JP2007535323A - サンプル調製コントロールのための方法およびデバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、核酸増幅反応およびサンプル調製の検証のための、標的核酸配列を含むと疑われるサンプルを調製する方法を提供する。この方法は、そのサンプルとサンプル調製コントロールとを混合する工程を包含する。このサンプル調製コントロールは、マーカー核酸配列を含む細胞、胞子、微生物またはウイルスである。このサンプル調製コントロールと混合されたサンプルは、溶解処理に供されれ、そしてその溶解処理によって放出された核酸は、核酸増幅条件に供される。次いで標的核酸配列およびマーカー核酸配列の存在または非存在が決定される。そのマーカー核酸配列の陽性の検出は、そのサンプル調製プロセスが十分であったことを示し、一方そのマーカー核酸配列を検出できないことは、不十分なサンプル調製プロセスであったことを示す。

Description

（発明の背景）
本発明は、一般的に、核酸アッセイに関し、より具体的には核酸増幅のためのサンプルを調製するため、およびそのサンプル調製プロセスの完全性を検証するためのデバイスおよび方法に関する。

核酸を増幅するための方法は、ヒトの病原体の検出、ヒトの遺伝子多型の検出、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列の検出、分子クローニング、核酸の配列決定などのための有用なツールを提供する。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列のクローニング、親子鑑定、病原体同定、疾患診断、および核酸配列の増幅が所望される他の有用な方法において重要なツールとなっている。例えば、非特許文献１；非特許文献２を参照のこと。

目的の核酸配列を含むと疑われるサンプルの分析は、一般的に一連のサンプル調製工程を包含し、この工程としては、濾過、細胞溶解、核酸精製、および試薬との混合が挙げられる。核酸アッセイの結果について自信をもつためには、そのサンプル調製プロセスの完全性について制御することが有用である。本発明は、この問題および他の問題に取り組む。
Ｅｒｌｉｃｈ編、１９９２年、「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｉｎｎｉｓら編、１９９０年、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」

（要旨）
一局面によると、本発明は、核酸増幅反応のためのサンプルを調製するため、およびそのサンプル調製の有効性を検証するための方法を提供する。そのサンプルは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いがあり、その標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含む。その方法は、そのサンプルを、そのサンプルとサンプル調製コントロールとを混合するための混合チャンバーに導入する工程を包含する。そのサンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、そしてこのサンプル調製コントロールは、マーカー核酸配列を含む。そのデバイスは、溶解チャンバーおよび反応チャンバーをさらに備える。上記サンプルは、その混合チャンバーにおいてサンプル調製コントロールと混合される。この方法は、そのサンプル調製コントロールと、そのサンプル中に存在する場合は上記標的物を、その溶解チャンバーでの溶解処理に供する工程、その溶解チャンバー中に放出された核酸を、上記反応チャンバー中の核酸増幅条件に供する工程、およびその少なくとも１つの標的核酸配列および上記マーカー核酸配列の存在および非存在を検出する工程をさらに包含する。そのマーカー核酸配列の陽性検出が、そのサンプル調製プロセスが十分であったことを示し、一方そのマーカー核酸配列の検出ができないことは、不十分なサンプル調製プロセスを示す。

いくつかの実施形態において、上記溶解チャンバーは、固相物質を含み、そして上記方法は、上記サンプル調製コントロールと混合されたサンプルをその溶解チャンバーを通して流し、溶解処理の前にそのサンプル調製コントロールおよび（そのサンプル中に存在する場合は）上記標的物を、固相物質に捕捉する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、その固相物質は、そのサンプル調製コントロールおよびその標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む。上記サンプルは、そのサンプルをサンプル調製コントロールと混合する前に、（例えば、粗い物質を除去するために）前濾過され得る。いくつかの実施形態において、上記溶解処理は、そのサンプル調製コントロールおよび標的物を、上記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器を使用して超音波エネルギーに供する工程を包含する。その溶解処理は、必要に応じて、その溶解チャンバーにおいてビーズを攪拌する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記サンプル調製コントロールは、胞子である。いくつかの実施形態において、上記混合する工程は、上記サンプル調製コントロールを含む乾燥ビーズを溶解する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記溶解処理は、化学溶解剤との接触を包含する。いくつかの実施形態において上記核酸増幅条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を含む。いくつかの実施形態において、上記マーカー核酸配列の存在および非存在が、上記マーカー核酸配列に結合可能なプローブ由来のシグナルが閾値レベルを超えるか否かを決定することによって検出される。

別の局面によると、本発明は、核酸増幅反応のためのサンプルを調製するため、およびそのサンプル調製の有効性を検証するためのデバイスを提供する。そのサンプルは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いがあり、その標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含む。そのデバイスは、そのサンプルと混合されるサンプル調製コントロールを含む第１のチャンバーを有する本体を備える。そのサンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、そしてそのサンプル調製コントロールは、マーカー核酸配列を含む。上記本体はまた、そのサンプル調製コントロールと、そのサンプル中に存在する場合はその標的物を溶解処理に供し、そのサンプル調製コントロールおよびその標的物から核酸を放出させるための溶解チャンバーを有する。その本体はさらに、増幅および検出のためにその核酸を保持するための反応チャンバーを有する。そのデバイスはさらに、そのサンプル調製コントロールと混合されたそのサンプルを、その第１のチャンバーからその溶解チャンバーに流し、溶解チャンバー中に放出されたその核酸をその反応チャンバーに流すための少なくとも１つの流れ制御器を備える。そのデバイスは、さらにそのマーカー核酸配列および少なくとも１つのその標的核酸配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブを含む。

いくつかの実施形態において、上記溶解チャンバーは、上記サンプル調製コントロールと、上記サンプル中に存在する場合は上記標的物を、そのサンプルがその溶解チャンバーを通って流れる際に捕捉するための固相物質を含む。そのデバイスはさらに、その溶解チャンバーを通って流れた使用済みサンプル流体を受容するための少なくとも１つの廃棄チャンバーを備える。そして少なくとも１つの上記流れ制御器はさらに、その溶解チャンバーを通って流れた使用済みサンプルを、その廃棄チャンバーに向けることができる。いくつかの実施形態において、上記固相物質は、上記サンプル調製コントロールおよび上記標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、上記溶解チャンバーを超音波処理するための、上記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器をさらに備える。いくつかの実施形態において、そのデバイスは、上記サンプル調製コントロールおよび上記標的物を破裂させるために、上記溶解チャンバー中にビーズを含む。いくつかの実施形態において、上記サンプル調製コントロールは胞子である。いくつかの実施形態において、そのサンプル調製コントロールは、流体中に溶解可能な乾燥ビーズ中に存在する。いくつかの実施形態において、上記プライマーおよびプローブが、上記反応チャンバー中に存在し、そのビーズは流体中に溶解可能である。いくつかの実施形態において、上記本体は、上記反応チャンバーと接続された試薬チャンバーを備え、上記プライマーおよびプローブは、上記混合チャンバー中の乾燥ビーズに存在し、そのビーズは流体中に溶解可能である。

別の局面によると、本発明は、溶解手順の有効性を決定するための方法を提供する。その方法は、サンプル調製コントロールと、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いのあるサンプルとを混合する工程を包含する。その標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含む。そのサンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、そのサンプル調製コントロールはマーカー配列を含む。そのサンプル調製コントロールと、そのサンプル中に存在する場合はその標的物との混合物が、溶解処理に供される。上記方法はさらに、そのマーカー核酸配列の存在または非存在を検出し、核酸がその溶解処理の間にそのサンプル調製コントロールから放出されたか否かを決定する工程を包含する。そのマーカー核酸配列の陽性検出は十分な溶解を示し、一方そのマーカー核酸配列を検出できないことは、不十分な溶解を示す。

いくつかの実施形態において、上記方法はさらに上記サンプル調製コントロールと混合されたサンプルを、固相物質を含むチャンバーを通って流し、溶解処理の前にサンプル調製コントロールと、上記サンプル中に存在する場合は標的物とを捕捉する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記固相物質は、上記サンプル調製コントロールおよびその標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む。いくつかの実施形態において、上記サンプルと上記サンプル調製コントロールとを混合する前に、そのサンプルは前濾過される。いくつかの実施形態において上記溶解処理は、上記サンプル調製コントロールおよび上記標的物を、超音波エネルギーに供する工程を包含する。上記溶解処理は、上記サンプル調製コントロールおよび標的物を破裂させるために、ビーズを攪拌する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、そのサンプル調製コントロールは、胞子である。いくつかの実施形態において、上記混合する工程は、上記サンプル調製コントロールを含む乾燥ビーズを溶解する工程を包含する。,いくつかの実施形態において、上記溶解処理は、化学溶解剤との接触を包含する。いくつかの実施形態において、上記マーカー核酸配列は、そのマーカー配列を（例えば、ＰＣＲによって）増幅し、そしてその増幅されたマーカー配列を検出することによって検出される。いくつかの実施形態において、その増幅されたマーカー核酸配列は、そのマーカー核酸配列に結合可能なプローブ由来のシグナルが閾値レベルを超えるか否かを決定することによって検出される。

（具体的な実施形態の説明）
図１〜４は、複数のチャンバー１３を有するハウジング１２を備える流体制御および処理システム１０を示す。図１は、説明目的のために露出されたチャンバー１３を示す。頂部のカバーは、代表的に、チャンバー１３を増強するために提供される。図３および図４において最もよく分かるように、流体制御デバイス１６および反応管１８は、ハウジング１２の異なる部分に連結される。示される実施形態における流体制御デバイスは、回転式流体制御弁１６である。その弁１６は、円盤部分２２および管状部分２４を有する弁本体２０を備える。その円盤部分２２は、図３において最もよく分かるように、ほぼ平面の外部ポート表面２３を有する。その弁１６は、上記ハウジング１２に対して回転可能である。そのハウジング１２は、弁１６の円盤部分２２の外部ポート表面２３に面する複数のチャンバーポート２５（図４）を備え、チャンバー１３と弁１６との間の流体連通を可能にする。任意のシールまたはガスケット２６が、円盤部分２２とハウジング１２との間に配置される。円盤部分２２はさらに、フィルター２７および外壁２８、ならびに鋸歯状の外周２９を備える。

図４において見られるように、円盤部分２２は、溶解チャンバー３０を備える。溶解チャンバー３０は、溶解される細胞、胞子、ウイルスまたは微生物を捕捉するための固相物質を含み得る。適した固相物質としては、フィルター、ビーズ、繊維、膜、濾紙、ガラスウール、ポリマーまたはゲルが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、その固相物質は、溶解される標的細胞、胞子、ウイルス、または微生物を捕捉するのに十分な孔サイズを有するフィルターである。

図５〜８において示されるように、外壁２８は、溶解チャンバー３０および弁１６の円盤部分２２の底面を取り囲む。図８において、溶解チャンバー３０は、第１の流体処理チャネル３４に連結された第１の流体処理ポート３２、および第２の流体処理チャネル３８に連結された第２の流体処理ポート３６を備える。第１の流体処理チャネル３４は、外部ポート表面２３における第１の外部ポート４２が端部である第１の外側導管４０に連結され、一方第２の流体処理チャネル３８は、外部ポート表面２３における第２の外部ポートが端部である第２の外側導管４４に連結される。流体置換チャネル４８は、近位の一端にて第１の流体処理チャネル３４および第１の導管３４に連結され、他端にて流体交換チャンバー５０に連結される。第１の外側導管４０は、第１の外部ポート４２と、第１の流体処理チャネル３４および流体置換チャネル４８のいずれかまたはそれらの両方との間の流体連通を可能にするための共通導管として機能する。溶解チャンバー３０は、流体交換チャンバー５０と連続的に流体連通している。

図６〜図８に示されるように、外部ポート４２、４６は、弁１６の軸５２に対して、互いに１８０°の角度で間隔が空いている。その外部ポート４２、４６は、軸５２から同じ距離だけ、放射状に間隔が空いている。その軸５２は、外部ポート２３に対して垂直である。別の実施形態において、外部ポート４２、４６の間の角度間隔は、異なったものであり得る。円盤部分２２におけるチャネルの構成もまた、別の実施形態において異なったものであり得る。例えば、第１の流体処理チャネル３４および第１の外側導管４０は、流体交換チャンバー５０に対して傾いて直接連結され、それによって流体置換チャネル４８を取り除き得る。第２の流体置換チャネル３８もまた、直線的なラインで第２の流体処理ポート３６と第２の外部ポート４６との間を傾いて延び、それによって第２の外側導管４４を取り除き得る。さらに、より多くのチャネルおよび外部ポートが、弁１６に備えられ得る。図３において最もよく分かるように、クロスカバーチャネルまたは溝５６が、望ましくは外部ポート表面２３上に提供される。その溝５６は、曲がっており、望ましくは一定の半径で軸５２から間隔が空いている。１つの実施形態において、溝５６は、軸５２から共通の半径上にある円弧である。以下でより詳細に説明されるように、溝５６は、上記導管を満たすために使用される。

図８において示されるように、流体交換チャンバー５０は、弁１６の管状部分２４内に実質的に配置され、円盤部分２２内に部分的に延びる。プランジャまたはピストン５４の形態での流体置換部材は、チャンバー５０内に移動可能に配置される。ピストン５４が上向きに動く場合、ピストン５４はチャンバー５０の容量を膨張させ、流体をチャンバー５０内にくみ上げるための吸引力を生成する。ピストン５４が下向きに動く場合、ピストン５４は、チャンバー５０の容量を減少させ、流体をチャンバー５０の外に出す。

回転式の弁１６がその軸５２の周りを図１〜図４のハウジング１２に対して回転するにつれて、外部ポート４２、４６のうちの１つが開いてチャンバー１３または反応管１８のうちの１つと流体連通し得るか、または外部ポート４２、４６の両方が遮断もしくは閉鎖され得る。この実施形態において、多くてもその外面４２、４６のうちの１つのみが、チャンバーまたは反応管１８のうちの１つと流体連通する。他の実施形態では、外部ポート４２、４６の両方が、別々のチャンバーまたは反応管１８と流体連通することを可能にするように構成され得る。従って、上記弁１６は、ハウジング１２に対して回転可能であり、その外部ポート４２、４６が、チャンバー１３および反応管１８を備える複数のチャンバーと選択的に流体連通するように配置されることを可能にする。どの外部ポート４２、４６が開いているかまたは閉じているか、そしてピストン５４が上向きに動いているかまたは下向きに動いているかのどちらであるかに依存して、弁１６における流体流れは方向を変換し得、外部ポート４２、４６は各々入口ポートから出口ポートへと切り替わることができ、そしてその流体流れは処理領域３０を通過するかまたは溶解チャンバー３０を迂回し得る。特定の実施形態において、第１の外部ポート４２が入口ポートであり、その結果溶解チャンバー３０の入口サイドは溶解チャンバー３０の出口サイドよりも流体交換チャンバー５４に近い。

図９Ａ〜図９ＬＬは、１つ以上の標的物（例えば、細胞、胞子、ウイルス、または微生物）を含むと疑われるサンプルの核酸アッセイを実施するための弁１６の操作を図示する。その標的物は少なくとも１つの標的核酸配列を含み、その標的核酸配列についてサンプルが試験される。サンプルは、種々の機構（手動または自動）により、流体制御および処理デバイス１０のハウジング１２（これは、カートリッジとして構成され得る）に導入され得る。手動の添加のためには、測定された容量の物質が、注入ポートを通ってハウジング１２の受容領域（例えば、複数のチャンバーのうちの１つ）内に入れられ、次いでそのポート上に配置される。あるいは、その受容領域はゴムまたは類似の障壁によってカバーされ得、そしてそのサンプルは、その障壁を針で刺し、そのサンプルをその針を通して注入することによって、その受容領域に注入される。あるいは、分析のために必要とされるよりも多量のサンプル物質がハウジング１２に加えられ得、そのハウジング１２内の機構が、具体的なプロトコルのために必要とされるサンプルの正確な測定およびアリコート分けを行い得る。

特定のサンプル（例えば、組織生検物質、土壌、糞便、浸出液、および他の複合物質）を、別のデバイスまたは付属品内に入れ、次いでその二次的なデバイスまたは付属品（これが、混合、分配または抽出のような機能をもたらす機械的作動を引き起こす）をハウジング内へ配置するのが望ましいかもしれない。例えば、一片の組織が注入ポート蓋として機能する二次デバイスの内腔に配置され得る。その蓋がそのポート内に圧迫される場合、その組織がメッシュと通され、そのことがその組織をスライスするかまたはそうでなければ分割する。

自動サンプル導入のためには、さらなるハウジングまたはカートリッジ設計の特徴が利用され、そして多くの場合において、サンプル収集機能をそのハウジング内に直接的に付与する。操作者または環境に有害である危険を提示するような特定のサンプル（例えば、ヒトレトロウイルス病原体）では、そのサンプルの移送は危険をもたらし得る。従って、１つの実施形態において、シリンジまたはストロー（ｓｉｐｐｅｒ）がそのデバイスに一体化され、サンプルを上記ハウジングに直接移動させるための手段を提供し得る。あるいは、そのデバイスは、サンプルを獲得するために使用され得るアセンブリを形成する静脈穿刺針および管を備え得る。収集後、その管および針は除去および廃棄され、そしてハウジング１２が次いで器具内に配置され、処理を達成する。そのようなアプローチの利点は、操作者または環境が、病原体に曝されないことである。

注入ポートが、意図される標本の性質の作用のような、適切なヒトの因子を考慮して設計され得る。例えば、呼吸器の標本は、咳由来の痰として、下気道から獲得され得る。スワブ（ｓｗａｂ）サンプルまたは摩擦（ｂｒｕｓｈ）サンプルもまた、そのデバイス内に配置され得る。前者の場合においては、上記注入ポートは、患者が上記ハウジング１２内に直接的に咳をすることを可能にするか、またはそうでなければそのハウジング内に唾サンプルを唾を吐かせるように設計され得る。摩擦サンプルまたはぬぐいサンプルについては、その摩擦物またはスワブは、好ましくは、そのデバイス１０のチャンバーのうちの１つに配置され、そのサンプルは、例えば水または他の適した溶出流体を使用して、その摩擦物またはスワブから流出される。さらに、上記ハウジング１２は、サンプル受容チャンバーにおいてスワブ（ｓｗａｂ）または摩擦物（ｂｒｕｓｈ）の端を破壊し保持するのを容易にする特徴を備え得る。

別の実施形態において、そのハウジング１２は、１つ以上の注入管またはストローを備える。この注入管またはストローは、サンプルプール中に配置され得、その結果、そのサンプル物質がデバイス中に流れる。あるいは、親水性ウィッキング材料が、サンプルをそのデバイス中に引き込むように機能し得る。例えば、カートリッジ全体がそのサンプル中に直接浸され、十分量のサンプルがそのウィッキング材料に吸収され、そしてハウジング１２中に滲み出す（ｗｉｃｋ）。そのハウジングが次いで取り外され、研究室に移送されるか、または携帯用器具を使用して直接的に分析され得る。別の実施形態において、管材が用いられ、その管の一端が上記ハウジングと直接連通されて少なくとも１つのチャンバーとの流体接点を提供し、他端はサンプルの受容器として機能するための外部環境に接近可能である。次いでその管はサンプル中に配置され、そしてストローとして機能する。従って、上記デバイスは、種々の異なる供給源からサンプルを収集するため、およびそのサンプルをハウジング１２内に移動させるための特徴を備えることができ、それによって操作および不便さを低減させる。

図９Ａおよび図９ＡＡにおいて、サンプルは例えばピペッティングによって混合チャンバー６０中に配置され、次いでそのチャンバー６０上に寝かされる。そのサンプルは、１つ以上の標的核酸配列を含むか否かを決定するために試験される。これには、サンプル調製工程（例えば、その標的核酸配列を含む細胞、胞子、ウイルス、または微生物を溶解する工程）を必要とする。チャンバー６０は、そのサンプルと混合されるべきサンプル調製コントロールを含む。このサンプル調製コントロールもまた、細胞、胞子、ウイルスまたは微生物である。このサンプル調製コントロールは、標的核酸配列（この配列について、そのサンプルはアッセイされる）とは異なるマーカー核酸配列を含む。このマーカー核酸配列は、標識核酸配列がそのサンプル中に存在する場合に、そのアッセイの後半に、標的核酸配列と一緒に反応チャンバー１８において検出される。マーカー核酸配列が検出されるためには、そのサンプル調製コントロールは、首尾よく溶解されてその核酸を放出しなければならず、かつその核酸が首尾よく増幅試薬と混合されて増幅されなければならない。従って、このサンプル調製コントロールは、それが検出され得る場合には、サンプル調製がその核酸アッセイに対して十分であることを示し、それが検出され得ない場合には、サンプル調製が不十分であることを示す。従って、このサンプル調製コントロールは、それが陽性に検出され得る場合には、そのサンプル調製が効果的であることを立証し、その結果、そのアッセイの結果において自信がもてる。

１つの好ましい実施形態において、そのサンプル調製コントロールは、増幅および検出されるべき特定のマーカー核酸配列を含む胞子である。例えば、特異的マーカー核酸配列を含む２，０００個〜１０，０００個の胞子が一般的に好ましく、より好ましくは約６，０００個の胞子が上記サンプル調製コントロールとして使用される。この胞子は、サンプル調製の溶解工程が効果的であり、そしてただ外部の核酸を失っただけではないことを証明するために、外部の核酸が存在しないように洗浄されるべきである。さらに、そのサンプル調製コントロールは、好ましくは、速やかに液体に溶解可能な凍結乾燥ビーズまたは乾燥した（ｄｒｉｅｄ−ｄｏｗｎ）ビーズ中で、ハウジング１２の１つのチャンバーにおいて保存される。そのようなビーズを作製する方法は、当該分野において周知であり、米国特許第５，５９３，８２４号および２００３年９月２５日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０／６７２，２６６号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。

標的の細胞、胞子、ウイルスまたは微生物を含むと疑われるサンプルは、チャンバー６０において上記サンプル調製コントロールと混合される。この混合は、好ましくは、そのサンプル調製コントロールを含む乾燥ビーズをサンプル流体に溶解することによって達成される。第１の外部ポート４２は、弁１６を回転させることによってチャンバー６０と流体連通するように配置され、ピストン５４が上向きに引っ張られ、溶解チャンバー３０を迂回しながら、流体サンプルをチャンバー６０から第１の外側導管４０および流体交換チャンバー５０にくみ上げる。単純にするために、ピストン５４は図９Ａ〜図９ＬＬには示されていない。次いで弁１６が回転され、図９Ｂおよび図９ＢＢに示されるように、第２の外部ポート４６を、廃棄チャンバー４６と流体連通するように配置する。このピストン５４が下向きに押され、上記サンプル調製紺とロールと混合された流体サンプルを、溶解チャンバー３０を通して廃棄チャンバー６４に動かす。特定の実施形態において、その溶解チャンバー３０は、サンプル流体が溶解チャンバー３０を通過する際にサンプル調製コントロールを補足するだけでなく、そのサンプル中に存在する場合は標的の細胞、胞子、ウイルス、または微生物を補足するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルター２７を備える。この理由のために、サンプル調製コントロールは、標的物がサンプル中に存在する場合にその標的物の濾過が功を奏したことを証明するために、サンプル調製コントロールは、サンプル中の標的細胞、胞子、ウイルスまたは微生物とほぼ同じサイズかまたはそれよりもわずかに小さいサイズを有することが望ましい。代替の実施形態において、他の固相物質は、溶解チャンバー３０中に備えられ得る。

図９Ｃおよび図９ＣＣにおいて、上記弁１６が回転され、第１の外部ポート４２を洗浄チャンバー６６と流体連通するように配置させ、そしてピストン５４が上向きに引っ張られて、溶解チャンバー３０を迂回しながら、洗浄流体を洗浄チャンバー６６から流体交換チャンバー５０に流す。次いで弁１６が回転され、図９Ｄおよび図９ＤＤに示されるように、第２の外部ポート４６を廃棄チャンバー６４と流体連通するように配置させる。ピストン５４が下向きに押され、洗浄流体を溶解チャンバー３０を通して廃棄チャンバー６４に動かす。蒸気の洗浄工程は、所望されるだけ繰り返され得る。中間の洗浄が、弁１６内の望ましくない残留物を除去するために使用される。

図９Ｅおよび図９ＥＥにおいて、弁１６が回転され、第１の外部ポート４２を、緩衝液チャンバー７０と流体連通するように配置させ、そしてピストン５４が上向きに引っ張られ、溶解チャンバー３０を迂回しながら、溶解緩衝液（例えば、水または溶解因子と混合された水）を、緩衝液チャンバー７０から流体交換チャンバー５０にくみ上げある。次いで弁１６が回転され、図９Ｆおよび図９ＦＦに示されるように、第２の外部ポート４６を、廃棄チャンバー６４と流体連通するように配置させる。ピストン５４が下向きに押され、緩衝流体を溶解チャンバー３０内に動かす。図９Ｇおよび図９ＧＧにおいて、弁１６が回転され、外部ポート４２、４６を閉じる。

上記サンプル調製コントロールおよび（存在する場合は）標的細胞、ウイルス、胞子、または微生物は、溶解チャンバー３０における溶解処理に供される。この溶解処理の目的は、サンプル調製コントロールおよび（存在する場合は）標的細胞、ウイルス、胞子または微生物の外壁を破壊し、それらの核酸を放出させることである。このサンプル調製コントロールは、好ましくは、その溶解処理が効果的であったことを証明するために、標的細胞、ウイルス、胞子または微生物と同じレベルで溶解が困難であるか、またはそれらよりもより溶解しにくい。細胞、ウイルス、胞子、または微生物からの核酸の解放、およびＤＮＡ結合タンパク質の変性は、一般的に、化学的方法、物理的方法、または電解方法によって実施され得る。例えば一般的に、化学的方法は、細胞を破裂させてその細胞からの核酸を抽出するために溶解剤を利用し、次いでその抽出物をカオトロピック塩（例えば、グアニジウムイソチオシアネートまたは尿素）で処理し、任意の混入タンパク質および潜在的に干渉性のタンパク質を変性させる。化学的抽出および／または変性方法が使用される場合は、適切な溶解剤が、好ましくはチャンバー７０に保存され、溶解チャンバー３０内にポンプされる溶解緩衝液中に存在する。

あるいは、物理的方法が、核酸を抽出し、ＤＮＡ結合タンパク質を変性させるために使用され得る。米国特許第５，３０４，４８７号（全ての目的のために、その全体が本明細書中に援用される）は、細胞膜に穴を開けてその内容物を抽出するための、チャンバーまたはチャネル内のマイクロチャネルまたは鋭い端部の粒子における物理的突起の使用について議論している。攪拌するためのそのような構造と圧電性要素との組み合わせが、溶解のための適したせん断力を提供し得る。細胞抽出のより伝統的な方法もまた使用され得、この方法は、例えば、サンプルがそのチャネルを十分な流れ圧力で通過するときに細胞溶解を引き起こす、制限された断面積を有するチャネルを利用する。あるいは、細胞抽出および混入タンパク質の変性は、交流を印加することによって引き起こされ得る。種々の他の方法が本発明のデバイス内で利用され得、細胞溶解／抽出を達成し得る。この方法としては、例えば、細胞を超音波攪拌に供すること、または細胞を微小形状開口部を強引に通し、それによってその細胞に破裂をもたらす高いせん断ストレスを供給することなどが挙げられる。

１つの好ましい実施形態において、上記溶解処理は、溶解チャンバー３０の外壁２８に連結された超音波変換器７６を使用して溶解チャンバー３０を超音波処理する工程を包含する。この超音波変換器７６（好ましくは、超音波ホーン）は、溶解チャンバー３０内に超音波エネルギーを伝達するために壁２８と接触して配置され、細胞、胞子、ウイルスまたは微生物の溶解を容易にする。適した超音波ホーンは、５３ Ｃｈｕｒｃｈ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ ０６４７０−１６１４，Ｕ．Ｓ．Ａにオフィスを有するＳｏｎｉｃｓ ＆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。あるいは、この超音波変換器は、圧電円板または壁２８に連結され得る任意の他のタイプの超音波変換器を包含し得る。加えて、ビーズ（例えば、ガラスビーズまたはポリスチレンビーズ）が、好ましくは溶解チャンバー３０中で攪拌され、細胞、胞子、ウイルスまたは微生物を破裂させる。壁２８に対して振動する変換器１６によって作り出される圧力波または圧力振動は、そのビーズをその溶解チャンバー内で弾道的な動作で動かし、破裂を引き起こす。超音波変換器を使用するこれらの実施形態において、上記溶解緩衝液は、超音波透過媒体（例えば、脱イオン水）であるべきである。この溶解緩衝液としてはまた、溶解を補助するための１以上の溶解剤が挙げられ得る。現在好ましい実施形態において、上記壁２８は、２００１年１０月４日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／９７２，２２１号（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、屈折可能なプラスチック壁である。

図９Ｈおよび図９ＨＨにおいて、上記弁１６が回転され、第２の外部ポート４６を、試薬チャンバー７８と流体連通させるように配置させ、そしてピストン５４が下向きに押され、溶解チャンバー３０における溶解物を試薬チャンバー７８に溶出させる。この試薬チャンバー７８は、好ましくは、サンプル調製コントロールのマーカー核酸配列および１つ以上の標的核酸配列（この配列についてサンプルは試験されている）を増幅および検出するための全ての必要な核酸増幅試薬およびプローブ（例えば、酵素、プライマー、および蛍光プローブ）を含む。任意の過剰の溶解物は、図９Ｉおよび図９ＩＩに示されるように、弁１６が回転されてポート４６を廃棄チャンバー６４と流体連通するように配置した後に、第２の外部ポート４６を介して廃棄チャンバー６４に分配される。溶解チャンバー３０において放出された核酸を含む溶解物は、ついで、試薬チャンバー７８において混合される。これは、図９Ｊおよび図９ＪＪに示されるように、流体交換チャンバー５０を、試薬チャンバー７８と流体連通するように配置させ、そしてピストン５４を上下に動かすことによって実施される。例えば処理領域３０においてフィルターを通す、混合物の，トグリング（ｔｏｇｇｌｉｎｇ）は、フィルターに捕捉されたより大きな粒子を一時的にそこから動かし、より小さな粒子を通過させる。

サンプル調製コントロールのマーカー核酸配列および１つ以上の標的核酸配列（これに対してサンプルが試験される）を増幅および検出するための試薬およびプローブは、好ましくは、液体中に速やかに溶解可能な凍結乾燥ビーズまたは乾燥した（ｄｒｉｅｄ−ｄｏｗｎ）ビーズ中で、チャンバー７８において保管される。そのようなビーズを作製するための方法は当該分野で周知であり、米国特許第５，５９３，８２４号および２００３年９月２５日に出願された同時係属中の米国特許出願第１０／６７２，２６６号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。代替の実施形態において、その試薬およびプローブは、反応管１８の反応チャンバー中に保管される。

図９Ｋ、９ＫＫおよび９Ｋ’Ｋ’において、上記弁１６が回転されて、第１の外部ポート４２を、反応管１８に連結された第１の分岐８４と流体連通するように配置させ、一方その反応管１８に連結された第２の分岐８６はクロスカバーの溝５６と流体連通するように配置される。第１の分岐８４および第２の分岐８６は、弁１６の軸５２から異なる半径に配置され、第１の分岐８４は第１の外部ポート４２と共通の半径を有し、そして第２の分岐８６は、クロスカバーの溝５６と共通の半径を有する。このクロスカバーの溝５６もまた、試薬チャンバー７８と流体連通しており（図９Ｋ）、そして試薬チャンバー７８と第２の分岐８６との間の間隙を橋渡しして、それらの間にクロスカバー流れを提供するように機能する。この外部ポートは、軸から外部ポート半径の範囲内に配置され、このクロスカバーの溝は、軸からクロスカバーの溝半径の範囲内に配置される。ここで、その外部ポート半径およびクロスカバーの溝半径は、重複しない。外部ポート４２、４６の半径とは異なる半径にクロスカバーの溝５６を配置することは有利である。なぜなら、それが弁１６の回転式の動きの結果として、弁１６と外部ポート４２、４６の半径でのハウジング１２との間の表面付近の領域に存在し得る混入物による、クロスカバーの溝５６の二次汚染を回避するからである。従って、外部ポート４２、４６の半径が重複するものを含む、クロスカバーの溝の他の構成が使用され得るが、示される実施形態が、そのクロスカバーの溝５６を弁１６と外部ポート４２、４６の半径でのハウジング１２との間の表面付近からの汚染から隔離する好ましい配置である。

反応管１８を満たすために、上記ピストン５４が上向きに引っ張られ、試薬チャンバー７８における反応混合物を、クロスカバーの溝５６および第２の分岐８６を通して反応管１８にくみ上げる。次いでこの弁１６が回転され、図９Ｌおよび図９ＬＬに示されるように、第２の外部ポート４６を、第１の分岐８４と流体連通し、第１の外部ポート４２と近接するように配置する。ピストン５４が下向きに押され、反応管１８内の反応混合物を加圧する。この反応管１８は、核酸増幅および検出のために反応混合物を保持するための反応チャンバーを有する。この反応チャンバーは、核酸の増幅および検出を実施するために、熱反応スリーブ内に挿入され得る。２つの分岐８４、８６により、反応管１８の反応チャンバーの充填および排出が可能になる。この管は、超音波溶接、機械的連結などによってハウジング１２に連結されてもよいし、例えば鋳造によってハウジング１２と一体化して形成されてもよい。

反応管１８の反応チャンバーにおける反応混合物は、核酸増幅条件に供される。反応を使用するＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの増幅は周知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。熱安定性の酵素を使用するＰＣＲによって核酸を増幅および検出する方法は、米国特許第４，９６５，１８８号（これは、本明細書中に参考として援用される）に開示される。ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの熱変性、２つのオリゴヌクレオチドプライマーの増幅されるべきＤＮＡセグメントに隣接する配列へのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼでのそのアニーリングしたプライマーの伸長のサイクルの繰り返しを包含する。このプライマーは、標的配列の対向する鎖にハイブリダイズし、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がそのプライマー間の領域を横切るように向けられ、ＤＮＡセグメントの量を効率的に倍加させる。さらに、伸長産物もまたプライマーに相補的で結合可能であるので、連続的なサイクルの各々が、先のサイクルで合成されたＤＮＡの量を実質的に倍加させる。これは、サイクル当たり２^ｎ（ここで、ｎはサイクル数）の速度で、特異的標的フラグメントの指数関数的な蓄積をもたらす。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法が、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリから、標的ＤＮＡ配列の核酸配列を直接的に増幅するのに使用され得る。

等温増幅反応もまた公知であり、本発明の方法に従って使用され得る。等温増幅反応の例としては、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３（１）：１−６（１９９３））、転写媒介増幅（Ｐｈｙｆｆｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：８３４−８４１（１９９６）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８５６−１８５９（１９９５））、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１）、回転サイクル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（ｌ）：７５−９９（１９９９））；Ｈａｔｃｈら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５（２）：３５−４０（１９９９））および分岐ＤＮＡシグナル増幅（ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ｂＤＮＡ）（例えば、Ｉｑｂａｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ １３（４）：３１５−３２０（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。当業者に公知な他の増幅方法としてはＣＰＲ（サイクリングプローブ反応；Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＳＲ（自立配列複製；Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（鎖置換増幅；Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＱＢＲ（Ｑβ複製；Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）、Ｒｅ−ＡＭＰ（以前はＲＡＭＰ）、ＲＣＲ（修復鎖反応；Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＴＡＳ（転写ベース増幅系；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）およびＨＣＳが挙げられる。

上記核酸増幅反応は、好ましくは、反応管１８において反応混合物をその増幅反応に必要な温度に加熱および／または冷却する熱処理器具を使用して実施される。この熱処理器具もまた、必要に応じて、上記サンプル調製コントロールのマーカー核酸配列および上記１つ以上の標的核酸配列（これについて、サンプルが試験されている）を検出するための１つ以上の検出機構を備え得る。反応管１８において核酸配列を増幅および検出するための、光学検出器中に備えられた（ｗｉｔｈ ｂｕｉｌｔ ｉｎ）好ましい熱処理器具が、同一人に譲渡された米国特許第６，３６９，８９３号および同第６，３９１，５４１号に記載されている（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）。反応混合物の温度を制御し、本発明に適した反応混合物における核酸配列を検出するための多くの他の公知の方法もまた存在する。例えば、核酸増幅および検出のための他の機器は、例えば米国特許第５，９５８，３４９号；同第５，６５６，４９３号；同５，３３３，６７５号；同５，４５５，１７５号；同５，５８９，１３６号および同５，９３５，５２２号に記載されている。

上記サンプル調製コントロールの上記マーカー核酸配列および１つ以上の標的核酸配列（それに対してそのサンプルは試験されている）の検出は、好ましくは、プローブを使用して実施される。上記反応管１８は、好ましくは、１つ以上の透明な壁または光透過性の壁を有し、これらの壁を通ってそのプローブからのシグナルが必要に応じて検出され得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブが、上記核酸配列を検出および定量するために使用される。核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いる多くの他のタイプのアッセイが存在する。これらのプローブのうちのいくつかは、別の分子または部分とのその相互作用の変化に起因して蛍光団の蛍光の変化によりシグナルを生成する。代表的には、その相互作用はほぼ、その蛍光団と、その相互作用する分子または部分との間の距離の変化によってもたらされる。これらのアッセイは、蛍光共鳴エネルギー転移、または「ＦＲＥＴ」に依存する。ＦＲＥＴは、第１の蛍光団を、相互作用する共鳴エネルギーアクセプター（別の蛍光団またはクエンチャー）から隔離している距離における変化によって引き起こされる蛍光の変化を利用する。蛍光団と、相互作用する分子または部分（失活させる分子または部分を含む）との組み合わせは、「ＦＲＥＴ対」として公知である。ＦＲＥＴ対相互作用の機構は、そのペアの一方のメンバーの吸収スペクトルが、他の分子（第１の蛍光団）の放出スペクトルと重複することを必要とする。この相互作用する分子または部分がクエンチャーである場合、そのクエンチャーの吸収スペクトルは、蛍光団の放出スペクトルと重複しなければならない。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８，４７：８１９−８４６；ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ 第ＩＩ部，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（Ｃ．Ｒ．ＣａｎｔｏｒおよびＰ．Ｒ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ編、１９８０）４４８−４５５頁、ならびにＳｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６：３００−３３５（１９９５）を参照のこと。効率的な、またはかなりの程度のＦＲＥＴ相互作用は、上記対の吸収スペクトルおよび放出スペクトルが大きな程度の重複を有することを必要とする。ＦＲＥＴ相互作用の有効性はその重複に、直線的に比例する。Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｊｒ．およびＳｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：２４−３０（１９６９）を参照のこと。非ＦＲＥＴプローブもまた、記載されている。例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと。

増幅産物の検出のための別の好ましい方法は、５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイとも呼ばれる）である（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３７６１−３７６６（１９９３））。このアッセイは、増幅反応の間に、二重に標識された蛍光発生プローブ（「Ｔａｑｍａｎ（登録商標）」）のハイブリダイゼーションおよび切断による、特定のＰＣＲ産物の蓄積を検出する。この蛍光発生プローブは、蛍光リポーター色素およびクエンチャー色素の両方から構成される。ＰＣＲの間に、このプローブは、それが増幅されるべきセグメントにハイブリダイズする場合に（そしてその場合にのみ）、ＤＮＡポリメラーゼの５’−エクソヌクレアーゼ活性によって切断される。プローブの切断は、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じる。

エネルギー転移の使用に依存する増幅産物の別の検出方法は、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０９（１９９６））に記載される「ビーコンプローブ」の使用であり、これはまた、米国特許第５，１１９，８０１号および同第５，３１２，７２８号の主題でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを利用する。そのハイブリダイゼーションプローブの一端（５’末端または３’末端のいずれか）に、ドナー蛍光団が存在し、そしてその他端に、アクセプター部分が存在する。上記ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒの方法においては、このアクセプター部分はクエンチャーであり、すなわちこのアクセプターは、そのドナーから放出されたエネルギーを吸収するが、そこでそれ自体が蛍光を発しはしない。従って、このビーコンが開いた立体配座にある場合は、そのドナー蛍光団の蛍光は検出可能であり、一方そのビーコンがヘアピン（閉じた）立体構造にある場合は、そのドナー蛍光団の蛍光は消光している。ＰＣＲにおいて用いられる場合は、その分子ビーコンプローブ（ＰＣＲ産物の鎖のうちの１つにハイブリダイズする）は、「開いた立体配座」にあり、その蛍光が検出されが、ハイブリダイズしないまま残っているビーコンプローブは蛍光を発しない（ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０６（１９９６））。結果として、蛍光の量は、ＰＣＲ産物の量が増加するに連れて増加し、そしてそれゆえ、ＰＣＲの進行の測りとして使用される。

サンプルにおける標的核酸の検出、またはそれが検出されないことについて自信をもつために、サンプル調製の完全性を制御しなければならない。これは、そのサンプル調製コントロールが、サンプルにおける標的物（例えば、標的配列を含む標的細胞、胞子、ウイルスまたは微生物）と同じサンプル処理に供されるからである。そのサンプル調製コントロールのマーカー核酸配列が検出される場合は、そのサンプル調製は十分であるとみなされる。そのマーカー核酸配列の存在が検出され得ない場合には、そのサンプル調製は不十分であるとみなされ、標的核酸配列に対する試験の結果は「未解決」とみなされる。好ましくは、そのマーカー核酸配列の存在または非存在は、そのマーカー核酸配列に結合することが出来るハイブリダイゼーションプローブ由来のシグナルが、閾値レベル（例えば、そのアッセイが有効だとみなされるために満たされるかまたは超えられなければならない所定の蛍光閾値）を超えるか否かを決定することによって検出される。

図３〜８の弁１６を操作するために、ステッパーモーターのようなモーターが、代表的に、円板部分２２の鋸歯状の周辺２９に連結され、高い正確性を伴って流体を分配するためにハウジング１２に対して弁１６を回転させる。このモーターは、望ましいプロトコルに従って、コンピューター制御され得る。リニアモーターなどが代表的に、正確な計測を提供するためにピストン５４を正確に上下に駆動し、これもまた望ましいプロトコルに従ってコンピューター制御され得る。

単一の弁の使用は、１つの欠陥要素のみしか存在しないことに起因して、高い製造収率をもたらす。流体コントロールおよび処理構成要素の集中は、コンパクトな装置（例えば、小さなカートリッジの形態）をもたらし、自動での成形およびアセンブリを容易にする。上で議論したように、上記システムは、有利には、希釈および混合能力、中間洗浄能力、および正の加圧能力を備える。そのシステム内の流路は、汚染を最小にし、そしてそのシステムないでの流体の封じ込みおよび制御を容易にするために、通常は閉じられている。反応管は、簡便に取り外し可能かつ交換可能であり、そしていくつかの実施形態においては廃棄可能である。

流体制御および処理システムの構成要素は、使用される流体と適合性の種々の物質であり得る。適した物質の例としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、アクリルまたはナイロンのようなポリマー性物質が挙げられる。そのシステムにおける種々のチャンバー、チャネル、ポートなどは、種々の形状およびサイズを有し得る。図１０は別の実施形態を示し、この実施形態においてピストンアセンブリ２１０は、少量の流体を駆動するためのロッド２１２よりも小さい断面を有するピストンシャフト２１４に連結されたピストンロッド２１２を備える。薄いピストンシャフト２１４は、それが長すぎる場合は、加えられた力で屈曲する。このピストンロッド２１２は、バレルまたはハウジング２１６の上側部分に沿って動くが、一方ピストンシャフト２１４は、バレル２１６の下側部分に沿って動く。ピストンロッド２１２の動きは、ピストンシャフト２１４の動きを導き、屈曲させる力が薄いピストンシャフト２１４にほとんど伝わらないように、加えられた力の多くを吸収する。

図１１は別の実施形態を示し、この実施形態において、上記サンプルは、上記サンプル調製コントロールと混合される前に前濾過される。このサンプルは、好ましくは、デバイスに組み込まれている側面チャンバー２２０において前濾過される。この側面チャンバー２２０は、入口ポート２２２および出口ポート２２４を備える。この例において、この側面チャンバー２２０は、入口ポート２２２に配置されたフィルター２２６を備える。サンプル流体は、側面濾過（ｓｉｄｅ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）のために、入口ポート２２２を通って側面チャンバー２２０に入り、出口ポート２２４を通って出るように流れるように向けられる。これにより、本発明の流体制御デバイスを使用した流体サンプルなどの濾過が可能になる。この流体は、フィルター２２６によるより良い濾過を達成するために再循環され得る。この前濾過は、サンプルをサンプル調製コントロールと混合する前に、そうしなければデバイスの他の部分を塞ぎ得る粗い物質を除去するのに有用である。このサンプルが前濾過された後は、そのサンプルはサンプル調製コントロールと、例えば図９Ｃのチャンバー６６またはハウジング１２の別のチャンバーにおいて混合される。側面チャンバーの使用は、例えば、弁およびデバイスにおける他のチャンバーの汚染を避けるために有利である。

デバイスおよび方法の上述の配置は、本発明の原理の適用を単に例示するのみであり、多くの他の実施形態および改変は、特許請求項の範囲に規定されている精神および範囲から逸脱せずになされ得る。

例えば、回転式の弁カートリッジが好ましい実施形態として記載されているが、本発明のサンプル調製コントロールは、多くの他のカートリッジの設計に適している。代替的なカートリッジの設計は、米国特許第６，３９１，５４１号，同第６，４４０，７２５号および同第６，１６８，９４８号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。さらに、回転式の弁カートリッジが使用される場合、このカートリッジは、好ましい実施形態に示されたよりも多いかまたは少ないチャンバーを有し得、そして多くの異なるサンプル調製プロトコルが実行され得る。

それゆえ本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲をその全体の範囲の等価物と一緒に参照して決定されるべきである

図１は、本発明の実施形態に従う流体コントロールおよび処理デバイスの斜視図である。 図２は、図１のデバイスの別の斜視図である。 図３は、図１のデバイスの分解図である。 図４は、図２のデバイスの分解図である。 図５は、図１のデバイスにおける流体制御装置およびガスケットの正面図である。 図６は、図５の流体制御装置およびガスケットの底面図である。 図７は、図５の流体制御装置およびガスケットの上面図である。 図８は、８−８に沿った、図７の回転式流体制御装置の断面図である。 図９Ａ〜図９ＬＬは、図１の流体制御および処理デバイスを使用する、流体を制御および処理するための特定のプロトコルを図示する平面図および断面図である。 図１０は、ピストンアセンブリの断面図である。 図１１は、濾過チャンバーの側方断面図である。

Claims (36)

1. 核酸増幅反応のためのサンプルを調製するため、および該サンプル調製の有効性を検証するための方法であって、該サンプルは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いがあり、該標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含み、該方法は以下の工程：
   ａ）該サンプルをデバイスに導入する工程であって、該デバイスは、
   ｉ）該サンプルとサンプル調製コントロールとを混合するための混合チャンバーであって、該サンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、そして該サンプル調製コントロールはマーカー核酸配列を含む、混合チャンバー；
   ｉｉ）溶解チャンバー；および
   ｉｉｉ）反応チャンバー、
   を備える、工程；
   ｂ）該サンプルと該サンプル調製コントロールとを、該混合チャンバーにおいて混合する工程；
   ｃ）該サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は該標的物とを、該溶解チャンバーでの溶解処理に供する工程；
   ｄ）該溶解チャンバー中に放出された核酸を、該反応チャンバー中の核酸増幅条件に供する工程；ならびに
   ｅ）該標的核酸配列および該マーカー核酸配列の存在および非存在を検出する工程、
   を包含し、該マーカー核酸配列の検出が十分なサンプル調製を示す、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、該溶解チャンバーは固相物質を含み、かつ該方法は、前記サンプル調製コントロールと混合されたサンプルを、前記溶解チャンバーを通して流し、溶解処理の前に、該サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は前記標的物とを該固相物質に捕捉させる工程をさらに包含する、方法。
3. 請求項２に記載の方法であって、前記固相物質は、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む、方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記サンプルと前記サンプル調製コントロールとを混合する前に、該サンプルを前濾過する工程を包含する、方法。
5. 前記溶解処理は、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を、前記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器を使用して超音波エネルギーに供する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
6. 前記溶解処理が、前記チャンバー中でビーズを攪拌する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
7. 前記サンプル調製コントロールが胞子である、請求項１に記載の方法。
8. 前記混合する工程が、前記サンプル調製コントロールを含む乾燥ビーズを溶解する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
9. 前記溶解処理は、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を、前記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器を使用して超音波エネルギーに供する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
10. 前記溶解処理は、前記チャンバー中でビーズを攪拌し、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を破裂させる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
11. 前記溶解処理は、化学溶解剤との接触を包含する、請求項１に記載の方法。
12. 前記核酸増幅条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記マーカー核酸配列の存在および非存在が、該マーカー核酸配列に結合可能なプローブ由来のシグナルが閾値レベルを超えるか否かを決定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
14. 核酸増幅反応のためのサンプルを調製するため、および該サンプル調製の有効性を検証するためのデバイスであって、該サンプルは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いがあり、該標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含み、該デバイスは、以下：
    ａ）該サンプルと混合されるサンプル調製コントロールを含む第１のチャンバーであって、該サンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、そして該サンプル調製コントロールは、マーカー核酸配列を含む、第１のチャンバー；
    ｂ）該サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は該標的物とを溶解処理に供し、該サンプル調製コントロールおよび該標的物から核酸を放出させるための溶解チャンバー；
    ｃ）増幅および検出のために該核酸を保持するための反応チャンバー；ならびに
    ｄ）該サンプル調製コントロールと混合された該サンプルを、該第１のチャンバーから該溶解チャンバーに流し、溶解チャンバー中に放出された該核酸を該反応チャンバーに流すための少なくとも１つの流れ制御器、
    を有する、本体、
    を備え、ここで該デバイスは、さらに該マーカー核酸配列および少なくとも１つの該標的核酸配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブを含む、デバイス。
15. 請求項１４に記載のデバイスであって、前記溶解チャンバーは、前記サンプルが該溶解チャンバーを通って流れる際に、前記サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は前記標的物とを捕捉するための固相物質を含み、該デバイスはさらに、該溶解チャンバーを通って流れた使用済みサンプル流体を受容するための廃棄チャンバーを備え、前記少なくとも１つの流れ制御器はさらに、該溶解チャンバーを通って流れた使用済みサンプル流体を、該廃棄チャンバー内に流れるように向けさせることができる、デバイス。
16. 前記固相物質は、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む、請求項１５に記載のデバイス。
17. 前記溶解チャンバーを超音波処理するための、前記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器をさらに備える、請求項１６に記載のデバイス。
18. 前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を破裂させるために、前記溶解チャンバー中にビーズを含む、請求項１７に記載のデバイス。
19. 前記サンプル調製コントロールが胞子である、請求項１４に記載のデバイス。
20. 前記サンプル調製コントロールは、液体中に溶解可能な乾燥ビーズ中に存在する、請求項１４に記載のデバイス。
21. 前記プライマーおよびプローブが、前記反応チャンバーにおける乾燥ビーズ中に存在し、該ビーズは流体中に溶解可能である、請求項１４に記載のデバイス。
22. 前記本体は、前記反応チャンバーと接続された試薬チャンバーを備え、前記プライマーおよびプローブは、前記混合チャンバー中の乾燥ビーズに存在し、該ビーズは液体中に溶解可能である、請求項１４に記載のデバイス。
23. 前記溶解チャンバーを超音波処理するための、前記溶解チャンバーの壁面に連結された超音波変換器をさらに備える、請求項１４に記載のデバイス。
24. 前記溶解チャンバー中に、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を破裂させるためのビーズをさらに含む、請求項２３に記載のデバイス。
25. 溶解手順の有効性を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    ａ）サンプル調製コントロールと、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択される標的物を含む疑いのあるサンプルとを混合する工程であって、該標的物は、少なくとも１つの標的核酸配列を含み、該サンプル調製コントロールは、細胞、胞子、微生物、およびウイルスからなる群より選択され、該サンプル調製コントロールはマーカー配列を含む、工程；
    ｂ）該サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は該標的物との混合物を溶解処理に供する工程；
    ｃ）該マーカー核酸配列の存在または非存在を検出し、核酸が該溶解処理の間に該サンプル調製コントロールから放出されたか否かを決定する工程、
    を包含し、該マーカー核酸配列の陽性検出が十分な溶解を示す、方法。
26. 請求項２５に記載の方法であって、該方法は、前記サンプル調製コントロールと混合されたサンプルを、固相物質を含むチャンバーを通して流し、該サンプル調製コントロールと、該サンプル中に存在する場合は前記標的物とを、溶解処理の前に該固相物質で捕捉する工程を包含する、方法。
27. 前記固相物質が、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を捕捉するのに十分な孔サイズを有する少なくとも１つのフィルターを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記サンプルと前記サンプル調製コントロールとを混合する前に、該サンプルを前濾過する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記溶解処理は、前記サンプル調製コントロールおよび前記標的物を、超音波エネルギーに供する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
30. 前記溶解処理は、前記サンプル調製コントロールおよび標的物を破裂させるために、ビーズを攪拌する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記サンプル調製コントロールは胞子である、請求項２５に記載の方法。
32. 前記混合する工程が、前記サンプル調製コントロールを含む乾燥ビーズを溶解する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
33. 前記溶解処理は、化学溶解剤との接触を包含する、請求項２５に記載の方法。
34. 前記マーカー核酸配列が、該マーカー核酸配列を増幅し、そして該増幅されたマーカー核酸配列を検出することによって検出される、請求項２５に記載の方法。
35. 前記マーカー核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記増幅されたマーカー核酸配列が、該マーカー核酸配列に結合可能なプローブ由来のシグナルが閾値レベルを超えるか否かを決定することによって検出される、請求項３４に記載の方法。

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