JP2005533502A - 膜法による微生物の捕捉と検出 - Google Patents
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Abstract
膜ベース検出システムを用いて分析検体の存在を検出する方法とシステムを記述する。流体試料は膜ベース検出システム(100)を通過する。微粒子検体(即ち、微生物)を膜(110)で捕捉する。検出法及び分析法を用いて捕捉した分析検体の同定と定量を行う事が出来る。
Description
本発明は流体中の分析検体の検出のための方法および装置に関する。より詳しくは、本発明は医療、食品/飲料および環境関連溶液中の、分析検体、毒素、及び/又は細菌混合物を区別し得る、センサーアレイシステムの開発に関する。
異なる分析検体、毒素や細菌を区別できるスマートなセンサーの開発は臨床医学、環
境、安全衛生、遠隔感知、軍関係、食品/飲料及び化学プロセスへの応用に非常に重要になってきた。高感度且つ高選択性を持つ多くのセンサーは単一の分析検体検出用として対応してきた。溶液相の多分析検体を検出し表示出来るセンサーは少数開発されてきた。最もよく使用される感知法の一つは臨床分析におけるラテックス凝集試験(LATs)用コロイドポリマー微粒子の利用である。60個以上の分析検体用の市販LATsを用い感染症、不法ドラッグや初期妊娠テストでの検出に日常的に使われている。このタイプのセンサーの大部分はラテックス粒子(ポリマー微粒子)の凝集、即ち抗体に由来する微粒子が外来抗原により効率よく“架橋する”ことによりフィルターに付着するかフィルターを透過出来いという原理の基づく操作である。抗原を運ぶ溶液を除去して染料をドープした微粒子を比色法により検出する。
境、安全衛生、遠隔感知、軍関係、食品/飲料及び化学プロセスへの応用に非常に重要になってきた。高感度且つ高選択性を持つ多くのセンサーは単一の分析検体検出用として対応してきた。溶液相の多分析検体を検出し表示出来るセンサーは少数開発されてきた。最もよく使用される感知法の一つは臨床分析におけるラテックス凝集試験(LATs)用コロイドポリマー微粒子の利用である。60個以上の分析検体用の市販LATsを用い感染症、不法ドラッグや初期妊娠テストでの検出に日常的に使われている。このタイプのセンサーの大部分はラテックス粒子(ポリマー微粒子)の凝集、即ち抗体に由来する微粒子が外来抗原により効率よく“架橋する”ことによりフィルターに付着するかフィルターを透過出来いという原理の基づく操作である。抗原を運ぶ溶液を除去して染料をドープした微粒子を比色法により検出する。
より最近には、“味覚チップ”センサーが医療、食品/飲料及び環境関係溶液におけ分析検体、毒素及び/又は細菌混合物の区別に使われてきた。このタイプのあるセンサー類は、本明細書中に十分に述べられているものとされる文献として加えられる、マックデビット等(McDevitt et al.)により2002年1月31日に提出された米国特許出願番号10/072,800(発明の名称“マイクロマシン加工法による化学センサーアレー中への材料閉じこめための方法と装置”)に記述されている。そこに開示されているのは一個あるいは複数の分析検体を含む流体の分析用のシステムと方法である。この味覚チップは多数の規則的なアレー状に配列した化学的に鋭敏なビーズを持つセンサーを有し、多くの異なる分析検体を迅速に且つ同時に検出できる。このシステムの一つの局面はアレーがミクロ加工法を用いて作成でき、その結果安価な方法でこのシステムを製造できる。
バイオテロ攻撃への関心がより高くなって以来、微生物、特に化学攻撃や生物攻撃に使用出来る大腸菌O157:H7,炭疽菌/B. globigiiやクリストポリジウムのような病原菌の検出方法とシステムに対する興味が増加した。多くの優れた微生物検出用試験法が研究実験室レベルの設定では存在する。しかしこれらの試験は一般に高価で、長時間を要し、多くの実験室要員を必要とする。安全衛生、環境、軍関係、条約検証や本土防衛分野のような多くの実世界で応用するには、微生物が殆どいつも危険なレベルで存在しないような場所であっても多くの場所を同時にモニターすることが望ましい。
多年にわたり微生物学者が使ってきた典型的な検出法は単一の細菌を色々な培地で細菌コロニーを成長させ、形態的生化学的試験を含むタイムリーな識別を行う。従来の微生物学では数を数え列挙する方法により微生物を分類し核酸染色或いは染色混合物を用いてグラム陽性とグラム陰性を区別し且つ死亡した生物と生きている生物を区別する。しかしこれらの方法は特異性が低くオンラインでの迅速な分析への応用は容易ではない。これ等の一連のステップはしばしば非常に正確な結果をもたらすが、高度に訓練された人に依存し長ったらしく且つ複雑な分析が必要である。最近は捕捉培地の物理的特徴と種々の化学的官能性に対する細菌の親和性を組み合わせる事により、細菌の包括或いは捕捉に適したアプローチの開発に努力が向けられている。ポリマーとの化学的会合や自己組織化単分子層(SAMs)との化学的会合を応用して細菌捕捉を行った。これらの方法は迅速ではあるが非特異的であり、同定と定量には多くのステップの分析を完了する必要がある。PCRを含む多くの技法はオリゴヌクレオチドプローブや混成検出法を用いる。これらは特異性や感度に関しては優れているが、偽陽性と判断したり、高コストであり試料多数化への対応性に低く、熟練した人材が必要である点がこのアプローチの主たる限界である。
最近種々の技術を用いて分析時間の短縮と感度改善に多くの努力が払われた。このような技術としては核酸ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR),電気化学的トランスデューサー、光学マイクロアレー検出法、フロースルー型免疫濾過法,音センサーやフローサイトメーターがある。
胞子や細菌検出に最もよく使われる試験法は酵素結合免疫吸着検定法(ELSIA)である。この方法は特別な抗体使用により高い特異性、再現性及び複数試料分析が可能であるが、一般に分析に長時間を要しリアルタイムでの分析にはそぐわない。分析時間の短縮、選択性と感度の改善の為にこの免疫測定法と他の分析技術を組み合わせた種々の方法が適応されてきた。しかしこれらの技術は少数の市販感知装置で明らかなように、“理想のセンサー”の創生に必要な多くの特質を殆ど持ち合わせていない。
それ故微生物を区別できる新しい方法とシステムの開発が安全衛生、環境、本土防衛、軍関係、医療/臨床診断、食品/飲料や化学プロセスへの応用にむけ望まれる。更にその方法とシステムがより特異性、確実性の高いテスト法の引き金となり微生物の迅速なスクリーニングに用いられることが望まれる。更にセンサーアレーが効率的な微生物収集法として特異な目的に合うように開発されることが望まれる。
本明細書中で、我々は、一つ又はそれ以上の分析検体を含む流体の分析のための方法およびシステムを記述する。このシステムは液状もしくは気体状の流体のいずれにも使用できる。ある実施形態では、このシステムは個々の分析検体と検体混合物の両者を診断するパターンを発生し得る。ある実施形態では、このシステムは、規則正しい配列に形成された、複数の化学的に鋭敏な粒子を含み、多くの異種の分析検体を同時に迅速に検出することが可能である。
一つの実施形態では、センサーアレーはマクロ細孔をもつ一個又はそれ以上のビーズを含むことができる。流体中の、細菌、胞子や原虫のような微生物は、ビーズのマクロ細孔に捕捉される。ある実施形態では、それに限定されるものではないが抗体やレクチンのような半選択的配位子を含む、受容体が、ビーズの内部細孔領域中の粒子と結合されて選択的ビーズを形成し得る。ある実施形態では、捕捉された分析検体と結合し得る可視化抗体が導入されてCCD検出器により記録可能な比色もしくは蛍光のしるしを発生することもできる。ある実施形態では、選択的および半選択的なビーズをシリーズとして上述のセンサーアレーシステムと一緒に用いられてもよい。
ある実施形態では、微生物検出方法は、流体が先ず迅速なスクリーニングにかけられ、次いで、このスクリーニング段階の結果が妥当であれば、更により特異的な及び/又は確認用のテストにかけられる。マクロ細孔ビーズを含むセンサーアレーが該特異的な及び/又は確認用のテストを行なうのに用いられてもよい。
本明細書中では、更に微生物の検出に使用され得るマクロ細孔ビーズを形成する方法も記述される。一つの実施形態では、マクロ細孔ビーズの作成方法は、親水性乳化剤の分散液をポリマー樹脂の水溶液に加えて水中油型エマルジョンを形成し、疎水性乳化剤の溶液を該水中油型エマルジョンに加えて油中水型エマルジョンを形成し;更に、該油中水型エマルジョンを冷却して、多数の油滴が分散されているポリマーマトリックスを形成する。該油滴はポリマーマトリックスの孔から洗い出されてマクロ多孔性ビーズを形成する。
本明細書中で、一個又はそれ以上の分析検体を含む流体の分析に関する方法とシステムを記述する。このシステムは液体或いは気体流体に使用できる。ある実施形態ではこのシステムは個々の分析検体と分析検体混合物を診断するパターンを発生出来る。ある実施形態ではこのシステムは多数の化学的に鋭敏な粒子を用いて規則正しいアレーを作成し多くの異種の分析検体を同時に迅速に検出できる。このシステムの或る局面は、該配列がミクロ加工プロセスを用いて作成され得るので、該システムを安価に製造することが出来ることである。
分析検体検出システムの或る実施形態において、該システムは、いくつかの態様で、光源、センサーアレー、及び検出器を含む。いくつかの実施形態において、センサーアレーは種々の化学的に感受性の粒子(以下“粒子”とする)を規則的なアレーに保持するように構成された支持部材からなる。いくつかの実施形態において、該粒子は分析検体の存在下で検出可能な信号を発生する要素となる。この粒子は、分析検体に出会うと、光学(たとえば吸光度或いは反射率)或いは蛍光/燐光信号を発生する。この粒子の例には、これらに限定されるものではないが、機能性ポリマービーズ、寒天ビーズ、ブドウ糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、細孔制御ガラスビーズ、金属酸化物粒子(たとえば酸化珪素(SiO2)や酸化アルミニウム(Al2O3))、ポリマー薄膜、金属量子粒子(たとえば銀、金、白金など)及び半導体量子粒子(たとえば珪素、ゲルマニウム、ゲルマニウム−ヒ素など)が含まれる。検出器(たとえば電荷結合デバイス、“CCD”)をデータ収集の為にセンサーの下に設置してもよい。他の実施形態では、検出器は粒子からの光反射をデータ収集するようセンサーの上に設置されてもよい。
光源からの光はこのセンサーアレーを通過しセンサーアレーの底面から出てくる。該粒子により変調された光は、このセンサーアレーを通り近くに配置された検出器に到達する。この光学的変化を目視で或いはCCD検出器単独で或いは光学顕微鏡との組み合わせで評価することにより完了する。マイクロプロセッサーをこのCCD検出器或いは顕微鏡と組み合わせてもよい。流体送りシステムをこのセンサーアレーの支持部材と組み合せることも出来る。ある実施形態では、流体送りシステムは、試料をこのセンサーアレーへ流入および流出するように配置される。
一つの実施形態ではこのセンサーアレーシステムは粒子の配列を含む。この粒子はポリマービーズに結合された受容体分子を含んでもよい。ある実施形態では、この受容体は分析検体と相互作用するように選択される。この相互作用はこの受容体がこの分析検体と結合/会合する形をとる事が出来る。支持部材は、適当な波長の光を透過させるならば、この粒子を支持し得る如何なる材料から出来ていてもよい。この支持部材は多数の空洞を含んでいてもよい。該空洞は少なくとも一つの粒子が空洞内に実質的に含まれるように形成され得る。このセンサーアレーは被覆層を含む事が出来る。被覆層は、該センサーアレーの表面上に、センサーアレー表面と被覆層との間にチャネルが形成されるような距離を置いて配置されてもよい。被覆層は、該被覆層が、流体は該センサーアレーと該被覆層の間に形成されたチャネルを通じて空洞に流入し得るが該粒子がセンサーアレーの空洞から追い出されるのを阻止するような距離に設置されてもよい。ある実施形態では、該空洞は、流体が空洞を通過する際に該粒子が空洞中に保持されるように構成されると共に、使用中に流体が空洞を通過できるように構成され得る。
一つの実施形態では、光学検出器は、別個の検出装置として使用するよりも、むしろ支持材の底部内に一体化されてもよい。この光学検出器は、マイクロプロセッサーと組み合わされて、別個の検出用構成を用いずに、流体の評価を行なわせることも出来る。さらに、流体送りシステムは支持部材中に組み込まれてもよい。支持部材中への検出器および流体送りシステムの一体化により、コンパクトで携帯し得る分析検体検出システムを形成してもよい。
高感度CCDアレーは、生物/化学試薬の結合によって生じる、光学特性の変化を測定するのに使用され得る。該CCDアレーは、機能性センサーアレーを創生するように、フィルター、光源、流体送りおよびマイクロマシン加工粒子容器と一体化されてもよい。データ取得と処理は既存のCCD技術で実行され得る。CCD検出器は、白光、紫外光、或いは蛍光を測定するように配置され得る。他の検出器、たとえば光電子増倍管、電荷誘導装置、フォトダイオード、フォトダイオードアレーやマイクロチャネルメンバーも使用され得る。
ある実施形態では粒子はこの注目の分析検体と結合し変調信号を発生する能力を有する。この粒子は、注目の分析検体と結合し変調信号を発生する能力を有する受容体分子を含むことが出来る。或いはこの粒子は受容体分子と指示薬を含んでもよい。この受容体分子は注目の分析検体を結合する能力を有してもよい。この受容体分子は、注目の分析検体と結合すると、指示薬分子に変調信号を発生するよう働く。この受容分体子は自然に生成する受容体でもよく、或いは適当にデザインするか組み合わせ法で作成される合成受容体であってもよい。天然受容体の幾つかの例には、これらに限定されるものではないが、DNA、RNA、蛋白質、酵素、オリゴペプチド、抗原および抗体を含まれる。分析検体分子と特異的な態様で結合する能力により、天然か合成の受容体のいずれかが選択され得る。
一つの実施形態では、天然に存在する又は合成の受容体は、粒子を形成するためにポリマービーズと結合される。ある実施形態では、該粒子は、注目の一つか複数の分析検体と結合し得ると共に検出可能な信号を発生し得る。ある実施形態では、該粒子は、注目の分析検体に結合されると、光学信号を発生する。
種々の天然及び合成の受容体が使用され得る。合成受容体は、種々の種類に由来することができ、それらには、これらに限定されるものでがないが、ポリクレオチド(たとえばアプタマー)、ペプチド(たとえば酵素や抗体)、合成受容体、非天然バイオポリマー(たとえばポリチオ尿素、ポリグアニジニウム)およびインプリントポリマーが含まれる。ポリヌクレオチッドは、DNA配列を連続的に構築することにより得られる、DNAの比較的小さな断片である。ペプチドは、抗体や酵素のような天然ペプチッドを含み、またアミノ酸から合成されてもよい。非天然バイオポリマーは、天然ポリマーに基づく化学構造を持つが、天然にない結合単位を用いて構築される。例えばポリチオ尿素やポリグアニジニウムはペプチドと同様の構造を持つが、アミノ酸からではなくジアミン(即ち少なくとも二個のアミン官能基を持つ化合物)から合成され得る。合成受容体は、種々の分析検体と結合できるように設計された有機或いは無機の構造を持つ。
種々の天然及び合成の受容体が使用され得る。合成受容体は、種々の種類に由来することができ、それらには、これらに限定されるものでがないが、ポリクレオチド(たとえばアプタマー)、ペプチド(たとえば酵素や抗体)、合成受容体、非天然バイオポリマー(たとえばポリチオ尿素、ポリグアニジニウム)およびインプリントポリマーが含まれる。ポリヌクレオチッドは、DNA配列を連続的に構築することにより得られる、DNAの比較的小さな断片である。ペプチドは、抗体や酵素のような天然ペプチッドを含み、またアミノ酸から合成されてもよい。非天然バイオポリマーは、天然ポリマーに基づく化学構造を持つが、天然にない結合単位を用いて構築される。例えばポリチオ尿素やポリグアニジニウムはペプチドと同様の構造を持つが、アミノ酸からではなくジアミン(即ち少なくとも二個のアミン官能基を持つ化合物)から合成され得る。合成受容体は、種々の分析検体と結合できるように設計された有機或いは無機の構造を持つ。
一つの実施形態では、軍関係や市民社会にとって利害のある多くの化学/生物試薬が、前述のアレーセンサーにより容易に感知され得る。細菌も又同様なシステムを使って検出され得る。手つかずの細菌を検出し、感知し、同定するには、一つの細菌の細胞表面が他の細菌と区別されてもよく、或いはゲノム材料がオリゴ核酸受容体を用いて検出されてもよい。この差別化を行う一つの方法は、細胞表面オリゴ糖(即ち糖残基)を標的にすることである。オリゴ糖に特異な合成受容体を用いて細胞表面オリゴ糖を分析することにより特異な細胞の存在を決めることが出来る。
一つの実施形態では、受容体はポリマー樹脂と結合されてもよい。受容体は分析検体の存在下で化学反応を起こし信号を発生する。指示薬をこの受容体或いはポリマービーズと組み合わしてもよい。この分析検体と受容体との反応はこの指示薬の局部的微少環境を変化させ指示薬の分光的性質を変える。この信号は種々の信号発生手順を用いて発生出来る。このような手順には吸光度、蛍光エネルギー移動、および/或いは蛍光消光が含まれる。受容体―分析検体の組み合わせには、限定はされないが、ペプチッド−蛋白質分解酵素、ポリヌクレチド−核酸分解酵素やオリゴ糖―オリゴ糖切断試薬が含まれる。
一つの実施形態では、受容体および指示薬がポリマー樹脂と結合されてもよい。この受容体は、分析検体の存在下で、指示薬の局部的微少環境の変化をもたらす、立体構造変化を生じ得る。この変化はこの指示薬の分光的性質を変え得る。この受容体と指示薬との相互作用は、用いられる信号発生手順によって種々の異なる信号を発生できる。このような手順には吸光度、蛍光エネルギー移動、および/又は蛍光消光が含まれ得る。
一つの実施形態では、このセンサーアレーは粒子配列を含む。この粒子にはポリマービーズと結合された受容体が含まれる。ある実施形態では、この受容体はこの分析検体と相互作用するように選ばれる。この相互作用は受容体と分析検体との結合/会合と云う形をとる。その支持部材は、適当な波長の光を通すなら、この粒子を支持できるいかなる材料でもよい。この支持部材は多数の空洞を含んでいてもよい。この空洞は、その空洞中に少なくとも一個の粒子が実質的に含まれるように形成され得る。真空が、この空洞と組み合わされてもよい。真空がセンサーアレー全体に適用されてもよい。あるいは真空装置をこの空洞と組み合わせて空洞を真空にすることも出来る。真空装置は圧力差を発生し流体移動を起こすことの出来る装置であればいずれの装置でもよい。真空装置は任意の流体を空洞内へ吸引する力を適用し得る。真空装置は該流体を空洞を通して引き込むことができる。真空装置の例には封止真空チャンバー、真空ポンプ、真空ライン、或いはアスピレーター型ポンプが含まれる。
これらシステムについての詳細は、以下の米国特許出願に見いだされ、それらの全ては文献として本明細書中に加えられる:塔Zンサーアレーによる複数分析検体の流体ベースの分析“(Fluid Based Analysis of Multiple Analytes by a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/287,248;”溶液中の多数分析検体測定及び同定用センサーアレー“(Sensor Arrays for the Measurement and Identification of Multiple Analytes in Solutions)と題する米国特許出願番号09/354,882,;”分析検体と反応する粒子に基づいた検出システム“(Detection System Based on an Analyte Reactive Particle)と題する 米国特許出願番号09/616,355;”固定マトリックスにおける化学受容体対する一般的信号プロトコール“(General Signaling Protocols f or Chemical Receptors in Immobilized Matrices)と題する米国特許出願番号09/616,482; “化学センサーアレーへ試料を送る方法と装置”(Method and Apparatus for the Delivery of Samples to a Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/616,731; “センサーアレーへのセンサー素子の磁気ベースの配置と保持”(Magnetic-Based Placement and Retention of Sensor Elements in a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,342; “化学情報の収集と送信方法とシステム”(Method and System for Collecting and Transmitting Chemical Information)と題する米国特許出願番号09/775,340; “体液分析用システムと方法”(System and Method for the Analysis of Bodily Fluids)と題する米国特許出願番号09/775,344; “センサーアレー作成方法”(Method of Preparing a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,353; “センサーアレーを通じた液体試料送りシステム”(System for Transferring Fluid Samples Through A Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,048,(米国公開番号 2002-0045272-A1として公開); および“携帯用センサーアレーシステム”(撤ortable Sensor Array System)と題する米国特許出願番号09/775,343,;“材料のマイクロ機械加工化学センサーアレー中への拘束方法と装置” (Method and Apparatus for the Confinement of Materials in a Micromachined Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号10/072,800。
膜システムを用いた微生物のテスト法
他の実施形態では、流体装置内に設置されたフィルターで微生物を捕捉するように構成された、配置膜ベース流れセンサーが作成された。フィルターの細孔よりそのサイズが大きい微生物が、流体セルアセンブリー内に捕捉される。捕捉された微生物は、直接分析されてもよく、或いは可視化化合物で処理されてもよい。
上述の膜ベース流れセンサーを用いて、種々の微生物が捕捉され分析され得る。ここで用いられる、“微生物”は、限定されないが、細菌、胞子、原虫、酵母、ウイルスや藻類が含まれる。検出にとって特に注目すべき微生物としては種々の毒性細菌がある。膜ベースの流量センサーにより検出出来る細菌の例としては限定されないが、大腸菌O157:H7、クリストスポリジウム、コレラ菌、赤痢菌、レジオネラ、リステリア、Bacillus globigii, 炭疽菌(アンスラックス)がある。又人免疫不全症ウイルスを含むウイルスも膜を用いて検出できる。
他の実施形態では、流体装置内に設置されたフィルターで微生物を捕捉するように構成された、配置膜ベース流れセンサーが作成された。フィルターの細孔よりそのサイズが大きい微生物が、流体セルアセンブリー内に捕捉される。捕捉された微生物は、直接分析されてもよく、或いは可視化化合物で処理されてもよい。
上述の膜ベース流れセンサーを用いて、種々の微生物が捕捉され分析され得る。ここで用いられる、“微生物”は、限定されないが、細菌、胞子、原虫、酵母、ウイルスや藻類が含まれる。検出にとって特に注目すべき微生物としては種々の毒性細菌がある。膜ベースの流量センサーにより検出出来る細菌の例としては限定されないが、大腸菌O157:H7、クリストスポリジウム、コレラ菌、赤痢菌、レジオネラ、リステリア、Bacillus globigii, 炭疽菌(アンスラックス)がある。又人免疫不全症ウイルスを含むウイルスも膜を用いて検出できる。
図1には膜ベース流れセンサー100の拡大図を示す。流れセンサーは少なくとも2個のパーツ(部材)140と150ではさまれた膜110を有する。パーツ140と150は流体が膜110に流入し通過出来るように配置されている。パーツ140と150はその分析検体が膜110上に捕捉された後、検体を検出出来るように配置される。種々の材料が膜110に利用でき、限定はされないが、ヌクレポーア(登録商標)(Nucleopore)トラックエッチ膜、ニトロセルロース、ナイロンや酢酸セルロースが含まれる。一般に膜110に使用する材料は可視化や検出の過程に使う抗体や色素と非特異的に結合しにくい物でなければならない。更に膜110は、種々の試薬、緩衝液や溶剤に不活性な材料からなる。膜110はかなり均一に分布した多数のサブミクロンサイズの細孔を有する。均一な細孔分布を持つ膜を使用すると流体の流れをより良くコントロールでき、更に分析検体の単離もコントロール出来る。
パーツ140と150は、この分析検体の検出用光波長に実質的に透明な材料からなる。例えば、この分析検体検出法として紫外光を用いる場合、パーツ140は紫外光に十分透明な材料からなる必要がある。パーツ140はこの検出法の基準に合致する適当ないかなる材料からなるものでもよい。パーツ140形成に使う透明材料としては限定はされないが、ガラス、石英ガラス、アクリル樹脂(たとえばポリメチルメタアクリレート)のような高分子がある。ある実施形態では上面パーツ(上部部材)140と底面パーツ(底部部材)150の双方が透明材料からなる。上面パーツと下面パーツに透明材料を使用することで膜ベース流れセンサーを通して検出が可能になる。
図1に示すように膜110は上面パーツ140と底面パーツ150ではさまれている。底面パーツ150及び/又は上面パーツ140は膜を保持するようにくぼみがあっても良い。例えば図1では底面パーツ150は膜110を支持或いは封止用の他の付属部品と共に膜110をはめ込むように配置したくぼみ152を有する。くぼみ或いは空洞は標準的なエッチング法を用いて上面パーツ140及び/又は底面パーツ150にエッチすればよい。
図1では、底面パーツ150は、膜支持材130をはめ込むように配置される、第一くぼみ152を有する。底面パーツは又第二くぼみ154を有する。第二くぼみは膜支持材130が第二くぼみに入るのを防ぐように配置される。第二くぼみは膜支持材130の近くに配置したうねを有し膜支持材130がこのうねに座る。あるいは図1に示したように第二くぼみは膜支持材130のサイズより小さいサイズにすることも出来る。いずれの場合も組み立てた時に、膜支持材130は第二くぼみ154に入らないようにし、膜支持材130の下に空洞を形成する。空洞154はこのシステムから流出する前に膜支持材130を通過する流体の収集に使用される。
膜支持材130は使用時に膜110を支持出来るように配置される。膜支持材130は流体がその支持膜を通過出来るような多孔材料から作られる。膜支持材130の細孔は流体が膜110を通過する速度と等しいかより早い速度で通過出来るようなサイズでなければならない。一つの実施形態では膜支持材130の細孔は膜110の細孔より大きい。しかし細孔はあまり多くすぎてはいけない。膜支持材130の一つの機能は膜110を支持することである。それ故膜支持材130の細孔は使用中膜110がたわむのを防ぐに十分な小ささでなければならない。膜支持材130には、種々な材料があり、限定されないが、高分子材料、金属やガラスが含まれる。一つの実施形態では高分子材料(たとえばセルコンアクリル系)が膜支持材130の材料として使用出来る。更に膜支持材130は使用中膜を平面に維持するのを助ける。膜を平面に保つことによりこの分析検体の捕捉や検出を単一焦点面で行えるため分析検体の検出を簡単化出来る。
上述のごとく膜110は膜ベース流れセンサーを組み立てる時膜支持材130の上に置く事が出来る。ある実施形態では、ガスケット120が膜110の上部に配置されてもよい。ガスケットは、パーツ140及び150と膜110との間の耐流体用シールとして用いられ得る。このガスケットで、使用中のシステムから流体が漏れるのを防ぐ事が出来る。
上面パーツ140は流体注入口160を持つ事が出来きる。分析用流体は流体注入口160から装置100に導入する。流体注入口160は上面パーツ140の一部を通過出来る。ある実施形態ではチャネル162をチューブ164がチャネル162に挿入出来るように上面パーツ内に作る。チャネル162がこの上面パーツの中心近くで回転しこの流体を膜110の上部表面に送る事が出来る。
上面パーツ140は流体注入口160を持つ事が出来きる。分析用流体は流体注入口160から装置100に導入する。流体注入口160は上面パーツ140の一部を通過出来る。ある実施形態ではチャネル162をチューブ164がチャネル162に挿入出来るように上面パーツ内に作る。チャネル162がこの上面パーツの中心近くで回転しこの流体を膜110の上部表面に送る事が出来る。
底面パーツ150は流体出口170を有する事が出来る。流体注入口160から装置100に導入された流体は上面パーツ140及び膜110を通過する。この流体を空洞154に収集される。流体出口170は底面パーツ150の一部を通過出来る。ある実施形態ではチャネル172をチューブ174がチャネル172に挿入できるよう底面パーツ150の中に作成する。チャネル172は使用中空洞154に収集した流体を受けられるよう配置される。
随意には洗浄流体出口180を上面パーツ140中に作ることも出来る。洗浄流体出口180は洗浄操作中膜110を通過するかその上を通る流体を受け取るように配置される。洗浄流体出口180は上面パーツ140の一部を通るように作られる。ある実施形態ではチャネル182はチューブ184をチャネル182に挿入出来るように上面パーツ140内に作られる。チャネル182は使用中膜110の洗浄に使用した流体を受け取る位置にもうけられる。
膜110は流体流れから注目の分析検体を濾過出来る材料から選ばれる。例えば微生物が注目の分析検体であるなら、フィルターは流体流れから微生物を除去出来ねばならない。適応出来る膜は多くの細孔を有しその大きさは注目の分析検体の大きさよりかなり小さい。空気中の毒性微生物(例えば炭疽菌)に関しては膜は約1μmより大なる直径を持つ微生物を捕捉するように構成される。1μm以下の直径をもつ微生物の大量発生は非常に起こりにくく、もしそのような生物が生存可能であれば高表面積/質量比による環境ストレスのため微生物行動が妨害されやすいと信じられている。膜は既存の技術で既知の種々の材料から作れられる。一つの実施形態では膜110はトラックエッチ化ヌクレポーアTM(Nuclearpore)ポリカーボネート膜である。ヌクレポーア(Nuclearpore)膜はホワットマン社(Whatman plc)から入手出来る。膜110の厚みは5−10ミクロンである。膜110には多数の細孔がある。細孔の直径は約0.2μmから約12μmの範囲で非常に危険な微生物を捕捉できる。
図2はハウジング200に配置した膜ベース流れセンサーの実施例を示す。上面パーツ140、ガスケット120、膜110、膜支持材130及び底面パーツ150を組み立てて、ハウジング200内に配置する。ハウジング200内に膜ベース流れセンサー取り込んでも良い。蓋210を使って膜ベースの流体センサーをハウジング200内に保持しても良い。蓋210は膜110を目視できる窓を持つことも出来る。ハウジング200内に配置した場合、流体注入口160,流体出口170及び洗浄流体出口180がハウジング200から延びて膜ベース流体センサー100へのアクセスを容易にする。
図3に完全な膜ベース分析システムの概略図を示す。この分析システムは多数のポンプ(p1,p2,p3及びp4)を含む。ポンプは試料(p1)、可視化試薬(p2とp3)及び膜洗浄流体(p4)を使用中の膜ベース流体センサー100に送るように配置される。試薬、洗浄流体、及び可視化試薬は流体が膜ベース流体センサーに到達する前にプリフィルター(f1,f2、f3及びf4)を通過する。プリフィルターは膜110を詰まらす大きい粒子性物をふるい分けて除去するために使用される。それぞれのプリフィルターの性質と細孔の大きさは大きな粉塵粒子や微粒子物の集合体が詰まらないよう効率よく満足に捕捉出来るよう最適化される。プリフィルターf1はこの試料が膜ベース流体センサー100に到達する前に試料を濾過するように配置される。プリフィルターf1は注目の分析検体と関係のない粒子は防ぐが注目の分析検体は通過出来るように配置される。例えばプリフィルターf1の細孔より大きさが小さい胞子はこのプリフィルターを通過し膜ベースの流体センサー100で捕捉される。プリフィルターf1−f4を通過後流体はマニホールドを通過する。ある実施形態では膜ベース流体センサー100は単一の入力ラインからなる。このマニホールドで異なる流体ラインと膜ベースの流体センサー100の単一入力ラインとを組み合わせられる。
流体はマニホールドを通過した後膜ベース流体センサー100の液体注入口に導入される。適当な時間に検出器250によりこの膜ベース流体センサー100が捕捉した分析検体があるかどうかを決定する。図3に示すように、この検出器を膜の画像が得られるよう膜ベース流体センサー100の一部の上に配置する。例えば膜の画像が膜ベース流体センサー100の窓を通じて得るように検出器を配置できる。検出器250は膜110上に捕捉した微粒子物の画像を得るのに使用できる。画像取得は画像の“デジタルマップ”の発生を含む。一つの実施形態では検出器250は高感度CCDアレーを含む。このCCDアレーはフィルター、光源、流体送りと組み合わせて機能性センサーアレーを創生出来る。データ取得と処理は既存のCCD技術で行うことが出来る。ある実施形態では光は赤、緑、青の三色成分に分割される。光学的変化の評価は目視での検査(即ち顕微鏡による)或いはマイクロプロセッサー(CPU)とこの検出器との組み合わした完了できる。蛍光測定には検出器250と膜110の間に励起波長を除くためフィルターを入れる。このマイクロプロセッサーは又図3に示すようにポンプやバルブのコントロールに用いる事も出来る。
この分析検体検出システムはどのバルブが開き且つ閉じているかにより異なるモードで運転出来る。“フロースルー”モードでのこのシステムの配置を図3に示す。このモードでは流体はそのマニホールドから膜ベース流体センサー100に通過し分析検体を捕捉するか発色試薬を添加する。分析用流体は流体注入口160から膜ベース流体センサー100に導入できる。“フロースルー”操作中バルブV1は閉じた位置にありこの流体が洗浄流体出口180に流れを防ぐ。それ故この流体は膜ベース流体センサー100を通り流体出口170を経てこのセンサーから流出させることが出来る。バルブV2は開いた位置にありこの流体が廃棄物容器に流出出来る。バルブV3は閉じた位置にあり洗浄流体供給ラインへのこの流体の流入を防ぐ。
この分析検体検出システムはどのバルブが開き且つ閉じているかにより異なるモードで運転出来る。“フロースルー”モードでのこのシステムの配置を図3に示す。このモードでは流体はそのマニホールドから膜ベース流体センサー100に通過し分析検体を捕捉するか発色試薬を添加する。分析用流体は流体注入口160から膜ベース流体センサー100に導入できる。“フロースルー”操作中バルブV1は閉じた位置にありこの流体が洗浄流体出口180に流れを防ぐ。それ故この流体は膜ベース流体センサー100を通り流体出口170を経てこのセンサーから流出させることが出来る。バルブV2は開いた位置にありこの流体が廃棄物容器に流出出来る。バルブV3は閉じた位置にあり洗浄流体供給ラインへのこの流体の流入を防ぐ。
この分析検体検出システムは図4に示すように“側部ライン膜洗浄”モードで運転することも出来る。このモードではその膜は膜の収集表面を横切る流体通路によりクリアされている。このモードでは次の試験にこの膜を再使用できる。膜洗浄用流体は流体注入口160からセンサー100に導入する。“側部ライン膜洗浄”操作中は出口バルブV2とV3は閉じた位置にありその流体が流体出口170から流出するのを防ぐ。出口バルブV2とV3を閉じると又その流体がセンサー100の膜を通して流れるのを防ぐ。それ故センサー100に入った流体は洗浄流体出口180をとうしてセンサー100から出るようになる。バルブV2は開いた位置にありその流体を洗浄流体出口180を通り廃棄物容器に流出する。流体が膜を通って流れないようにしているから、この膜により収集した分析検体や他の粒子も膜から“洗浄”され再度の使用が可能になる。
この分析検体検出システムはまた図5に示すように“逆流洗浄”モードで運転出来る。逆洗浄運転中洗浄流体出口180はその流体がこの装置から流出するのに使用されるのに対し、流体出口170は流体をこの分析検体検出システムへ導入するのに使用する。流体のセルへのこの“逆”流により膜はクリアー出来る。一つに実施形態では図5に示すようにバルブを洗浄流体が流体出口170を通るよう配置する。特にバルブV1とV3は開いておりバルブV2は閉じている。
側部ライン膜洗浄或いは逆流置換処理のいずれかで膜から分析検体と他の粒子をクリアー出来る。この膜表面の両洗浄法は超音波攪拌或いは機械的攪拌によりより強められる。使用中流体試料中の分析検体は膜の開口より大きいので膜により保持される。この分析検体は使用後膜全体に無秩序に分布する傾向がある。細孔間に位置する膜上をしめる分析検体はその膜の細孔上かその近くにある分析検体より除去しにくい。逆流洗浄流体力は分析検体と十分に接触出来ないので、細孔間の膜上にしめる分析検体はより除去しにくい。逆流洗浄及び側部ライン洗浄運転中捕捉分析検体は超音波攪拌や機械攪拌の使用でその除去を強めることが出来る。両攪拌法はこの分析検体を膜表面を横切って移動させ、分析検体がこの細孔の一つを通過する円柱状の洗浄流体に出会うチャンスが増加する。
分析検体検出システムは流体システム中に分析検体が存在するかを決定するのに使うことも出来る。流体試料中の分析検体の存在を決定する方法の一つの実施形態を図7のフローチャートに示す。試料を分析する前にバックグランド試料を集めて分析する。典型的には固体分析検体が集められ液流体中に保存される。この試料作成に使用した液流体を分析検体が流体中に存在するかどうかを決めるために分析する。一つの実施形態ではこの固体流体収集に使用済みの液流体試料をこの流体によるバックグランド“ノイズ”を決定するため分析検体検出装置に導入する。このバックグランド収集中に膜が収集した粒子を見てこの液流体中の微粒子物レベルを決定する。ある実施形態ではこの収集段階で膜が収集した粒子を液流体中に分析検体が存在するか否かを決定する為に可視化試薬で処理する。バックグランドチェックで集めた情報を用いて収集資料分析中に偽陽性という表示を減少させる。
バックグランド試料を収集後前述のごとく逆流置換洗浄か側部ライン洗浄のいずれかににより膜をクリアー出来る。膜をクリアー後このシステムは固体分析検体(即ち微生物)用試料の分析に使用できる。ここで使用した“微生物”という言葉は細菌、胞子、ウイルスや原虫を含む種々の生きた生物を意味する。収集試料が多孔膜を通過すると、この多孔膜の細孔の大きさより大きい粒子はいずれもこの多孔膜で捕捉される。粒子の収集は既定時間継続されるか収集試料の全てがこの膜を通過するまで継続できる。
収集後膜が収集した粒子は検出器を用いて分析する。ある実施形態ではこの検出器はCCDカメラであっても良い。この膜が収集した粒子の分析はその粒子の大きさ及び/或いは形の分析により実行する。この膜により収集した粒子の大きさ及び/又は形を既知の粒子の大きさと形と比べることにより既定の分析検体の存在を示すことが出来る。或いは微生物分析検体を種々の可視化試薬(即ち有色染料及び蛍光染料)と反応させる。一つの実施形態では微生物分析検体の検出は可視化試薬の助けで微生物を染色出来る。この可視化試薬は微生物に既知の色変化を起こすか蛍光を付与する。一つの実施形態では膜が収集した粒子を染色しその粒子を適当な検出器を使って分析する。適当な色及び/又は蛍光を持つ粒子の存在はテストする分析検体が存在することを指示している。典型的には非微生物粒子(即ち粉塵)はこの可視化試薬で処理したとき微生物が示すのと同じ色及び/又は蛍光を持たない。この可視化試薬は注目の微生物を標識するように設計した半特異的染料の“カクテル”混合物を含む。この混合物の選択は光学的指紋を創生する染料発色団能力に基づき、その指紋を検出器と特異な病原性細菌や胞子に関する画像ソフトウエアーにより確認すると共に、粉塵や他のバックグラウンド微粒子物による信号を同時に区別する。
この粒子分析は注目の分析検体が試料中に存在することを指示出来る。この場合はその粒子は膜から洗い出し更なるテストのためシステムから送り出す。更なる試験は培養や存在する特異的分析検体をより正確に決定できるELISA技術のような技法を含む。或いは上述のように更なる試験のためにその粒子をセンサーアレーに送る事も出来る。有意量の分析検体が膜上に発見できない場合は、この膜を洗浄し他の試料を分析する。
一つの実施形態では使用者指定の閾値基準を確立し一個或いは複数の特異的微生物が膜上に存在する確率を表示出来る。その基準は種々の画像特性の内の一つ或いは複数のものに基づく。ある実施形態ではこの基準は特異な微生物にあらかじめ確立した画素或いは色指紋に基づく。この特性は限定はされないが、その画像上の物体の一部の大きさ、形、或いは色、その物体を表す会合面積、或いはその物体の全蛍光強度を含む。一つの実施形態ではこのシステムは一個或いは複数の病原性及び非病原性細菌用に開発した自動計数法を実行する。
一つの実施形態ではこの膜システムにコンピュータシステム(非表示)を含んでもよい。コンピューターシステムは検出器により発生したディジタル画像マップを処理できる一個或いは複数のソフトウエアーを含む事が出来る。例えばこのコンピューターシステムに使用できるソフトウエアーを用いてテスト画像を既定の光学的指紋と比べることも出来る。或いはコンピューターシステムに使用できるソフトウエアーを用いてカウント数が既定の閾値限界を超えているか否かを決定することも出来る。
検出器は膜上に捕捉した分析検体と他の微粒子物の画像を得るのに使用出来る。微生物は膜上に粉塵や他の微粒子物と共に収集され検出器で発生する画像として得られる。検出器で得た画像を既定の基準をもとに分析する。正の結果は微生物の存在を指示する。テスト基準は限定されないが、画像の一部或いは複数部分の大きさ、形、アスペクト比、或いは色を含む種々の画像特性に基づく。このテスト基準を用いて微生物を粉塵と他の微粒子物から区別できる。分析中その試料は流体送りシステムを流れ続ける。
ある実施形態では正の結果をもとに流体が特有な分析検体を含有していると推定することがある。もしその画像がテスト基準に関して正の結果であれば、この流体試料は確認試験か特異試験を受ける。一方もし画像がテスト基準に関して負の結果であれば、膜を洗浄し以前の方法を他の試料からの流体について実施する。
分析検体のテスト中試料はこの分析検体検出装置に導入する。引き金パラメーターを測定していつ可視化試薬を分析検体検出装置に導入するかを決める。引き金パラメーターの測定は連続で行えるし又使用者により開始し出来る。代わりに着色剤をこの試料導入直後に分析検体検出装置に導入出来る。
一つの実施形態では引き金パラメーターはこの流体を制御した流量で分析検体検出装置に導入開始後のある経過時間であっても良い。例えばこの流体試料を一分間に1ミリリッターの流量で分析検体検出装置に導入開始後20秒して着色剤を導入する。他の実施形態では引き金パラメーターは膜全体での圧力低下でも良い。この膜全体での圧力低下はこの膜のいずれかのサイドにある圧力トランスデューサを用いて決定出来る。
その他の実施形態ではこの引き金パラメーターは膜が捕捉した分析検体の自己蛍光である。検出器はその分析検体の自己蛍光からの信号が既定レベルに達するまでスイッチをオンにする。なおその他の実施形態ではフィルターソフトウエアーを用いて青或いは赤色スペクトル領域の色を含むいかなる画素も排除した膜上の物体の自己蛍光データマップを作成する事も出来る。データマップを用いて可視スペクトルのうち“純緑色”部分だけの自己蛍光性粒子の値を計算することも出来る。
ある実施形態ではもし引き金パラメーターが着色剤を使うこと無しにある値を越えたとき正の結果だと推定する。例えば推定的正の結果で自己蛍光値が着色剤使用が指示する値の2倍以上だと推定する。このような場合には着色剤の使用をやめその試料の確認テストを実施する。もし引き金パラメーターの値が確認テストを直接行うよう指示するよりは低いが、着色剤使用を指示するよう決めた値を越える場合には、着色剤を分析検体検出装置に導入する。
流体試料の収集には固体、液体又は気体からの試料収集を含む。ある実施形態では試料は目的環境の空気からエーロゾルの形で収集しエーロゾルをヒドロゾルに変換する。例えば500リッターの空気試料から粒子を集め約0.5ミリリッターの液体に沈着する。本明細書中に十分に開示されているものとして文献として組み込まれる、マックファーランド(McFarland)により“蒸散壁型エーロゾル収集システムと方法煤iTRNSPIRATED WALL AEROSOL COLLECTION SYSTEM AND METHOD煤jとの題で 米国特許第6,217,636号には、多孔性壁を用いて気体から微粒子性物を液体として収集するシステムが記述されている。
一つの実施形態では上述のシステムは炭疽菌、胞子や細菌の存在の決定に用いられる。非常に汚染している場所での空気試料の収集はエーロゾルコレクターを用いて液体試料に濃縮する。この液体試料は上述の膜ベース検出システムを通過する。この膜ベース検出システムはこのエーロゾルコレクターにより収集したどの粒子も収集できる。この収集した粒子は炭疽菌細菌に特異な着色剤を含む可視化試薬で処理する。このような可視化試薬は既存技術の通常技術の一つとして知られている。適当な色/蛍光を示す粒子の存在は炭疽菌の存在を指示する。炭疽菌を指示していれば更にその他の確認試験で決定できる。
実験
フローセル
フローセルの組み立ては基板、支持部、及びねじ込み型キャップからなる三点ステンレススチール製セルホルダーから作られた。二個の円形ポリメチルメタアクリレート(PMMA)インサートによりヌクレポーア(登録商標)膜(Nuclepore)を収容する。これら二つのPMMAインサートは、ステンレススチール製チューブ(#304-H-19.5, ミクログループ(Microgroup)、メッドウエイ(Medway)、マサチュセッツ州)を通してチップへ及びチップから流体が流れるように、その縁と側部に沿って穴が開けられている。穴を開けたPMMAインサート中にエポキシ接着剤で固定された、該チューブは0.039インチ(19.5ゲージ)の外径および0.0255−0.0285インチの内径を有していた。フローセルの基本構成物は二個の円形のPMMA“インサート”である。底部PMMAインサートは、排出機能を発揮するように、且つフィルター用支持材として作用するプラスチックスクリーンディスク(セルコン アクリル系)を含むように、改変されている。各インサートは、ステンレススチールチューブがPMMAディスクの側部の穴に入る、長さのステンレススチールチューブを有している。上部インサートはまた、フィルターの再使用が必要な場合に用いられる追加の出口を有している。シリコーンチューブが該ステンレススチールチューブ上にパチッととめられており、そのようにして広範囲の流体付属品(たとえばポンプ、バルブなど)や溶剤と容易に適合する。このフローセルは、20mL/分のような高い流量で生ずる圧力に耐え漏れもないことが示された。
フローセル
フローセルの組み立ては基板、支持部、及びねじ込み型キャップからなる三点ステンレススチール製セルホルダーから作られた。二個の円形ポリメチルメタアクリレート(PMMA)インサートによりヌクレポーア(登録商標)膜(Nuclepore)を収容する。これら二つのPMMAインサートは、ステンレススチール製チューブ(#304-H-19.5, ミクログループ(Microgroup)、メッドウエイ(Medway)、マサチュセッツ州)を通してチップへ及びチップから流体が流れるように、その縁と側部に沿って穴が開けられている。穴を開けたPMMAインサート中にエポキシ接着剤で固定された、該チューブは0.039インチ(19.5ゲージ)の外径および0.0255−0.0285インチの内径を有していた。フローセルの基本構成物は二個の円形のPMMA“インサート”である。底部PMMAインサートは、排出機能を発揮するように、且つフィルター用支持材として作用するプラスチックスクリーンディスク(セルコン アクリル系)を含むように、改変されている。各インサートは、ステンレススチールチューブがPMMAディスクの側部の穴に入る、長さのステンレススチールチューブを有している。上部インサートはまた、フィルターの再使用が必要な場合に用いられる追加の出口を有している。シリコーンチューブが該ステンレススチールチューブ上にパチッととめられており、そのようにして広範囲の流体付属品(たとえばポンプ、バルブなど)や溶剤と容易に適合する。このフローセルは、20mL/分のような高い流量で生ずる圧力に耐え漏れもないことが示された。
流体送り、光学的計装及びソフトウエアー
図3,4及び5に示される完全分析システムは、空気から集めた分析検体、抗体、フローセルへの洗浄緩衝液、および再生モードでのフローセルの清掃に供される、4つのぜん動ポンプ(p1,p2、p3及びp4)を有する。一体化されたソフトウエアーが、チップへの流体の送りを確保し、バルブの適正な使用による洗浄サイクルに対応するのに、用いられた。該試料、抗体、PBSおよび再生ラインはまた、濾過されて(プリフィルターf1,f2,f3及びf4)、大きな粒子物を除去する。プリフィルターf1は5μmの孔径を有するヌクレポア(登録商標)(nuclepore)フィルターである。プリフィルターf2,f3及びf4は0.4μmのヌクレポア(登録商標)(nuclepore)フィルターである。プリフィルターf1の細孔より小さいサイズの胞子はフィルターを通り抜け、変性された化合物BX2オリンパス顕微鏡のモーター可動架台上の分析用フローセルで捕捉される。この顕微鏡は種々の対物レンズ、光学フィルター及び操作を自動化した電荷結合デバイス(CCD)カメラを装備している。
図3,4及び5に示される完全分析システムは、空気から集めた分析検体、抗体、フローセルへの洗浄緩衝液、および再生モードでのフローセルの清掃に供される、4つのぜん動ポンプ(p1,p2、p3及びp4)を有する。一体化されたソフトウエアーが、チップへの流体の送りを確保し、バルブの適正な使用による洗浄サイクルに対応するのに、用いられた。該試料、抗体、PBSおよび再生ラインはまた、濾過されて(プリフィルターf1,f2,f3及びf4)、大きな粒子物を除去する。プリフィルターf1は5μmの孔径を有するヌクレポア(登録商標)(nuclepore)フィルターである。プリフィルターf2,f3及びf4は0.4μmのヌクレポア(登録商標)(nuclepore)フィルターである。プリフィルターf1の細孔より小さいサイズの胞子はフィルターを通り抜け、変性された化合物BX2オリンパス顕微鏡のモーター可動架台上の分析用フローセルで捕捉される。この顕微鏡は種々の対物レンズ、光学フィルター及び操作を自動化した電荷結合デバイス(CCD)カメラを装備している。
水銀灯が光源として使用された。この報告書に示した蛍光画像はFITCフィルターキューブ(フルオロイソチオシアン酸塩、480nm励起、505長光路ビームスプリッター二色鏡及び535 ± 25 nm発光)で得られ、この顕微鏡に装填したDVC 1312C(ディジタルビデオ社、オースチン、テキサス州(Digital Video Company, Autsin, TX))電荷結合デバイス(CCD)で捕捉され、イメージプロプラス4.0(Image Pro 4.0)ソフトウエアー(メディアアイバネティック社(Media Cybernetics))にインターフェースされた。そのアレーの画像のうち注目領域が自動的に選択され、赤、緑及び青色(RGB)画素強度の数値抽出に用いられた。
試薬
pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)はピアース社(Pierce)(#28374,0.008MNa3PO4,0.14MNaCl、0.01MKCl)から購入された。予め重量をはかったパックの内容物が500 mLのイオン交換水に溶かされた。完全に溶解後、この緩衝液が、60ミリリッターの使い捨て型注射器(ベクトンディキンソン#309654)(Becton Dickinson#309654)と0.2mm細孔の注射器用フィルター(ホアットマン社(Whatman)25mmメータ、0.2mmポリエーテルスルホン(PES)フィルター#6896−2502)を使って濾過された。ポリオキシエチレン−ソルビトールモノラウリン酸エステル(ツイーン−20)(Tween-20)とウシ血清アルブミン(BSA)はシグマ社(Sigma)(#P−1379及び#A−0281)から購入された。抗bg(Bacillus Globigii)抗体はテトラコーア社(Tetracore)の好意で供与され蛍光標識試薬で標識された。生抗体はモレキュラープローブス社(Molecular Probes)のアレキサフルオル(登録商標)488(Alexa Fluor (登録商標)488)蛋白質標識化キット(#A−10235)に記載の手順で標識化され4℃で保存された。標識された抗bgの最終濃度は0.5mg/mLであった。分析用サンプルを作るときには、この抗体は1%BSA/PBS(PBS1mL当たり0.01gのBSA)の濾過(ベクトン ディキンソン社(Becton Dickinson)3mL使い捨て型注射器#309574、ポールゲルマン社(Pall Gelman)による)液の13mm、0.2μmアクロディスクCRポリテトラフルオロエチレンPTFE#4423(Acrodisc CR Polytetrafluoroethylene PTFE#4423)注射器用フィルター)で50倍に希釈された。胞子の作成はエッジウッド/ダウウエイプルービンググラウンド(Edgewood/Dugway Proving Grounds)から供与された。その評価の為にこの胞子はペトリ皿に分けローリアベルターニプレーティング培地で生育された。培地はディフコ社(Difco)から購入したバクトトリプトン(Bacto Triptone)、バクト酵母抽出物(Bacto Yeast Extract)、藻類テクニカル(Agar Technical)(それぞれ#211705,#212750,#281230)及びイーエム社(EM)から購入した食塩(#SX0420−1)からなる。バーンステッドナノピュアーカラム(Barnstead Nanopure Column)で脱イオン化した蒸留水は121℃で30分加圧減菌された。
pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)はピアース社(Pierce)(#28374,0.008MNa3PO4,0.14MNaCl、0.01MKCl)から購入された。予め重量をはかったパックの内容物が500 mLのイオン交換水に溶かされた。完全に溶解後、この緩衝液が、60ミリリッターの使い捨て型注射器(ベクトンディキンソン#309654)(Becton Dickinson#309654)と0.2mm細孔の注射器用フィルター(ホアットマン社(Whatman)25mmメータ、0.2mmポリエーテルスルホン(PES)フィルター#6896−2502)を使って濾過された。ポリオキシエチレン−ソルビトールモノラウリン酸エステル(ツイーン−20)(Tween-20)とウシ血清アルブミン(BSA)はシグマ社(Sigma)(#P−1379及び#A−0281)から購入された。抗bg(Bacillus Globigii)抗体はテトラコーア社(Tetracore)の好意で供与され蛍光標識試薬で標識された。生抗体はモレキュラープローブス社(Molecular Probes)のアレキサフルオル(登録商標)488(Alexa Fluor (登録商標)488)蛋白質標識化キット(#A−10235)に記載の手順で標識化され4℃で保存された。標識された抗bgの最終濃度は0.5mg/mLであった。分析用サンプルを作るときには、この抗体は1%BSA/PBS(PBS1mL当たり0.01gのBSA)の濾過(ベクトン ディキンソン社(Becton Dickinson)3mL使い捨て型注射器#309574、ポールゲルマン社(Pall Gelman)による)液の13mm、0.2μmアクロディスクCRポリテトラフルオロエチレンPTFE#4423(Acrodisc CR Polytetrafluoroethylene PTFE#4423)注射器用フィルター)で50倍に希釈された。胞子の作成はエッジウッド/ダウウエイプルービンググラウンド(Edgewood/Dugway Proving Grounds)から供与された。その評価の為にこの胞子はペトリ皿に分けローリアベルターニプレーティング培地で生育された。培地はディフコ社(Difco)から購入したバクトトリプトン(Bacto Triptone)、バクト酵母抽出物(Bacto Yeast Extract)、藻類テクニカル(Agar Technical)(それぞれ#211705,#212750,#281230)及びイーエム社(EM)から購入した食塩(#SX0420−1)からなる。バーンステッドナノピュアーカラム(Barnstead Nanopure Column)で脱イオン化した蒸留水は121℃で30分加圧減菌された。
ポリマー微粒子溶液
蛍光性ポリマー緑色微粒子はデュークサイエンティフィック社(Duke Scientific Corporation)(パロアルト、カリフォルニア州(Palo Alto, CA))から購入された。ビーズのストック溶液は数滴の原ビーズ溶液を500mLの脱イオン化水で希釈された。輝線カウントチャンバーまたは細胞数計数器(ハウザーサイエンティフィック社、ホルシャム、ペンシルバニア州)(Hausser Scientific,Horsham, PA)がこの溶液の正確な濃度決定に用いられた。溶液濃度は良く確立されたプロトコールに従い典型的には数回測定の平均として求められた。このストック溶液濃度は1,883,750ビーズ/mL ± 8539で相対的誤差0.45%であった。図3と図4に用いられた溶液には、ストック溶液の1:50希釈液を用い、この溶液50μl、100μl、150μl、200μl 及び250μlを同じフローセルに加え種々の倍率で画像を得た。
蛍光性ポリマー緑色微粒子はデュークサイエンティフィック社(Duke Scientific Corporation)(パロアルト、カリフォルニア州(Palo Alto, CA))から購入された。ビーズのストック溶液は数滴の原ビーズ溶液を500mLの脱イオン化水で希釈された。輝線カウントチャンバーまたは細胞数計数器(ハウザーサイエンティフィック社、ホルシャム、ペンシルバニア州)(Hausser Scientific,Horsham, PA)がこの溶液の正確な濃度決定に用いられた。溶液濃度は良く確立されたプロトコールに従い典型的には数回測定の平均として求められた。このストック溶液濃度は1,883,750ビーズ/mL ± 8539で相対的誤差0.45%であった。図3と図4に用いられた溶液には、ストック溶液の1:50希釈液を用い、この溶液50μl、100μl、150μl、200μl 及び250μlを同じフローセルに加え種々の倍率で画像を得た。
Bg胞子溶液の調製
1mg/mLの胞子ストック溶液(A)は、減菌水中で、x mgの胞子をx mLの減菌水中に懸濁させることにより、調製された。それぞれ10e-1, 10e-2,10e-3, 10e-4, 10e-5, 10e-6, 10e-7及び 10e-8 mg/mLの濃度を有する、溶液B,C、D、E,F、G、H及びIが、ストック溶液Aを段階希釈して得られた。
1mg/mLの胞子ストック溶液(A)は、減菌水中で、x mgの胞子をx mLの減菌水中に懸濁させることにより、調製された。それぞれ10e-1, 10e-2,10e-3, 10e-4, 10e-5, 10e-6, 10e-7及び 10e-8 mg/mLの濃度を有する、溶液B,C、D、E,F、G、H及びIが、ストック溶液Aを段階希釈して得られた。
Bg胞子溶液の特性決定
標品ミリグラム当たりの胞子濃度はルリアベルタニ培地にコロニーを成長することにより評価され胞子1ミリグラム当たりのコロニー形成単位(CFU)で表された。バクトトリプトン(Bacto Triptone)15g、バクト酵母抽出物(Bacto Yeast Extract)7.5g及び食塩15gが減菌水1.5Lに溶かされた。そのpHは0.1Nの苛性ソーダ液で7.6(フィッシャーアクメットピーエッチメーター620)(Fisher Accumet pHmeter 620)に調整された。寒天テクニカル(Agar technical)22.5gがこの標品に添加された。この溶液はマイクロ波で加熱されて完全に溶解され、30分間121℃で加圧減菌された。冷却後この培地は使い捨て型減菌培地メンバー(フィッシャーブランド#08−757−12)(Fisherbrand#08-757-12)に注がれだ。このメンバーは培地が完全に固化するまで放置され、保存のためパラフィルムで包装された。
標品ミリグラム当たりの胞子濃度はルリアベルタニ培地にコロニーを成長することにより評価され胞子1ミリグラム当たりのコロニー形成単位(CFU)で表された。バクトトリプトン(Bacto Triptone)15g、バクト酵母抽出物(Bacto Yeast Extract)7.5g及び食塩15gが減菌水1.5Lに溶かされた。そのpHは0.1Nの苛性ソーダ液で7.6(フィッシャーアクメットピーエッチメーター620)(Fisher Accumet pHmeter 620)に調整された。寒天テクニカル(Agar technical)22.5gがこの標品に添加された。この溶液はマイクロ波で加熱されて完全に溶解され、30分間121℃で加圧減菌された。冷却後この培地は使い捨て型減菌培地メンバー(フィッシャーブランド#08−757−12)(Fisherbrand#08-757-12)に注がれだ。このメンバーは培地が完全に固化するまで放置され、保存のためパラフィルムで包装された。
Bg胞子標本1mg当たりのCFU値は次のように評価された。溶液A〜Iの100μLが培地に37℃、24時間分割された。インキュベートした後コロニーは数を数えられるまで成長した。統計的な数のコロニー(30乃至300)をもつメンバーについてだけ胞子標本1ミリグラム当たりのCFU値を計算した。AからEの溶液はカウント数が多すぎ(TNC)、HとIの溶液はカウント数(30以下)が不十分であった。更に減菌水をネガティブコントロールとして分割CFUゼロとした。残ったメンバーから平均濃度は3x108CFU/mgの胞子標本と決定された。
試験法の最適化
Bg胞子に対するテトラコア(Tetracore)抗体の特異性はまずチューブ内反応で次いでガラススライド上で染色した胞子の蛍光顕微鏡観察により確認された。この同じ抗体をこのシステムの濾過膜に捕捉したBg胞子の検出に用いた。このオンラインアッセイに対しSN比が最大になる条件を見つけるため一連の試験を行った。評価されたパラメーターには、a)このシステムのチューブ及び濾過膜のBSA(即ち検出抗体に対する非特異的結合場所の遮断)による前処理効果、b)フローセルへの抗体導入速度(即ち流量)の変化、c)抗体濃度の変化、d)Bg胞子による抗体インキュベート時間の変化、e)画像捕獲の為の最適露出時間の同定、及びf)抗体のセルへの流れが一方向モードである時と再循環の場合との比較が含まれていた。我々の研究により、システムのチューブ及びフローセル濾過膜のBSAによる遮断は非特異的信号の減少と云う意味ではこのアッセイに対して有意性をもたらさないことが明らかになった。それにもかかわらず我々は1%BSAを抗体溶液に含めるとBgに特異な信号が強くなり、その結果より高いSN比が得られ、より高感度のアッセイとなることを見いだした。Bg胞子のインキュベート時間は10μg/mL濃度のBgに特異な抗体を1.5mLと共に5分間処理し0.3mL/分の速度で一方向モードでフローセルに導入するのがアッセイの最適条件であることが判った。
Bg胞子に対するテトラコア(Tetracore)抗体の特異性はまずチューブ内反応で次いでガラススライド上で染色した胞子の蛍光顕微鏡観察により確認された。この同じ抗体をこのシステムの濾過膜に捕捉したBg胞子の検出に用いた。このオンラインアッセイに対しSN比が最大になる条件を見つけるため一連の試験を行った。評価されたパラメーターには、a)このシステムのチューブ及び濾過膜のBSA(即ち検出抗体に対する非特異的結合場所の遮断)による前処理効果、b)フローセルへの抗体導入速度(即ち流量)の変化、c)抗体濃度の変化、d)Bg胞子による抗体インキュベート時間の変化、e)画像捕獲の為の最適露出時間の同定、及びf)抗体のセルへの流れが一方向モードである時と再循環の場合との比較が含まれていた。我々の研究により、システムのチューブ及びフローセル濾過膜のBSAによる遮断は非特異的信号の減少と云う意味ではこのアッセイに対して有意性をもたらさないことが明らかになった。それにもかかわらず我々は1%BSAを抗体溶液に含めるとBgに特異な信号が強くなり、その結果より高いSN比が得られ、より高感度のアッセイとなることを見いだした。Bg胞子のインキュベート時間は10μg/mL濃度のBgに特異な抗体を1.5mLと共に5分間処理し0.3mL/分の速度で一方向モードでフローセルに導入するのがアッセイの最適条件であることが判った。
我々の研究からはまた、抗体の再循環は検出時間の短縮や検出限界の減少という点で何ら有利にはならないことが示された。このようなアプローチは検出に使う抗体量を減らす可能性があるが、長時間の抗体の再循環はその沈降と関連するのでこの方法をとらない事とした。予期されるように沈降した抗体は膜により捕捉され非特異性信号を増加する可能性がある。反対に一方向モードで送った場合には検出検体は殆ど沈澱しない。沈殿抗体も分析用フローセルに到達しないよう0.4μmのプリフィルターをこのシステムに装備した。このアプローチにより遙かにクリーンなアッセイが得られる。
最後に、このアッセイの最終画像を捕獲する妥当な露出時間は184msと決定された。この露出時間でBgに特異な最強信号を発生し、システムに見いだされる可能性のある粉塵、無関係な非染色細菌や蛍光紙の繊維のような混入物による非特異的なバックグランド信号を最弱に出来た。
用量反応曲線
標準曲線を確立するため胞子溶液を前述と同様の方法で減菌水の代わりにPBSを使って作成した。手短に1mg/mL 濃度(又は3x108 CFU/mL)の胞子ストック溶液Aを用いて胞子1mgをPBS1mLに懸濁した。溶液B、C、D、E、F及びGはストック溶液Aをそれぞれ3x108、3x107、3x106、3x105、3x104、3x103、3x102CFU/mLになるように段階希釈した。これらの濃度は1ng/mLから1mg/mLの範囲をカバーする。各溶液に対して下記のステップで測定を実行した。この溶液をポンプ1から60秒間に1mL/分の流量で導入しポンプ2から同じ流速で60秒間PBSにより洗浄した。次いで抗体をゆっくりと(3ml/分)ポンプ3からフローセルに流した。最後に90秒間洗浄することによりいかなる非結合的又は非特異的に付着した抗体を確実に除去した。バックグランド信号は抗体が胞子不在の5つの異なるフローセルを通過して得た5つの独立に測定した信号で評価した。検出限界はこれら5回測定の平均値から得た標準偏差の3倍とした。検量線は胞子数900、3000,9000及び30000の4種の胞子溶液を測定し作成した。最終洗浄後の残留信号の蛍光顕微鏡写真を記録しその信号を画素当たり緑色強度密度として表した。画素当たりの平均緑色密度を胞子カウント数に対してプロットし検知限界は胞子数900と決定した。
標準曲線を確立するため胞子溶液を前述と同様の方法で減菌水の代わりにPBSを使って作成した。手短に1mg/mL 濃度(又は3x108 CFU/mL)の胞子ストック溶液Aを用いて胞子1mgをPBS1mLに懸濁した。溶液B、C、D、E、F及びGはストック溶液Aをそれぞれ3x108、3x107、3x106、3x105、3x104、3x103、3x102CFU/mLになるように段階希釈した。これらの濃度は1ng/mLから1mg/mLの範囲をカバーする。各溶液に対して下記のステップで測定を実行した。この溶液をポンプ1から60秒間に1mL/分の流量で導入しポンプ2から同じ流速で60秒間PBSにより洗浄した。次いで抗体をゆっくりと(3ml/分)ポンプ3からフローセルに流した。最後に90秒間洗浄することによりいかなる非結合的又は非特異的に付着した抗体を確実に除去した。バックグランド信号は抗体が胞子不在の5つの異なるフローセルを通過して得た5つの独立に測定した信号で評価した。検出限界はこれら5回測定の平均値から得た標準偏差の3倍とした。検量線は胞子数900、3000,9000及び30000の4種の胞子溶液を測定し作成した。最終洗浄後の残留信号の蛍光顕微鏡写真を記録しその信号を画素当たり緑色強度密度として表した。画素当たりの平均緑色密度を胞子カウント数に対してプロットし検知限界は胞子数900と決定した。
電子顕微鏡
相関性光学電子顕微鏡分析を5μlの抗体染色胞子液をフォルムバールでコートした(Formvar-coated)透過型電子顕微鏡グリッド(マックスタフォルムH2ファインダーグリッド、テッドペヤ社(Maxtaform H2 finder grids, Ted Pella, Inc.)に乗せて行った。胞子壁が厚いためより複雑な脱水処理が避けられ胞子懸濁液を単に空気乾燥することが出来た。適当な領域を決め蛍光顕微鏡法で写真をとった後、グリッドをフィリップス420透過型電子顕微鏡(Philips 420 TEM)内に置き同じグリッド四方の写真を撮った。このグリッドをカーボンテープでアルミ切れ端に貼り付け金―パラジウムでスパッタリングコートした。レオ1530走査型電子顕微鏡(Leo 1530 SEM)を用いて注目領域の画像を捕獲した。
相関性光学電子顕微鏡分析を5μlの抗体染色胞子液をフォルムバールでコートした(Formvar-coated)透過型電子顕微鏡グリッド(マックスタフォルムH2ファインダーグリッド、テッドペヤ社(Maxtaform H2 finder grids, Ted Pella, Inc.)に乗せて行った。胞子壁が厚いためより複雑な脱水処理が避けられ胞子懸濁液を単に空気乾燥することが出来た。適当な領域を決め蛍光顕微鏡法で写真をとった後、グリッドをフィリップス420透過型電子顕微鏡(Philips 420 TEM)内に置き同じグリッド四方の写真を撮った。このグリッドをカーボンテープでアルミ切れ端に貼り付け金―パラジウムでスパッタリングコートした。レオ1530走査型電子顕微鏡(Leo 1530 SEM)を用いて注目領域の画像を捕獲した。
ビーズ試験
このシステムの機能性と分析有効性を決めるため2.3μmと1μmの蛍光ポリマー微粒子(デュークサイエンティフィックコーポレーション(Duke Scientific Corporation)から購入)を用いてこの一体化ステムをテストした。これら粒子サイズは胞子や細菌の分布を一番良くシンミュレート出来るよう選択した。画素当たりの平均密度を添加容積の関数に対してプロットした検量線を図7に示した。これらのグラフを調べると検出レスポンスの直線性は倍率によって影響されないことが明になる。しかし予想されるようにビーズからの信号が高倍率で輝度が高くなると回帰直線の傾斜は倍率の増加と共に増加する。細菌や胞子の大きさと輝度、分析検体に曝される膜の全面積、視野の広さのような多くの因子が使用する実験パラメーターを支配する。ポリマービーズはその大きさと強度に関しては非常に均一であるので、このビーズは胞子の理想的な検量体で且つ模擬体を表す。しかし胞子の実際の大きさは使用したビーズよりやや小さく、単一胞子―抗体―蛍光標識試薬コンプレックスから発生する信号はこの微粒子からのものに比べ遙かに弱い。更に流体を極端に少数の細孔を無理に通過させると内部圧が非常に上昇するので、流体学的懸念から小さすぎる濾過面積の使用をやめた。図7に示したように倍率により検量線の直線性は変化しないのでフローセルが持続的に流れるように全倍率x100に対し5xの対物レンズを定量用に選んだ。
このシステムの機能性と分析有効性を決めるため2.3μmと1μmの蛍光ポリマー微粒子(デュークサイエンティフィックコーポレーション(Duke Scientific Corporation)から購入)を用いてこの一体化ステムをテストした。これら粒子サイズは胞子や細菌の分布を一番良くシンミュレート出来るよう選択した。画素当たりの平均密度を添加容積の関数に対してプロットした検量線を図7に示した。これらのグラフを調べると検出レスポンスの直線性は倍率によって影響されないことが明になる。しかし予想されるようにビーズからの信号が高倍率で輝度が高くなると回帰直線の傾斜は倍率の増加と共に増加する。細菌や胞子の大きさと輝度、分析検体に曝される膜の全面積、視野の広さのような多くの因子が使用する実験パラメーターを支配する。ポリマービーズはその大きさと強度に関しては非常に均一であるので、このビーズは胞子の理想的な検量体で且つ模擬体を表す。しかし胞子の実際の大きさは使用したビーズよりやや小さく、単一胞子―抗体―蛍光標識試薬コンプレックスから発生する信号はこの微粒子からのものに比べ遙かに弱い。更に流体を極端に少数の細孔を無理に通過させると内部圧が非常に上昇するので、流体学的懸念から小さすぎる濾過面積の使用をやめた。図7に示したように倍率により検量線の直線性は変化しないのでフローセルが持続的に流れるように全倍率x100に対し5xの対物レンズを定量用に選んだ。
胞子と細菌
この検出システムの能力を示すために、炭疽菌(Ba)の非病原性模擬体として通常使われるBacillus globigii (Bg)を標的にした。Bg胞子の捕捉とイムノコンプレックス生成の結果、Bgに特異な抗体との相互作用をもとにイムノアッセイを作成した。このアッセイ中の干渉の可能性についてもこの報告書に以後検討するように、酵母菌、タルク粉や他のバシラス属菌のような種々の種についてテストした。図5にアレックサ(登録商標)488)(Alexa(登録商標)488)標識された抗Bacillus globigii抗体で染色したBg胞子の蛍光顕微鏡写真を示す。イムノコンプレックスの概略図を挿入図として示す。抗Bg抗体とBg胞子との相互作用の特異性を示すため、蛍光顕微鏡写真と透過型電子顕微鏡(TEM)と走査型電子顕微鏡で得た画像との相関関係を調べた。一定量のイムノ標識したBgをフォルムバールコート(Formvar-coated)したTEMファインダーグリッドに乗せエピ蛍光顕微鏡写真を種々の倍率で作成した。このグリッドは次いで透過型電子顕微鏡(TEM)で撮影し、その後で金―パラジウムでコートして走査型電子顕微鏡(SEM)で撮影した。蛍光信号と胞子の位置との対応性から示されるようにこのファインダーグリッドは各機器で明白に同じ場所だと位置づけられ、明らかに蛍光信号はBg胞子と特異的に結合したアレックサ488(登録商標)(Alexa(登録商標)488)標識化抗体から発生したことを示している。この相関関係を良く表すため全倍率約400倍で得た蛍光顕微鏡写真をしめした。しかし胞子の蛍光信号とTEM又はSEM顕微鏡写真との相関関係の成立が倍率100xの低さまで確立出来た。
この検出システムの能力を示すために、炭疽菌(Ba)の非病原性模擬体として通常使われるBacillus globigii (Bg)を標的にした。Bg胞子の捕捉とイムノコンプレックス生成の結果、Bgに特異な抗体との相互作用をもとにイムノアッセイを作成した。このアッセイ中の干渉の可能性についてもこの報告書に以後検討するように、酵母菌、タルク粉や他のバシラス属菌のような種々の種についてテストした。図5にアレックサ(登録商標)488)(Alexa(登録商標)488)標識された抗Bacillus globigii抗体で染色したBg胞子の蛍光顕微鏡写真を示す。イムノコンプレックスの概略図を挿入図として示す。抗Bg抗体とBg胞子との相互作用の特異性を示すため、蛍光顕微鏡写真と透過型電子顕微鏡(TEM)と走査型電子顕微鏡で得た画像との相関関係を調べた。一定量のイムノ標識したBgをフォルムバールコート(Formvar-coated)したTEMファインダーグリッドに乗せエピ蛍光顕微鏡写真を種々の倍率で作成した。このグリッドは次いで透過型電子顕微鏡(TEM)で撮影し、その後で金―パラジウムでコートして走査型電子顕微鏡(SEM)で撮影した。蛍光信号と胞子の位置との対応性から示されるようにこのファインダーグリッドは各機器で明白に同じ場所だと位置づけられ、明らかに蛍光信号はBg胞子と特異的に結合したアレックサ488(登録商標)(Alexa(登録商標)488)標識化抗体から発生したことを示している。この相関関係を良く表すため全倍率約400倍で得た蛍光顕微鏡写真をしめした。しかし胞子の蛍光信号とTEM又はSEM顕微鏡写真との相関関係の成立が倍率100xの低さまで確立出来た。
このシステムの検出限界を決めるため、用量依存性を調べた。1mL当たり1mgの乾燥胞子は1mL当たり108個の胞子を生成すると仮定してストック胞子溶液を段階希釈した胞子溶液を作成した。フローセル実験に続いて一定量の胞子溶液を分割して1mL当たりのコロニー形成単位(CFU)で表した正確な胞子濃度を決定した。バックグランドはブランクフィルターをこの抗体が通過後続いてPBSですすいだ後得た信号として求めた。検出限界を評価するため標準偏差はこのようなバックグランド測定5回の平均から計算した。検出限界は胞子900個と決定した。
粉塵及び混入物に関する考察
フローセルの内容積は非常に小さいので膜フィルターが詰まるのを避けるため全ての混入物を洗い出す必要がある。これら研究に特に重要なのは郵便環境に通常かつ多量にみられるほこりのコントロールである。SEMでの研究(非表示)により郵便物の運搬、操作及び処理で発生するほこりは繊維、細片や種々の細菌を含んでいることが示された。この研究で一番有意なのはほこりが注目の生物的試薬のサイズ範囲にわたる広いサイズ分布を持った多くの粒子含有することである。さらに多くのほこり成分は紙や文書産業での蛍光増白剤やインクの使用により自己蛍光を発する。現在軍用検出器に使用されている多くのトリガーシステムは空力粒度分布測定法(APS)やフローサイトメーター(FC)のようなサイズ選択原理によっており以前に明らかにした理由から理想的なトリガーシステムとは思えない。このシステムで酵母菌、タルクや粉末洗剤により引き金が引くかどうかの盲試験を行った。偽陽性は発生せず成功率100%であった。このシステムでほこりの蓄積から起こるその他の主要で且つ大きな問題はヌクレポーア(登録商標)(nucleopore(登録商標))フィルターの目詰まりである。我々が行った研究でフローセル操作がうまく行かなくなるのはフローセルに到達するほこりの濃度が平均6.2μl/Lと仮定して、ほこり60mgが通過した後圧力が60psiを越した場合、即ち400時間の郵便物操作したときにのみ起こることを明らかにした。しかしこの結果はエアロゾルシステムの効率に広く依存し、エアロゾル収集システムが10μm或いはそれより大きいほこり粒子の少なくとも95%を廃棄出来る能力が組み込まれているという仮定を基にしている。このような条件ではフローセル内のほこり蓄積を長期運転では避けられないが、この装置は軍関係への応用に望まれる寿命よりなお遙かに長い事を示している。更にフィルター上に集積されたほこり、胞子或いは細片の99%迄洗い出すことによりフローセルを再生し且つその寿命を延長出来ることが示された。この機能はフローセル上面インサート内の追加出口を用い自動洗い出し手順を実行する事で簡単に実施出来る。超音波処理、逆流及び側部ライン流れを組み合わした方法でこの膜から不必要な材料を除く。この結果テクニシャンが注意を払うこと無しにこの検出システムを長期運転出来る。膜表面から胞子サイズ(0.93μm)の蛍光ポリマー微粒子を除去するトライヤルを5回連続で行った。この5回トライヤルでそれぞれ効率95%、98%、99%、99%及び99%に達した。
フローセルの内容積は非常に小さいので膜フィルターが詰まるのを避けるため全ての混入物を洗い出す必要がある。これら研究に特に重要なのは郵便環境に通常かつ多量にみられるほこりのコントロールである。SEMでの研究(非表示)により郵便物の運搬、操作及び処理で発生するほこりは繊維、細片や種々の細菌を含んでいることが示された。この研究で一番有意なのはほこりが注目の生物的試薬のサイズ範囲にわたる広いサイズ分布を持った多くの粒子含有することである。さらに多くのほこり成分は紙や文書産業での蛍光増白剤やインクの使用により自己蛍光を発する。現在軍用検出器に使用されている多くのトリガーシステムは空力粒度分布測定法(APS)やフローサイトメーター(FC)のようなサイズ選択原理によっており以前に明らかにした理由から理想的なトリガーシステムとは思えない。このシステムで酵母菌、タルクや粉末洗剤により引き金が引くかどうかの盲試験を行った。偽陽性は発生せず成功率100%であった。このシステムでほこりの蓄積から起こるその他の主要で且つ大きな問題はヌクレポーア(登録商標)(nucleopore(登録商標))フィルターの目詰まりである。我々が行った研究でフローセル操作がうまく行かなくなるのはフローセルに到達するほこりの濃度が平均6.2μl/Lと仮定して、ほこり60mgが通過した後圧力が60psiを越した場合、即ち400時間の郵便物操作したときにのみ起こることを明らかにした。しかしこの結果はエアロゾルシステムの効率に広く依存し、エアロゾル収集システムが10μm或いはそれより大きいほこり粒子の少なくとも95%を廃棄出来る能力が組み込まれているという仮定を基にしている。このような条件ではフローセル内のほこり蓄積を長期運転では避けられないが、この装置は軍関係への応用に望まれる寿命よりなお遙かに長い事を示している。更にフィルター上に集積されたほこり、胞子或いは細片の99%迄洗い出すことによりフローセルを再生し且つその寿命を延長出来ることが示された。この機能はフローセル上面インサート内の追加出口を用い自動洗い出し手順を実行する事で簡単に実施出来る。超音波処理、逆流及び側部ライン流れを組み合わした方法でこの膜から不必要な材料を除く。この結果テクニシャンが注意を払うこと無しにこの検出システムを長期運転出来る。膜表面から胞子サイズ(0.93μm)の蛍光ポリマー微粒子を除去するトライヤルを5回連続で行った。この5回トライヤルでそれぞれ効率95%、98%、99%、99%及び99%に達した。
[微生物検出のための画素解析法]
ある実施形態では流体或いは捕捉物体の画像解析に画素解析法を用いることが出来る。例えば画素解析は微生物を膜に捕捉したほこりや他の微粒子物から区別するのに使用できる。画素解析は微生物が画像化した流体中に存在するか否かを決めるための画像特性の解析を含む
画素解析は限定はされないが、画像或いは画像の一部の大きさ、形、色及び強度比を含む特性に基づく。例えば画像中の光を発光する全領域を解析に利用出来る。他の例では画像の緑色蛍光強度を用いて解析出来る。一つの実施形態では一つの特定の微生物或いは微生物の組の“光学的指紋”を画素解析に利用しても良い。ある実施形態では画素解析は画像上に捕獲した物体要素のアスペクト比のような値の比を基にしても良い。他の実施形態では画素解析は閾値を基にしている。
ある実施形態では流体或いは捕捉物体の画像解析に画素解析法を用いることが出来る。例えば画素解析は微生物を膜に捕捉したほこりや他の微粒子物から区別するのに使用できる。画素解析は微生物が画像化した流体中に存在するか否かを決めるための画像特性の解析を含む
画素解析は限定はされないが、画像或いは画像の一部の大きさ、形、色及び強度比を含む特性に基づく。例えば画像中の光を発光する全領域を解析に利用出来る。他の例では画像の緑色蛍光強度を用いて解析出来る。一つの実施形態では一つの特定の微生物或いは微生物の組の“光学的指紋”を画素解析に利用しても良い。ある実施形態では画素解析は画像上に捕獲した物体要素のアスペクト比のような値の比を基にしても良い。他の実施形態では画素解析は閾値を基にしている。
使用中可視化試薬は粒子の性質に依存して異る粒子には異なる波長の光を発光する。この粒子をカメラで解析する時には使用者は粒子の色に基づいて特定の分析検体が存在するか否かを決められる。例えば緑色粒子は注目の分析検体の存在を指示するかも知れない。その他のいかなる色の粒子も使用者に興味がないこともある。人は色を区別出来るかも知れないが、コンピューターシステムで膜試料の色を区別出来るのが好ましい。画像解析時に多くの検出器は特定の色だけを見分ける事が出来る。例えば多くのCCD検出器は赤色、青色及び緑色のみを区別できる。従ってCCD検出器は青色と緑色両方の光を発光する粒子と緑色の光のみを発光する粒子とをたとえシステム使用者にとってその色の差が明らかでも区別できない。この問題を解決するには“誤った”色を有する粒子を減じ除く方法を用いる事が出来る。
ある実施形態では使用者が規定した色範囲内に入らない画像画素は画像から除去出来る。一つの実施形態では流体を染色して注目の微生物が可視スペクトルの緑色部のみの光を発光するようにする事も出来る。対照的に流体に含まれるほこりや他の粒子は染色物の存在下で可視スペクトルの緑、青及び赤色部分の組み合わせた光を発光するようにしても良い。注目の微生物のみを表す画像部分を単離するためバイナリーマスクを作成し画像から非微生物物体による発光を除去してもよい。
そのような方法を図8A−Fに示す。図8Aは膜に捕捉した全粒子の画像を示す。この例の目的のため図の楕円の中が空白の粒子500は緑色を発光する。粒子510の形で内部塗り形式を持つ粒子は赤色である。粒子520の形で内部塗り形式を持つ粒子は緑色と青色の光を吸収する。粒子530の形で内部塗り形式を持つ粒子は赤色と青色の光を吸収する。粒子540の形で内部塗り形式持つ粒子は青色である。これらの色の帰属は説明の目的のためだけである事を知る必要がある。現在の例では分析の目的は緑色粒子全てを見いだすことである。
緑色粒子を見いだす一つの方法は緑色粒子のみを示すフィルターを用いることである。図8Bにこのようなフィルターを用いた場合の残留粒子を描いている。図8Bに示した粒子全ては緑色光を吸収するが必ずしも図8Bに描かれた粒子の全てが緑色だけを示すとは限らない。粒子520は緑色と青色の両方の光を吸収する。検出器はこの二つのタイプの粒子を区別できないから偽陽性となることがある。
このような現象を補償するには青色と赤色を吸収する粒子の画像を適当なフィルターを用いて解析する。青色と赤色を吸収する粒子用マスクを作成し、除去プロセスをもちいて何個の緑色粒子が存在するか決定する。一つの実施形態では画像はスペクトルの赤色部分の色を発する粒子のみ捕捉する。(図8C参照。)“赤色”粒子の画像を用いてマスクを作成し粒子の全スペクトル図と比較出来る。注目の分析検体はスペクトルの緑色部分の色のみを発光するから、スペクトルの赤色部分の色を持ついかなる粒子も最初の画像から除くことが出来る。図8Dに最初の画像から粒子に現れるスペクトルの赤色部分を差し引いた画像を示す。残留粒子は注目の分析検体であり得る有望な粒子である。
第二の反復では図8Eに示すようにバイナリーマスクを用いて青色成分を含む画素をマスクする。スペクトルの青色部分の色を示す粒子のみが画像として捕獲される。(図8E参照)“青色”粒子の画像を用いてその粒子の全スペクトル図と比べるマスクを創生する。注目の分析検体はこのスペクトルの緑色部分の色を示すから、スペクトルのうち青色部分の色を持つ粒子はいかなる物でも最初の画像から除かれる。図8Fには赤色バイナリーマスクと青色バイナリーマスクを用いて赤色或いは青色成分を含む画素を除いた最初の画像を示す。従って画像に残る粒子は緑色だけを示す粒子である。従ってこの方法は“純緑色”画素だけを含む画像を生成するのに使用できる。このような画像を解析して関連性のない粒子を除去することで微生物の存在を検出出来る。上述の例は緑色粒子の存在を決める方に向いていたがこの方法は青色粒子だけ、赤色粒子だけ又はこれら色の組み合わせ(例えば赤と青、赤と緑、青と緑或いは赤、青、緑)を示す粒子の決定に使えるよう改良出来ると理解すべきである。
ある実施形態では画素解析は上述の微生物検出用の膜法と組み合わして利用出来る。画像解析はステイン染色の前後のいずれかで実施出来る。一つの実施形態では画像解析をいつステイン染色するかを決めるのに利用できる。
注目の分析検体を膜ベース検出装置を用いて検出した後に、この分析検体の同定のため更なるテストを行うことができる。一例としては、膜で捕捉された粒子は、以下の米国特許出願の何れかに記述されたセンサーアレーに転送され得る:塔Zンサーアレーによる複数分析検体の流体ベースの分析“(Fluid Based Analysis of Multiple Analytes by a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/287,248;”溶液中の多数分析検体測定及び同定用センサーアレー“(Sensor Arrays for the Measurement and Identification of Multiple Analytes in Solutions)と題する米国特許出願番号09/354,882,;”分析検体と反応する粒子に基づいた検出システム“(Detection System Based on an Analyte Reactive Particle)と題する 米国特許出願番号09/616,355;”固定マトリックスにおける化学受容体対する一般的信号手続き“(General Signaling Protocols f or Chemical Receptors in Immobilized Matrices)と題する米国特許出願番号09/616,482; “化学センサーアレーへの試料送り方法と装置”(Method and Apparatus for the Delivery of Samples to a Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/616,731; “センサーアレーへのセンサー素子の磁気ベースの配置と保持”(Magnetic-Based Placement and Retention of Sensor Elements in a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,342; “化学情報の収集と送信方法とシステム”(Method and System for Collecting and Transmitting Chemical Information)と題する米国特許出願番号09/775,340; “体液分析用システムと方法”(System and Method for the Analysis of Bodily Fluids)と題する米国特許出願番号09/775,344; “センサーアレー作成方法”(Method of Preparing a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,353; “センサーアレーを通じた液体試料送りシステム”(System for Transferring Fluid Samples Through A Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,048,(米国発行文書番号 2002−0045272−A1として発行)(Published as U.S. Publication No.: 2002-0045272-A1); “携帯用センサーアレーシステム”(撤ortable Sensor Array System)と題する米国特許出願番号09/775,343,;“材料のマイクロ機械加工化学センサーアレー中への拘束方法と装置” (Method and Apparatus for the Confinement of Materials in a Micromachined Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号10/072,800。
図9に粒子センサーアレー検出器600を膜分析検体検出装置100と組み合わしたシステムを示す。膜ベース分析検体検出装置は前述の分析検体検出システムの一部であっても良い。試料が膜を通過後この膜が捕捉した粒子を更に分析検体を同定するため追加試験を行うことが出来る。一つの実施形態では上述のいずれの特許申請にも記載されているように、この分析検体を膜表面から洗浄した後センサーベース分析検体検出システムに送る事も出来る。この試料から抽出した分析検体はセンサーアレーに置かれたビーズと反応することも出来る。分析検体のセンサーアレービーズとの反応で分析検体の確認(或いは更に同定)が可能になる。センサーアレーシステムを用いた微生物検出法は上に参照した特許申請に更に詳しく記述されている。
注目の分析検体を膜ベース検出装置を用いて検出した後に、この分析検体の同定のため更なるテストを行うことができる。一例としては、膜で捕捉された粒子は、以下の米国特許出願の何れかに記述されたセンサーアレーに転送され得る:塔Zンサーアレーによる複数分析検体の流体ベースの分析“(Fluid Based Analysis of Multiple Analytes by a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/287,248;”溶液中の多数分析検体測定及び同定用センサーアレー“(Sensor Arrays for the Measurement and Identification of Multiple Analytes in Solutions)と題する米国特許出願番号09/354,882,;”分析検体と反応する粒子に基づいた検出システム“(Detection System Based on an Analyte Reactive Particle)と題する 米国特許出願番号09/616,355;”固定マトリックスにおける化学受容体対する一般的信号手続き“(General Signaling Protocols f or Chemical Receptors in Immobilized Matrices)と題する米国特許出願番号09/616,482; “化学センサーアレーへの試料送り方法と装置”(Method and Apparatus for the Delivery of Samples to a Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/616,731; “センサーアレーへのセンサー素子の磁気ベースの配置と保持”(Magnetic-Based Placement and Retention of Sensor Elements in a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,342; “化学情報の収集と送信方法とシステム”(Method and System for Collecting and Transmitting Chemical Information)と題する米国特許出願番号09/775,340; “体液分析用システムと方法”(System and Method for the Analysis of Bodily Fluids)と題する米国特許出願番号09/775,344; “センサーアレー作成方法”(Method of Preparing a Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,353; “センサーアレーを通じた液体試料送りシステム”(System for Transferring Fluid Samples Through A Sensor Array)と題する米国特許出願番号09/775,048,(米国発行文書番号 2002−0045272−A1として発行)(Published as U.S. Publication No.: 2002-0045272-A1); “携帯用センサーアレーシステム”(撤ortable Sensor Array System)と題する米国特許出願番号09/775,343,;“材料のマイクロ機械加工化学センサーアレー中への拘束方法と装置” (Method and Apparatus for the Confinement of Materials in a Micromachined Chemical Sensor Array)と題する米国特許出願番号10/072,800。
図9に粒子センサーアレー検出器600を膜分析検体検出装置100と組み合わしたシステムを示す。膜ベース分析検体検出装置は前述の分析検体検出システムの一部であっても良い。試料が膜を通過後この膜が捕捉した粒子を更に分析検体を同定するため追加試験を行うことが出来る。一つの実施形態では上述のいずれの特許申請にも記載されているように、この分析検体を膜表面から洗浄した後センサーベース分析検体検出システムに送る事も出来る。この試料から抽出した分析検体はセンサーアレーに置かれたビーズと反応することも出来る。分析検体のセンサーアレービーズとの反応で分析検体の確認(或いは更に同定)が可能になる。センサーアレーシステムを用いた微生物検出法は上に参照した特許申請に更に詳しく記述されている。
多くの微生物はセンサーアレーのビーズと反応しないかもしれない。大きな微生物はこのビーズとうまく接触出来ず、このビーズにより検出されない。一つの実施形態ではその微生物処理によりビーズベース検出システムによりさらに良く検出出来るようにする。一つの実施形態では粒子に溶解条件を適用出来る。微生物の溶解によりその微生物は崩壊するか溶出する。細菌に関してはアルカリ塩基処理或いは酵素の使用により溶解を引き起こす事も出来る。この細菌の溶出により細菌に含まれる材料の一部を遊離し分析にかけることが出来る。典型的にはこの微生物から遊離した蛋白質か核酸のいずれかを分析することが出来る。
流体中の細菌、胞子及び原虫のような微生物はビーズのマクロ細孔内に捕捉される。ある実施形態では受容体は限定はされないが、選択的抗体やレクチンのような半選択的配位子とその粒子の内部細孔領域にある粒子と結合して選択的ビーズの生成を含む。適当な受容体を上述の方法を用いて選択出来る。ある実施形態では可視化抗体を導入し捕捉した分析検体と結合することも出来る。目視出来る抗体により比色或いは蛍光のしるしを発生しCCD検出器によりそのしるしを記録する事も出来る。ある実施形態では一連の選択的と半選択的ビーズを上述のセンサーアレーシステムと組み合わせて使用できる。
ある実施形態では微生物と結合するか相互作用する事が知られている試薬をこの微生物がセンサーアレーの近くに来るタイミング前に導入する事も出来る。このような試薬はこのセンサーアレー中の粒子による微生物の捕捉を促進する特性を持つ
マクロ細孔粒子
一つの実施形態ではマクロ細孔を持つ粒子はアガロースからなるものでもよい。そのような粒子の描写を図10に示す。この粒子は球状ビーズの形である。この粒子はその表面上及び内部に多数のマクロ細孔を持つことが出来る。
一つの実施例ではアガロースは生体適合性をもち生体分子や生きた生物と相互作用出来るのでマクロ細孔用出発材料に利用できる。活性化したアガロースは細菌や微生物と親和性相互作用を示す。この相互作用を促進するため粒子の特異的性質を特別な微生物や細胞への標的として利用できる。アガロース鎖から硫酸エステル基を脱離した加工アガロースは活性化と付着に利用できる第一級及び第二級アルコールを持つ電荷を帯びない親水性マトリックスにすることも可能である。例えばこの粒子の化学的表面を隣接ジオールのアルデヒド基への酸化により修飾出来る。メタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)を用いて脂肪族アルデヒドを得還元的アミノカップリング法に利用できる。
一つの実施形態ではマクロ細孔を持つ粒子はアガロースからなるものでもよい。そのような粒子の描写を図10に示す。この粒子は球状ビーズの形である。この粒子はその表面上及び内部に多数のマクロ細孔を持つことが出来る。
一つの実施例ではアガロースは生体適合性をもち生体分子や生きた生物と相互作用出来るのでマクロ細孔用出発材料に利用できる。活性化したアガロースは細菌や微生物と親和性相互作用を示す。この相互作用を促進するため粒子の特異的性質を特別な微生物や細胞への標的として利用できる。アガロース鎖から硫酸エステル基を脱離した加工アガロースは活性化と付着に利用できる第一級及び第二級アルコールを持つ電荷を帯びない親水性マトリックスにすることも可能である。例えばこの粒子の化学的表面を隣接ジオールのアルデヒド基への酸化により修飾出来る。メタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)を用いて脂肪族アルデヒドを得還元的アミノカップリング法に利用できる。
一つの実施形態では、マクロ細孔はゲル使用の懸濁重合により形成されてもよい。その粒子の大きさ、形及び均一性はエマルジョン安定化に用いる親水性又は疎水性添加物に依存する。細孔の大きさはそのゲルのアガロース濃度により決まり得る。ゲル強度のような機械的物性はそのアガロースの分子量が影響し得る。一つの実施形態では懸濁重合をアガロース単量体とエマルジョン安定化剤からなる二相系を用いて実施できる。シクロヘキサン中の親水性乳化剤(ツイーン85(TWEEN 85)のような)分散液を攪拌しながらアガロース水溶液に60℃で5分間に添加し水中油型エマルジョンを生成する。この段階でこの乳化剤により安定化したアガロースの微粒子が生成する。次に疎水性乳化剤(スパン85(SPAN 85)のような)をこの第一のエマルジョンに加えて油中水型エマルジョンを生成する。その後この油中水型エマルジョンを室温に冷却する。ポリマー粒子が約40℃で出現する。フロキュレーションと呼ばれる方法による液滴凝集物はビーズ内で細孔や導管を形成する油滴とマトリックスを形成できる。この粒子を蒸留水とアルコールで洗浄し工業用篩いで分粒し水中に保存する。
乳化剤が親水及び/又は疎水相に加えられ、アガロース溶液の濃度はこのビーズの品質に影響し得る。更にこの製造工程中の混合速度、攪拌の性質及び温度も重要である。この溶液の安定性は選択した乳化剤及び使用した溶剤に依存する。
粒子は実質的に球状のものであり得る。球形状の粒子は分析検体と相互作用に利用できる表面積を増強出来る。この粒子内の細孔生成により表面積が増加する。粒子は通常の分散細孔以外に大きな連結した流れ細孔を持ちうる。マクロ細孔を持つ粒子はマクロ細孔のない粒子に比べより良い物質移動物性を有する。
粒子は実質的に球状のものであり得る。球形状の粒子は分析検体と相互作用に利用できる表面積を増強出来る。この粒子内の細孔生成により表面積が増加する。粒子は通常の分散細孔以外に大きな連結した流れ細孔を持ちうる。マクロ細孔を持つ粒子はマクロ細孔のない粒子に比べより良い物質移動物性を有する。
粒子は約250〜300ミクロンの直径を有し得る。粒子中のマクロ細孔は約1ミクロンより小さくてもよい。異なる細孔サイズと形により限定はされないが、細胞、細菌、核酸オリゴマー、蛋白質/抗体及び小さな分子のような種々の分析検体を包括し検出出来るようになる。
懸濁重合の代替法は発泡剤を用いて粒子の多孔度を変える事でもよい。例えば重合中アジ化物又は炭酸エステルを分解し窒素や炭酸ガスの“気泡”を粒子中に取り込む事も出来る。アガロースのゲル化点は40℃であるから分解反応は低温で行わねばならない。
懸濁重合のその他の代替え法は分子インプリント法を利用する事でもよい。粒子のインプリントは非共有結合法及び共有結合法で起こり得る。非共有結合インプリント法は機能性単量体と鋳型メンバーとの間の水素結合、イオン結合及びファンデルワールス力のような非共有結合性相互作用に基づいている。重合前の単量体―鋳型メンバー(部材)コンプレックスの安定性はこの鋳型メンバーと機能性単量体間の親和定数に依存する。共有結合法ではこの機能性単量体と鋳型メンバー間に形成した結合は重合マトリックスが一旦得られれば切断する事が出来る。
懸濁重合の代替法は発泡剤を用いて粒子の多孔度を変える事でもよい。例えば重合中アジ化物又は炭酸エステルを分解し窒素や炭酸ガスの“気泡”を粒子中に取り込む事も出来る。アガロースのゲル化点は40℃であるから分解反応は低温で行わねばならない。
懸濁重合のその他の代替え法は分子インプリント法を利用する事でもよい。粒子のインプリントは非共有結合法及び共有結合法で起こり得る。非共有結合インプリント法は機能性単量体と鋳型メンバーとの間の水素結合、イオン結合及びファンデルワールス力のような非共有結合性相互作用に基づいている。重合前の単量体―鋳型メンバー(部材)コンプレックスの安定性はこの鋳型メンバーと機能性単量体間の親和定数に依存する。共有結合法ではこの機能性単量体と鋳型メンバー間に形成した結合は重合マトリックスが一旦得られれば切断する事が出来る。
共有結合及び非共有結合ベースのアプローチの中でも、異なる方法で分子インプリントポリマーを作成出来る。一つのアプローチはインプリントした分子の大きさを約25μmに粉砕しインプリントした表面を曝す。“表面鋳型メンバー重合法”と云われる他の技法は水と油を用いる。この技法では水溶性鋳型メンバーが水―油界面でこの機能性単量体と相互作用する。有機相の単量体―鋳型メンバーコンプレックスが重合しポリマーをインプリントした表面を形成する。この技法は亜鉛イオンのような水溶性物質をインプリント出来る。
ポリマーのインプリントはその他の方法論も適応出来る。ミクロゲル球への分子インプリントはインプリントしたゲルを在来の分子インプリントのように粉砕で大きさを小さくする必要がないため、アガロースをインプリントするのに便利な方法である。別々にインプリントしたミクロゲルとインプリントした微粒子は鋳型メンバーの存在下に単量体の架橋重合により合成出来、このプロセスは“沈降重合法”として知られている。
ポリマーのインプリントはその他の方法論も適応出来る。ミクロゲル球への分子インプリントはインプリントしたゲルを在来の分子インプリントのように粉砕で大きさを小さくする必要がないため、アガロースをインプリントするのに便利な方法である。別々にインプリントしたミクロゲルとインプリントした微粒子は鋳型メンバーの存在下に単量体の架橋重合により合成出来、このプロセスは“沈降重合法”として知られている。
表面鋳型メンバー重合法と沈降重合法は規則的な粒子の化学的表面修飾の代替え技法として用いられ得る。両方技法は細菌性胞子のような鋳型メンバーでアガロースをインプリントする事が出来る。インプリントしたビーズを装備したクロマトグラフ用カラムの使用はインプリントしたビーズの効率を評価する迅速な方法である。例えば細菌を再結合しカルセインとして知らるカルシウムに鋭敏な蛍光性指示薬にさらし蛍光分光法により検出出来る。
分子インプリント法は生物開拓の為の反応釜として使用できる。粒子中の細孔は包括した微生物試薬の供給を促進し望ましいプロダクトを生成させる。分子インプリント法は根粒菌属生物のような細菌をアガロースに包括するのに利用出来る。これらの細菌は大気中の窒素をアンモニアに変換できる。これら細菌に窒素を“供給”することによりアンモニアが生じる。細菌を被包化した細孔は細菌表面の形態学的研究用生物のインプリントを保持できる。
分子インプリント法は生物開拓の為の反応釜として使用できる。粒子中の細孔は包括した微生物試薬の供給を促進し望ましいプロダクトを生成させる。分子インプリント法は根粒菌属生物のような細菌をアガロースに包括するのに利用出来る。これらの細菌は大気中の窒素をアンモニアに変換できる。これら細菌に窒素を“供給”することによりアンモニアが生じる。細菌を被包化した細孔は細菌表面の形態学的研究用生物のインプリントを保持できる。
高速液体クロマトグラフィーと蛍光性アッセイは分子インプリントポリマーの研究に有益なツールであり得る。蛍光染料アクリジンオレンジでアガロースビーズを染色しそれらを共焦点レーザー顕微鏡法用いて形態学的分析ができる。他の形態学的研究には原子間力顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法及びミクロトーム法がある。ビーズ表面面積の特性評価は等温吸着線を測定しブルナウアー(Brunauer)-エメット(Emmet)-テラー(Teller)式を用いて達成できる。
ある実施形態では、粒子表面は化学的に変性されていてもよい。他の実施形態では化学的官能性は、限定されないが非特異的なもの(即ち官能基)及び高度に特異的なもの(即ち生体リガンドたとえば抗体)を包含し、細孔領域の境界内に存在し得る。化学的官能性は種々の分析検体の捕捉を促進できる。
ある実施形態では、粒子表面は化学的に変性されていてもよい。他の実施形態では化学的官能性は、限定されないが非特異的なもの(即ち官能基)及び高度に特異的なもの(即ち生体リガンドたとえば抗体)を包含し、細孔領域の境界内に存在し得る。化学的官能性は種々の分析検体の捕捉を促進できる。
一つの実施形態では粒子は特別な金属を含む受容体を含む事が出来る。その金属は特定の分析検体に特有の材料と結合し得るものでもよい。例えばテルビウム(III)を含む粒子が形成されてもよい。テルビウム(III)は、胞子に独特な物質であるジピコリン酸と発光性錯体を形成する。
実施例
マクロ細孔ビーズが前述の二相懸濁重合法にもとずく方法を用いて合成された。得られたビーズは光学及び蛍光顕微鏡法により分析された。アガロースビーズの透明性により、アガロースビーズの異なった部分の蛍光性ビーズを目視出来た。細孔の存在は1μmの蛍光性ビーズを添加することにより確認された。光学及び蛍光顕微鏡法を用いて、導管の存在は確定的には決定出来なかった。このビーズは、ビーズ中に存在する空隙中に、恐らくは導管末端に集積された。
実験は先ずメルクのオムニピュア(Merck's Omnipure)アガロース粉末を用いて行われた。250〜300μmの範囲の非球状粒子が低収率で得られた。過剰量の親水性乳化剤3.5mLのスパン85を用いた実験では、細孔のない荒い表面を持ったビーズが生じた。疎水性乳化剤量を減らすとアガロース粒子が水中油型エマルジョン中で不安定なため大量のゲル化が起こった。
アガロース水溶液濃度4%(w/v)
油/水エマルジョン:0.7mLツイン80/10mLシクロヘキサン
水/油エマルジョン:7mLスパン85/75mLシクロヘキサン
表1.多孔性アガロースビーズ加工に及ぼす攪拌速度の影響
攪拌速度の影響を簡単に評価した。攪拌速度が高いほど、ビーズの完全性は低かった。攪拌速度が高いほど粒子が小さくなると予期されるが、より高い物理的ストレスをかけるとビーズ崩壊を起こすのみである。シグマ社(Sigma)のアガロースを用いて同様条件下で試みたところ、メルク社(Merck)のアガロースと同様の結果となったが、その収率は少し高く約20%であった。ビーズの完全性はやや向上し、ゲル強度のような機械的物性の改善を示唆した。
マクロ細孔ビーズが前述の二相懸濁重合法にもとずく方法を用いて合成された。得られたビーズは光学及び蛍光顕微鏡法により分析された。アガロースビーズの透明性により、アガロースビーズの異なった部分の蛍光性ビーズを目視出来た。細孔の存在は1μmの蛍光性ビーズを添加することにより確認された。光学及び蛍光顕微鏡法を用いて、導管の存在は確定的には決定出来なかった。このビーズは、ビーズ中に存在する空隙中に、恐らくは導管末端に集積された。
実験は先ずメルクのオムニピュア(Merck's Omnipure)アガロース粉末を用いて行われた。250〜300μmの範囲の非球状粒子が低収率で得られた。過剰量の親水性乳化剤3.5mLのスパン85を用いた実験では、細孔のない荒い表面を持ったビーズが生じた。疎水性乳化剤量を減らすとアガロース粒子が水中油型エマルジョン中で不安定なため大量のゲル化が起こった。
アガロース水溶液濃度4%(w/v)
油/水エマルジョン:0.7mLツイン80/10mLシクロヘキサン
水/油エマルジョン:7mLスパン85/75mLシクロヘキサン
表1.多孔性アガロースビーズ加工に及ぼす攪拌速度の影響
攪拌速度の影響を簡単に評価した。攪拌速度が高いほど、ビーズの完全性は低かった。攪拌速度が高いほど粒子が小さくなると予期されるが、より高い物理的ストレスをかけるとビーズ崩壊を起こすのみである。シグマ社(Sigma)のアガロースを用いて同様条件下で試みたところ、メルク社(Merck)のアガロースと同様の結果となったが、その収率は少し高く約20%であった。ビーズの完全性はやや向上し、ゲル強度のような機械的物性の改善を示唆した。
均質な粒子の作成をメルク社(Merck)から得たアガロースを使って一定濃度で攪拌しながら行った。結果を表2に示す。
アガロース水溶液濃度4%(w/v)
油/水エマルジョン:0.7mLツイン80/10mLシクロヘキサン
水/油エマルジョン:7mLスパン85/75mLシクロヘキサン
表2. 均質アガロースビーズ加工に対する乳化剤の影響
油中水型エマルジョンの過度の安定化は、凝集低下を引き起こし、低収率をもたらす微粒子の生成を増大させた。固定スターラー速度8(コーニング社(Corning)スターラー/ホットメンバーモデル番号PC−420)を用いて同じ実験を行い、収率がやや向上した。マグネチックスターラーによる攪拌は高粘度溶液や乳化中に生じる泡(クリーミング)には不適当である。
アガロース水溶液濃度4%(w/v)
油/水エマルジョン:0.7mLツイン80/10mLシクロヘキサン
水/油エマルジョン:7mLスパン85/75mLシクロヘキサン
表2. 均質アガロースビーズ加工に対する乳化剤の影響
油中水型エマルジョンの過度の安定化は、凝集低下を引き起こし、低収率をもたらす微粒子の生成を増大させた。固定スターラー速度8(コーニング社(Corning)スターラー/ホットメンバーモデル番号PC−420)を用いて同じ実験を行い、収率がやや向上した。マグネチックスターラーによる攪拌は高粘度溶液や乳化中に生じる泡(クリーミング)には不適当である。
ビーズ選択技法
ビーズ(非多孔性か多孔性のいずれか)を使用するセンサーアレーを用いて、種々の分析検体の存在を決定できる。典型的にはこのビーズは分析検体と結合する受容体を含む。この受容体は又指示薬と結合する。この指示薬は分析検体が不在の場合に発する信号とは異なる分析検体存在による信号を発する。特定の分析検体に用いるビーズの選択はセンサーアレーが成功する上で重要である。一般にビーズはこの分析検体に対し強い親和性を持ち容易に検出できる信号を発せねばならない。ここに記述する方法は供与の分析検体と指示薬に対し最適の受容体を決定するのに使用できる。
ビーズ(非多孔性か多孔性のいずれか)を使用するセンサーアレーを用いて、種々の分析検体の存在を決定できる。典型的にはこのビーズは分析検体と結合する受容体を含む。この受容体は又指示薬と結合する。この指示薬は分析検体が不在の場合に発する信号とは異なる分析検体存在による信号を発する。特定の分析検体に用いるビーズの選択はセンサーアレーが成功する上で重要である。一般にビーズはこの分析検体に対し強い親和性を持ち容易に検出できる信号を発せねばならない。ここに記述する方法は供与の分析検体と指示薬に対し最適の受容体を決定するのに使用できる。
分析検体の存在を決定する方法の一つは置換検定法である。置換検定法においては受容体を含むビーズに指示薬を前もって添加する。この指示薬は、この受容体と相互作用して(たとえば結合して)、ビーズがこの指示薬による特異な色もしくは蛍光を持つようになる。分析検体を含む溶液がこのビーズと接触すると、分析検体が受容体から指示薬を置換することが出来る。この置換により指示薬はもはやこのビーズと会合していないからこのビーズの色もしくは蛍光を失うことになる。このビーズの色もしくは蛍光の喪失を測定することにより分析検体の存在を決定できる。このような検定法が分析検体の存在の決定で成功するには部分的にはこの受容体の分析検体及び指示薬との相互作用に依存する。一般には指示薬が受容体と結合した場合ビーズは最高の色と蛍光を示すべきであるが、この指示薬は分析検体により容易に置換されねばならない。
一つの実施形態では、種々の受容体を持つ複数のビーズが作成できる。一つの実施形態ではこの受容体は種々の異なるタイプの受容体から作成される。代わりに、このビーズは同じ受容体を持つことも出来る。例えばポリマービーズ上のペプチッド、擬態ペプチッド或いはヌクレオチッドのライブラリーを創生する技法は良く知られている。ペプチッドに関しては20n個迄の異なるビーズライブラリーを作成出来る。ここでnはペプチッド鎖中のアミノ酸の数である。核酸用ライブラリーは4n個迄の異なるビーズがあり、ここでnは核酸塩基の数である。これらライブラリーでは多数の異なるビーズがあるため個々のビーズをテストするのは非常に難しい。
図11に、ビーズ上の受容体を最適化する方法の概略図を示す。図11Aではビーズは受容体Xを含有するように描かれている。受容体Xは、ベース(基材)から伸びる6個の副パートからなる。ベースはこのビーズに結合されている。このビーズは先ず、図11Aに星形で表されている指示薬と接触しされる。この指示薬は、受容体に結合されている、ライブラリー中の各ビーズと相互作用する。図11Bに、このビーズの受容体に結合された指示薬を示す。図11Bに示すように、このビーズの色もしくは蛍光はこの指示薬の受容体との相互作用により変化する。このビーズの色もしくは蛍光の変化は、このビーズが指示薬を相互作用出来ることを示す。
多数のビーズを用いたときには、指示薬は種々の強度でビーズと結合する。結合力は典型的にはビーズが発する色或いは蛍光の強さと関連する。指示薬の存在下で強い色もしくは蛍光を発するビーズはその指示薬と結合する受容体を有する。弱い色もしくは蛍光を示すか或いは全く両者を示さないビーズはこの指示薬と弱く結合した受容体を有する。理想的にはこの指示薬と最も強く結合するビーズをこの指示薬と弱い結合か結合しないビーズのかわりに選ぶべきである。図12にこのビーズの色もしくは蛍光強度を基にビーズの分離に利用できるフローサイトメーターの概略図を示す。一般にフローサイトメーターは個々のビーズを分析できる。このビーズをフローセルに流し測定すべきビーズの色もしくは蛍光強度が測定出来る。測定強度によりこれらビーズを図12に示すように収集するか又は廃棄物収集容器に送る事が出来る。指示薬との相互作用に最適なビーズを決定するにはこのフローサイトメーターを一定の閾値以上の色もしくは蛍光を持つビーズのみを受け入れるように設置する。選択した閾値(即ちこの指示薬と弱い結合を持つか全く持たないビーズ)に達しないビーズは収集せず選別プロセスから除去する。フローサイトメーターは多くの所から市販されている。
ビーズライブラリーを指示薬に関して最適化した後、収集ビーズは最初に作成したビーズの個体群が減少したものになる。もしビーズの個体群が大きすぎると強度閾値を高くすることにより追加のスクリーンを行う。受容体と最適の相互作用を示すビーズが同定できると、残るビーズについてその指示薬を注目の分析検体で置換するよう最適化する。かくして、残留ビーズは図11Cに示すように注目の分析検体を含む流体で処理される。この分析検体は丸印で示されている。あるビーズに関してはこの分析検体は指示薬と置換し図11Dに示すようにこのビーズの色もしくは蛍光強度が弱くなる。ビーズが分析検体と相互作用した後のビーズの色もしくは蛍光強度はこの指示薬がいかに競合的に置換されるかによる。分析検体で処理されたときに弱い色もしくは蛍光を示すか或いは両者を示さないビーズが最も望ましい。このようなビーズは、この分析検体が受容体と容易に結合され、この受容体からその指示薬を置換することができることを示す。
再度、フローサイトメーターは分析用最適ビーズの決定に利用することができる。指示薬との相互作用を最適化したビーズライブラリーを分析検体含有流体で処理する。処理したビーズはフローサイトメーターを通過しビーズを色もしくは蛍光強度に基づいて分離する。既定強度以下の色もしくは蛍光を発するビーズが収集され、既定強度以上の色もしくは蛍光を示すビーズは廃棄物収集に送られる。集めたビーズは選択した分析検体と指示薬と一緒に用いる最適ビーズを表す。このビーズと結合した受容体の同一性は既知技術で決定できる。この受容体を同定した後このビーズを再生し試料分析に使用できる。
HIV検出
3500万人以上のHIV感染者が資源のかなり限られた開発途上国に住んでいる。効果的な抗レトロウイルス治療法を先進国ではほぼこの10年間で利用できるようになったが、開発途上国の住人で治療を受けられるのは30万人以下と信じられている。一つの主な障害である抗レトロウイルス(ARVs)治療コストに関しては低価格化とジェネリック版ARVsの到来に取り組んでいる。第二の障害であるHIV治療の開始と監視に使用する洗練された実験室のコストと技術的必要性についてはまだ取り組むべき物として残っている。
3500万人以上のHIV感染者が資源のかなり限られた開発途上国に住んでいる。効果的な抗レトロウイルス治療法を先進国ではほぼこの10年間で利用できるようになったが、開発途上国の住人で治療を受けられるのは30万人以下と信じられている。一つの主な障害である抗レトロウイルス(ARVs)治療コストに関しては低価格化とジェネリック版ARVsの到来に取り組んでいる。第二の障害であるHIV治療の開始と監視に使用する洗練された実験室のコストと技術的必要性についてはまだ取り組むべき物として残っている。
特に重要なのはCD4+リンパ球の測定はHIV感染患者の評価に必須である。CD4カウントは血液1ミリリッターあたりのCD4細胞の絶対数か、全Tリンパ球のパーセントか、CD4対CD9Tリンパ球の比として表され、予後及び治療上大きな意味があり大部分の治療決定の基礎となる。先進国ではCD4カウントはレーザーによりCD4及び他のT細胞マーカーに特異な蛍光性抗体プローブを励起するフローサイトメーターを用いて実施する。放射光は一連の光電子増倍管に集められ、これら信号を分析してCD4+T細胞をCD8+T細胞及び他の血液の細胞成分から区別する。フローサイトメーターの値段は一台につき3万ドルから10万ドルである。このような支出と同時にこの装置の高電圧電気、定期的メンテナンス及び高価な試薬の必要性は資源に乏しい環境ではフローサイトメーターは実用的でなく維持もできない。
資源に乏しい環境の為の代わりのコスト的に余裕のあるCD4カウント法開発のため予備的努力が幾つか行われた。CD4カウント用の単一目的型フローサイトメーターが開発されたがまだ高価である。第二のアプローチでは低コストに免疫磁気的にCD4細胞を他の血液細胞から分離し、続いて光学顕微鏡を用いて標準細胞数カウント法をもちいる。かなり安くなったがこれらの方法はフローサイトメーターベースの方法に比べ処理量が低く精度も劣る。
資源に乏しい環境での低コストCD4カウントが大いに必要であるため、ミクロ検出技術の最近の進歩応用して正確、コスト的に余裕があり且つ携帯型のCD4カウントの開発に取り組んだ。ここに記述するものはコスト的に余裕があるマイクロチップベースのCD4試験法でプロトタイプ型の性能特性とHIV感染及びコントロール被験者の予備的評価を含む。
ミクロ細孔リンパ球捕捉膜は前述の膜ベース流量センサーを用いた。予備的研究のためCD4細胞を健康な提供者から得た軟膜から免疫磁気分離により精製した。全てのCD4標品はフローサイトメーター分析により純度98%以上であった。アレクサ(Alexa)488複合化アンチーCD4抗体で標識したCD4細胞を細胞培地1ml中ゼロから20万個の細胞範囲の量でフローセルに導入し2乃至5ミリリッターのリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。
ミクロ細孔リンパ球捕捉膜は前述の膜ベース流量センサーを用いた。予備的研究のためCD4細胞を健康な提供者から得た軟膜から免疫磁気分離により精製した。全てのCD4標品はフローサイトメーター分析により純度98%以上であった。アレクサ(Alexa)488複合化アンチーCD4抗体で標識したCD4細胞を細胞培地1ml中ゼロから20万個の細胞範囲の量でフローセルに導入し2乃至5ミリリッターのリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄した。
ヒト被験者の研究のため静脈穿刺により得た全血液20マイクロリッターをCD3,CD4、及び/又はCD8に対するアレクサ(Alexa)488又はアレクサ(Alexa)647複合化抗体2マイクロリッターと共にインキュベートした。8分後試料を更に処理すること無しにフローチャンバーに直接導入し、2ミリリッターのPBSで洗浄した。ミクロチャンバー中で捕獲した染色細胞の画像を得てから解析にかけた。ある実験では画像収集後2%グルタルアルデヒドをフローセルに導入し細胞を走査型電子顕微鏡法用に固定した。
膜ベースのフローセンサーを光源として中圧水銀ランプを装備した顕微鏡システムの架台上に固定化した。各研究被験者に対しミクロチャンバーの床にあるリンパ球捕獲膜の5つの重複しない領域をワークステーションに取り付けたディジタルカメラ(DVC、オースチン、テキサス)(DVC, Austin, Texas)を用いて画像化した。各領域を一度は赤色波長吸収フィルター(アレクサ(Alexa)―488蛍光検出のため)下で一度は緑色波長吸収フィルター(アレクサ(Alexa)―647蛍光検出のため)を用いて二度画像化した。予備的研究を除けばこれら二つの画像は解析前に合体して単一画像を作成した。
膜ベースのフローセンサーを光源として中圧水銀ランプを装備した顕微鏡システムの架台上に固定化した。各研究被験者に対しミクロチャンバーの床にあるリンパ球捕獲膜の5つの重複しない領域をワークステーションに取り付けたディジタルカメラ(DVC、オースチン、テキサス)(DVC, Austin, Texas)を用いて画像化した。各領域を一度は赤色波長吸収フィルター(アレクサ(Alexa)―488蛍光検出のため)下で一度は緑色波長吸収フィルター(アレクサ(Alexa)―647蛍光検出のため)を用いて二度画像化した。予備的研究を除けばこれら二つの画像は解析前に合体して単一画像を作成した。
各画像を市販の画像処理ソフトウエアパッケッジ(イメージプロプラス(Image-Pro Plus))で開発された特別仕様アルゴリズムを用いて解析した。赤色、緑色及び青色強度の閾値をバックグランドに対しリンパ球に最適になるよう確立し、リンパ球をその幾何形状(大きさと形)により特性化した。このように同定した細胞数を自動的な方法で数え、その結果を使用した抗体の組み合わせに依存するが、CD4CD3−細胞、CD4+CD3+細胞、CD8+CD3+細胞及びCD8+CD3−とCD4+CD8+細胞の数としてスプレッドシートに記録した。
血液はマサツセッツジェネラルホスピタル(Massachusetts General Hospital)で健康な有志者かHIV感染被験者から静脈穿刺により採取した。試料はフローサイトメーター法でMGH臨床ラボか研究設備のいずれかで標準4色プロトコールをファックスカリバー(FACScalibur)フローサイトメーターを用いて平行処理した。この研究はマサツセッツジェネラルホスピタル(Massachusetts General Hospital)の研究所レビュー委員会(Institutional Review Board)で承認され全研究被験者から説明と同意を得た。
自動化したマイクロチップ法で得た結果は各研究被験者に関するフローサイトメーター法で得た結果と直接比較し、標準の統計ソフトウエアパッケッジを用いて相関関係を求めた。
我々は以前に逆ピラミッド型マイクロチャンバー中に固定した抗体に結合したミクロビーズを用いたミクロチップ免疫アッセイを開発した。このデザインは抗原及び抗体検出用のミクロELISAプラットフォームとして非常に有効であることを明らかにした。CD4のカウントのため多孔性プラスチック格子からなる床を持つようにフローチャンバーを改造しその格子上に使い捨てリンパ球捕捉膜フィルターを乗せた。これらのフィルターは0.2から30ミクロン範囲の既定の細孔サイズを有する。予備実験では2乃至5ミクロンの細孔サイズがこのフローチャンバーのミクロフルイディクス及びリンパ球の保持に最適であることが判った。不必要な赤血球と血小板は細孔を通過し画像化する前にフローチャンバーから流出し、バックグランド蛍光を大いに減じ画像品質を向上した。
我々は以前に逆ピラミッド型マイクロチャンバー中に固定した抗体に結合したミクロビーズを用いたミクロチップ免疫アッセイを開発した。このデザインは抗原及び抗体検出用のミクロELISAプラットフォームとして非常に有効であることを明らかにした。CD4のカウントのため多孔性プラスチック格子からなる床を持つようにフローチャンバーを改造しその格子上に使い捨てリンパ球捕捉膜フィルターを乗せた。これらのフィルターは0.2から30ミクロン範囲の既定の細孔サイズを有する。予備実験では2乃至5ミクロンの細孔サイズがこのフローチャンバーのミクロフルイディクス及びリンパ球の保持に最適であることが判った。不必要な赤血球と血小板は細孔を通過し画像化する前にフローチャンバーから流出し、バックグランド蛍光を大いに減じ画像品質を向上した。
このシステムで検出した蛍光強度と標識化CD4細胞数の相関関係を決めるため、個々のマイクロチャンバーに多数のRPMI1mL中の精製CD4+リンパ球を加え検出可能な蛍光を測定した。個々のCD4+T細胞は希釈試料では識別出来る。重要なのは画素解析によりディジタル画像を測定すると、この試料中の細胞数と光強度の間に直線関係が存在することである。これによりこのマイクロチャンバーと画像解析システムは蛍光マーカーで標識したリンパ球個体群の正確な測定と検出に使用できるという原理が実証出来た。
次に我々は一段非溶解システムでの全血から直接CD4細胞を測定する試験法を開発した。健康なコントロール被験者とHIV感染被験者から静脈穿刺により採取した血液を用いて、全血20マイクロリッターをCD3、CD4或いはCD8に対し蛍光標識化抗体2マイクロリッターでインキュベートした。光漂白及び信号強度の初期研究を基に、ヒト被験者の研究ではアレクサ(Alexa)系列のフルオロフォア(モレキュラープローブ社(Molecular Probes))だけを使用した。CD抗原に対してはアレクサー(Alexa)488及びアレクサー(Alexa)647複合抗体だけしか利用できないため二色画像化に限定された。8分間インキュベートした後試料をPBS480マイクロリッターに希釈しフローチャンバーに導入しPBS2mLで洗浄してから画像化した。血液処理から画像解析までに要する全時間は15分以下であった。
次に我々は一段非溶解システムでの全血から直接CD4細胞を測定する試験法を開発した。健康なコントロール被験者とHIV感染被験者から静脈穿刺により採取した血液を用いて、全血20マイクロリッターをCD3、CD4或いはCD8に対し蛍光標識化抗体2マイクロリッターでインキュベートした。光漂白及び信号強度の初期研究を基に、ヒト被験者の研究ではアレクサ(Alexa)系列のフルオロフォア(モレキュラープローブ社(Molecular Probes))だけを使用した。CD抗原に対してはアレクサー(Alexa)488及びアレクサー(Alexa)647複合抗体だけしか利用できないため二色画像化に限定された。8分間インキュベートした後試料をPBS480マイクロリッターに希釈しフローチャンバーに導入しPBS2mLで洗浄してから画像化した。血液処理から画像解析までに要する全時間は15分以下であった。
アレクサー(Alexa)488複合化抗体はCD4細胞を緑色に、CD3に対するアレクサー(Alexa)647複合化抗体は全Tリンパ球を赤色に標識する。画像の自動的な併合により注目のCD3+CD4+Tリンパ球は黄色となりCD4+CD3−単球と(緑色)CD3+CD4−T細胞(赤色)から区別できる。各研究被験者に関して5個の重複しない画像が得られ、試料細胞個体群のサイズが増加し精度を向上した。
走査型電子顕微鏡法の典型的な試料は上述のよう作成マイクロチャンバー内で加工した。不必要な赤血球はフィルター上には保持されず食塩水洗浄と共に細孔を通過し溶解の必要性をなくす。これを大量洗浄(20マイクロリッター試料に対し100倍過剰)と組み合わすことでバックグランド蛍光を有意に減じ画像品質を向上した。
走査型電子顕微鏡法の典型的な試料は上述のよう作成マイクロチャンバー内で加工した。不必要な赤血球はフィルター上には保持されず食塩水洗浄と共に細孔を通過し溶解の必要性をなくす。これを大量洗浄(20マイクロリッター試料に対し100倍過剰)と組み合わすことでバックグランド蛍光を有意に減じ画像品質を向上した。
このマイクロチップシステムで得たCD4の百分率(CD4+CD3+細胞数/全CD3細胞数)及びCD4対CD8の比(CD4パーセント/CD8パーセント)の結果と各研究被験者に対しフローサイトメーター法で得た結果を比較した。CD4対CD8比に関するこのマイクロチップ法とフローサイトメーター法との比較により良い相関関係があることが判った。
この発明の種々な面での更なる改良や代替え実施形態は本記述の観点からこの技術に熟達した人々には明白である、従って本明細書は図解的だけなものとして理解し本発明を実行する一般的方法をこの技術に熟達した人々を教育する事を目的としている。ここに示し且つ記述した本発明の形式は現在の好ましい実施形態として受け止められると考えられる。本発明の記述の利益を取得した後はこの技術に熟達した人には明白であるが、要素や材料はここに図示し記述した物で置き換えられ、パーツやプロセスも逆にでき、本発明の特色は独立に利用できる。以下の請求項に記述するように本発明の精神と範囲から逸脱しない限りここに記載した要素を変更できる。
この発明の種々な面での更なる改良や代替え実施形態は本記述の観点からこの技術に熟達した人々には明白である、従って本明細書は図解的だけなものとして理解し本発明を実行する一般的方法をこの技術に熟達した人々を教育する事を目的としている。ここに示し且つ記述した本発明の形式は現在の好ましい実施形態として受け止められると考えられる。本発明の記述の利益を取得した後はこの技術に熟達した人には明白であるが、要素や材料はここに図示し記述した物で置き換えられ、パーツやプロセスも逆にでき、本発明の特色は独立に利用できる。以下の請求項に記述するように本発明の精神と範囲から逸脱しない限りここに記載した要素を変更できる。
本発明の方法および装置の特色と利点は、添付の図面と組み合わせ、本発明に係る現在好ましいが例証的な実施形態の以下の詳細な記述を参照にすることによって、よく理解されよう。図面において、
膜ベース流れセンサーの拡大図を示す。
ハウジングに設置した膜ベース流れセンサーの実施形態を示す。
フロースルーモードでの分析検体検出システムの概略図を示す。
側部流れモードでの分析検体検出システムの概略図を示す。
逆流置換(モードでの分析検体検出システムの概略図を示す。
試料収集法のフローチャートを示す。
試料収集法のフローチャートを示す。
A−Fは膜により捕捉された粒子の分析法を示す。
センサーアレー検出装置を含む膜ベース分析検体分析システムの概略図を示す。
多孔性粒子を示す。
A−Dはビーズの最適化法の概略図を示す。
フローサイトメーターを示す。
Claims (73)
- 以下のものからなる、分析検体検出装置:
本体;
該本体と組み合わされた多孔性膜;
該多孔性膜の上方に、或る間隔をあけて設置された上部部材(但し該上部部材と該多孔性膜との間には第一空洞が形成され、該上部部材は該多孔性膜の少なくとも一部を覆っており、該上部部材は実質的に光に対し透明である);及び
該多孔性膜の下方に設置された底部部材(但し該底部部材は使用中に該多孔性膜を通して流れる流体を受け容れるように構成されている)。 - 多孔性膜が約0.2ミクロンから約12ミクロンの間の直径を持つ細孔を有する、請求項1の装置。
- 該上部部材が可視光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該底部部材が可視光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該上部部材が可視光に対し実質的に透明であり且つ該底部部材が可視光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該上部部材が紫外光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該底部部材が紫外光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該上部部材が紫外光に対し実質的に透明であり且つ該底部部材が紫外光に対し実質的に透明である、請求項1の装置。
- 該底部部材が該膜を収容するように構成されたくぼみを有する、請求項1の装置。
- 該底部部材がフィルターを収容するように構成された第一のくぼみ及び使用中に該膜を通過する流体を受け容れるように構成された第二のくぼみを有する、請求項1の装置。
- 更に該膜と組み合された膜支持体(但し該膜支持体は多孔性材料からなる)を有する、請求項1の装置。
- 該膜支持材は、流体が膜を通過する速度と等しいか又はそれより大きな速度で流体が該膜支持材を通過し得る細孔を有する、請求項11の装置。
- 該膜支持材は、使用中に該膜がたるむのを阻止するのに十分に該膜を支持する、請求項11の装置。
- 該膜支持材が、使用中に該膜を実質的に平面方向に維持するように構成さ
れている、請求項11の装置。 - 更に該膜と該上部部材の間に置かれたガスケットを有する、請求項1の装置。
- 該上部部材が、流体を該上部部材を通して該膜へ導入するように構成された流体入り口を有する、請求項1の装置。
- 該底部部材が、流体を該膜を通過し該分析検体検出装置の外に流出するように構成された流体出口を有する請求項1の装置
- 該上部部材が流体を該上部部材を通して該膜へ導入するように構成された流体入り口を有し、且つ該上部部材が洗浄操作中に流体を該膜から該分析検体検出装置の外に流出するように構成された洗浄流体出口を有する、請求項1の装置。
- 更に本体および蓋を有し、該上部部材、該膜および該底部部材が該本体内に配置され、該蓋が該本体内の該上部部材、該膜および該底部部材をしっかりと保持する、請求項1の装置。
- 該上部部材がアクリルエステルポリマーからなる、請求項1の装置。
- 該上部部材および該底部部材がアクリルエステルポリマーからなる、請求項1の装置。
- 以下のものからなる、分析検体検出システム:
分析検体検出装置[但し該分析検体検出装置は
本体;
該本体と組み合わされた多孔性膜;
該多孔性膜の上方に、或る間隔をあけて設置された上部部材(但し該上部部材と該多孔性膜との間には第一空洞が形成され、該上部部材は該多孔性膜の少なくとも一部を覆っており、該上部部材は実質的に光に対し透明である);及び
該多孔性膜の下方に設置された底部部材(但し該底部部材は使用中に該多孔性膜を通して流れる流体を受け容れるように構成されている)
からなる];
該多孔性膜と光学的に組み合わされた検出器(但し該検出器は窓を通して該膜の少なくとも一部が見えるように構成されている);
該分析検体検出装置に組み合わされた流体送りシステム(但し該流体送りシステムは流体試料を該分析検体検出装置に送り込むように構成されている)。 - 該検出器がCCDカメラを有する、請求項22のシステム。
- 該流体送りシステムが一個またはそれ以上のポンプを有する、請求項22のシステム。
- 該流体送りシステムが複数のポンプを有し、各ポンプは異なる流体保存容器と組み合わされている、請求項22のシステム。
- 該流体送りシステムが一個または複数のポンプおよび一個またはそれ以上のフィルターを有し、該フィルターは流体が該分析検体検出装置に送られる前に流体を濾過するように構成されている、請求項22のシステム。
- 該分析検体検出器が流体入り口を有し、該流体送りシステムが、各ポンプが異なる流体保存容器と組み合わされた複数のポンプおよびマニフォールドを有し、該マニフォールドは、該ポンプの少なくとも一部から受け容れられた流体を該流体出口へ向きを変えさせるように構成されている、請求項22のシステム。
- 該検出器が顕微鏡を有する、請求項22のシステム。
- 更に該流体送りシステムと組み合わされたプログラム化し得るコントローラーを有する、請求項22のシステム。
- 該プログラム化し得るコントローラーが更に該検出器と組み合わされた、請求項29のシステム。
- 以下のことからなる、流体中の分析検体を感知する方法:
多孔性膜上にこの分析検体を捕捉出来るように構成された多孔性膜を横切って該流体を通過させ;
該多孔性膜上に捕捉された物質の画像を検出し;そして
該多孔性膜上に該分析検体が存在するかどうかを決定すること。 - 更に、該画像が使用者定義の基準に合致する場合に、該分析検体をセンサーアレーに送ることからなる、請求項31の方法。
- 該センサーアレーが多孔性粒子からなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の形を使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の大きさを使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の会合面積を使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の色を使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の蛍光を使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 該分析検体が存在するか否かの決定が該物質の蛍光強度を使用者定義の基準と比較することからなる、請求項31の方法。
- 更に該膜に捕捉された該物質を染色することからなら、請求項31の方法。
- 更に空気収集装置を用いて流体中の分析検体の試料を収集することからなる、請求項31の方法。
- 更に該分析検体を含む該流体を該多孔性膜を横切って通過させる前にバックグランド流体を該フィルターを通過させ該多孔性膜上に補足された画像を検出することからなる、請求項31の方法。
- 更に該分析検体を含む該流体を該膜を横切って通過させる前に該膜の表面を清浄にする側部洗浄を行なうことからなる、請求項31の方法。
- 更に該分析検体を含む該流体を該膜を横切って通過させる前に該膜の表面を清浄にする逆流置換洗浄を行なうことからなる、請求項31の方法。
- 画像検出がCCD検出器を用いて行なわれる、請求項31の方法。
- 画像検出が顕微鏡を用いて行なわれる、請求項31の方法。
- 更に該流体が該膜上を通過した後に可視化試薬を該膜を横切って通過させることからなる、請求項31の方法。
- 更に画像検出後に該膜の表面を清浄にする側部洗浄を行なうことからなる、請求項31の方法。
- 更に画像検出後に該膜の表面を清浄にする逆流置換洗浄を行なうことからなる、請求項31の方法。
- 以下のことからなる、膜上に捕捉された分析検体の分析方法:
流体試料を膜を横切って通過させ(但し該流体試料は、膜により少なくとも部分的に保持される分析検体からなる);
該流体試料が該膜を横切って通過する時に該膜上に収集された材料に可視化試薬を添加し;
白光を用いて、第一波長の光、第二波長の光および第三波長の光で、該収集された材料の画像を収集し(但し該分析検体は該第一波長の光に相当する色からなる);
該第二波長の光で該収集された材料の画像に相当する第一マスクを形成し;
該第三波長の光で該収集された材料の画像に相当する第二マスクを形成し;
白色光での該収集された材料の該画像から該第一マスクおよび該第二マスクを差し引くこと。 - 該波長の光が赤、青および緑色からなる群から選ばれる、請求項50の方法。
- 該画像データの該収集と該マスクの形成がコンピューターで実施される、請求項50の方法。
- 更に白色光での該収集された材料の該画像から該第一マスクおよび該第二マスクを差し引いて得られる該画像の解析により該膜上に存在する分析検体の量を決定することからなる、請求項50の方法。
- 該画像がCCD検出器を用いて収集される、請求項50の方法。
- 該画像が顕微鏡と組み合わされたCCD検出器を用いて収集される、請求項50の方法。
- ポリマー樹脂に結合された受容体からなる、流体中の分析検体を検出する為の粒子(但し該ポリマー樹脂は約1μmより小さい直径を有する多数の細孔を有する)。
- 更に該細孔の一つの表面に結合された受容体からなる、請求項56の粒子。
- 該粒子がアガロースからなる、請求項56の粒子。
- 該粒子が実質的に球状である、請求項56の粒子。
- 該粒子が約100〜500ミクロンの間の直径を有する、請求項56の粒子。
- 該粒子が微生物を包括するように構成されている、請求項56の粒子。
- 以下のことからなる、多孔性粒子の作成方法:
水溶液中のポリマー樹脂のエマルジョンを形成し;
該エマルジョンの温度を低下させて多孔性粒子を生成すること(但し該多孔性粒子は約1μmより小さい直径を有する多数の細孔を有する)。 - エマルジョンの形成が水中の該ポリマー樹脂の混合物に乳化剤を添加することかなる、請求項62の方法。
- 請求項62の方法で形成された、多孔性粒子。
- 以下のことからなる、微生物の検出方法:
該微生物を捕捉するように構成された多孔性粒子上に該流体を流し;
検出器で該微生物を検出すること。 - 該微生物を受け容れるように構成された受容体が該多孔性粒子と組み合わされた、請求項65の方法。
- 以下のものからなる、流体中の分析検体を検出するシステム:
光源;
センサーアレー(但し該センサーアレーは、支持部材内に形成された少な くとも一個の空洞を有する支持部材からなる);
粒子(但し該粒子は該空洞内に位置し、該粒子は使用中に該分析検体と相互作用したときに信号を発生するように構成され、且つ該粒子はポリマー樹脂と結合された受容体からなり、該ポリマー樹脂は約1μmより小さい直径を有する多数の細孔を有する);及び
検出器(但し該検出器は、使用中に該粒子と該分析検体との相互作用により発せられる信号を検出するように構成され;該光源と該検出器は、使用中に光が該光源から、該粒子に、および該検出器上に到達するように構成されている)。 - 以下のことからなる、流体中の分析検体の感知法:
センサーアレー上に流体を通過させ(但し該センサーアレーは、支持部材の空洞内に位置する少なくとも一個の粒子からなり、該粒子はポリマー樹脂に結合された受容体からなり、該ポリマー樹脂は1μmより小さい直径を有する多数の細孔を有する);
該流体が該センサーアレー上を通過するときに該粒子の分光的変化を監視すること(但し該分光的変化は該粒子と該分析検体との相互作用によって引き起こされる)。 - 以下のことからなる、流体中の分析検体の感知法:
多孔性膜上に該分析検体を捕捉するように構成された多孔性膜を横切って該流体を通過させ;
該多孔性膜上の該粒子に可視化試薬を適用し;
該多孔性膜上に捕捉された物質の画像を、検出器を用いて複数の波長の光で検出し;
該多孔性膜上に捕捉された物質の画像を、特定波長の光で検出すること(但し該特定波長の光が該分析検体の存在を指示しない光を表す)。 - 以下のことからなる、センサーアレー形成方法:
支持部材内に複数の空洞を形成し;
複数の粒子を形成し(但し各粒子は、ポリマー樹脂と結合された受容体からなり、複数の異なる受容体が該粒子と結合されている);
該多数の粒子を分析検体と相互作用させ;
どの粒子が該分析検体と相互作用したか及び該分析検体との相互作用の程度を決定し;
該分析検体と相互作用し且つ既定基準に合致する粒子を、該分析検体と実質的に相互作用していないか或いは既定基準に合致しない粒子から、分離し;
該分析検体と相互作用し且つ既定基準に合致する、分離された粒子を、センサーアレーに添加すること。 - 該粒子の分離がフローサイトメーターを用いて該粒子を分離することからなる、請求項70の方法。
- 以下のことからなる、血液中のHIVウイルスの感知法:
血液を多孔性膜を横切って通過させ(但し該多孔性膜は、白血球を保持するが血液中の他の物質を通過させるように構成されている);及び
該膜により捕捉された白血球の量と白血球のタイプを決定すること。 - 以下のものからなる、分析検体検出装置:
本体;
該本体と組み合わされた多孔性膜。
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