う微生物検知方法である。

係る本発明の第４の態様におけるより好ましい具体的構成例は次の通りである。
（１）細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知を行うものであり、第１の微生物検知チップにおける前処理は発芽促進剤を保管する工程と細胞壁の溶解を行う工程とからなり、第２の微生物検知チップにおける後処理は細胞壁が溶解された遺伝子を遺伝子結合担体に結合させる工程と遺伝子−遺伝子結合担体結合物を洗浄する工程と遺伝子を遺伝子結合担体から溶離する工程と溶離した遺伝子を検出する工程とからなること。

本発明によれば、使い勝手が良好で、迅速にしかも精度良く微生物の検知が可能な微生物検知チップ及び微生物検知システム並びに微生物検知方法を提供することができる。

また、本発明によれば、使用する機器を小形、安価にしつつ、迅速および安全性を確保して精度良く微生物の検知が可能な微生物検知方法を提供することができる。

以下、本発明の複数の実施形態について説明する。なお、本発明は、各実施形態に開示した形態に限られるものではなく、公知技術などに基づく変更を許容するものである。
[第１実施形態]
本発明の第１実施形態を図１から図１４を用いて説明する。本発明の第１実施形態として、芽胞を形成した細菌を大気中から捕集し、芽胞を処理した後に細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。ここで、芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌、クロストリディウム属菌等の細菌であることができる。
(細菌検知の流れ)
第１実施形態の細菌の検知方法は、大きく分けて、細菌を捕集する工程と、細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程と、遺伝子を増幅・検出する工程と、からなっている。ここで、遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ，次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。

図１を参照して、第１実施形態の細菌の検知方法を説明する。図１は本発明の第１実施形態の細菌の検知方法の手順を示すフローチャート図である。

ステップ１において、衝突法による細菌の捕集を行う。具体的には、ここで用いる衝突法は、検知の対象となる空気をノズルの入口から吸引してノズルの出口から高速で噴出させ、ノズルの出口側に設けた衝突板である捕集材に細菌を捕集する方法である。空気中の細菌は、その粒径の２乗に比例した慣性力を得て、衝突板に付着する。この捕集方法によれば、フィルタ法のように目詰まりを起こさず、細菌が濃縮されて集まるという利点がある。

次に、ステップ２において、細菌芽胞の発芽を行う。具体的には、捕集した細菌（試料）の細菌芽胞に発芽促進剤を加え、所定時間が経過すると、細菌芽胞が発芽を開始する。発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。

次に、ステップ３において、細胞壁及び細胞膜の溶解を行う。細菌は細胞壁と細胞膜との二重構造から成る。先ず、試料に特定の酵素を加え、細菌の細胞壁を壊す。次に、試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−１価の陰イオン）を含む溶液を混合し、細菌の細胞膜をカオトロピックイオンの働きにより溶解して破壊する。また、カオトロピックイオンは、同時に、試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。

次に、ステップ４において、遺伝子の捕獲を行う。具体的には、溶解後の混合物にシリカを加える。シリカを加えると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合し、遺伝子−シリカ結合物となる。一般的には、溶解後の混合物をガラスフィルタに通すことにより、遺伝子とシリカとを結合する方法が用いられる。

次に、ステップ５において、遺伝子−シリカ結合物の洗浄を行う。具体的には、試料に含まれる蛋白質やカオトロピックイオンが遺伝子の抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカ結合物を洗浄する操作が必要となる。通常では高濃度のエタノールにより洗浄する。遺伝子はこれらの溶液に溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。

次に、ステップ６において、遺伝子をシリカから溶離する。具体的には、洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカ結合物に加え、遺伝子をシリカから溶離する。

次に、ステップ７において、溶離した遺伝子の検出を行う。具体的には、溶離した遺伝子に、プライマ（目的とするＤＮＡ領域の両末端の２０塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖DNA）、DNA合成酵素（ポリメラーゼ）及び四種類の基質（ｄＮＴＰ）等の試薬を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかける。これによって、遺伝子は増幅する（ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで、上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。
（検知システムの構成、動作）
第１実施形態の検知システムの構成、動作を図２を用いて説明する。図２は本発明の第１実施形態の細菌検知システムの構成を示す図である。

検知システムは、捕集機１００、微生物検知チップ（２００、３００）、および分析装置４００から構成される。微生物検知チップは、第１のチップでる捕集チップ２００と第２のチップである分析チップ３００とから構成されている。

図１のステップ２（芽胞の発芽）からステップ３（細胞膜の溶解）までの処理に用いる複数の試薬が予め内蔵されている捕集チップ２００を捕集機１００にセットする。大気中に浮遊する細菌を捕集機１００により吸引し、捕集機１００にセットされた捕集チップ２００の捕集材２０１（図５及び図６参照）に細菌を捕集する。この捕集チップ２００を捕集機１００から取り出して捕集チップ２００の捕集材収納部２０３（図５及び図６参照）の開口をシール材で閉塞し、或いはこの捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞してから捕集機１００から取り出し、分析装置４００にセットする。すなわち、捕集材に微生物を付着した状態で前記開口面をシール材で封止してなる捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。このように捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞して取り扱うことにより、捕集チップ２００を安全に取り扱うことができる。分析装置４００には送液手段が備えられており、捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で、捕集チップ２００内の試薬を送液し、捕集チップ２００の中で細菌芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う。

このように、複数の試薬が予め内蔵された捕集チップ２００を用いて細菌を捕集し、細菌を捕集した捕集チップ２００をそのまま用いて次の複数の微生物検知処理に移行できるので、使い勝手良く捕集から微生物検知処理に移行できる。

次いで、捕集チップ２００を分析装置４００から取り出し、捕集チップ２００で処理された液（既に細菌は溶解して破壊されているため、触れても汚染されることはない）の一部を分析チップ３００に移す。

この分析チップ３００を分析装置４００にセットする。この時、分析チップ３００は捕集チップ２００がセットされた部位と同じ場所にセットされるようになっている。ここで、分析チップ３００には図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの処理で用いる試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００の送液手段により分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までを行う。そして、分析終了後、分析チップ３００を分析装置４００から取り出し、分析チップ３００を廃棄する。

このように、２種類の微生物検知チップ（捕集チップ２００、分析チップ３００）の中に、細菌の前処理から検出に至るまでの工程に必要な試薬が全て予め内蔵されており、従来から行われている煩雑な試薬操作を省略化することができる。すなわち、従来の検知工程では、試料である細菌に試薬を加えて処理をした後に別の容器に移し、といった具合に試料がいくつもの容器を介して動いていくため、煩雑かつ検査者に汚染の恐れがあった。しかしながら、この第１実施形態によれば、２種類のチップ２００、３００間での試料の受け渡しの工程以外は、試料がチップから出ることはなく、閉じられた系において分析がおこなわれるため、非常に安全である。また、廃棄物はチップ２００、３００のみとすることができ、そのチップ２００、３００を焼却可能な素材にしておくことで、二次汚染の危険性を低減することができる。さらに、２種類のチップ２００、３００に内蔵される試薬は、一検査分のみであり、チップ２００、３００は使い切りとすることができることから、屋外で簡便に遺伝子レベルの高精度な細菌検査を行うことができる。

しかも、試薬を内蔵した２種類のチップ２００、３００を細菌の捕集から溶解までを処理するチップ２００とそれ以後の分析の処理をするチップ３００とに分けているので、捕集から溶解までの処理が同一である試料を用いて複数回の分析が容易となり、安全性を確保しつつ、分析精度の向上を容易に図ることができる。
（捕集機の構成、動作）
図３及び図４を参照して捕集機１００の構成、動作を具体的に説明する。図３は本発明の第１実施形態に係る捕集機１００の透視斜視図、図４は図３の捕集機１００に捕集チップ２００を装着する方法を示す斜視図である。ここで、図４（ａ）は捕集機１００の蓋部１１０及びチップ支持部１３０を開いた状態を示す図、図４（ｂ）は図４（ａ）から捕集チップ２００を装着して支持部１３０を閉じた状態を示す図である。

捕集機１００は、図３に示すように、蓋部１１０、ノズル部１２０、一次フィルタ１２１、チップ支持部１３０、二次フィルタ１４０、支持板１５０、ファンモータ１６０、排出口１７０、制御部１８０、表示部１８１、バッテリ１８５およびケーシング１９０を備えて構成されている。

蓋部１１０はノズル部１２０を有する正方形または短形の部材からなり、両側面に固定手段１１１を有する。ノズル部１２０の内径は捕集効率に大きく関係する。ノズル１２０の内径を１０［ｍｍ］より小さくするほど、細菌を濃縮して捕集することができるが、ノズル部１２０を通過する空気流速が増大するため、圧力損失が増加する。圧力損失は、空気流速の２乗に比例して増加する。それにより、ファンモータ１６０の負荷が増加し、バッテリ１８５の電圧が低下する。例えば、ノズル部１２０の内径を３［ｍｍ］以下とすると、可搬型の細菌捕集機１００に搭載可能なバッテリ１８５（リチウムー水素）で駆動可能な仕事量を超える。従って、ノズル部１２０の内径Ｗは４〜１５［ｍｍ］が適当である。より好ましくは、ノズル部１２０の内径Ｗを８〜１２［ｍｍ］にすると良い。これにより、高い捕集効率を得ながら、ノズル部１２０の直下に細菌を濃縮して捕集することができる。

ノズル部１２０には一次フィルタ１２１が装着されている。一次フィルタ１２１は、大気中の粗大粒子をトラップするために設けられている。したがって、その目開きは１００〜２００μｍが望ましい。花粉の飛散量が増加する時期には、目開きが１０〜１００μｍであることが望ましい。それにより、粒子径１０μｍ以上の花粉と粒子径１０μｍ未満の細菌とを簡便に分級することができる。一次フィルタ１２１は、蓋部１１０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製またはフッ素樹脂製が好ましい。

チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０の上（前方）に設置されている。チップ支持部１３０は、図４に示すように開閉式になっており、捕集チップ２００を挟んで蓋を閉めることで捕集チップ２００を容易に捕集機１００にセットすることができる。チップ支持部１３０は捕集チップ２００のいわば外周に相当するため、細菌が付着しやすい。よって、チップ支持部１３０は、二次フィルタ１４０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製またはフッ素樹脂製とすることが好ましい。

二次フィルタ１４０は、支持板１５０に設置され、捕集チップ２００で捕集できなかった細菌等の微粒子が排出口１７０から大気中に放出されることを防止するために設けられている。二次フィルタ１４０には、０．３μｍ以上の微粒子を９９．９７％以上捕集可能なHEPA（High Efficiency Particulate Air）フィルタを使用することが好ましい。また、０．１〜０．２μｍの微粒子を９９．９９９％以上捕集可能なULPA（Ultra Low Penetration Air）フィルタを使用することが更に好ましい。ULPAを用いることにより、排出口１７０から大気に放出する空気の清浄度を更に上げることができる。

ケーシング１９０内には、制御部１８０、表示部１８１、およびバッテリ１８５が設けられている。ケーシング１９０の上面には掴み部１９１が設けられている。

次に、捕集機１００の動作を説明する。ファンモータ１６０を駆動すると、大気はノズル部１２０に吸引される。吸引された大気はノズル部１２０によって加速され、一次フィルタ１２１を通過する。このとき、一次フィルタ１２１によって空気中の粗大粒子が除去される。蓋部１１０内に導入された空気中の微粒子は、捕集チップ２００の中央に設けた捕集材２０１に慣性衝突して付着する。蓋部１１０内に導入された空気は二次フィルタ１４０を通過し、ファンモータ１６０の下部の排出口１７０より外部へ排出される。二次フィルタ１４０によって、捕集チップ２００に捕集されなかった微粒子が除去される。
（捕集チップの構成、動作）
図５及び図６を参照して捕集チップ２００の構成、動作を具体的に説明する。図５は本発明の第１実施形態に係る捕集チップ２００の正面図、図６は図５の捕集チップ２００の縦断面図である。

捕集チップ２００は、図１におけるステップ１（細菌の捕集）からステップ３（細胞膜の溶解）までを担う。すなわち、まず、捕集チップ２００を捕集機１００にセットして細菌を捕集した後（ステップ１）、捕集チップ２００を捕集機１００から取り外し、捕集チップ２００を分析装置４００にセットして、芽胞の発芽処理（ステップ２）から細胞膜の溶解処理（ステップ３）までの処理工程を行う。

捕集チップ２００はチップの構成要素をかたどるパターンをフォトリソグラフィー技術を用いて作製される。すなわち、捕集チップ２００はこのパターンを樹脂に転写成形することにより成型される。このパターンの大部分は微細流路であり、微細流路を形成した２枚の樹脂を張り合わせることで、樹脂に刻まれたパターンが流路となる。チップの材料としては、加工費用が高くまた割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂のほうが好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、この第１実施形態では、以下の優れた特性を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製，シルポット184）を使用した。
・生体適合性が良好である（通常のシリコンゴムは生理的に不活性である）。
・サブミクロンの精度で型の転写が可能である（硬化前は低粘度で流動性に富むため，複雑な形状の細部まで良好に浸透する）。
・低コストである（従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックス（登録商標）ガラスよりも一般的に安価である）。
・焼却により容易に廃棄可能である。

捕集チップ２００は、大気中から微生物（本実施形態では芽胞を形成した細菌）を付着して捕集する捕集材２０１と、この捕集材２０１を装着した薄い板状の基板２０２とを備えて構成されている。この捕集チップ２００は、捕集材２０１を収納する捕集材収納部２０３と、複数の試薬保管槽（２１０、２２０、２３０、２４０）チップ背面に開口されたチップポート２１１、２２１、２３１、２４１と、チップ正面に開口された空気穴２５０とを有している。

複数の試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する発芽促進剤保管槽２１０と、２種類の細胞壁溶解液を保管する酵素Ａ保管槽２２０及び酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピックイオンを保管するカオトロピック保管槽２４０とを有している。そして、複数の試薬保管槽２１０〜２４０は、捕集材収納部２０３の周囲を取り囲むように配置されている。これによって、基板２０２をコンパクトなものとすることができる。

試薬保管槽２１０〜２４０は細長い流路によって構成されている。いずれの試薬保管槽２１０〜２４０も、細長い流路形状とすることが好ましい。試薬保管槽２１０〜２４０内の試薬を送液するために、試薬保管槽２１０〜２４０の背後から気体を試薬保管槽２１０〜２４０に送る。このとき、試薬保管槽２１０〜２４０が細長い流路形状でなかった場合、気体の通り抜けやすい部位のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬保管槽に残るためである。消費する試薬の量を減らすために、試薬保管槽２１０〜２４０を細長い流路形状にするのは効果的である。流路の断面形状は特に限定されないが、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れる恐れがある。試薬保管槽２１０〜２４０の細長い流路は、蛇行状に形成されている。これによって、基板２０３における流路の占有面積を小さなものとしつつ、流路における試薬の保管容量を確保することができる。

試薬保管槽２１０〜２４０の一端は捕集材収納部２０３に連通して接続され、試薬保管槽２１０〜２４０の他端はチップポート２１１〜２４１に連通して接続されている。試薬保管槽２１０〜２４０の一端側および他端側にそれぞれ堰２０４が設けられている。これにより、各試薬保管槽２１０〜２４０の保管される試薬の流出をより確実に防止することができる。チップポート２１１〜２４１は、外部の流路との接点を構成する。具体的には、発芽促進剤保管槽２１０、酵素Ａ保管槽２２０、酵素Ｂ保管槽２３０及びカオトロピック保管槽２４０は、いずれも、捕集材収納部２０３と連通されている。従って、捕集材収納部２０３は、発芽促進剤保管槽２１０、酵素Ａ保管槽２２０、酵素Ｂ保管槽２３０及びカオトロピック保管槽２４０、およびチップポート２１１〜２４１を介して外部の流路に接続されている。なお、試薬保管槽２１０〜２４０の流路幅を１０〜５０μｍまで狭めることで、捕集材収納部２０３の側からの空気の流入を防ぐことができる。

発芽促進剤保管槽２１０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ａ保管槽２２０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ｂ保管槽２３０の体積は５〜２０μＬ、カオトロピック保管槽２４０の体積は４００〜８００μＬが好ましい。カオトロピックイオンの体積が、発芽促進剤と２種類の細胞壁溶解液の体積の和の２倍以上とすることで、細胞膜の破壊が促進される。より好ましくは４倍以上、最適なのは、８倍以上である。

捕集材２０１として寒天が好適である。寒天の特徴は、ゲル表面の自由水（ゲル網目間の水）由来の「付着性」を有することである。寒天濃度は２〜５％にするのが好適であり、寒天濃度３〜４％が最適である。寒天濃度が２％未満では水分が多いため、高速の空気が当たり続ける捕集材２０１として強度不足である。一方、寒天濃度が６％より大きいと、寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が著しく低下する。

寒天の強度を上げ、かつ水分の蒸発を防止するため、アルコール類を添加すると良い、このアルコール類は凍結防止、乾燥防止、ゲル強化剤として作用する。具体的には、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、1，３−ブタンジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどが挙げられる。アルコール類の添加量は、寒天の４０〜８０％、好ましくは５０〜７０％が好ましい。アルコール類が４０％未満では、水分の蒸発防止が十分でない。また、８０％を超えると寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が低下する。

捕集チップ２００の使用方法の一例を具体的に説明する。

捕集チップ２００を捕集機１００のチップ支持台に取り付けて、所定時間大気を吸引する。大気の吸引量は、例えば約１０００Ｌである。大気中の細菌は捕集チップ２００の捕集材２０１表面に付着する。次に、捕集チップ２００をチップ支持台から外し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３の開口面をシール材で封止した後に捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。捕集材収納部２０３の封止は、手動でも良いが、捕集機１００にシール機構がついていることがより好ましい。捕集材収納部２０３の封止により、細菌が捕集チップ２００の外部に露出することがなくなり、より安全となる。

捕集チップ２００の試薬保管槽２１０〜２４０はチップポート２１１〜２４１を介して分析装置４００の流路と接続されているので、分析装置４００の流路側から所定の制御動作で空気をチップポート２１１〜２４１を介して供給することにより、試薬保管槽２１０〜２４０に予め封入された発芽促進剤、細胞壁溶解液、細胞膜溶解液、およびカオトロピックイオンが所定時間ごとに捕集材収納部２０３内（捕集材２０１上）に送液される。捕集材収納部２０３の正面は封止されているが、空気穴２５０が捕集材収納部２０３の一部に連通しており、空気穴２５０は大気開放となっているので、試薬の送液の際に捕集材２０１の上（捕集材収納部２０３内）に存在する空気は空気穴２５０より放出される。特に、各試薬の送液時に空気穴２５０が捕集材収納部２０３の上部に連通しているため、捕集材収納部２０３内の空気は確実に放出することができる。

かかる試薬保管槽２１０〜２４０から捕集材２０１へ試薬を送液することについての詳細を説明する。

まず、捕集材２０１に発芽促進剤を１００μＬ送液する。ここで、発芽促進剤としては、アラニン、アデノシン、グルコースを含むブイヨンが好ましい。特にＬ−アラニンを１ｍＭ〜１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。そして、１０分以上を経過すると、細菌芽胞が発芽を開始し、３０分間経過すると、全体の５０％以上が発芽する。よって、芽胞の発芽処理は３０分以上が好ましい。細菌芽胞を発芽させるのにより好ましいのは３５℃〜４０℃であり、最も好ましいのは３５℃〜３７℃である。細菌芽胞が発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。

次に、細菌の細胞壁を壊す２種類の蛋白質変性酵素Ａ、Ｂを順次捕集材２０１に送液し、至適温度に所定時間保持する。酵素処理の時間はそれぞれ１０分以上が望ましく、３０分が好適である。ここで蛋白質変性酵素としては、リゾチーム（至適温度：３７℃）１００μＬとプロテアーゼＫ（至適温度：５５℃〜６０℃）２０μＬが好適である。これらの酵素処理により、捕集チップ２００内の細菌は細胞膜がむき出しの状態になる。なお、発芽促進剤とリゾチームは同じタイミングで注入して処理することも可能であるが、リゾチームとプロテアーゼＫを同時に添加することは酵素活性が低下するため好ましくない。

最後に、カオトロピックイオン８００μＬを捕集材２０１に送液する。この送液により、細菌の細胞膜が破壊され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。ここで、カオトロピックイオンとしては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウムが挙げられる。捕集チップ２００の使用方法として、捕集チップ２００の冷蔵あるいは冷凍により試薬の活性を長期間維持する方法が考えられる。よって、捕集チップ２００に封入して冷蔵あるいは冷凍をした際に、組成の変化が極めて少ないグアニジン塩酸が好適である。

また、カオトロピック塩に界面活性剤や緩衝剤を含有させることが好ましい。界面活性剤として特に限定はされないが、ツイーン−２０やトリトンＸ−１００等が挙げられる。緩衝剤として特に限定はされないが、トリス−塩酸塩、リン酸２水素カリウム−４ホウ酸ナトリウム等が挙げられる。

以上の工程により、捕集チップ２００に捕集した細菌の芽胞および細胞壁を処理することができる。すなわち、図１におけるステップ２〜３までをチップ上で自動化することができるため、試薬の分注操作を省略することができる。捕集チップ２００は細菌の捕集から前処理までの工程を担い、分析チップ３００は細菌遺伝子の分析の工程を担う。分析の精度を上げるために、同一の試料に対して複数回の分析、或いはターゲットの細菌を複数設定するためには、１枚の捕集チップ２００で処理した試料を複数の分析チップ３００に分配して分析する方が好適であり、２種類のチップ２００、３００を供している。

なお、この捕集チップ２００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で捕集チップ２００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。
（分析チップの構成、動作）
図７から図１０を参照して分析チップ３００を具体的に説明する。図７は本発明の第１実施形態に係る分析チップ３００の正面図、図８は図７のＡ−Ａ’断面図である。なお、図８は分析チップ３００を縦置きにしたときの断面図である。

分析チップ３００は、図１におけるステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までを担う。捕集チップで処理された液の一部を移した状態の分析チップを分析装置４００にセットする。分析チップ３００には、図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの処理に用いられる試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００には送液手段を動作させて分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う。なお、分析チップ３００の素材は捕集チップ２００と同様の樹脂である。

分析チップ３００は、チップ正面に開口された試料注入口３１０と、試料溜め３１５と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア３２０と、廃液槽３３０と、洗浄液Ａを保管する洗浄液Ａ保管槽３４０と、洗浄液Ｂを保管する洗浄液Ｂ保管槽３５０と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽３６０と、遺伝子増幅試薬Ａを保管する遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０と、遺伝子増幅試薬Ｂを保管する遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽３９０と、チップ背面に開口されたチップポート３１１、３３１、３４１、３５１、３６１、３７１、３８１とを有している。これらの試薬保管槽３４０〜３８０は捕集チップ２００の試薬の保管槽２１０〜２４０と同様に細長い流路によって構成されている。保管槽３４０〜３８０の流路の断面形状は特に限定されないが、捕集チップ２００の流路と同様、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れる恐れがある。この第１実施形態においては縦１ｍｍ、横１ｍｍで形成している。

試料溜め３１５、廃液槽３３０、および試薬保管槽３４０〜３８０の一端にはチップポート３１１〜３８１が形成されている。チップポート３１１〜３８１は、外部である分析装置４００の流路との接点を構成する。試薬保管槽３４０〜３８０内の試薬を送液するために、チップポート３４１〜３８１を介して分析チップ３００の外部である分析装置４００から空気を試薬保管槽３４０〜３８０に送る。この送る空気の代わりに、分析に支障のない水やその他の流体（例えば窒素ガス）を用いてもよい。

試料溜め３１５、洗浄液Ａ保管槽３４０、洗浄液Ｂ保管槽３５０、および溶離液保管槽３６０は、いずれも、遺伝子抽出エリア３２０と連通している。また、遺伝子抽出エリア３２０、遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０および遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０は、反応槽３９０に連通している。反応槽３９０の下部の拡大図を図９に示す。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０から反応槽３９０に送られた遺伝子増幅試薬Ａおよび遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０から反応槽３９０に送られた溶離液が一度反応槽３９０に入った後、試薬が逆流しないように流路が狭まっている局部的な突出部である堰３９２が設けられている。流路幅を１／１０〜１／２０に狭めるのが好適である。

試料溜め３１５の体積は１００〜２００μＬ、遺伝子抽出エリア３２０の体積は１００〜２００μＬ、洗浄液Ａ保管槽３４０の体積は８０〜２００μＬ、洗浄液Ｂ保管槽３５０の体積は２０〜５０μＬ、溶離液保管槽３６０の体積は１０〜２０μＬ、遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０の体積は１０〜２０μＬ、遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０の体積は２０〜３０μＬが好ましい。

遺伝子抽出エリア３２０に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール、ガラスウール、ガラスファイバー、ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを５０μｍ以下とするのが好ましく、流路への堰き止めを考慮すると２０〜３０μｍが最適である。遺伝子保持担体を堰きとめるために、遺伝子抽出エリア３２０を構成する流路中に１箇所以上の堰３２５を設けるのが好ましい。図１０に、堰３２５の構成の一例を示す。遺伝子抽出エリア３２０の流路中、流路幅を数箇所１０〜５０μｍまで狭めることで、狭められた流路が遺伝子結合担体に対して堰となる。流路を１０μｍ未満にすると流体抵抗が大きく流体制御が困難になる。よって、堰３２５としての流路幅は１０〜５０μｍが好適である。
（分析装置の構成、動作）
図１１から図１３を参照して分析装置４００の構成、動作を具体的に説明する。図１１は本発明の第１実施形態に係る分析装置４００の斜視透視図、図１２は図１１の分析装置４００の断面構成図、図１３は図１１の分析装置４００の基板４１０を示す図である。

分析装置４００は、大きく分けて、チップ設置部、流体系、温調系、そして光学検出系の４つから構成される。

捕集チップ２００および分析チップ３００がセットされるのは、前蓋４０１の内側に設けられた基板４１０である。この第１実施形態では、両チップ２００、３００を縦置きにセットするので、基板４１０の下部には、チップ２００、３００を止めるチップストッパ４１１が備えられる。チップ２００、３００を基板４１０にセットして前蓋４０１を閉めると、チップ２００、３００は基板４１０とチップホールダ４２０の間に固定される。基板４１０とチップホールダ４２０には、チップ２００、３００の温度を最適化するための温度制御機構４１５が内蔵されている。温度制御機構４１５としては、様々な発熱体が適用可能であるが、例えば、好ましいのはペルチェである。ペルチェを使用した場合、印加電流の向きを変えるだけでチップ２００、３００の昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。

チップ２００、３００をセットする基板４１０には、複数の基板流路４１２が設置されており、基板流路４１２の一端はチップ２００、３００のポート２１１〜２４１、３１１〜３８１に連通され、基板流路４１２の他端は装置内流路４０２に連通されている。基板４１０に予め複数の基板流路４１２が設置されることで、捕集チップ２００および分析チップ３００のいずれのチップポート２１１〜２４１、３１１〜３８１にも対応することでき、分析装置４００は捕集チップ２００と分析チップ３００のプラットフォームとなり得る。

複数の装置内流路４０２は、それぞれバルブ４３０を介してポンプ４４０に接続される。チップ２００、３００内のある試薬槽の試薬を送液するには、バルブ４３０を切り替えてその試薬槽に連通する流路のみに送風を行う。すなわち、ポンプ４４０によって送られた気体は選択された装置内流路４０２および基板４１０流路を経てチップ２００、３００内に到達し、試薬槽の試薬を送液する。試薬槽に予め所定量の試薬のみ内蔵されているので、試薬槽内の試薬をすべて時間管理で排出するのみでよく、ポンプ４４０の送液精度は求められない。よって、ポンプ４４０は、送風のみで吸引を行わない、簡素で小型なものを使用することができる。

このように流体を制御するバルブ４３０をチップの内部ではなく、分析装置４００側に設けることが好ましい。これにより、チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。

光検出系は、チップ反応槽３９０内の遺伝子に励起光を照射する光源４５０と、励起光の特定の波長のみを透過する励起フィルタ４５５と、チップ反応槽３９０から生じた蛍光の光路を変更するミラー４６０と、蛍光の特定の波長のみを透過する検出フィルタ４７５と蛍光を測定する光検出器４７０とから構成される。光源４５０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、波長領域の広いキセノンランプを用いることができる。また、波長が限定される場合には、ＬＥＤを使うこともできる。光検出器４７０としてはＣＣＤカメラ、光電子倍増管、フォトダイオード等を使用できるが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。光検出器４７０によって検出された遺伝子の光信号は光信号変換機４８０によってデジタル化され、データ表示画面４９０に信号強度が表示される。

そのほか、分析装置４００には各機器の制御を行う制御機構が備えられている。具体的には、分析装置４００に、バルブ４３０を制御するバルブ制御機構４３１、ポンプ４４０を制御するポンプ制御機構４４１、光源４５０を制御する光源制御機構４５１、光検出器４７０を制御する光検出器制御機構４７１が搭載されている。

第１実施形態では、機械部品を内蔵しない小型の分析チップ３００を基板４１０上に置いて簡便な光検出器４７０を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置４００を提供することが出来る。
（分析の手順）
図７、図１２、および図１４を参照しながら分析チップ３００と分析装置４００とを用いた分析の手順を説明する。図１４は本発明の第１実施形態の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。

分析チップ３００を用いた分析の手順としては、主に以下の手順を有することができる。

まず、捕集チップ２００で細胞壁が溶解された細菌試料を分析チップ３００に注入し、分析チップ３００内においてこの細菌試料を遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。

以下に、その分析手順の一例を具体的に説明する。なお、ステップ１０１〜１０４、１１１〜１１３の表示は図示されていない。

初めに、５種類の試薬、すなわち洗浄液Ａ、洗浄液Ｂ、遺伝子溶離液、遺伝子増幅試薬Ａ、遺伝子増幅試薬Ｂがそれぞれ洗浄液Ａ保管槽３４０、洗浄液Ｂ保管槽３５０、溶離液保管槽３６０、遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０、遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０に内蔵され、冷蔵あるいは冷凍保存しておいた分析チップ３００を室温で解凍する。分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、分析チップ３００を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。また、ユーザーは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この分析チップ３００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で分析チップ３００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。このように、使い捨て可能な分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップ３００を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる。（ステップ１０１）
分析チップ３００の解凍後、捕集チップ２００の処理液を分析チップ３００の試料注入口３１０に約１００μＬ移す。（ステップ１０２）
そして試料注入口３１０にカバーをして穴を塞ぐ。カバーは、分析チップ３００と同素材の薄い樹脂シートが好ましい。樹脂同士の密着性が良く、また安価であるため使い捨てに好適である。試料注入口３１０をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置４００側に試料注入口３１０を覆う機構が備わっているとより好ましい。（ステップ１０３）
次に、分析装置４００の前蓋４０１を開いて、前蓋４０１に設けられたチップガイドに沿って分析チップ３００を分析装置４００にセットした後、分析装置４００の前蓋４０１を閉める。これにより、分析チップ３００が基板４１０に固定され、チップポートと装置内流路４０２が連通する。なお、分析チップ３００は横置き、縦置きいずれでも可能であるが、ここでは縦置きの場合について述べる。（ステップ１０４）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて試料ポート３１１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３１１、３３１：開、他のポート：閉とし、図１４で開を白丸、閉を黒丸で示す）。ここで使用する流体は空気や窒素など試薬と接した時に試薬の活性が損なわれない気体であればよい。試料溜め３１５内の試料は遺伝子抽出エリア３２０に移動される。試料中のカオトロピックイオンの働きにより、試料中の細菌遺伝子は、遺伝子抽出エリア３２０に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア３２０を通過する時間は１０分以上が好ましい。そして、遺伝子抽出エリア３２０を通過した試料は廃液槽３３０に貯まる。送液用の気体は廃液ポート３３１に抜ける。なお、チップ３００を縦置きにすることで、試料が廃液ポート３３１から漏れるのを防ぐことができる。（ステップ１０５）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３１１を閉じ、洗浄液Ａポート３４１を開く。そして洗浄液Ａポート３４１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１、３４１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ａ保管槽３４０内の洗浄液Ａ２００μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで、洗浄液Ａとしては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩化水素、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。この洗浄液Ａにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留する蛋白質が除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ａは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０６）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３４１を閉じ、洗浄液Ｂポート３５１を開く。そして洗浄液Ｂポート３５１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１、３５１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ｂ保管槽３５０内の洗浄液Ｂ５０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで洗浄液Ｂとしては、５０％以上の高濃度エタノールや酢酸カリウム溶液が好ましい。この洗浄液Ｂにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留するカオトロピックイオンが除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ｂは廃液槽３３０に貯まる。（ステップ１０７）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３３１、ポート３５１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ａポート３６１および反応槽ポート３９１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ａポート３６１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３６１、３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ａ保管槽３７０内の遺伝子増幅試薬Ａ１０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。ここで遺伝子増幅試薬Ａとしては、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（ＴＲＩＳ塩酸、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）、プライマなどから構成される。送液用の気体は、反応槽ポート３９１に抜ける。（ステップ１０８）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３６１を閉じ、遺伝子増幅試薬Ｂポート３７１を開く。そして遺伝子増幅試薬Ｂポート３７１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３７１、３９１：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ｂ保管槽３８０内の遺伝子増幅試薬Ｂ３０μＬは、流体によって反応槽３９０に送液される。ここで遺伝子増幅試薬Ｂとしては、ＤＮＡ合成酵素（TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼなど）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（Molecular Probe製）、ＦＡＭ，ＲＯＸなど）などから構成される。（ステップ１０９）
次に、分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３７１を閉じ、溶離液ポート３８１を開く。そして溶離液ポート３８１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３８１、３９１：開、他のポート：閉）。溶離液保管槽３６０内の溶離液１０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。この溶離液により、遺伝子抽出エリア３２０の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。溶離した遺伝子は反応槽３９０に送液される。（ステップ１１０）
以上の手順により、分析チップ３００の反応槽３９０に細菌遺伝子と２種類の遺伝子増幅試薬が導入される。反応槽３９０内の細菌遺伝子を増幅・検出するために、温度制御機構４１５を駆動し、反応槽３９０の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける。（ステップ１１１）
温度サイクル例としては、下記の程度を実施する。
「９０〜９５℃１０〜３０秒⇔６５〜７０℃１０〜３０秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「９４℃３０秒⇔６８℃３０秒」×４５回
温度サイクルをかけながら、光源４５０からの励起光を反応槽３９０に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると，吸収した光源４５０の光エネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果，蛍光色素は励起こされて蛍光を発する。すなわち、試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器１８１により反応槽３９０内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる。なお、分析チップ３００を分析装置４００に縦置きにセットすることにより、温度サイクル中の反応物質の一部が蒸発し、蒸気が反応槽３９０上部に滞留しても、蛍光を検出する反応槽３９０の側面は蒸気によって曇らない、よって検出感度が低下しない、という長所を有する。（ステップ１１２）。

そして最後に、分析が完了した時、分析チップ３００を分析装置４００から取り出し、廃棄する。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる。（ステップ１１３）
以上説明したように、第１実施形態によれば、捕集チップ２００および分析チップ３００と、捕集機１００および分析装置４００を組み合わせて使用することで、細菌の捕集から細菌の検出までの工程が２種類の小型のチップ２００、３００内で自動化される。細菌芽胞の処理や遺伝子抽出工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に分析が可能である。さらに、チップ２００、３００にバルブ等の機械部品が含まれないので、使い捨て用途に好適なチップ２００、３００が提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。さらに、ディスポーザブルなチップ２００、３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、チップ２００、３００を冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能、かつ分析後に試薬と共に処分しうる分析チップを提供することができる。
［第２実施形態］
第１実施形態においては、分析チップ３００内の反応槽３９０の個数が１個の例を示した。しかし、検査する対象が多数ある場合に対応する等の観点で、反応槽３９０が複数個であってもよい。その場合、検査対象の各細菌に対応したプライマが必要となるため、プライマを包含する遺伝子増幅試薬Ａの保管槽も複数個必要となる。さらに、複数の反応槽３９０内の反応を検出するために光源４５０からの励起光の照射位置を反応槽３９０に対して切り替える必要があるが、１枚の分析チップ上で複数の細菌を同時に検査できる長所を有する。
［第３実施形態］
第１実施形態においては、捕集チップ２００と分析チップ３００とをセットするチップ設置部が一つの例を示した。しかし、捕集チップ２００の処理と分析チップ３００の処理を同時に平行して行うために、チップ設置部を２箇所設けて捕集機と分析装置とを兼用させることも可能である。捕集チップ２００の処理工程では、光学検出系が不要のため、流体系、温調系を２系統にすることで２つのチップ設置部を設けることができる。装置のサイズが若干大きくなるが、捕集チップ２００と分析チップ３００を同時処理することで、多検体の処理時間を短縮することができる。
［第４実施形態］
この第４実施形態は、第１実施形態と比較して、分析チップ３００の底部に水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を設置した点で相違する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定する手法として広く利用されている。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドを圧電素子に固定しておく。固定方法は下記の如くが好ましい。まず、圧電素子の電極上にスパッタリング、蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいＳｉＯ２を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ０．１〜１μｍであることが好ましい。双方の厚みが１μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて６０ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。

第４実施形態における試料から遺伝子を抽出するまでの工程は、第１実施形態と同じである。そして反応槽３９０に送液された遺伝子を温度制御機構４１３により９４℃付近まで昇温すると、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子とチップ底部上に固定されたヌクレオチドが結合したとき、圧電素子の発振周波数が変化する。よって、この周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りが可能となる。

液中で圧電素子を使用した場合、液温が１℃変化すると周波数は１５〜３０Ｈｚ変化するため液温の正確な制御が必須となるが、本実施例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルが要らないため検出時間が短くなる長所がある。

本発明の第１実施形態の細菌の検知方法の手順を示すフローチャート図である。 同第１実施形態の細菌検知システムの構成を示す図である。 同第１実施形態に係る捕集機の透視斜視図である。 図３の捕集機に捕集チップを装着する方法を示す斜視図である。 同第１実施形態に係る捕集チップの正面図である。 図５の捕集チップの縦断面図である。 同第１実施形態に係る分析チップの正面図である。 図７のＡ−Ａ’断面図である。 図７の分析チップの反応槽下部の拡大図である。 図７の分析チップの遺伝子抽出エリアの堰を示す拡大図である。 同第１実施形態に係る分析装置の斜視透視図である。 図１１の分析装置の断面構成図である。 図１１の分析装置の基板を示す図である。 同第１実施形態の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。

符号の説明

１００…捕集機、１１０…蓋部、１１１…固定手段、１２０…ノズル部、１２１…一次フィルタ、１３０…チップ支持部、１４０…二次フィルタ、１５０…支持板、１６０…ファンモータ、１７０…排出口、１８０…制御部、１８１…表示部、１８５…バッテリ、１９０…ケーシング、１９１…掴み部、２００…捕集チップ、２０１…捕集材、２０２…基板、２０３…捕集材収納部、２０４…堰、２１０…発芽促進剤保管槽、２１１…チップポート、２２０…酵素A保管槽、２２１…チップポート、２３０…酵素B保管槽、２３１…チップポート、２４０…カオトロピック保管槽、２４１…チップポート、２５０…空気穴、３００…分析チップ、３１０…試料注入口、３１１…チップポート、３１５…試料溜め、３２０…遺伝子抽出エリア、３２５…堰、３３０…廃液槽、３３１…チップポート、３４０…洗浄液A保管槽、３４１…チップポート、３５０…洗浄液B保管槽、３５１…チップポート、３６０…溶離液保管槽、３６１…チップポート、３７０…遺伝子増幅試薬A保管槽、３７１…チップポート、３８０…遺伝子増幅試薬B保管槽、３８１…チップポート、３９０…反応槽、３９１…チップポート（反応槽ポート）、３９２…堰、４００…分析装置、４０１…前蓋、４０２…装置内流路、４０５…電源、４１０…基板、４１１…チップストッパ、４１２…基板流路、４１５…温度制御機構、４２０…チップホールダ、４３０…バルブ、４４０…ポンプ、４５０…光源、４５５…励起フィルタ、４６０…ミラー、４７０…光検出器、４７５…検出フィルタ、４８０…光信号変換機、４９０…データ表示画面。

Claims (16)

1. 大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した板状の基板とを備えた微生物検知チップであって、
   前記基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
   前記捕集材は、濃度が２〜５％の寒天であり、且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されており、
   前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部に接続されている
   ことを特徴とする微生物検知チップ。
2. 請求項１の微生物検知チップにおいて、前記捕集材収納部は、微生物を含む大気を取り入れる開口面を有する浅い凹部で形成されると共に、その開口面に対向する底部に前記捕集材を収納し、前記開口面は前記捕集材に微生物が付着された状態でシール材により封止されていることを特徴とする微生物検知チップ。
3. 請求項２の微生物検知チップにおいて、前記試薬保管槽から前記捕集材収納部に試薬が送液される状態における前記捕集材収納部の上部が外部に開口する空気穴に連通されていることを特徴とする微生物検知チップ。
4. 請求項１の微生物検知チップにおいて、前記捕集材収納部は前記基板の中央部に配置され、前記複数の試薬保管槽は前記捕集材収納部の周囲を取り囲むように配置されていることを特徴とする微生物検知チップ。
5. 請求項４の微生物検知チップにおいて、前記複数の試薬保管槽は、細長い微細流路で形成され、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になるチップポートに接続されていることを特徴とする微生物検知チップ。
6. 請求項１の微生物検知チップにおいて、細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知用として用いられるものであり、前記試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する試薬保管槽と、細胞壁破壊液を保管する試薬保管槽と、カオトロピックイオンを保管する試薬保管槽とを有することを特徴とする微生物検知チップ。
7. 請求項１の微生物検知チップにおいて、前記基板および前記捕集材を焼却可能な素材で構成したことを特徴とする微生物検知チップ。
8. 捕集機と、捕集チップおよび分析チップからなる微生物検知チップと、分析装置とを備えた微生物検知システムであって、
   前記捕集チップは、大気中の微生物を付着して捕集する捕集材と、この捕集材を装着した薄い板状の捕集チップ基板とを備え、
   前記捕集材は、濃度が２〜５％の寒天であり、且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されており、
   前記捕集チップ基板は、前記捕集材を収納した捕集材収納部と、微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
   前記捕集機は、前記捕集チップを装着した状態で、前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させるものであり、
   前記分析チップは薄い板状の分析チップ基板を備え、
   前記分析チップ基板は、前記捕集チップで前処理された試料を貯留する試料溜めと、微生物の検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備え、
   前記分析装置は、前記捕集チップを設置した状態で前記捕集チップによる前処理を行わせると共に、前記分析チップを設置した状態で前記分析チップによる後処理を行わせるものである
   ことを特徴とする微生物検知システム。
9. 請求項８に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集機と前記分析装置とは兼用して構成されていることを特徴とする微生物検知システム。
10. 請求項８に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集機は、大気を導入するためのノズルと、このノズルの出口側に設けられた捕集室と、前記捕集チップを着脱する機構と、捕集室に導かれた空気を上記ノズルと反対側に排気するための排気部とを有するものであり、前記ノズル孔の内径は４〜１５ｍｍの範囲内にあることを特徴とする微生物検知システム。
11. 請求項８に記載された微生物検知システムにおいて、前記分析チップが前記分析装置に縦置きに設置されることを特徴とする微生物検知システム。
12. 請求項８に記載された微生物検知システムにおいて、前記捕集チップの複数の試薬保管槽は、それぞれの一側が前記捕集材収納部に接続されると共に、それぞれの他側が外部との接続口になる複数のチップポートに接続され、前記分析装置は、前記捕集チップの各チップポートに接続される複数の流路を有する分析装置基板と、前記分析装置基板の複数の流路から前記捕集チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給する流体供給機構とを備えていることを特徴とする微生物検知システム。
13. 請求項１２に記載された微生物検知システムにおいて、前記分析チップの複数の試薬保管槽は外部との接続口になるチップポートに接続され、前記分析装置基板は前記分析チップの各チップポートに接続される複数の流路を有し、流体供給機構は前記分析装置基板の複数の流路から前記分析チップの各チップポートに流体をバルブを介して選択的に供給するように構成されていることを特徴とする微生物検知システム。
14. 濃度が２〜５％の寒天であり且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、
    微生物を付着された前記微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知処理を行う
    ことを特徴とする微生物検知方法。
15. 濃度が２〜５％の寒天であり且つ４０〜８０％濃度のアルコール類が添加されている捕集材を収納した捕集材収納部と微生物の検知前処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽とを備えた第１の微生物検知チップを捕集機に装着して、前記捕集機の送風機構を動作することにより前記捕集材に大気中の微生物を衝突させて付着させ、
    微生物を付着された前記第１の微生物検知チップを分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第１の微生物検知チップの複数の試薬保管槽内の試薬を前記捕集材に順次供給することにより微生物検知前処理を行い、
    試料溜めと検知後処理をするための試薬を貯留した複数の試薬保管槽と反応槽とを備えた第２の微生物検知チップを前記試料溜めに前記検知前処理をした試料を充填した状態で分析装置に装着して、この分析装置の送液機構を動作させて前記第２の微生物検知チップの試料溜めの試料および複数の試薬保管槽内の試薬を前記反応槽に順次供給することにより微生物検知後処理を行う
    ことを特徴とする微生物検知方法。
16. 請求項１５の微生物検知方法において、細菌芽胞を形成した細菌の遺伝子を検知を行うものであり、第１の微生物検知チップにおける前処理は発芽促進剤を保管する工程と細胞壁の溶解を行う工程とからなり、第２の微生物検知チップにおける後処理は細胞壁が溶解された遺伝子を遺伝子結合担体に結合させる工程と遺伝子−遺伝子結合担体結合物を洗浄する工程と遺伝子を遺伝子結合担体から溶離する工程と溶離した遺伝子を検出する工程とからなることを特徴とする微生物検知方法。

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