CZ304743B6 - Prostředek pro izolaci nukleových kyselin a způsob prováděný pomocí tohoto prostředku - Google Patents

Abstract

Prostředek pro izolaci nukleových kyselin, který v jednom uzavřeném celku obsahuje zásobní komory (12) pro vzájemně oddělené uvolnitelné uložení reagenčních chemikálií, vkládací komoru (11) pro vložení vzorku biologického materiálu, jímž je přiřazena směšovací komora (25), jejímuž výstupu je přiřaditelná filtrační komora (32), jejímuž výstupu je přes separační membránu (322) přiřaditelná odpadní komora (41) nebo reakční komora (42), přičemž pouze vkládací komora (11) je opatřena pro obsluhu otevíratelným a uzavíratelným víkem (111). Řešení dále popisuje způsob izolace nukleových kyselin prováděný tímto prostředkem.

Description

(57) Anotace:

Prostředek pro izolaci nukleových kyselin, který v jednom uzavřeném celku obsahuje zásobní komory (12) pro vzájemně oddělené uvolnitelné uložení reagenčních chemikálií, vkládací komoru (11) pro vložení vzorku biologického materiálu, jímž je přiřazena směšovací komora (25), jejímuž výstupu je přiřaditelná filtrační komora (32), jejímuž výstupu je přes separační membránu (322) přiřaditelná odpadní komora (41) nebo reakční komora (42), přičemž pouze vkládací komora (11) je opatřena pro obsluhu otevíratelným a uzavíratelným víkem (111). Řešení dále popisuje způsob izolace nukleových kyselin prováděný tímto prostředkem.

Prostředek pro izolaci nukleových kyselin a způsob prováděný pomocí tohoto prostředku

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku pro izolaci nukleových kyselin a z nich případnou následnou detekci určitého genomu, například patogenního, a/nebo diagnostiku geneticky podmíněných chorob živých organismů.

Dále se vynález týká způsobu izolace nukleových kyselin prováděného prostředkem podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Molekulární in vitro diagnostika založená na přímém průkazu cílové sekvence DNA je dnes jedním z nej progresivněji rostoucích segmentů trhu laboratorní in vitro diagnostiky. Tradičně nachází uplatnění v diagnostice tuberkulózy, kde nahradila zdlouhavé (3 až 9 týdnů) a málo citlivé (104 baktérií / 1 ml vzorku) mikroskopické vyšetření, dále v diagnostice sexuálně přenosných chorob (chlamydiové infekce, syfilis) nebo v diagnostice virových onemocnění s nízkou protilátkovou odpovědí nebo příliš rychlým průběhem (virové hepatitidy B a C, herpetická meningoencefalitida, cytomegaloviróza). Stále častěji však bývá molekulární diagnostika využívána také v diagnostice respiračních infekcí (byla jedním z prvních dostupných testů pro diagnostiku SARS) nebo nosokomiálních nákaz (meticilin resistentní stafylokokové infekce - MRSA) 2. Jedním z nedostatků molekulární diagnostika je její značná náročnost jak na personál, tak na přístrojové vybavení. Ačkoliv samotná metodika molekulární detekce infekčního agens trvá při současném stavu techniky 2 až 4 hodiny, laboratoře nejsou schopné optimalizovat při náročnost metodiky svoji práci tak, aby výsledek v tomto čase dodaly.

Běžné je dnes (v ČR) dodání výsledků do 3 až 5 pracovních dnů, což však neumožňuje lékařům včasný a cílený zásah do léčebného schématu a vede ve svém důsledku (mimo jiné) k nadměrnému užívání antibiotik se všemi negativními důsledky pro společnost, jak ekonomickými v podobě vysokých primárních nákladů na lékovou politiku, tak epidemiologickými v podobě vzniku rezistence na běžná antibiotika se vznikem sekundárních nákladů za antibiotika speciální.

V současné době jsou dostupné dva typy molekulární diagnostiky, tzv. uzavřený typ a otevřený typ.

Uzavřeným typem se označují řešení, u nichž stejný výrobce dodává diagnostické soupravy i samotný laboratorní přístroj. Laboratorní přístroj je určený k vyšetření pouze s diagnostickými soupravami stejného výrobce, nelze jej použít s diagnostickými soupravami jiných dodavatelů. Výhodou tohoto řešení je pro zákazníka větší odpovědnost, kterou výrobce za výsledek vyšetření přejímá, garance daná dobrým jménem společnosti výrobce a v některých případech vyšší stupeň automatizace. Nevýhodou bývají vyšší provozní náklady takového řešení a určitá smluvní nesvoboda zákazníka. Typickým zákazníkem bývá velká laboratoř s vysokými nároky na standardizaci metod a automatický provoz.

Otevřený typ řešení vychází vstříc menším laboratořím. Umožňuje koupit některý z laboratorních přístrojů volně dostupných na trhu a kombinovat jej s diagnostickou soupravou kteréhokoliv jiného výrobce, popřípadě vyvinout si pro vyšetření metody vlastní. Výhodu jsou smluvní volnost a možnost snižovat náklady na jedno vyšetření, nevýhodou bývá méně kvalitní zákaznická podpora ze strany výrobců a vyšší nároky na udržení požadovaného stupně kvality prováděných vyšetření.

-1 CZ 304743 B6

Nevýhodou dosud známých řešení je potřeba školeného personálu v laboratořích, dlouhé časy dodání výsledků, vysoká cena přístroje a vysoké náklady najedno vyšetření a zejména nebezpečí kontaminace životního prostředí nebezpečnými látkami, neboť dávkování reagenčních chemikálií do zkumavek se v laboratořích provádí ručně pomocí pipet a podobně.

Cílem vynálezu je navrhnout a vytvořit způsob manipulace a prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu, který by zcela zabraňoval možnosti kontaktu obsluhy se vzorkem nebo reakčními chemikáliemi a zabraňoval jakémukoliv úniku reakčních činidel mimo prostředek pro manipulaci. Vynález by měl zároveň umožnit přesunutí molekulární diagnostiky z laboratoří přímo na místo, kde se nachází pacient, tedy Point of care testing (POCT) v důsledku zjednodušení manipulace se vzorky a umožnění zpracování každého vzorku samostatně při zachování laboratorní kvality a zkrácení času do dosažení výsledku na možné minimum, které v současné době představuje 2 až 4 hodiny.

Podstata vynálezu

Cíle vynálezu je dosaženo prostředkem pro izolaci nukleových kyselin podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že vjednom uzavřeném celku obsahuje zásobní komory pro vzájemně oddělené uvolnitelné uložení reagenčních chemikálií, vkládací komoru pro vložení vzorku biologického materiálu, jimž je přiřazena směšovací komora, jejímuž výstupu je přiřaditelná filtrační komora, jej ímuž výstupu je přes separační membránu přiřaditelná odpadní komora nebo reakční komora, přičemž pouze vkládací komora je opatřena pro obsluhu otevíratelným a uzavíratelným víčkem. Vzhledem k tomu, že všechny reakce probíhají vjednom uzavřeném celku bez možnosti přístupu k reagenčním chemikáliím a bez nutnosti takového přístupu, umožňuje takový prostředek provádět molekulární diagnostiku přímo na místě POCT, bez nároku na speciální prostory a speciálně školený personál.

V obecném provedení jsou zásobní komory a vkládací komora uspořádány v zásobníkové části, na kterou navazuje směšovací část opatřená směšovací komorou, jejímuž vstupu jsou volitelně přiřaditelné jednotlivé komory zásobníkové části, které jsou spřáhnutelné s otevíracím prostředkem pro vypuštění jejich obsahu do směšovací komory, přičemž výstupu směšovací komory je přiřaditelný vstup filtrační komory filtrační části, jejímuž výstupu je volitelně přiřaditelná odpadní komora nebo reakční komora reakční části, zásobníková část, přičemž směšovací část, filtrační část a reakční část jsou tvořeny samostatnými tělesy, kterájsou vzájemně spojena, přičemž spojení umožňuje vzájemný pohyb a zajišťuje těsnost.

Toto obecné provedení má dvě možnosti konkrétního provedení, kdy jsou jednotlivé části spojeny buď otočně, nebo suvně, přičemž je alespoň jedna z nich opatřena prostředkem pro spřažení s pohonem, alespoň jedna z nich je opatřena prostředkem pro fixaci její polohy a zbývající části jsou opatřeny prostředky pro přenos pohybu od části spřažené s pohonem.

V jednom z výhodných provedení je separační membrána tvořena ionexovou membránou.

Pro snadné otevírání zásobních komor a vkládací komory jsou tyto v dolní části opatřeny výstupky, jimž je přiřazen otevírací prostředek, který je s výhodou tvořen břitem pevně uloženým ve směšovací komoře. Uříznutím spodní částí výstupku příslušné komory je zajištěno uvolnění jejího obsahu a jeho transport do směšovací komory a v případě, že tato je již otevřena, transport do dalších částí prostředku.

Cíle vynálezu je dosaženo rovněž způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že vzorek biologického materiálu se na počátku procesu vloží do jedné komory manipulačního prostředku, v jehož dalších komorách byly před tím odděleně od sebe uloženy všechny pro příslušný proces potřebné reagenční chemikálie, přičemž následující etapy procesu probíhají uvnitř manipulačního prostředku bez přímé manipulace obsluhy s reagenčními chemikáliemi, které se po-2 CZ 304743 B6 stupně mísí a reagují, přičemž nežádoucí zbytky z reakcí se ukládají do odpadního prostoru, který se nachází rovněž uvnitř manipulačního prostředku a je bezpečně oddělen od ostatních prostor manipulačního prostředku, obsluhy i okolí. To zjednodušuje způsob manipulace se vzorky biologického materiálu a umožňuje provádět takovou manipulaci přímo na místě, kde se nachází pacient - point of care testing (POCT), místo v laboratořích.

Při tom je výhodné, když vzorek biologického materiálu se uvnitř manipulačního prostředku v jeho směšovací komoře smísí s lyzačním enzymem a současně nebo následně se z příslušné zásobní komory manipulačního prostředku přidá lyzační pufr a po dalším promíchání se směs ve směšovací komoře podrobí inkubaci, během níž se roztok směsi opakovaně promíchává a probíhá lyže roztoku, až vznikne lyžovaná směs, následně se k lyžované směsi přivede z další zásobní komory manipulačního prostředku precipitační činidlo, s výhodou ethanol nebo isopropanol, načež se lyžovaná směs s precipitačním činidlem homogenizuje a v průběhu reakce s precipitačním činidlem dochází ke srážení volné nukleové kyseliny, tedy k její precipitaci. Po precipitaci se směs přivede na separační membránu uspořádanou uvnitř manipulačního prostředku, přes kterou se přefiltruje do odpadního prostoru, který je vytvořen uvnitř manipulačního prostředku, přičemž separační membrána zadrží zbytky buněčných struktur a precipitovanou nukleovou kyselinu, načež se zbytky buněčných struktur ze separační membrány odstraní propláchnutím promývacím pufrem, který se přivede z další zásobní komory manipulačního prostředku, načež se uzavře odpadní prostor a k separační membráně se u další zásobní komory manipulačního prostředku přivede eluční pufr, který se nechá působit na separační membránu a následně projde separační membránou do reakční komory manipulačního prostředku, přičemž v roztoku je izolována příslušná nukleová kyselina ze zkoumaného vzorku biologického materiálu. To znamená, že všechny reakce potřebné k izolaci příslušné nukleové kyseliny ze zkoumaného vzorku biologického materiálu proběhnou uvnitř manipulačního prostředku.

Pro urychlení procesu probíhá inkubace směsi při teplotě vyšší, než je teplota okolí, s výhodou 70 °C po dobu 10 až 30 min.

Dalšího urychlení a zkvalitnění procesu se dosáhne tím, že se teplota separační membrány před přivedením elučního pufru zvýší nad teplotu okolí, s výhodou na 70 °C na dobu 3 min.

Pro urychlení startu a snížení počtu zásobních komor se vzorek biologického materiálu po zahájení procesu přivede do směšovací komory, do níž byl před tím umístěn lyzační enzym.

Ze stejných důvodů je výhodné, je-li lyzační enzym součástí lyzačního pufru.

Ziychlení průchodu směsi separační membránou se dosáhne působením odstředivé síly.

Ve výhodném provedení je separační membrána tvořena ionexovou membránou.

Po izolaci nukleové kyseliny může v reakční komoře probíhat polymerázová řetězová reakce, přičemž její výsledky lze snadno detekovat přes stěnu reakční komory, která je s výhodou průhledná. V případě neprůhledné stěny reakční komory lze detekci provádět použitím radioaktivního záření.

Přehled obrázků na výkresech

Prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu podle vynálezu je schematicky znázorněn na přiložených výkresech, kde značí obr. 1 podélný řez prvním příkladným provedením prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu, obr. 2 řez A-A z obr. 1, obr. 3 řez B-B z obr. 1, obr. 4 řez C-C z obr. 1, obr. 5 pohled na první příkladné provedení prostředku a obr. 6 řez druhým příkladným provedením prostředku.

-3 CZ 304743 B6

Příklady provedení vynálezu

Prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu, zejména pro molekulární diagnostiku nebo pro izolaci nukleových kyselin a z nich případnou následnou detekci určitého genomu, například patogenního, a/nebo diagnostiku geneticky podmíněných chorob živých organismů bude popsán na příkladných provedeních, která slouží k vysvětlení konstrukce a funkce prostředku a nikoliv k omezení řešení pouze na tato provedení. Prostředek pro manipulaci je znázorněn a popisován ve svislé poloze, což nevylučuje možnost zaujímat během jeho funkce jiné polohy. Prostředek pro manipulaci obsahuje čtyři základní části, které jsou ve znázorněném provedení vzájemně otočně spojeny. V horní části je vytvořena zásobníková část 1, na kterou směrem dolů navazuje směšovací část 2, na kterou směrem dolů navazuje filtrační část 3, pod níž se nachází odpadní a reakční část 4. Jednotlivé části i, 2, 3, 4 jsou vzájemně otočně spojeny zámky 5, které jsou tvořeny výstupkem 51 na vnitřní ze spojovaných částí a drážkou 52 ve vnější ze spojovaných částí. Jednotlivé části 1, 2, 3, 4 jsou zároveň vzájemně utěsněny, například pomocí okroužků 6 znázorněných na obr. 1 nebo jiným vhodným známým způsobem. Tím je zabráněno úniku reakční směsi mimo vymezený prostor prostředku či do okolí a nežádoucímu míšení zbytků z reakcí a výsledku reakcí.

V příkladu provedení znázorněném na obr. 1 až 5 je zásobníková část 1 uložena v objímce vytvořené ve směšovací části 2, takže výstupek 51 zámku 5 je vytvořen na obvodu zásobníkové části I a drážka 52 zámku je vytvořena ve směšovací části 2. Směšovací část 2 je na své výstupní straně opatřena objímkou, v níž je uložena filtrační část 3, takže výstupek 51 zámku je vytvořen na obvodu filtrační části 3 a drážka 52 zámku je vytvořena ve směšovací části 2. Filtrační část 3 je na své výstupní straně opatřena objímkou, v níž je uložena odpadní a reakční část 4, takže výstupek 51 zámku 5 je vytvořen na obvodu odpadní a reakční části 4 a drážka 52 zámku je vytvořena ve filtrační části 3.

Zejména pokud jsou prostředky pro manipulaci se vzorky biologického materiálu podrobovány během manipulace působení odstředivé síly ve směru od zásobníkové části 1 k odpadní a reakční části 4, je výhodné opačné vzájemné uspořádání spojení jednotlivých částí 2, 3, 4. To znamená, že při spojení filtrační části 3 odpadní a reakční části 4 je objímka vytvořena v odpadní a reakční části 4 a v této objímce je uložena filtrační část 3, takže výstupek 51 zámku je vytvořen na obvodu filtrační části 3 a drážka 52 zámku je vytvořena v odpadní a reakční části 4. Filtrační část 3 je na své vstupní straně opatřena objímkou, v níž je uložena směšovací část 2, takže výstupek 51 zámku je vytvořen na obvodu směšovací části 2 a drážka 52 zámku je vytvořena ve filtrační části 3. Spojení směšovací části 2 a zásobníkové části je tímto způsobem provedeno již ve znázorněném provedení. I toto spojení však může být vytvořeno opačně, to znamená, že objímka může být vytvořena na zásobníkové části 1 a v ní bude uložena směšovací část 2. Výstupek 51 zámku je pak vytvořen na obvodu směšovací části 2 a drážka 52 zámku je vytvořena v zásobníkové části 2. Výše popsaná provedení zámků lze podle potřeby vzájemně kombinovat.

Zásobníková část 1 obsahuje vkládací komoru 11 pro vložení zkoumaného vzorku biologického materiálu, která je opatřena otevíratelným víkem 110. Zásobníková část 1 dále obsahuje zásobní komory 12, kterých je ve znázorněném provedení sedm a které slouží pro vzájemně oddělené uvolnitelné uložení reagenčních chemikálií a po vložení reagenčních chemikálií jsou uzavřeny společným pevným víkem 120. Zásobníková část 1 je ve znázorněném provedení tvořena horní válcovou částí, která se směrem dolů zužuje do dolní válcové části, pod níž je vkládací komora H zakončena kapkovitým výstupkem 111 a jednotlivé zásobní komory 12 jsou zakončeny kapkovitými výstupky 1210 až 1270, jejichž sténaje ve výhodném provedení ztenčená. Na obvodu zásobníkové části 1 jsou vytvořeny dva polohovací výstupky 13, které slouží pro polohování prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu během diagnostiky, například v centrifuze.

-4CZ 304743 B6

V důsledku svého uložení zasahuje zásobníková část 1 svou dolní válcovou částí do vstupního prostoru směšovací části 2. Vstupní prostor směšovací části 2 je tvořen válcovou dutinou 21, v níž je uloženo sítko 22, v němž je uložen nůž 23, zasahující svým ostřím mezi kapkovité výstupky 112, 122 komor 11, 12 zásobníkové části 1 a sloužící k odříznutí jejich konců. Kolem válcové dutiny 21 je na obvodu směšovací části vytvořen ozubený pastorek 24. Pod válcovou dutinou 21 je ve směšovací části 2 vytvořena směšovací komora 25, která se směrem dolů zužuje až k výstupnímu otvoru 26, který je vytvořen ve dně 27 směšovací části 2. Kolem výstupního otvoru 26 je v dolní straně dna 27 uloženo těsnění tvořené ve znázorněném provedení okroužkem 6, která dosedá na víko 31 filtrační části 3 a zabraňuje účinku reagencií ze směšovací komory 25, dokud se její výstupní otvor 26 při vzájemném otáčení směšovací části 2 a filtrační části 3 nedostane nad vstupní otvor 321 filtrační komory 32.

Filtrační část 3 má v podstatě válcový tvar, přičemž filtrační komora 32 je ve znázorněném provedení tvořena válcovou dutinou a zbývající vnitřní prostor je tvořen odlehčovací dutinu 33. Ve filtrační komoře 32 je uložena alespoň jedna separační membrána 322. Ve znázorněném provedení jsou ve filtrační komoře 32 uloženy dvě separační membrány 322, mezi nimiž je uložen oddělovací prstenec 323. Oddělovací prstenec 323 je podle znázorněného provedení uspořádán také nad horní separační membránou 322. Ve dně filtrační komory 32 je vytvořen výstupní otvor 324.

Odpadní a reakční část 4 obsahu je odpadní komoru 41. která má ve znázorněném příkladu provedení tvar rozšířeného srpku měsíce, a reakční komoru 42, která je tvořena válcovou dutinou směrem dolů se zužující, přičemž dolní část reakční komory 42 vyčnívá ze soustavy prostředku pro manipulaci směrem dolů, má ztenčenou stěnu aje ze všech stran volně přístupná jak pro optické, tak pro jiné vyhodnocovací prostředky.

Na obvodu odpadní a reakční části 4 jsou vytvořeny dva výstupky 13, které slouží pro polohování prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu během diagnostiky, například v centrifuze.

K ovládání vzájemné polohy jednotlivých částí 1, 2, 3, 4 prostředku během manipulace a diagnostiky slouží ozubený pastorek 24 na směšovací části, který je známým způsobem spřáhnutelný s neznázoměným ovládacím ozubeným kolem nebo šnekem, přičemž zásobníková část 1 a odpadní a reakční část 4 mají stálou polohu, určenou ve znázorněném provedení zasunutím jejich obvodových výstupků 13 do odpovídajících vybrání v neznázoměném pouzdru. Směšovací část 2 je opatřena výstupkem 28, v provedení podle obr. 1 až 5 obvodovým výstupkem, který zasahuje do drážky 34 ukončené dorazem 341, který vymezuje úhel natočení směšovací části 2 vůči filtrační části 3. V provedení podle obr. 1 až 5 je drážka 34 vytvořena na obvodu filtrační části 3. Základní poloha filtrační části 3 vůči odpadní a reakční části 4 je vymezena výstupkem 35, který zasahuje do vybrání mezi dvojicí dorazů 44, které jsou u provedení podle obr. 1 až 5 vytvořeny na obvodu odpadní a reakční části 4 podobně jako mezi ně zasahující výstupek 35 vytvořený na obvodu filtrační části 3. Ve směru otáčení filtrační části 3 za dvojicí dorazů 44 je v dráze výstupku 35 filtrační části situován na odpadní a reakční části 4 koncový doraz 45, který po dosednutí výstupku 35 filtrační části 3 ukončí vzájemné otáčení filtrační části 3 a odpadní a reakční části 4 v koncové poloze, v níž se výstupní otvor 324 filtrační části 3 nachází nad reakční komorou 42.

Provedení polohovacích výstupků, drážek a dorazů znázorněných na obr. 1 až 5 je příkladné a slouží k vysvětlené konstrukce a funkce prostředku a nikoliv kjeho omezení. Výstupky, drážky a dorazy mohou být vytvořeny libovolným vhodným způsobem.

Ve druhém příkladu provedení znázorněném na obr. 6 se prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu liší od předchozího provedení jiným konkrétním spojením směšovací části 2, filtrační části 3 a odpadní a reakční části 4. Směšovací část 2 je na své výstupní straně opatřena objímkou, v jejíž válcové dutině je otočně uložena svou vstupní částí filtrační část 3. Výstupní strana filtrační části 3 je otočně uložena v objímce vytvořené na vstupní straně odpadní

-5 CZ 304743 B6 a reakční části 4, přičemž tato objímka filtrační část 3 přesahuje až na směšovací část 2, kterou obepíná a která je v ní uložena svým vnějším obvodem. Výstupek 51 zámku je vytvořen na obvodu směšovací části 2 a drážka 52 zámku je vytvořena v odpadní a reakční části 4. Filtrační část 3 je uložena uvnitř směšovací části 2 a odpadní a reakční části 4 bez zámků. Toto provedení je výrobně jednodušší a levnější.

Odpadní a reakční část 4 je navíc opatřena pomocnou odpadní drážkou 43, která slouží ke shromažďování případných zbytků z reakcí, pokud se dostanou mezi dno filtrační části 3 a homí plochu odpadní a reakční části 4.

Prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu je určen k provádění rychlé a účinné diagnostiky infekčních a geneticky podmíněných chorob člověka v režimu POCT (Point of care testing) v zařízení s plně automatickým provozem ve všech fázích diagnostiky, jednoduchou obsluhou a vysokou bezpečností pro obsluhující personál i životní prostředí. Prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu je předem naplněn všemi potřebnými reagenciemi, které jsou uzavřeny v jednotlivých zásobních komorách 12 zásobníkové části T V níže uvedeném příkladu bude popisován prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu se sedmi zásobními komorami 12 a jednou vkládací komorou 11 v zásobníkové části J.

Do vkládací komory 11 vloží obsluha vzorek biologického materiálu a vkládací komoru uzavře otevíratelným víkem 111.

V první zásobní komoře 121 je uložen lyzační enzym, například proteináza K.

V druhé zásobní komoře 122 je uložen lyzační pufr, který je tvořen směsí dodecylsulfátu sodného a chelatizačních činidel.

Ve třetí zásobní komoře 123 je uloženo precipitační činidlo, v konkrétním případě ethanol.

Čtvrtá zásobní komora 124 je v popisovaném příkladném provedení prázdná.

V páté zásobní komoře 125 je uložen první promývací pufr, tvořený v popisovaném příkladném provedení sedmdesáti procentním etanolem a stabilizační ionty.

V šesté zásobní komoře 126 je uložen druhý promývací pufr, tvořený v popisovaném příkladném provedení sedmdesáti procentním etanolem a stabilizačními ionty.

V sedmé zásobní komoře 127 je uložen eluční pufr, který je tvořen roztokem s nízkou koncentrací iontů Tris- hydroxymethylaminomethan + chelatizační činidlo EDTA (kyselinu ethylendiaminotetraoctovou).

V základní výchozí poloze je filtrační komora 32 svým výstupním otvorem 321 nad odpadní komorou 41, přičemž vstupní otvor 321 filtrační komory 32 je mimo výstupní otvor 26 směšovací komory 25, takže směšovací komora 25 je uzavřena a utěsněna těsněním, kterým je ve znázorněném provedení o-kroužek 6. Dráha nože 23 protíná kapkovité výstupky 1210 až 1270 a v základní výchozí poloze se ve směru otáčení nachází před kapkovitým výstupkem 111 vkládací komory JT. Poloha prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu je přitom dána umístěním polohovacích výstupků 13 zásobníkové části J a polohovacích výstupků 13 odpadní a reakční části do příslušných vybrání v neznázoměné centrifuze, přičemž ve znázorněném a popisovaném provedení zabraňují polohovací výstupky 13 otáčení zásobníkové části J a otáčení odpadní a reakční části 4. Směšovací část 2 a filtrační část 3 se při manipulaci se vzorky biologického materiálu otáčejí, přičemž kroutící moment je na ně přenášen ozubeným pastorkem 24,

Po vložení vzorku biologického materiálu do vkládací komory JJ zásobníkové části J a uzavření otevíratelného víka 111 se prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu vloží do

-6CZ 304743 B6 zařízení, v němž probíhá celý diagnostický proces a kterým je obvykle centrifuga. Po vložení je ozubený pastorek 24 spřažen se známým hnacím členem neznázoměného pohonu, například se šnekem nebo ozubeným kolem. Jednotlivé části prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu jsou ve výchozí poloze, v níž se nůž nachází před výstupkem 111 vkládací komory 11, výtokový otvor 26 směšovací komory 25 je uzavřen víkem 31 filtrační části 3 a výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se nachází nad odpadní komorou 41.

V provedeních znázorněných na obr. 1 a 6 jsou všechny kapkovité výstupky 111, 1210 až 1270 znázorněny celé neuříznuté a nůž 23 je na obr. 1 znázorněn schematicky před jedním z kapkovitých výstupků. Jedná se o schematické znázornění a jednotlivé kroky manipulace se vzorky budou popsány níže včetně postupného uřezávání kapkovitých výstupků.

V prvním kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 4 o 45°, přičemž ostatní části stojí. Tím dojde k uříznutí spodní části kapkovitého výstupku 110 vkládací komory JT a její obsah tvořený zkoumaným vzorkem vyteče do směšovací komory 25, přičemž odříznutá spodní část kapkovitého výstupku 110 se zachytí na sítku 22. Výtokový otvor 26 se přemístil o 45° nad plnou částí víka 31 filtrační části 3 a je stále uzavřen. Pro dokonalé přemístění celého obsahu vkládací komory 11 do směšovací komory 25 se centrifuga krátce roztočí na cca 500 g.

Ve druhém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 2 o dalších 45°, zatímco ostatní části stojí. Tím dojde k uříznutí kapkovitého výstupku 1210 první zásobní komory 121, v níž se nachází lyzační enzym, například proteináza K. Výtokový otvor 26 se přemístí o dalších 45° nad plnou částí víka 31 filtrační části 3 a je stále uzavřen. Lyzační enzym, například proteináza K se přemístí do směšovací komory 25, s výhodou za působení odstředivé síly, a prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu se ohřeje na teplotu vyšší, než je teplota okolí, s výhodou na 70 °C, čímž dojde k rozpuštění případně vysrážených komponent.

Ve třetím kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací části 2 o dalších 45°, zatímco ostatní části stojí. Celková natočení směšovací části 2 je 135°. Tím dojde k uříznutí kapkovitého výstupku 1220 druhé zásobní komory 122, v níž se nachází lyzační pufr. Výtokový otvor 26 se přemístil o dalších 45° nad plnou částí víka 31 filtrační části 3 a je stále uzavřen. Lyzační pufr se přemístí do směšovací komory 25, s výhodou za působení odstředivé síly, a po důkladném promíchání zkoumaného vzorku biologického materiálu s enzymem a lyzačním pufrem se zahájí proces lyže, tedy odbourávání buněčných obalů a uvolnění DNA do roztoku.

Následuje inkubace směsi při teplotě vyšší než je teplota okolí, s výhodou 70 °C po dobu 10 až 30 min, během níž se roztok opakovaně promíchává.

Po inkubaci se teplota alespoň ve střední části prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu sníží na laboratorní teplotu (20 až 25 °C).

Ve čtvrtém kroku se směšovací část 2 pootočí o dalších 45° na celkových 180°. Tím se odřízne kapkovitý výstupek 1250 třetí zásobní komory a dojde k transportu precipitačního činidla, v popisovaném příkladu provedení ethanolu, za třetí zásobní komory 1230. Kvalita a rychlost transportu precipitačního činidla do směšovací komory 25 se zvýší roztočením centrifugy na cca 500 g. Směs se důkladně promíchá. Důkladná homogenizace a promíchání následně zabezpečí správnou vazbu DNA na separační membránu 322, v popisovaném příkladném provedení na ionexovou membránu. Výtokový otvor 26 se přemístil o dalších 45° nad plnou částí víka 3J_ filtrační části 3 a je stále uzavřen.

V pátém kroku se směšovací část otočí o dalších 45° na celkových 225° a nůž odřízne kapkovitý výstupek 1240 čtvrté zásobní komory 124, která v příkladném provedení prázdná. Výtokový otvor 26 směšovací komory 25 se přemístil o dalších 45° a nachází se nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32, jejíž výstupní otvor 324 se stále nachází nad odpadní komorou 4J. odpadní a reakční části 4, neboť filtrační část 3 dosud stála. Výstupek 28 na směšovací části 2 dosedl na

-7CZ 304743 B6 doraz 341 na konci drážky 34 ve filtrační části 3, čímž došlo ke spojení těchto částí, které se budou dále otáčet společně. Lyzační směs homogenizovaná s ethanolem se ze směšovací komory 25 přemístí do filtrační komory na separační membránu 322, pod kterou se nachází odpadní komora

44.

Následuje centrifugace 5000 až 15 000 g, při níž se lyzační směs přefiltruje přes separační membránu 322 do odpadní komory 41 odpadní a reakční části 4, přičemž separační membrána 322 zadrží zbytky buněčných struktur a DNA.

V šestém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 opět pootočí směšovací částí 2 o dalších 45°, neboť je unášena výstupkem 28 a dorazem 341. Přitom výstupek 35 na filtrační části překoná sílu dvojice dorazů 44. které dosud vymezovaly jeho polohu. Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32 a výstupní otvor filtrační komory 32 je nad odpadní komorou 41 odpadní a reakční části 4. Nůž 23 odřízne kapkovitý výstupek 1250 páté zásobní komory 125 a z ní do směšovací komory 25 vyteče první promývací pufr, který proteče do filtrační komory 32 nad separační membránu 322.

Centrifugací při 5000 až 15000 g proteče první promývací pufr přes separační membránu 322 do odpadní komory 41 odpadní a reakční části 4. Tím dojde k promytí separační membrány 322 a odstranění zbytků buněčných struktur kromě DNA.

V sedmém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 2 o dalších 45° a směšovací část pootočí o 45° i filtrační částí 3. Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32, neboť filtrační část 3 je unášena směšovací částí 2. Výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se přes pootočení o 45° stále nachází nad odpadní komorou 44. Nůž 23 uřízne kapkovitý výstupek 1260 šesté zásobní komory 126, z níž vyteče druhý promývací pufr, který rovněž proteče do filtrační komory 32 nad separační membránu 322. Druhý promývací pufr protéká přes separační membránu 322 při centrifugací při 5000 až 15000 g. Tím dojde k dalšímu promytí separační membrány 322 a úplnému odstranění zbytků buněčných struktur kromě DNA.

Následně se alespoň střední část prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu vytemperuje nad teplotu okolí, s výhodou na teplotu 70 °C.

V osmém kroku se pomocí ozubeného pastorku 23 pootočí směšovací část o dalších 45° na celkových 360° a dojde k dalšímu pootočení filtrační části 3 vzhledem k odpadní a reakční části 4. Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32. Výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se tímto pootočením o 45° přemístí nad stěnu 40 mezi odpadní komorou 41 a reakční komorou 42, na níž je utěsněn těsnicím kroužkem 6. Při pootočení směšovací části 2 dojde k odříznutí kapkovitého výstupku 1270 sedmé zásobní komory 127, z níž po roztočení centrifugy na cca 500 g vyteče eluční pufr do filtrační komory 32 na separační membránu 322. Při inkubaci po dobu 3 minut při teplotě 70 °C se ze separační membrány 322 uvolní DNA do elučního pufru. Inkubace může probíhat i při teplotě nižší, ale po delší časový interval.

V devátém kroku dojde k dalšímu otočení směšovací komory 2 o 45° a její celkové natočení činí opět 45°. Přitom se současně otočí o 45° i filtrační část 3 takže výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se přemístí nad reakční komoru 42. Centrifugací při 5000 až 15000 g proteče eluční pufr s izolovanou DNA separační membránou 322 do prostoru reakční komory 42.

Dalším pootočením směšovací komory 2 v desátém kroku se výstupní otvor 324 filtrační komory přemístí nad odpadní komoru 41 a reakční komora 44 se uzavře, takže v ní může probíhat polymerázová řetězová reakce (PCR) nebo z ní lze izolovanou DNA odebrat k jinému použití. Polymerázová řetězová reakce probíhá standardním mechanismem cyklického chlazení a ohřívání směsi v reakčním prostoru.

-8CZ 304743 B6

Stejným způsobem probíhá izolace RNA i obecná molekulární diagnostika.

Lyzační enzym může být přidáván do vkládací komory JJ společně se vzorkem biologického materiálu nebo naopak vzorek může být přidáván do vkládací komory 11 k lyzačnímu enzymu. Potom bude první zásobní komora prázdná. Nůž 23 se tedy v jednom kroku pootočí o 90°, aby odřízl výstupek vkládací komory 11 s lyzačním enzymem a vzorkem a zároveň výstupek prázdné zásobní komory. Toto provedení je zřejmé, a nebude proto dále popisováno.

Pro zvýšení přesnosti je vhodné odstranit ze separační membrány 322 zbytkový obsah tekutin po propláchnutí separační membrány 322 promývacím pufrem a před uzavřením odpadní komory 41, aby se do reakční komory 42 nedostaly nežádoucí látky. Toho se dosáhne propláchnutím separační membrány 322 inertní tekutinou a/nebo elučním pufrem v množství odpovídajícím známému zbytkovému obsahu tekutin v separační membráně 322, čímž dojde k vytlačení těchto tekutin ze separační membrány. U tohoto provedení je uspořádání obsahu vkládací komory 11 a jednotlivých zásobních komor následující:

Do vkládací komory 11 vloží obsluha vzorek biologického materiálu společně s lyzačním enzymem, například proteinázou K, a vkládací komoru uzavře otevíratelným víkem 111.

V první zásobní komoře 121 je uložen lyzační pufř, který je tvořen směsí dodecylsulfátu sodného a chelatizačních činidel.

Ve druhé zásobní komoře 122 je uloženo precipitační činidlo, v konkrétním případě etanol.

Třetí zásobní komora 123 je v popisovaném příkladném provedení prázdná. ( v tomto provedení jsou upraveny unášecí detaily na směšovací komoře a směšovací části, které zajistí společně otáčení těchto dvou částí o jeden krok dříve = 45 stupňů).

Ve čtvrté zásobní komoře 124 je uložen první promývací pufr, tvořený v popisovaném příkladném provedení sedmdesáti procentním etanolem a stabilizačními ionty.

V páté zásobní komoře 125 je uložen druhý promývací pufr, tvořený v popisovaném příkladném provedení sedmdesáti procentním etanolem a stabilizačními ionty.

V šesté zásobní komoře 126 je uložena inertní tekutina a/nebo eluční pufr v množství odpovídajícím zbytkovému obsahu tekutin v separační membráně.

V sedmé zásobní komoře 127 je uložen eluční pufr, který je tvořen roztokem s nízkou koncentrací iontů Tris- hydroxymethylaminomethan + chelatizační činidlo EDTA (kyselinu etylendiaminotetraoctovou).

V prvním kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 4 o 45°, přičemž ostatní části stojí. Tím dojde k uříznutí spodní části kapkovitého výstupku 110 vkládací komory 11 a její obsah tvořený zkoumaným vzorkem a proteinázou K vyteče do směšovací komory 25. Výtokový otvor 26 směšovací komory 25 se přemístil o 45° nad plnu částí víka 31 filtrační části 3 a je stále uzavřen. Pro dokonalé přemístění celého obsahu vkládací komory 11 do směšovací komory 25 se centrifuga krátce roztočí na cca 500 g. Prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu se ohřeje na teplotu vyšší, než je teplota okolí, s výhodou na 70 °C, čímž dojde k rozpuštění případně vysrážených komponent.

Ve druhém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 2 o dalších 45°, zatímco ostatní části stojí. Tím dojde k uříznutí kapkovitého výstupku 1210 první zásobní komory 121, v níž se nachází lyzační pufr. Výtokový otvor 26 je stále uzavřen. Lyzační pufr, se přemístí do směšovací komory 25, s výhodou za působení odstředivé síly, a po důkladném promí-9CZ 304743 B6 cháni zkoumaného vzorku biologického materiálu s lyzačním enzymem a lyzačním pufrem se zahájí proces lyže, tedy odbourávání buněčných obalů a uvolnění DNA do roztoku.

Následuje inkubace směsi při teplotě vyšší než je teplota okolí, s výhodou 70 °C po dobu 10 až 30 min, během níž se roztok opakovaně promíchává.

Po inkubaci se teplota alespoň ve střední části prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu sníží na laboratorní teplotu (20 až 25 °C).

Ve třetím kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 2 o dalších 45°, zatímco ostatní části stojí. Celkové natočení směšovací části 2 je 135°. Tím dojde k uříznutí kapkovitého výstupku 1220 druhé zásobní komory 122, v níž se nachází precipitační činidlo. Výtokový otvor 26 se přemístil o dalších 45° nad plnou částí víka 3J. filtrační části 3 aje stále uzavřen. Kvalita a rychlost transportu precipitačního činidla do směšovací komory 25 se zvýší roztočením centrifugy na cca 500 g. Směs se důkladně promíchá. Důkladná homogenizace a promíchání následně zabezpečí správnou vazbu DNA na separační membránu 322, v popisovaném příkladném provedení na ionexovou membránu. Výtokový otvor 26 se přemístil o dalších 45° nad plnou částí víka 31 filtrační části 3 aje stále uzavřen.

Ve čtvrtém kroku se směšovací část 2 pootočí o dalších 45° na celkových 180°. Tím se odřízne kapkovitý výstupek 1230 třetí zásobní komory, která je v příkladném provedení prázdná. Výtokový otvor 26 směšovací komory 25 se přemístil o dalších 45° a nachází se nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32, jejíž výstupní otvor 324 se stále nachází nad odpadní komorou 41 odpadní a reakční části 4, neboť odpadní a reakční část 4 dosud stála. Výstupek 28 na směšovací části 2 dosedl na doraz 341 na konci drážky 34 ve filtrační části 3, čímž došlo ke spojení těchto částí, které se budou dále otáčet společně. Lyzační směs homogenizovaná s etanolem se ze směšovací komory 25 přemístí do filtrační komory na separační membránu 322, pod kterou se nachází odpadní komora 41.

Následuje centrifugace 5000 až 15000 g, při níž se lyzační směs přefiltruje přes separační membránu 322 do odpadní komory 41 odpadní a reakční části 4, přičemž separační membrána 322 zadrží zbytky buněčných struktur s DNA.

V pátém korku se směšovací část otočí o dalších 45° na celkových 225° a v důsledku toho se filtrační část 3 otočí o 45°, neboť je unášena výstupkem 28 a dorazem 341· Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32 a výstupní otvor filtrační komory 32 je nad odpadní komorou 44 odpadní a reakční části 4. Nůž 23 odřízne kapkovitý výstupek 1240 čtvrté zásobní komory 124 a z ní do směšovací komory 25 vyteče první promývací pufr, který proteče do filtrační komory 32 nad separační membránu 322. Centrifugací při 5000 až 15000 g proteče první promývací pufr přes separační membránu 322 do odpadní komory 41 odpadní a reakční části 4. Tím dojde k promytí separační membrány 322 a odstranění zbytků buněčných struktur kromě DNA.

V šestém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 opět pootočí směšovací částí 2 o dalších 45° na celkové natočení 270° a směšovací část pootočí o 45° i filtrační částí 3. Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32, neboť filtrační část 3 je unášena směšovací částí 2. Výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se přes pootočení o 45° stále nachází nad odpadní komorou 41. Nůž 23 uřízne kapkovitý výstupek 1250 páté zásobní komory 125, z níž vyteče druhý promývací pufr, který rovněž proteče do filtrační komory 32 nad separační membránu 322. Druhý promývací pufr protéká přes separační membránu 322 při centrifugací při 5000 až 15000 g. Tím dojde k dalšímu promytí separační membrány 322 a úplnému odstranění zbytků buněčných struktur kromě DNA.

V sedmém kroku se pomocí ozubeného pastorku 24 pootočí směšovací částí 2 o dalších 45° a směšovací část pootočí o 45° i filtrační částí 3. Výstupní otvor 26 směšovací komory 25 se stále

-10CZ 304743 B6 nachází nad vstupním otvorem 321 filtrační komory 32, neboť filtrační část 3 je unášena směšovací částí 2. Výstupní otvor 324 filtrační komory 32 se přes pootočení o 45° stále nachází nad odpadní komorou 41. Nůž 23 uřízne kapkovitý výstupek 1260 šesté zásobní komory 126, z níž vyteče inertní tekutina a/nebo eluční pufr v množství odpovídajícím zbytkovému obsahu tekutin v separační membráně 322 a proteče do filtrační komory 32 nad separační membránou 322. Tato inertní tekutina a/nebo eluční pufru protéká přes separační membránu 322 při centrifugaci při 5000 až 15000 g a vytlačí zbytkové tekutiny v separační membráně 322, které pak nemohou ovlivňovat další reakce. Tím dojde k úplnému odstranění zbytků buněčných struktur kromě DNA.

Následně se alespoň střední část prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu vytemperuje nad teplotu okolí, s výhodou na teplotu 70 °C.

Další kroky osm až deset probíhají stejně jako u dříve popsaného způsobu.

Průmyslová využitelnost

Způsob a prostředek pro manipulaci se vzorky biologického materiálu podle vynálezu jsou určeny pro molekulární diagnostiku nebo pro izolaci nukleových kyselin a z nich případnou následnou detekci určitého genomu, například patogenního, a/nebo diagnostiku geneticky podmíněných chorob živých organismů, například pro automatickou izolaci DNA/RNA ze vzorku, automatickou detekci metodou qPCR a automatické vyhodnocení výsledku reakce mimo specializované laboratoře, tedy přímo na místě - Point of care testing (POCT).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Prostředek pro izolaci nukleových kyselin a z nich případnou následnou detekci určitého genomu, například patogenního, a/nebo diagnostiku geneticky podmíněných chorob živých organismů, vyznačující se tím, že v jednom uzavřeném celku obsahuje zásobní komory (12) pro vzájemně oddělené uvolnitelně uložení reagenčních chemikálií, vkládací komoru (11) pro vložení vzorku biologického materiálu, jimž je přiřazena směšovací komora (25), jejímuž výstupu je přiřaditelná filtrační komora (32), jejímuž výstupu je přes separační membránu (322) přiřaditelná odpadní komora (41) nebo reakční komora (42), přičemž pouze vkládací komora (11) je opatřena pro obsluhu otevíratelným a uzavíratelným víkem (111).

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že zásobní komory (12) a vkládací komora (11) jsou uspořádány v zásobníkové části (1), na kterou navazuje směšovací část (2) opatřená směšovací komorou (25), jejímuž vstupu jsou volitelně přiřaditelné jednotlivé komory (11, 12) zásobníkové části (1), které jsou spřáhnutelné s otevíracím prostředkem pro vypuštění jejich obsahu do směšovací komory (25), přičemž výstupu směšovací komory (25) je přiřaditelný vstup filtrační komory (32) filtrační části (3), jejímuž výstupu je volitelně přiřaditelná odpadní komora (41) nebo reakční komora (42) reakční části (4), přičemž zásobníková část (1), směšovací část (2), filtrační část (3) a reakční část (4) jsou tvořeny samostatnými tělesy, která jsou vzájemně spojena, přičemž spojení umožňuje vzájemný pohyb a zajišťuje těsnost.

3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že zásobníková část (1), směšovací část (2), filtrační část (3) a reakční část (4) jsou vzájemně otočně spojeny, přičemž alespoň jedna z nich je opatřena prostředkem pro spřažení s pohonem, alespoň jedna z nich je opatřena prostředkem pro fixaci její polohy a zbývající části jsou opatřeny prostředky pro přenos otočného pohybu od části spřažené s pohonem.

-11 CZ 304743 B6

4. Prostředek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že směšovací část (2)je na své výstupní straně opatřena objímkou, v jejíž válcové dutině je otočně uložena svou vstupní částí filtrační část (3), jejíž výstupní strana je otočně uložena v objímce vytvořené na vstupní straně odpadní a reakční části (4), přičemž tato objímka filtrační část (3) přesahuje až na směšovací část (2), kterou obepíná a která je v ní uložena svým vnějším obvodem.

5. Prostředek podle libovolného z nároků laž4, vyznačující se tím, že v odpadní a reakční části (4) je vytvořena odpadní drážka (43) pro shromažďování případných zbytků z reakcí, pokud se dostanou mezi dno filtrační části (3) a horní plochu odpadní a reakční části (4).

6. Prostředek podle libovolného z nároků laž5, vyznačující se tím, že separační membránou (322) je ionexová membrána.

7. Prostředek podle libovolného z nároků lažó, vyznačující se tím, že zásobníkové komory (12) a vkládací komora (11) jsou v dolní části opatřeny kapkovitými výstupky, jimž je přiřazen otevírací prostředek.

8. Prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že otevíracím prostředkem je nůž (23) pevně uložený ve směšovací komoře (25).

9. Způsob izolace nukleových kyselin prováděný prostředkem podle libovolného z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že vzorek biologického materiálu se na počátku procesu vloží do vkládací komory (11) prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu, v jehož zásobních komorách (12) byly před tím odděleně od sebe uloženy a uzavřeny všechny pro příslušný proces potřebné reagenční chemikálie v množství potřebném pro příslušné reakce, načež se vkládací komora (11) uzavře, přičemž následující etapy procesu probíhají uvnitř uzavřeného prostředku bez jakékoliv součinnosti s prostředím mimo vnitřní prostor prostředku a bez přímé manipulace obsluhy s reagenčními chemikáliemi, které se uvnitř prostředku postupně mísí a reagují, přičemž nežádoucí zbytky z jednotlivých reakcí se ukládají do odpadní komory (41), která se nachází rovněž uvnitř prostředku a je bezpečně oddělena od ostatních prostor prostředku, obsluhy i okolí.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že vzorek biologického materiálu se uvnitř prostředku pro manipulaci se vzorky biologického materiálu v jeho směšovací komoře (25) smísí s lyzačním enzymem a současně nebo následně se z příslušné zásobní komory manipulač-