KR20070011525A

KR20070011525A - 샘플 조제 제어를 위한 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20070011525A
Application number: KR1020067024271A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 맥밀란
Original assignee: 세페이드
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2007-01-24
Also published as: WO2005106040A2; CA2564620A1; EP1740720A4; JP2007535323A; US20100129827A1; EP1740720A2; CN101124334A; US20050244837A1; WO2005106040A3; AU2005238486A1

Abstract

타겟 핵산 서열을 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 핵산 증폭 반응을 위해 조제하고, 그 샘플 제조의 유효성을 검증하는 방법은, 샘플을 샘플 조제 대조군과 혼합하는 것을 포함한다. 샘플 조제 대조군은 마커 핵산 서열을 함유하는 세포, 포자, 미생물 또는 바이러스이다. 샘플 조제 대조군과 혼합된 샘플은 용해 처리되고, 용해 처리에 의해 유리된 핵산은 핵산 증폭 조건에 노출된다. 이어서, 타겟 핵산 서열 및 마커 핵산 서열의 존재 여부가 결정된다. 마커 핵산 서열의 긍정적 검출은 샘플 조제 과정이 만족스러웠음을 나타내는 반면, 마커 핵산을 검출할 수 없으면 샘플이 부적절하게 조제되었음을 나타낸다.

Description

샘플 조제 제어를 위한 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR SAMPLE PREPARATION CONTROL}

본 발명은 일반적으로는 핵산 분석법(nucleic acid assay)에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 핵산 증폭을 위한 샘플을 조제(preparing)하고, 샘플 조제 과정의 무결성(integrity)을 검증하는 장치 및 방법에 관한 것이다.

핵산을 증폭시키는 방법은 사람의 병원균을 검출하고, 사람의 유전적 다형(genetic polymorphism)을 검출하며, RNA 및 DNA 서열을 검출하고, 분자를 복제하며, 그리고 핵산을 서열화(sequencing)하는 등에 유용한 수단을 제공한다. 특히, 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction : PCR)이 DNA 서열의 복제, 법의학, 친부 확정 검사, 병원균 확인, 질병 진단, 그리고 핵산 서열의 증폭이 요구되는 다른 유용한 방법에서 중요한 수단이 되었다[예를 들면, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification(Erlich 등, 1992) 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis 등, 1990) 참조].

관심 대상의 핵산 서열을 함유하고 있는 것으로 여겨지는 샘플의 분석은 일련의 샘플 준비 단계를 수반하며, 이들 단계에는 여과, 세포 용해, 핵산 정화, 및 시약과의 혼합을 포함할 수 있다. 핵산 분석 결과에 대한 확신을 갖기 위해서는 샘플 준비 과정의 무결성에 대한 제어가 유용할 것이다. 이와 관련된 과제 및 기타 과제를 본 발명에서 해결한다.

하나의 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 증폭 반응을 위해 샘플을 조제하고, 샘플 조제의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다. 샘플은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 타겟 실체(target entities)를 함유하는 것으로 여겨지며, 이 타겟 실체는 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함한다. 상기 방법은, 샘플과 샘플 조제 대조군(sample preparation controls)과 혼합하는 혼합 챔버를 갖는 장치 안으로 샘플을 도입하는 단계를 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제 대조군은 마커 핵산 서열을 포함한다. 상기 장치는 또한 용해 챔버(lysing chamber)와 반응 챔버를 구비한다. 샘플은 혼합 챔버에서 샘플 조제 대조군과 혼합된다. 상기 방법은 또한 샘플 조제 대조군 및 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체를 용해 챔버에서 용해 처리하는 단계와, 용해 챔버 내에 유리(遊離)된 핵산을 반응 챔버 내에서 핵산 증폭 조건에 노출시키는 단계와, 적어도 하나의 타겟 핵산 서열 및 마커 핵산 서열의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 마커 핵산 서열의 긍정적 검출은 샘플 조제 과정이 만족스러웠음을 나타내는 반면, 마커 핵산을 검출할 수 없으면 샘플이 부적절하게 조제되었음을 나타낸다.

몇몇 실시예에서, 용해 챔버는 고상 물질을 수용하며, 상기 방법은 용해 처리 전에 샘플 조제 대조군 및 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체를 고상 물질에 의해 포획하도록, 샘플 조제 대조군과 혼합된 샘플이 용해 챔버를 통해 흐르도록 하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 고상 물질은 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함한다. 샘플은 이 샘플과 샘플 조제 대조군을 혼합하기 전에 (예를 들면, 조대한 물질(coarse material) 을 제거하기 위해) 예비 여과될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 사용하여 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함한다. 용해 처리는 선택적으로는 용해 챔버 내에서 비드(bead)를 교반시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 포자이다. 몇몇 실시예에서, 혼합 단계는 샘플 조제 대조군을 함유하는 건조 비드를 분해하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 화학적 용해제와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 핵산 증폭 조건은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 조건을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 마커 핵산 서열의 존재 여부는 마커 핵산 서열에 결합될 수 있는 프로브(probe)로부터의 신호가 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출된다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 증폭 반응을 위해 샘플을 조제하고, 그 샘플 조제의 유효성을 검증하는 장치를 제공한다. 샘플은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 타겟 실체를 함유하는 것으로 여겨지며, 이 타겟 실체는 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함한다. 상기 장치는, 샘플과 혼합될 샘플 조제 대조군을 수용하는 제1 챔버가 있는 본체를 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물, 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제 대조군은 마커 핵산 서열을 포함한다. 상기 본체는 또한 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체 및 샘플 조제 대조군을 용해 처리하여 이들로부터 핵산을 유리시키는 용해 챔버를 포함하다. 상기 본체는 또한 증폭 및 검출을 위해 핵산을 유지하는 반응 챔버를 포함한다. 상기 장치는 샘플 조제 대조군과 혼합된 샘플을 제1 챔버에서 용해 챔버 안으로 흐르도록 안내하며, 용해 챔버에서 유리된 핵산을 반응 챔버 안으로 흐르도록 안내하는 적어도 하나의 흐름 제어기를 더 포함한다. 상기 장치는 또한 마커 핵산 서열 및 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브를 수용한다.

몇몇 실시예에서, 용해 챔버는 샘플이 용해 챔버를 통해 흐를 때에, 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체 및 샘플 조제 대조군을 포획하는 고상 물질을 수용하며, 상기 장치는 용해 챔버를 통해 흐른 사용된 샘플 유체를 수용하는 적어도 하나의 폐기 챔버를 더 포함하며, 상기 적어도 하나의 흐름 제어기는 또한 용해 챔버를 통해 흐른 사용된 샘플 유체를 폐기 챔버로 흐르도록 안내할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 고상 물질은 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 장치는 용해 챔버에 초음파를 제공하기 위해 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 장치는 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 파열시키기 위해 용해 챔버 내에 비드를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 포자이다. 몇몇 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 액체 내에 분해될 수 있는 건조 비드 상태로 있다. 몇몇 실시예에서, 프라이머 및 프로브는 액체 내에 분해될 수 있는 건조 비드 상태로 반응 챔버 내에 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 본체는 반응 챔버에 연결된 혼합 챔버를 포함하며, 프라이머와 프로브는 액체 내에 분해될 수 있는 건조 비드 상태로 혼합 챔버 내에 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 용해 과정의 유효성을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로부터 이루어진 군으로부터 선택된 타겟 실체를 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 샘플 조제 대조군과 혼합하는 단계를 포함한다. 타겟 실체는 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함한다. 샘플 조제 대조군은 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이 샘플 조제 대조군은 마커 핵산 서열을 포함한다. 샘플 조제 대조군과 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체의 혼합물은 용해 처리된다. 상기 방법은 또한 용해 처리 중에 샘플 조제 대조군으로부터 핵산이 유리되었는지를 결정하도록 마커 핵산 서열의 존재 여부를 검출하는 단계를 더 포함한다. 마커 핵산 서열의 긍정적 검출은 샘플 조제 과정이 만족스럽다는 것을 나타내는 반면, 마커 핵산을 검출할 수 없으면 샘플이 부적절하게 조제되었음을 나타낸다.

몇몇 실시예에서, 상기 방법은 용해 처리 전에, 샘플 조제 대조군 및 샘플 내에 존재하는 경우의 타겟 실체를 고상 물질에 의해 포획하기 위해, 샘플 조제 대조군과 혼합된 샘플이 고상 물질을 수용하는 챔버를 통해 흐르게 하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 고상 물질은 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플은 샘플과 샘플 조제 대조군을 혼합하기 전에 예비 여과될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 또한 샘플 조제 대조군 및 타겟 실체를 파열시키기 위해 비드를 교반시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 포자이다. 몇몇 실시예에서, 혼합 단계는 샘플 조제 대조군을 함유하는 건조 비드를 분해하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 용해 처리는 화학적 용해제와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 마커 핵산 서열은 마커 핵산 서열을 (예를 들면, PCB에 의해) 증폭시키고, 증폭된 마커 핵산 서열을 검출함으로써 검출된다. 몇몇 실시예에서, 마커 핵산 서열은 마커 핵산 서열에 결합될 수 있는 프로브로부터의 신호가 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 유체 제어 및 처리 장치의 사시도이며,

도 2는 도 1의 장치의 다른 사시도이고,

도 3은 도 1의 장치의 분해도이며,

도 4는 도 2의 장치의 분해도이고,

도 5는 도 1의 장치 중 유체 제어 장치 및 가스켓의 입면도이며,

도 6은 도 5의 유체 제어 장치 및 가스켓의 저면도이고,

도 7은 도 5의 유체 제어 장치 및 가스켓의 평면도이며,

도 8은 도 7의 선 8-8을 따라 취한 로터리식 유체 제어 장치의 단면도이고,

도 9a 내지 도 9ll은 도 1의 유체 제어 및 처리 장치를 사용하여 유체를 제 어하고 처리하는 특정 프로토콜을 나타내는 평면도 및 단면도이며,

도 10은 피스톤 조립체의 단면도이고,

도 11은 사이드 필터링 챔버의 단면도이다.

도 1 내지 도 4에서는 복수 개의 챔버(13)가 있는 하우징(12)을 포함하는 유체 제어 및 처리 장치(10)를 도시하고 있다. 도 1에는 예시를 위해 노출된 챔버(13)가 도시되어 있다. 이 챔버(13)를 폐쇄하도록 상부 커버가 통상 마련될 것이다. 도 3 및 도 4에 가장 잘 도시한 바와 같이, 유체 제어 장치(16) 및 반응 용기(18)가 하우징(12)의 서로 다른 부분에 연결되어 있다. 도시된 실시예에서의 유체 제어 장치는 로터리식 유체 제어 밸브(16)이다. 이 밸브(16)는 디스크부(22)와 관형부(24)를 갖는 밸브체(20)를 포함한다. 디스크부(22)는 도 3에 가장 잘 도시한 바와 같이 대체로 평탄한 외부 포트면(23)을 갖고 있다. 밸브(16)는 하우징(12)에 대해 회전할 수 있다. 하우징(12)은 밸브(16)의 디스크부(22)의 외부 포트면(23)에 면하는 복수 개의 챔버 포트(25)를 포함하고 있어, 챔버(13)와 밸브(16) 간에 유체 연통을 허용한다. 선택적 시일 또는 가스켓(26)이 디스크부(22)와 하우징(12) 사이에 배치된다. 디스크부(22)는 또한 필터(27), 외벽(28), 치(齒)형 주변부(29)를 더 포함한다.

도 4에 도시한 바와 같이, 디스크부(22)는 용해 챔버(3)를 포함한다. 이 용해 챔버(30)는 용해될 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물을 포획하는 고상 물질을 수용할 수 있다. 적절한 고상 물질로는, 필터, 비드, 섬유, 맴브레인, 여과지, 유 리솜, 폴리머, 또는 겔이 있으며, 이들에 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서, 고상 물질은 용해될 타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물을 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 필터이다.

도 5 내지 도 8에 도시한 바와 같이, 외벽(28)은 용해 챔버(30)와 밸브(16)의 디스크부(22)의 바닥 단부를 둘러싼다. 도 8에서, 용해 챔버(30)는 제1 유체 처리 채널(34)에 결합된 제1 유체 처리 포트(32) 및 제2 유체 처리 채널(38)에 결합된 제2 유체 처리 포트(36)를 포함한다. 제1 유체 처리 채널(34)은 외부 포트면(23)의 제1 외부 포트(42)에서 종결되는 제1 외부 도관(40)에 결합되는 한편, 제2 유체 처리 채널(36)은 외부 포트면(23)의 제2 외부 포트(46)에서 종결되는 제2 외부 도관(44)에 결합되어 있다. 유체 변위 채널(48)(fluid displacement channel)이 그 일단부 근방에서 제1 유체 처리 채널(34) 및 제1 도관(40)에 결합되며, 타단부에서 유체 변위 챔버(50)에 결합된다. 제1 외부 도관(40)은 제1 유체 처리 채널(34)과 유체 변위 채널(48) 중 어느 하나 또는 양자 모두와 제1 외부 포트(42) 간에 유체 연통을 허용하는 공통 도관으로서 기능을 한다. 용해 챔버(30)는 유체 변위 챔버(50)와 연속된 유체 연통을 이루고 있다.

도 6 내지 도 8에 도시한 바와 같이, 외부 포트(42, 46)는 밸브(16)의 축선(52)에 대해 약 180°만큼 서로로부터 각도 방향으로 간격을 두고 있다. 외부 포트(42, 46)는 축선(52)으로부터 동일한 거리만큼 반경 방향으로 떨어져 있다. 축선(52)은 외부 포트면(23)에 대해 수직이다. 다른 실시예에서는 외부 포트(42, 46) 간의 각도 방향 간격은 다를 수 있다. 디스크부(22)에서의 채널의 구성은 다 른 실시예에서는 다를 수 있다. 예를 들면, 제1 유체 처리 채널(34) 및 제1 외부 도관(40)은 기울어져 제1 유체 변위 챔버(50)와 직접 연결될 수 있고, 이에 의해 제1 유체 변위 채널(48)을 제거할 수 있다. 제2 유체 변위 채널(38) 또한 기울어져 제2 유체 처리 포트(36)와 제2 외부 포트(46) 사이에서 직선으로 연장할 수 있고, 이에 의해 제2 외부 도관(44)을 제거할 수 있다. 게다가, 보다 많은 채널 및 외부 포트가 밸브(16)에 마련될 수도 있다. 도 3에 가장 잘 도시한 바와 같이, 바람직하게는 교차 채널 또는 홈(56)이 외부 포트면(23)에 마련된다. 홈(56)은 만곡되어, 바람직하게는 일정 반경만큼 축선(52)으로부터 간격을 두고 있다. 하나의 실시예에서, 홈(56)은 축선(52)으로부터 동일한 반경 상에 놓인 원호이다. 아래에서 보다 상세하게 논의하는 바와 같이, 홈(56)은 용기를 충전하는 데에 사용된다.

도 8에 도시한 바와 같이, 유체 변위 챔버(50)는 실질적으로 밸브(16)의 관형부(24) 내에 배치되어, 디스크부(22) 안으로 부분적으로 연장한다. 플런저 또는 피스톤(54) 형태의 유체 변위 부재가 챔버(50) 내에 이동 가능하게 배치된다. 피스톤(54)이 위쪽으로 이동할 때에, 챔버(50)의 체적이 팽창하여, 그 챔버(50) 안으로 유체를 빨아들이는 흡인력을 생성한다. 피스톤(54)이 아래쪽으로 이동하는 경우, 챔버(50)의 체적이 감소하여, 유체를 챔버(50) 밖으로 내보낸다.

로터리 밸브(16)가 도 1 내지 도 4의 하우징(12)에 대해 축선(52)을 중심으로 회전함에 따라, 외부 포트(42, 46) 중 하나는 개방되어, 챔버(13) 또는 반응 용기(18) 중 하나와 유체 연통하게 되거나, 두 외부 포트(42, 46)가 모두 차단 또는 폐쇄될 수 있다. 이 실시예에서, 기껏해야 외부 포트(42, 46) 중 하나만이 챔버 또는 반응 용기(18) 중 하나와 유체 연통한다. 다른 실시예는 외부 포트(42, 46) 모두가 개개의 챔버 또는 반응 용기(18)와 유체 연통할 수 있도록 구성될 수 있다. 따라서, 밸브(16)는 하우징(12)에 대해 회전하여, 외부 포트(42, 46)가 챔버(13) 및 반응 용기(18)를 포함한 복수 개의 챔버와 유체 연통 상태로 선택적으로 배치될 수 있게 해준다. 외부 포트(42, 46)가 개방 또는 폐쇄되었는가의 여부와, 피스톤(54)이 위쪽 또는 아래쪽으로 이동하였는가에 따라, 밸브(16) 내에서의 유체의 흐름은 방향이 변경될 수 있고, 외부 포트(42, 46)는 유입 포트인 상태에서 유출 포트인 상태로 각각 전환될 수 있고, 유체 흐름은 처리 영역(30)을 통과하거나 용해 챔버(30)를 우회할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 외부 포트(42)는 용해 챔버(30)의 유입구측이 이 용해 챔버(30)의 유출구측보다 유체 변위 챔버(540에 더 근접하도록 유입 포트를 이룬다.

도 9a 내지 도 9ll에서는 하나 이상의 타겟 실체(예를 들면, 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물)를 함유하고 있는 것으로 여겨지는 샘플의 핵산 분석을 실행하기 위한 밸브(16)의 작동을 도시하고 있다. 타겟 실체는 샘플에서 테스트하기 위한 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함한다. 샘플은 카트리지로 구성될 수 있는 유체 제어 및 처리 장치(10)의 하우징(12) 안으로 각종 기구에 의해 수작업으로 또는 자동화 방식으로 도입될 수 있다. 수작업의 경우, 소정 측정된 체적의 물질을 유입 포트를 통해 하우징(12)의 수용 용역(예를 들면, 복수 개의 챔버 중 하나) 내에 배치하고, 이어서 마개를 포트 위에 배치한다. 대안적으로, 수용 영역을 고무 또는 유사한 배리어(barrier)로 덮고, 그 배리어를 바늘로 뚫고 그 바늘을 통해 샘 플을 주입함으로써 샘플이 수용 영역 안으로 주입된다. 대안적으로, 분석을 위해 필요로 하는 것보다 많은 양의 샘플이 하우징(12) 내에 넣어진 경우, 하우징(12) 내의 소정 기구가 지정된 프로토콜을 위해 필요한 샘플을 정확하게 계량하여 나눌 수 있다.

조직 생검 물질(tissue biopsy material), 토양, 배설물, 삼출물 또는 다른 복잡한 물질과 같은 소정 샘플을 다른 장치 또는 액세서리 내에 배치하고, 이어서 그러한 보조 장치 또는 액세서리를, 혼합, 분할 또는 추출과 같은 기능을 수행하는 기계적 작용을 초래하는 하우징 내에 배치하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 조직의 조각을 유입 포토의 마개로서 기능을 하는 보조 장치의 루멘(lumen) 내에 배치할 수 있다. 그 마개를 포트 안에 눌러 넣게 되면, 조직은 메쉬를 통과하게 되어 슬라이싱(slicing)되거나 분할된다.

자동화 방식의 샘플 도입의 경우, 하우징 또는 카트리지의 추가적인 구조적 특징이 채용되며, 대부분의 경우 하우징 내에 직접 샘플 채집 기능이 부여된다. 사람의 리트로바이러스 병원체 등의 작업자 및 주변 환경에 유해할 위험성을 갖는 것과 같은 특정 샘플에 있어서, 샘플을 하우징으로 이동시키는 것은 위험성을 지닐 수 있다. 따라서, 하나의 실시예에서, 하우징 안으로 바로 샘플을 이동시키는 수단을 제공하도록 상기 장치에는 주사기 또는 빨대(sipper)가 포함될 수 있다. 대안적으로, 상기 장치는 샘플을 채취하는 데에 사용될 수 있는 조립체를 형성하는 정맥 바늘 및 튜브를 포함할 수 있다. 채집 후에, 튜브와 바늘은 제거되어 폐기되고, 그 후에 하우징(12)이 처리를 행하는 장비 내에 배치된다. 이러한 기법의 이 점은 조작자 또는 주변 환경이 병원체에 노출되지 않는다는 이점을 갖는다.

유입 포트는 의도된 샘플의 성질에 따라 적절한 사람의 인자를 고려하여 설계될 수 있다. 예를 들면, 호흡기 샘플은 기침을 통한 가래와 같이 하기도(lower respiratory tract)로부터 얻을 수 있다. 또한, 면봉 또는 브러시 샘플이 장치 내에 배치될 수 있다. 전자의 경우, 유입 포트는 환자가 바로 하우징(12) 안으로 기침할 수 있도록 설계되거나, 하우징 안으로 뱉어진 샘플의 분리를 용이하게 하도록 설계될 수 있다. 브러시 또는 면봉 샘플의 경우, 브러시 또는 면봉을 상기 장치(10)의 챔버 중 하나에 배치하고, 샘플을 예를 들면 물 또는 기타 적합한 용리 유체(elution fluid)를 사용하여 브러시 또는 면봉으로부터 녹여 분리하는 것이 바람직하다. 게다가, 하우징(12)은 샘플을 수용한 챔버 내에서 면봉 또는 브러시의 단부의 절단 및 유지를 용이하게 하는 구성을 포함할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 하우징(12)은 샘플 물질이 하우징(12) 안으로 흘러 들어올 수 있도록 샘플 풀(pool) 내에 배치될 수 있는 하나 이상의 튜브 또는 빨대를 포함한다. 대안적으로, 친수성 심지 물질이 상기 장치 안으로 샘플을 빨아들이는 기능을 할 수 있다. 예를 들면, 카트리지 전체를 샘플 내에 직접 담그고, 이에 의해 충분한 양의 샘플을 심지 물질 내로 흡수하여 하우징(12) 내로 빨아들을 수 있다. 그 후, 하우징을 제거하여 실험실로 운반하거나 휴대용 장비를 사용하여 바로 분석할 수 있다. 다른 실시예에서, 배관을 사용함으로써, 튜브의 일단부가 적어도 하나의 챔버와의 유체 인터페이스를 제공하도록 하우징과 직접 연통하고, 타단부가 샘플을 위한 수취부(receiver)로서 기능을 하도록 외부 환경에 접근할 수 있다. 그러면, 튜브는 샘플 내에 배치되어 빨대로서 기능을 할 수 있다. 이와 같이, 상기 장치는 각종 상이한 소스로부터 샘플을 포집하고 그 샘플을 하우징(12) 안으로 이동시키기 위한 각종 구성을 포함할 수 있어, 취급 조작 및 그 불편함을 감소시킬 수 있다.

도 9a 및 도 9aa에 있어서, 샘플이 예를 들면 피펫에 의해 혼합 챔버(60) 내에 넣어지고, 이어서 뚜껑이 챔버(60) 위에 배치된다. 그 샘플은 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 갖고 있는지를 결정하기 위해 테스트될 것이다. 이는 예를 들면 타겟 핵산 서열을 함유하고 있는 타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물을 용해시키는 것과 같은 샘플 조제 단계를 요구한다. 챔버(60)는 샘플과 혼합될 샘플 조제 대조군이 수용된다. 이 샘플 조제 대조군 또한 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물이다. 이 샘플 조제 대조군은 샘플에서 분석하기 위한 타겟 핵산 서열과는 다른 마커 핵산 서열을 함유하고 있다. 이 마커 핵산 서열은 나중에 분석 시에 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하는 경우의는 타겟 핵산 서열과 함께 반응 챔버(18) 내에서 검출될 것이다. 마커 핵산 서열을 검출하기 위해, 샘플 조제 대조군은 그들의 핵산을 유리시키도록 성공적으로 용해되어야 하며, 그 핵산은 증폭 시약과 성공적으로 혼합되어 증폭되어야 한다. 따라서, 샘플 조제 대조군은 그들이 검출될 수 있는 경우에 샘플 조제가 핵산 분석을 위해 적합한 것이었으며, 검출될 수 없는 경우에 부적합하였음을 나타낸다. 따라서, 샘플 조제 대조군은 그들이 긍정적으로 검출될 수 있는 경우 샘플 조제가 유효하였음을 입증하여, 사람들이 분석 결과에 대해 확신을 가질 수 있게 한다.

하나의 바람직한 실시예에서, 샘플 조제 대조군은 증폭되고 검출될 특정 마커 핵산 서열을 함유하고 있는 포자이다. 예를 들면, 특정 핵산 서열을 함유하고 있는 2,000 내지 10,000개의 포자가 일반적으로 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 6,000개의 포자가 샘플 조제 대조군으로서 사용된다. 포자는 샘플 조제의 용해 단계가 유효하다는 것을 증명하기 위해, 외부적인 핵산을 단지 흐트러뜨리는 것이 아니라 외부 핵산이 없도록 세정되어야 한다. 게다가, 샘플 조제 대조군은 액체에서 신속하게 분해될 수 있는 동결 건조 또는 건조 비드 상태로 하우징(12)의 챔버 중 하나의 챔버 내에 저장되는 것이 바람직하다. 그러한 비드를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 것으로서, 개시 내용이 참조로 본 명세서에서 합체된 미국 특허 번호 제5,593,824호 및 2003년 9월 25일자로 출원된 동시 계속 미국 특허 출원 제10/672,266호에 개시되어 있다.

타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물을 함유하는 것으로 여겨지는 샘플은 챔버(60)에서 샘플 조제 대조군과 혼합된다. 혼합은 바람직하게는 샘플 조제 대조군을 함유한 건조 비드를 샘플 유체 내에 분해시킴으로써 달성한다. 제1 외부 포트(42)는 밸브(16)가 회전되어 챔버(60)와 유체 연통 상태로 배치되며, 피스톤(54)은 위로 당겨져, 유체 샘플을 챔버(60)에서부터 제1 외부 도관(40) 및 유체 변위 채널(48)을 통해 유체 변위 챔버(50)로 빨아 당겨, 용해 챔버(30)를 우회시키고 있다. 간략화를 위해, 도 9a 내지 도 9ll에서 피스톤(54)은 도시하지 않았다. 이어서, 밸브(16)가 회전하여, 제2 외부 포트(46)를 도 9b 및 도 9bb에 도시한 바와 같이 폐기 챔버(64)와 유체 연통 상태로 배치한다. 피스톤(54)은 아래쪽으로 눌러, 샘플 조제 대조군과 혼합된 유체 샘플을 용해 챔버(30)를 통해 폐기 챔버(64)로 보낸다. 특정 실시예에서, 용해 챔버(30)는 샘플 유체가 용해 챔버(30)를 통과할 때에, 샘플 조제 대조군을 포획할 뿐만 아니라 샘플 내에 존재한다면 타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물도 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터(27)를 포함한다. 이러한 이유로, 샘플 조제 대조군은, 타겟 실체가 샘플 내에 존재한 경우, 그 타겟 실체의 여과가 성공적이었다는 것을 입증하기 위해, 샘플 내의 타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물보다 약간 작거나 대략 동일한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 대안적인 실시예에서, 다른 고상 물질이 용해 챔버(30) 내에 제공될 수 있다.

도 9c 및 도 9cc에서, 밸브(16)가 회전되어, 제1 외부 포트(42)를 세척 챔버(66)와 유체 연통 상태로 배치시키며, 피스톤(54)은 위쪽으로 당겨져, 세척 유체를 세척 챔버(66)에서부터 유체 변위 챔버(50)로 빨아 당겨, 용해 챔버(30)를 우회시키고 있다. 이어서, 밸브(16)가 회전하여, 제2 외부 포트(46)를 도 9d 및 도 9dd에 도시한 바와 같이 폐기 챔버(64)와 유체 연통 상태로 배치한다. 피스톤(54)은 아래쪽으로 눌려, 세척 유체를 용해 챔버(30)를 통해 폐기 챔버(64)로 보낸다. 전술한 세척 단계는 필요에 따라 반복될 수 있다. 밸브 내의 원하지 않는 찌꺼기를 제거하기 위해 중간 세척이 사용된다.

도 9e 및 도 9ee에서, 밸브(16)가 회전하여, 제1 외부 포트(42)를 버퍼 챔버(70)와 유체 연통 상태로 배치하며, 피스톤(54)은 위쪽으로 당겨져, 용해 버퍼(lysis buffer)(예를 들면, 물 또는 용해제와 혼합된 물)를 버퍼 챔버(70)에서부 터 유체 변위 챔버(50) 안으로 빨아 당겨, 용해 챔버(30)를 우회시키고 있다. 이어서, 밸브(16)가 회전하여, 제2 외부 포트(46)를 도 9f 및 도 9ff에 도시한 바와 같이 폐기 챔버(64)와 유체 연통 상태로 배치한다. 피스톤(54)은 아래쪽으로 눌려, 버퍼 유체를 용해 챔버(30) 안으로 보낸다. 도 9g 및 도 9gg에서, 밸브(16)가 회전하여 외부 포트(42, 46)를 폐쇄하고 있다.

샘플 조제 대조군과 존재한다면 타겟 세포, 바이러스, 포자 또는 미생물도 용해 챔버(30)에서 용해 처리를 겪게 된다. 용해 처리의 목적은 샘플 조제 대조군과 존재하는 경우의 타겟 세포, 바이러스, 포자 또는 미생물의 외벽을 파괴하여 그들의 핵산이 유리될 수 있게 하는 것이다. 샘플 조제 대조군은 용해 처리가 유효하였다는 것을 입증하기 위해 타겟 세포, 바이러스, 포자 또는 미생물보다 용해되기에 보다 어렵거나, 동일한 수준의 어려움을 갖는 것이 바람직하다. 세포, 바이러스, 포자 또는 미생물로부터의 핵산의 유리와 DNA 결합 단백질의 변성은 일반적으로 화학적, 물리적, 전해적 용해 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 화학적 방법은 일반적으로 용해제(lysing agent)를 사용하여 세포를 파열시키고 그 세포로부터 핵산을 추출하며, 이어서 임의의 오염 단백질 또는 잠재적으로 방해가 되는 단백질을 변성시키기 위해, 구아니디움 이소티오시아네이트(guanidinium isothiocyanate) 또는 요소와 같은 카오트로픽염(chaotropic salts)에 의해 추출 처리를 한다. 화학적 추출 및/또는 변성 방법이 사용되는 경우, 적합한 용해제는 챔버(70) 내에 저장되고 용해 챔버(30) 내로 펌핑되는 용해 버퍼 내에 있는 것이 바람직하다.

대안적으로, 물리적 방법이 핵산을 추출하고, DNA 결합 단백질을 변성시키는 데에 사용될 수 있다. 사실상 참조로서 본 명세서에 완전히 합체된 미국 특허 제5,304,487호에 세포막을 뚫고 그 내용물을 추출하기 위해, 마이크로 채널 내의 물리적 돌기를 사용하거나 챔버 또는 채널 내의 예리한 모서리를 갖는 입자를 사용하는 것이 논의되어 있다. 교반을 위한 압전 소자와 그러한 구조의 조합은 용해를 위해 적합한 전단력을 제공할 수 있다. 세포 추출의 보다 통상의 방법으로는, 예를 들면 제한된 단면 치수를 갖는 채널을 채용하여, 샘플이 충분한 유동 압력으로 그 채널을 통과할 때에 세포 용해를 초래하도록 하는 것을 사용할 수도 있다. 대안적으로 세포 추출 및 오염 단백질의 변성은 교류 전류를 인가함으로써 수행될 수도 있다. 예를 들면, 세포를 초음파로 교반시키거나 세포를 미세 구조의 구멍을 통과하도록 강제하거나 하여 세포에 파열을 초래할 높은 전단력을 가하는 것을 비롯한 각종 다른 방법들이 세포의 용해/추출을 위해 본 발명의 장치 내에서 활용될 수 있다.

하나의 바람직한 실시예에서, 용해 처리는 용해 챔버(30)의 외벽(28)에 결합된 초음파 트랜스듀서(76)를 사용하여 용해 챔버(30)에 초음파를 가하는 것을 포함한다. 초음파 트랜스듀서(76), 바람직하게는 초음파 호온은 벽(28)과 접촉하게 배치되어, 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물의 용해를 촉진시키도록 초음파 에너지를 용해 챔버(30) 안으로 전달한다. 적합한 초음파 호온은 미국 코네티컷주 06470-1614 뉴톤 처치 힐 53에 사무소를 갖고 있는 Sonics & Materials사로부터 구입할 수 있다. 대안적으로, 초음파 트랜스듀서는 압전 디스크 또는 벽(28)에 결합 할 수 있는 임의의 다른 형태의 초음파 트랜스듀서를 포함할 수 있다. 게다가, 비드(예를 들면, 글라스 또는 폴리스티렌 비드)가 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물을 파열시키도록 용해 챔버(30) 내에서 교반되는 것이 바람직하다. 벽(28)에 대고 트랜스듀서(76)를 진동시킴으로써 생성된 압력파 또는 압력 펄스는 비드가 용해 버퍼 내에서 밸러스틱 모션(ballastic motion)으로 이동하게 하여, 파열을 초래한다. 초음파 트랜스듀서를 채용하는 이들 실시예에서, 용해 버퍼는 탈이온수와 같은 초음파 전달 매체이다. 용해 버퍼는 용해를 보조하도록 1종 이상의 용해제를 포함할 수 있다. 현재의 바람직한 실시예에서, 벽(28)은 개시 내용이 참조로서 본 명세서에 합체된 2001년 10월 4일자로 출원된 동시 계속 미국 특허 출원 제09/972,221호에 기재된 바와 같은 편향 가능한 플라스틱 벽이다.

도 9h 및 도 9hh에서, 밸브(16)는 회전하여 제2 외부 포트(46)를 시약 챔버(78)와 유체 연통하게 배치하며, 피스톤(54)은 아래쪽으로 눌려, 용해 챔버(30) 내의 용해물를 시약 챔버(78)로 용리시키고 있다. 시약 챔버(78)는 샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 1종 이상의 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위해 필요로 하는 핵산 증폭 시약 및 프로브(예를 들면, 효소, 프라이머 및 형광 프로브) 모두를 수용하는 것이 바람직하다. 임의의 과잉 용해물은 밸브(16)를 회전시켜 제2 외부 포트(46)를 도 9i 및 도 9ii에 도시한 바와 같이 폐기 챔버(64)와 유체 연통하게 배치한 후에, 제2 외부 포트(46)를 통해 폐기 챔버(64) 안으로 분배된다. 용해 챔버(30)에서 방출된 핵산을 함유하고 있는 용해물은 이어서 시약 챔버(78)에서 혼합된다. 이는 도 9j 및 도 9jj에 도시한 바와 같 이 유체 변위 챔버(50)를 시약 챔버(78)와 유체 연통하게 배치하고, 피스톤(54)을 아래위로 이동시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 처리 영역(30)에서의 필터를 통한 혼합물의 토글링(toggling)은 필터에 갇힌 큰 입자들을 방해가 되지 않는 곳으로 일시적으로 이동시켜, 보다 작은 입자가 통과할 수 있게 한다.

샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 시약 및 프로브는 액체 내에 신속하게 분해할 수 있는 동결 건조 또는 건조 비드 상태로 챔버(78) 내에 저장되는 것이 바람직하다. 그러한 비드를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 것으로서, 개시 내용이 참조로서 본 명세서에서 합체된 미국 특허 번호 제5,593,824호 및 2003년 9월 25일자로 출원된 동시 계속 미국 특허 출원 제10/672,266호에 개시되어 있다. 대안적인 실시예에서, 시약 및 프로브는 반응 용기(18)의 반응 챔버 내에 저장된다.

도 9k, 도 9kk 및 도 9kkk에서, 밸브(16)는 회전하여 제1 외부 포트(42)를 반응 용기(18)에 연결된 제1 분기부(84)와 유체 연통하게 배치하는 한편, 반응 용기(18)에 결합된 제2 분기부(86)는 교차 홈(56)과 유체 연통하게 배치되어 있다. 제1 분기부(84) 및 제2 분기부(86)는 밸브(16)의 축선(52)으로부터 상이한 반경에 배치되어, 제1 분기부(84)는 제1 외부 포트(42)와 공통 반경을 가지며 제2 분기부(86)는 교차 홈(56)과 공통 반경을 갖는다. 이 교차 홈(56)은 또한 시약 챔버(78)(도 9k 참조)와 유체 연통하여, 시약 챔버(78)와 제2 분기부(86) 사이에 교차 흐름(crossover flow)을 제공하도록 그 사이의 간극을 가교(bridging)하는 기능을 한다. 외부 포트는 축선으로부터 외부 포트 반경 범위 내에 배치되며, 교차 홈 은 축선으로부터 교차 홈 반경 범위 내에 배치되고, 외부 포트 반경 범위와 교차 홈 반경 범위는 중첩되지 않는다. 교차 홈(56)을 외부 포트(42, 46)의 반경과는 다른 반경에 배치하면, 밸브(16)가 회전함에 따라, 외부 포트(42, 46)의 반경에서 밸브(16)와 하우징(12) 사이의 표면 근처의 영역에 존재할 수 있는 오염물에 의한 교차 홈(56)의 교차 오염(cross-contamination)이 방지되기 때문에 유익하다. 따라서, 외부 포트(42, 46)의 반경과 중첩되는 것을 비롯한 교차 홈의 다른 구성이 사용될 수 있지만, 도시한 실시예는 외부 포트(42, 46)의 반경에서 밸브(16)와 하우징(12) 사이의 표면 근처의 영역의 오염물로부터 교차 홈(56)을 격리시키는 바람직한 구성이다.

반응 용기(18)를 충전하기 위해, 피스톤(54)이 위쪽으로 당겨져 시약 챔버(78)의 반응 혼합물을 교차 홈(56) 및 제2 분기부(86)를 통해 반응 용기(18) 안으로 빨아 당긴다. 이어서, 밸브(16)가 회전하여, 도 9l 및 도 9ll에 도시한 바와 같이 제2 외부 포트(46)를 제1 분기부(84)와 유체 연통하게 배치하고 제1 외부 포트(42)를 폐쇄한다. 피스톤(54)은 아래쪽으로 눌려져, 반응 용기(18) 내부의 반응 혼합물을 가압한다. 반응 용기(18)는 핵산 증폭 및 검출을 위해 반응 혼합물을 유지하는 반응 챔버를 갖고 있다. 반응 챔버는 핵산의 증폭 및 검출을 수행하는 열 반응 슬리브 안으로 삽입될 수 있다. 2개의 분기부(84, 86)는 반응 용기(18)의 반응 챔버를 채우고 비울 수 있게 한다. 반응 용기는 초음파 용접, 기계적 결합 등에 의해 하우징(12)에 연결되거나, 성형 등에 의해 하우징(12)에 일체로 형성될 수 있다.

반응 용기(18)의 반응 챔버 내의 반응 혼합물은 핵산 증폭 조건에 노출된다. 반응을 이용한 RNA 또는 DNA 템플릿(template)의 증폭은 공지되어 있다[미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis 등, 1990) 참조]. 열안정 효소(thermostable enzyme)를 이용하여 PCR에 의해 핵산을 증폭 및 검출하는 방법은 참조로 본 명세서에 합체된 미국 특허 제4,965,188호에 개시되어 있다. DNA의 PCR 증폭은 DNA를 열변성(heat-denaturation)시키고, 증폭될 DNA 분절에 측접하는 서열에 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하며, 어닐링된 프라이머를 DNA 중합 효소에 의해 연장시키는 것으로 이루어진 사이클의 반복을 수반한다. 프라이머는 타겟 서열의 대향하는 가닥(strand)에 교배되는 한편, 중합 효소에 의한 DNA 합성이 프라이머 사이의 영역에 걸쳐 진행되도록 배향되어, DNA 분절의 양을 효과적으로 두배로 만든다. 또한, 확장 생성물은 또한 보완적이며 프라이머를 결합할 수 있기 때문에, 개개의 연속적인 사이클은 이전 사이클에서 합성된 DNA의 양을 실질적으로 두배로 만든다. 이는 사이클 당 2n(여기서, n은 사이클 수)의 비율로 특정 타겟 분절의 지수적 축적을 가져온다. 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 및 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)과 같은 방법이 mRNA, cDNA, 게놈 라이브러리(genomic libraries) 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 타겟 DNA 서열의 핵산 서열을 직접 증폭시키는 데에 사용될 수 있다.

등온 증폭 반응이 또한 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 등온 증폭 반응의 예로는, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA)[Walker 등, Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6(1992); Walker, PCR Methods Appl 3(1):1-6(1993) 참조], 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification)[Phyffer 등, J. Clin. Microbiol. 34:834-841(1996); Vuorinen 등, J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995) 참조], 핵산 서열을 근거로 한 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA)[Compton, Nature 350(6313):91-2 참조], 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA)[Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch 등, Genet. Anal. 15(2):35-40(1999) 참조], 및 분지 DNA 신호 증폭(branched DNA signal amplification; bDNA)[예를 들면, Iqbal 등, Mol. Cell Probes 13(4):315-320(1999) 참조]가 있다. 당업계에 공지된 다른 증폭 방법으로는 CPR(Cycling Probe Reaction), SSR(Self-Sustained Sequence Replication), SDA(Strand Displacement Amplification), QBR(Q-Beta Replicase), Re-AMP(이전의 RAMP), RCR(Repair Chain Reaction), TAS(Transcription Based Amplification System), 및 HCS가 있다.

핵산 증폭 반응은 바람직하게는 용기(18) 내의 반응 혼합물을 증폭 반응에 필요한 온도로 가열 및/또는 냉각시키는 열처리 장비를 사용하여 수행한다. 그러한 열처리 장비는 또한 샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 검출하는 하나 이상의 검출 기구를 포함할 수 있다. 용기(18) 내의 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 광학적 검출기가 내장된 바람직한 열처리 장비가 개시 내용이 참조로서 본 명세서에 합체된 본 출원인 에게 양도된 미국 특허 제6,369,893호 및 제6,391,541호에 개시되어 있다. 또한, 반응 혼합물의 온도를 제어하고, 이 반응 혼합물에서 핵산 서열을 검출하기 위해 본 발명에 적합한 많은 기타 공지의 방법이 있다. 예를 들면, 핵산의 증폭 및 검출을 위한 다른 장비는 예를 들면 미국 특허 제5,958,349호, 제5,656,493호, 제5,333,675호, 제5,455,175호, 제5,589,136호, 및 제5,935,522호에 개시되어 있다.

또한 샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서열 및 샘플에서 테스트하기 위한 하나 이상의 타겟 핵산 서열의 검출은 프로브를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 반응 용기(18)는 광학적으로 검출될 수 있는 프로브로부터의 신호가 통과하는 하나 이상의 투명 또는 광투과성 벽을 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 교배 프로브(hybridization probe)가 핵산 서열을 검출 및 정량화하는 데에 사용될 수 있다. 핵산 교배 프로브를 채용하는 다양한 수많은 분석법이 있다. 이들 프로브 중 일부는 다른 분자 또는 반족(moiety)과의 상호 작용에서 변화로 인해 형광원의 형광 발광에서의 변화를 갖는 신호를 생성한다. 통상, 상호 작용은 상호 작용하는 분자 또는 반족과 형광원 사이의 거리를 변화시킴으로써 초래된다. 이러한 분석법은 신호 생성을 위해 형광 공명 에너지 전달, 즉 "FRET(fluorescence resonance energy transfer)"에 의존한다. FRET는 제1 형광원을 다른 형광원이거나 소광제(quencher)인 상호 작용하는 공명 에너지 억셉터로부터 떨어뜨리는 거리를 변화시킴으로서 초래된 형광 발광의 변화를 활용한다. 소광 분자 또는 반족을 비롯한 상호 작용하는 분자 또는 반족과의 형광원의 조합은 "FRET 쌍"으로 알려져 있다. FRET 쌍의 상호 작용 기구는 그 쌍의 하나의 요소의 흡수 스펙트럼이 다른 요소, 즉 제1 형광원의 방출 스펙트럼과 중첩될 것을 요구한다. 상호 작용하는 분자 또는 반족이 소광제인 경우, 그 흡수 스펙트럼은 형광원의 방출 스펙트럼과 중첩되어야 한다[Stryer, L., Ann. Rev. Biochem. 1978, 47(819-846); BIOPHYSICAL CHEMISTRY part II, Techniques for the Study of Biological Structure and Function(C. R. Cantor 및 P. R. Schimmel, eds, 1980) 페이지 448-455, 및 Selvin, P. R., Methods in Enzymology 246: 300-335 (1995) 참조]. 유효 또는 상당한 정도의 FRET 상호 작용은 FRET 쌍의 흡수 스펙트럼 및 방출 스펙트럼은 중첩의 정도가 클 것을 요구한다. FRET 상호 작용의 효율은 그러한 중첩에 선형적으로 비례한다[Haugland, R. P. , Yguerabide, Jr. , 및 Stryer, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 24-30 (1969) 참조]. 비FRET 프로브(non-FRET probes)가 또한 개시되어 있다[예를 들면, 미국 특허 제6,150,097호 참조].

증폭 생성물의 검출을 위한 다른 바람직한 방법으로는 5' 뉴클로아제 PCR 분석법(5' nuclease PCR assay)(TaqMan

분석법으로도 칭함)[Holland 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 88:7276-7280(1991); Lee 등, Nucleic Acids Res. 21:3761-3766 (1993)]. 이러한 분석법은 증폭 반응 중에 이중 형광 프로브(doubly labeled fluorogenic probe)("TaqMan

" 프로브)의 교배 및 분열에 의한 특정 PCR 생성물을 검출한다. 형광 프로브는 형광 리포터 염료(fluorescent reporter dye) 및 소광제 염료(quencher dye) 모두에 의해 표지화된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. PCR 중에, 이러한 프로브는 증폭될 분절이 교배되는 경우, 그리고 그 경우에 한해서만 DNA 중합 효소의 5'-엑소뉴클로제 활성에 의해 분열된다. 프로브의 분열은 리포터 염료의 형광 강도의 증가를 발생시킨다.

에너지 전이의 사용에 의존한 증폭 생성물 검출의 다른 방법으로는 Tyagi 및 Kramer[Nature Biotech. 14: 303-309 (1996) 참조]에 의해 개시되었고, 미국 특허 제5,119,801호 및 제5,312,728호의 주제이기도 한 "비콘 프로브(beacon probe)" 방법이 있다. 이 방법은 헤어핀 구조(hairpin structure)를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 교배 프로브를 채용한다. 교배 프로브의 하나의 말단(5' 말단 또는 3' 말단 중 하나)에는 도너 형광원이 있고, 다른 말단에는 억셉터 반족이 있다. Tyagi 및 Kramer 방법의 경우, 억셉터 반족은 소광제, 즉 억셉터는 도너에 의해 방출된 에너지를 흡수하지 그 자체로 발광하지는 않는다. 따라서, 비콘이 개방 형태(open conformation)로 있는 경우, 도너 형광원의 형광 발광은 검출할 수 있는 한편, 비콘이 헤어핀(폐쇄) 형태로 있는 경우 도너 형광원의 형광 발광은 소광된다. PCR에 채용할 경우, PCR 생성물의 가닥 중 하나에 교배되는 분자 비콘 프로브는 "개방 형태"로서 형광 발광이 검출되는 한편, 교배되지 않은 채로 유지되는 것들은 형광 발광을 하지 않을 것이다[Tyagi 및 Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306 (1996) 참조]. 결과적으로, 형광 발광의 양은 PCR 생성물의 양이 증가함에 따라 증가할 것이고, 이에 따라 PCR의 진척의 척도로서 사용될 수 있다.

샘플 내에 타겟 핵산 서열의 검출 또는 그것의 결여를 확신하기 위해, 샘플 조제의 무결성을 제어해야 한다. 이는 샘플 조제 대조군이 샘플 내의 타겟 실체(예를 들면, 타겟 핵산 서열을 함유하고 있는 타겟 세포, 포자, 바이러스 또는 미생물)와 동일한 처리를 받아야 하는 이유이다. 샘플 조제 대조군의 마커 핵산 서 열이 검출된다면, 샘플 조제는 만족스러운 것으로 간주된다. 마커 핵산 서열의 존재가 검출될 수 없다면, 샘플 조제는 부적절한 것으로 간주되며, 타겟 핵산 서열에 대한 테스트의 결과는 "미정"인 것으로 간주된다. 바람직하게는 마커 핵산 서열의 존재 여부는 마커 핵산 서열에 결합할 수 있는 교배 프로브로부터의 신호가 한계값, 예를 들면 분석법에 대해 유효한 것으로 간주되도록 만족하거나 초과해야 하는 미리 정해진 형광 발광의 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출된다.

도 3 내지 도 8의 밸브(16)를 작동시키기 위해, 스텝퍼 모터와 같은 모터가 통상 디스크부(22)의 치형 주변부(29)에 결합되어, 높은 정밀도로 유체를 분배하도록 밸브(16)를 하우징(12)에 대해 회전시킨다. 모터는 원하는 프로토콜에 따라 컴퓨터로 제어될 수 있다. 리니어 모터 등이 정확한 계량을 제공하기 위해 피스톤(54)을 정밀하게 상하로 구동하는 데에 사용될 수 있고, 이 또한 원하는 프로토콜에 따라 컴퓨터에 의해 제어될 수 있다.

단일 밸브를 사용하면 단지 하나의 실패 요소로 인해 높은 제조 수율을 생성할 수 있다. 유체 제어 및 처리 구성 부재의 통합은 컴팩트한 장치(예를 들면, 소형 카트리지 형태)를 얻을 수 있고, 성형 및 조립의 자동화를 용이하게 한다. 전술한 바와 같이, 그러한 시스템은 유리하게는 희석 및 혼합 능력, 중간 세척 능력 및 확실한 가압 능력을 포함할 수 있다. 시스템 내의 유체 경로는 시스템 내의 유체의 오염을 최소화하고 또 그러한 유체의 수용 및 제어를 용이하게 하도록 통상 폐쇄된다. 반응 용기는 편리하게는 분리 및 교환 가능하며, 몇몇 실시예에서는 폐기 가능하다.

유체 제어 및 처리 시스템의 구성 부재들은 사용되는 유체에 적합한 각종 재료로 이루어질 수 있다. 적합한 재료의 예로는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 아크릴 또는 나일론과 같은 폴리머 재료가 있다. 시스템 내의 각종 챔버, 채널, 포트 등은 다양한 형상 및 크기를 가질 수 있다.

도 10에는 피스톤 조립체(210)가 소량의 유체를 가압하도록 보다 작은 단면의 피스톤 샤프트(214)에 연결된 피스톤 로드(212)를 포함하고 있는 다른 실시예가 도시되어 있다. 가는 피스톤 샤프트(214)는 너무 긴 경우에 가해진 힘에 의해 굴곡될 수 있다. 피스톤 로드(212)는 배럴 또는 하우징(216)의 상부를 따라 이동하는 한편, 피스톤 샤프트(214)는 배럴(216)의 하부를 따라 이동한다. 피스톤 로드(212)의 이동은 피스톤 샤프트(214)의 이동을 안내하고 가해진 힘의 대부분을 흡수하여, 매우 작은 굽힘력이 가는 피스톤 샤프트(214)로 전달되게 한다.

도 11에는 샘플이 샘플 조제 대조군과 혼합되기 전에 예비 여과되는 또 다른 실시예가 도시되어 있다. 샘플은 상기 장치 내에 합체된 사이드 챔버(220)에서 예비 여과되는 것이 바람직하다. 사이드 챔버(220)는 입구 포트(222)와 출구 포트(224)를 포함한다. 이 예에서, 사이드 챔버(220)는 입구 포트(222)에 배치된 필터(226)를 포함한다. 샘플 유체는 예비 여과를 위해 입구 포트(222)를 통해 사이드 챔버(220) 안으로 흘러 출고 포트(224)를 통해 나오도록 안내된다. 이는 본 발명의 유체 제어 장치에 사용되는 유체 샘플 등을 여과할 수 있다. 유체는 필터(226)에 의한 여과를 보다 확실하게 달성하기 위해 재순환될 수도 있다. 이러한 예비 여과는 장치의 기타 부분에서 막힘을 초래할 수 있는 조대한 물질의 제거에 유용하다. 샘플을 예비 여과한 후에, 예를 들면 도 9c의 챔버(66) 내에서 또는 하우징(12)의 다른 챔버 내에서 샘플 조제 대조군과 혼합될 수 있다. 사이드 챔버를 사용하면, 예를 들면 밸브 및 상기 장치의 기타 챔버의 오염을 방지하는 데에 유리하다.

전술한 구성의 장치 및 방법은 단지 본 발명의 원리의 적용을 단지 예시하는 것으로서, 수많은 다른 실시예 및 수정예가 청구의 범위에서 정해지는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

예를 들면, 로터리 밸브 카트리지를 바람직한 실시예로서 설명하였지만, 본 발명의 샘플 조제 제어는 많은 다른 카트리지 구조에도 적합하다. 대안적인 카트리지 구조가 개시 내용이 참조로서 본 명세서에 합체된 미국 특허 제6,391,541호, 제6,440,725호, 6,168,948호에 개시되어 있다. 게다가, 로터리 밸브 카트리지가 사용되는 경우, 그 카트리지는 바람직한 실시예에서 도시한 것보다 많거나 적은 개수의 챔버를 가질 수 있고, 많은 다른 샘플 조제 프로토콜이 실행될 수 있다.

따라서, 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라, 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 의해 결정되어야 할 것이다.

Claims

세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함하는 타겟 실체(target entity)를 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 핵산 증폭 반응을 위해 조제하고 그 샘플 조제의 유효성을 검증하는 방법으로서,

a) 샘플을, ⅰ) 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며 마커 핵산 서열(marker nucleic acid sequence)을 포함하는 샘플 조제 대조군(sample preparation controls)과 상기 샘플을 혼합하는 혼합 챔버와, ⅱ) 용해 챔버와, ⅲ) 반응 챔버를 구비하는 장치 안으로 도입하는 단계와,

b) 상기 혼합 챔버 내에서 상기 샘플과 상기 샘플 조제 대조군을 혼합하는 단계와,

c) 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체를 상기 용해 챔버 내에서 용해 처리(lysis treatment)하는 단계와,

d) 상기 용해 챔버 내에 유리(遊離)된 핵산을 상기 반응 챔버 내에서 핵산 증폭 조건에 노출시키는 단계와,

e) 상기 타겟 핵산 서열 및 상기 마커 핵산 서열의 존재 여부를 검출하는 단계

를 포함하고, 상기 마커 핵산의 검출은 샘플 조제가 만족스러운 것임을 나타내는 것은 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 용해 챔버는 고상 물질을 수용하며, 상기 용해 처리 전에 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체를 상기 고상 물질에 의해 포획하도록, 상기 샘플 조제 대조군과 혼합된 상기 샘플이 상기 용해 챔버를 통과해 흐르게 하는 단계를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제2항에 있어서, 상기 고상 물질은 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제3항에 있어서, 상기 샘플과 상기 샘플 조제 대조군을 혼합하기 전에 샘플을 예비 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제3항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 사용하여 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제5항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 용해 챔버 내에서 비드를 교반시키 는 것을 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플 조제 대조군은 포자인 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합 단계는 상기 샘플 조제 대조군을 수용하는 건조 비드를 분해시키는 것을 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 사용하여 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제9항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 파열시키도록 상기 용해 챔버 내에서 비드를 교반하는 것을 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 용해 처리는 화학적 용해제(lysis agent)와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭 조건은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 조건을 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제1항에 있어서, 상기 마커 핵산 서열의 존재 여부는 마커 핵산 서열에 결합할 수 있는 프로브로부터의 신호가 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출되는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함하는 타겟 실체를 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 핵산 증폭 반응을 위해 조제하고 그 샘플 조제의 유효성을 검증하는 장치로서, 이 장치는,

a) 상기 샘플과 혼합될, 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며 마커 핵산 서열을 포함하는 샘플 조제 대조군을 수용하는 제1 챔버와,

b) 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체를 용해 처리하여 이들로부터 핵산을 유리시키는 용해 챔버와,

c) 증폭 및 검출을 위해 핵산을 유지하는 반응 챔버와,

d) 상기 샘플 조제 대조군과 혼합된 상기 샘플을 상기 제1 챔버에서부터 상기 용해 챔버로 흐르도록 안내하며, 상기 용해 챔버 내에 유리된 핵산을 상기 반응 챔버로 흐르도록 안내하는 적어도 하나의 흐름 제어기

를 갖는 본체를 포함하며, 상기 장치는 상기 마커 핵산 서열 및 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 또한 수용하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 용해 챔버는 샘플이 상기 용해 챔버를 통과해 흐를 때에, 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체를 포획하는 고상 물질을 수용하며, 상기 장치는 상기 용해 챔버를 통과해 흐른 사용한 샘플 유체를 수용하는 적어도 하나의 폐기 챔버를 더 포함하며, 상기 적어도 하나의 흐름 제어기는 또한 상기 용해 챔버를 통과해 흐른 사용한 샘플 유체를 상기 폐기 챔버로 흐르도록 안내할 수 있는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제15항에 있어서, 상기 고상 물질은 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제16항에 있어서, 상기 용해 챔버에 초음파를 가하도록 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제17항에 있어서, 상기 용해 챔버 내에 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 파열시키는 비드를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 샘플 조제 대조군은 포자인 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 샘플 조제 대조군은 액체 내에 분해될 수 있는 비드 상태로 있는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 프라이머 및 상기 프로브는 액체 내에 분해될 수 있는 건조 비드 상태로 상기 반응 챔버 내에 있는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 본체는 상기 반응 챔버에 연결된 시약 챔버를 포함하며, 상기 프라이머 및 상기 프로브는 액체에 분해될 수 있는 건조 비드 상태로 상기 혼합 챔버 내에 있는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제14항에 있어서, 상기 용해 챔버에 초음파를 가하도록 용해 챔버의 벽에 결합된 초음파 트랜스듀서를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
제23항에 있어서, 상기 용해 챔버 내에 상기 샘플 조제 대조군과 상기 타겟 실체를 파열시키기 위한 비드를 더 포함하는 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 장치.
용해 과정의 유효성을 결정하는 방법으로서,

a) 세포, 포자, 미생물 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되며 마커 핵산 서열을 포함하는 샘플 조제 대조군과, 세포, 포자, 바이러스 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되며 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 포함하는 타겟 실체를 함유하는 것으로 여겨지는 샘플을 혼합하는 단계와,

b) 상기 샘플 조제 대조군과 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체의 혼합물을 용해 처리하는 단계와,

c) 상기 용해 처리 중에 상기 샘플 조제 대조군으로부터 핵산이 유리되었는지를 결정하도록 상기 마커 핵산 서열의 존재 여부를 검출하는 단계

를 포함하며, 상기 마커 핵산 서열의 긍정적 검출은 용해가 만족스러운 것임을 나타내는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제25항에 있어서, 상기 샘플 조제 대조군과 혼합된 상기 샘플이 고상 물질을 수용하는 챔버를 통과해 흐르도록 하여, 용해 처리 전에 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 샘플 내에 존재하는 경우의 상기 타겟 실체를 상기 고상 물질에 의해 포획하도록 하는 단계를 더 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제26항에 있어서, 상기 고상 물질은 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 포획하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 적어도 하나의 필터를 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제27항에 있어서, 상기 샘플과 상기 샘플 조제 대조군을 혼합하기 전에 샘플을 예비 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제25항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 초음파 에너지에 노출시키는 것을 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제29항에 있어서, 상기 용해 처리는 상기 샘플 조제 대조군 및 상기 타겟 실체를 파열시키도록 비드를 교반시키는 것을 더 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제25항에 있어서, 상기 샘플 조제 대조군은 포자인 것인 샘플 조제 및 그 샘플 조제의 유효성 검증 방법.
제25항에 있어서, 상기 혼합 단계는 상기 샘플 조제 대조군을 수용하는 건조 비드를 분해시키는 것을 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제25항에 있어서, 상기 용해 처리는 화학적 용해제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제25항에 있어서, 상기 마커 핵선 서열은 마커 핵산 서열을 증폭시키고 증폭된 마커 핵산 서열을 검출함으로써 검출되는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제34항에 있어서, 상기 마커 핵산 서열은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.
제34항에 있어서, 상기 증폭된 마커 핵산 서열은 마커 핵산 서열에 결합할 수 있는 프로브로부터의 신호가 한계값을 초과하는 지를 결정함으로써 검출되는 것인 용해 과정의 유효성 결정 방법.