JP6997636B2 - メチシリン耐性ブドウ球菌属（ｍｒｓ）検査用マイクロデバイスおよびｍｒｓの検査方法 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 発表した刊行物：第４５回薬剤耐性菌研究会 プログラム・抄録集、発行者名：薬剤耐性菌研究会、発行年月日：平成２８年１０月

特許法第３０条第２項適用 発表した刊行物：第８６回日本感染症学会西日本地方会学術集会 第５９回日本感染症学会中日本地方会学術集会 第６４回日本化学療法学会西日本支部総会 合同開催 プログラム・抄録集２０１６、発行者名：琉球大学大学院 感染症・呼吸器・消化器内科学（第一内科）編集、発行年月日：平成２８年１０月１３日

特許法第３０条第２項適用 発表した刊行物：日本臨床微生物学雑誌、第２７巻、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、発行者名：一般社団法人日本臨床微生物学会、発行年月日：平成２８年１２月２５日

特許法第３０条第２項適用 電気通信回線による発表： 掲載年月日：平成２８年１０月２８日 掲載アドレス１： ｈｔｔｐ：／／ｙａｋｕｔａｉ．ｄｅｐｔ．ｍｅｄ．ｇｕｎｍａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｃｉｅｔｙ／ｐｄｆ／４５ｔｈ％２０Ｋｅｎｋｙｕｋａｉ％２０Ｓｙｏｕｒｏｋｕｓｙｕ．ｐｄｆ

特許法第３０条第２項適用 発表した研究集会：第４５回薬剤耐性菌研究会、開催場所：安芸グランドホテル（広島県廿日市市宮島口西１丁目１－１７）、主催者名：薬剤耐性菌研究会、開催日：平成２８年１０月２１日～２２日、発表日：平成２８年１０月２２日

特許法第３０条第２項適用 発表した研究集会：第８６回日本感染症学会西日本地方会学術集会 第５９回日本感染症学会中日本地方会学術集会 第６４回日本化学療法学会西日本支部 総会、開催場所：沖縄コンベンションセンター（沖縄県宜野湾市真志喜４丁目３－１）、主催者名：一般社団法人日本感染症学会 公益社団法人日本化学療法学会 開催日：平成２８年１１月２４日～２６日 発表日：平成２８年１１月２５日

本発明は、ＭＲＳ検査用マイクロデバイスおよびＭＲＳの検査方法に関する。

近年、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌等において、メチシリン耐性菌（ＭＲＳ）が増加している。

ＭＲＳＡにおけるβ－ラクタム薬耐性の耐性因子は、細胞壁合成酵素（PBP2’（Penicillin Binding Protein 2 prime）またはPBP2a（Penicillin Binding Protein 2a））と呼ばれている。この耐性因子は、ＳＣＣｍｅｃ遺伝子カセット内に存在するｍｅｃＡ遺伝子にコードされている。ＭＲＳＡには、院内感染型（Health-care associated（Ｈ））ＭＲＳＡおよび市中感染型（Community-acquired（ＣＡ））ＭＲＳＡが存在することが知られている。また、ＳＣＣｍｅｃ遺伝子は、複数のタイプ（Ｉ～Ｖ型）がありＨ－ＭＲＳＡは、Ｉ、II、またはIII型であるのに対し、ＣＡ－ＭＲＳＡはＩＶまたはＶ型が多いことが知られている。

ＭＲＳの検査は、微量液体培地希釈法によるオキサシリンのＭＩＣ（最少発育阻止濃度）値により判定する方法、オキサシリン含有ディスクにより寒天培地に形成される培養後の阻止円のサイズから耐性を決定する方法（ディスク法）、オキサシリン含有平板への発育の有無によるスクリーニング等の一般的な薬剤感受性検査法を用いたＭＲＳの検査方法により、現在行なわれている。しかしながら、これらの方法は、検査開始から感受性の判定まで、例えば、少なくとも１８時間程度を要するため、さらなる迅速化が求められている。

また、Ｈ－ＭＲＳＡは、薬剤耐性のレベルが高いのに対し、ＣＡ－ＭＲＳＡは、薬剤耐性のレベルが低い傾向にある。このため、前記一般的な薬剤感受性検査法を用いたＭＲＳの検査方法では、ＣＡ－ＭＲＳＡの検出感度が低いという問題がある。

そこで、本発明は、簡便、かつ迅速であり、例えば、さらに、高い検出感度でＣＡ－ＭＲＳＡ等の薬剤耐性のレベルが低いＭＲＳも検出できるＭＲＳ検査用マイクロデバイスおよびＭＲＳの検査方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のメチシリン耐性ブドウ球菌属（ＭＲＳ）検査用マイクロデバイス（以下、「ＭＲＳ検査デバイス」ともいう）は、第１の開口部、複数の第２の開口部、前記第１の開口部といずれか１つの第２の開口部とを連通する複数の流路、および抗菌薬を含み、
前記各流路は、前記第１の開口部と前記第２の開口部との間において、前記抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養部を含み、
前記培養部は、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する観察部を含み、
前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置されていることを特徴とする。

本発明のＭＲＳの検査方法（以下、「ＭＲＳ検査方法」ともいう）は、前記本発明のＭＲＳ検査用マイクロデバイスを用い、
前記ＭＲＳ検査用マイクロデバイスの培養部で、抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養工程、
前記培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置されている。このため、本発明によれば、例えば、前記ＭＲＳ検査デバイスの複数の流路に、被検菌懸濁液を導入し、前記複数の流路内で、前記抗菌薬および前記被検菌懸濁液との混合液を培養し、各流路における観察部を、例えば、顕微鏡等で観察することによって、ＭＲＳを簡便かつ迅速に確認できる。また、本発明によれば、例えば、耐性か否かを個々の細胞の増殖の有無で判別することから、ＣＡ－ＭＲＳＡ等の薬剤耐性レベルが低いＭＲＳも高い検出感度で、例えば、簡易的に検査できる。本発明によれば、例えば、同時にベンジルペニシリン（ＰＣＧ）やクリンダマイシンの感受性も検査することができ、治療薬の選択に有用な情報が、例えば、約３時間で取得できる。

このため、本発明は、例えば、臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。特に、臨床検査においては、例えば、対象となるブドウ球菌について、適切な抗菌薬の選択が早期に可能となるため、救命率の向上、不要な薬剤使用量の減少等の効果が期待でき、長期的に見れば、薬剤耐性菌の増加を抑制できる可能性がある。

図１Ａは、実施形態１の検査デバイスの一例を示す斜視図である。 図１Ｂは、実施形態１の検査デバイスにおける上基板の一例を示す下面図である。 図１Ｃは、実施形態１の検査デバイスにおいて、図１ＢのＩ－Ｉ方向からみた断面図である。 図１Ｄは、実施形態１の検査デバイスにおいて、図１ＢのII－II方向からみた断面図である。 図１Ｅは、実施形態１の検査デバイスにおいて、図１ＢのIII－III方向からみた断面図である。 図１Ｆは、実施形態１の検査デバイスにおいて、図１Ｂの二点鎖線で囲った部分の拡大図である。 図２は、実施形態１における検査デバイスのネック部の他の例を示す下面図である。 図３は、実施形態１の検査デバイスの他の例を示す斜視図である。 図４は、実施形態１における検査デバイスに被検菌懸濁液を導入する導入方法の一例を示す概略図である。 図５は、実施例１における各流路の結果を示す写真であり、（Ａ）は、条件Ｆにおける各流路を示す写真であり、（Ｂ）は、条件Ｇにおける各流路を示す写真である。

本発明のＭＲＳ検査デバイスは、例えば、前記第１の開口部と前記培養部との間において、前記第１の開口部側に隣接する前記流路の内寸よりも狭く形成されたネック部を含む。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記ネック部は、例えば、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって、ネック導入部、ネック最挟部、およびネック拡大部を含み、
前記ネック最挟部は、前記ネック導入部および前記ネック拡大部と連接して配置されており、
前記ネック導入部は、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって狭まるテーパ状である。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記ネック拡大部は、前記培養部に臨む対向面を有し、前記対向面は、前記流路の延在方向に直交して内側へ延びる面、または前記培養部に向かって前記流路の内側へ延びる面であることが好ましい。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記流路は、前記第１の開口部と前記ネック部との間において、狭窄部を含み、
前記狭窄部は、前記第１の開口部側から前記ネック部側に向かって、狭窄導入部、狭窄最挟部および狭窄拡大部を含み、
前記狭窄最挟部は、前記狭窄導入部および前記狭窄拡大部と連接して配置されており、
前記狭窄導入部は、前記第１の開口部側から前記ネック部側に向かって狭まるテーパ状であり、
前記狭窄拡大部は、前記狭窄最挟部側から前記ネック部側に向かって広がる逆テーパ状である。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記観察部は、例えば、隣接する前記培養部の内寸よりも狭く形成されている。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記各流路の観察部の少なくとも一部が、１つの評価領域内に収まるように配置されていることが好ましい。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記複数の流路は、例えば、前記混合液における前記抗菌薬（例えば、オキサシリン）の濃度が、耐性基準濃度未満となるように、前記抗菌薬が配置されている流路を含む。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記抗菌薬は、例えば、ペニシリン系抗菌薬、セファマイシン系抗菌薬、セファロスポリン系抗菌薬、およびリンコマイシン系抗菌薬からなる群から選択された少なくとも１つを含む。前記抗菌薬は、オキサシリン、セフォキシチン、またはセフチゾキシムを含むことが好ましい。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記複数の流路は、例えば、前記抗菌薬が配置されていないコントロールの流路を含む。

本発明のＭＲＳ検査方法は、例えば、前記各流路の観察部の少なくとも一部が、１つの評価領域内に収まるように配置されているＭＲＳ検査デバイスを用い、
前記検出工程において、前記評価領域の各流路における前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌について、数、形態および集落からなる群から選択された少なくとも１つを検出し、比較し、評価する。前記形態は例えば、前記ブドウ球菌の外観的な形でもよいし、前記ブドウ球菌の動きでもよい。また、前記ブドウ球菌が集落を形成する場合、前記形態は、例えば、集落外観、集落同士の結合状態、集落の動き等でもよい。

本発明のＭＲＳ検査方法において、前記複数の流路は、例えば、前記混合液における前記抗菌薬の濃度が、耐性基準濃度未満となるように、前記抗菌薬が配置されている流路を含むＭＲＳ検査用マイクロデバイスを用い、
前記耐性基準濃度未満となるように前記抗菌薬が配置されている流路の培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌がＭＲＳ（例えば、市中感染型ＭＲＳ）であるかを判定する判定工程を含む。

＜ＭＲＳ検査用マイクロデバイスおよびＭＲＳの検査方法＞
本発明のＭＲＳ検査用マイクロデバイスは、前述のように、第１の開口部、複数の第２の開口部、前記第１の開口部といずれか１つの第２の開口部とを連通する複数の流路、および抗菌薬を含み、
前記各流路は、前記第１の開口部と前記第２の開口部との間において、前記抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養部を含み、
前記培養部は、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する観察部を含み、
前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置されていることを特徴とする。

本発明のＭＲＳの検査方法は、前述のように、前記本発明のＭＲＳ検査用マイクロデバイスを用い、
前記ＭＲＳ検査用マイクロデバイスの培養部で、抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養工程、
前記培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する検出工程を含むことを特徴とする。

本発明のＭＲＳ検査デバイスにおいて、前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置されている。このため、本発明によれば、例えば、前記ＭＲＳ検査デバイスの複数の流路に、被検菌懸濁液を導入し、前記複数の流路内で、前記抗菌薬および前記被検菌懸濁液との混合液を培養する。そして、ＭＲＳの検査においては、例えば、この培養時間が、実質的に、検査に要するトータルの時間を決定づける要因となる。本発明によれば、前記混合液の培養を短時間（例えば、２～３時間）で行うことができるため、総合的に、非常に短時間での検査が可能となる。したがって、本発明によれば、各流路における培養部の観察部を、例えば、顕微鏡等で観察することによって、ＭＲＳを簡便かつ迅速に確認できる。また、本発明によれば、例えば、耐性か否かを個々の細胞の増殖の有無で判別することから、ＣＡ－ＭＲＳＡ等の耐性レベルが低いＭＲＳも高い検出感度で簡易的に検査できる。本発明によれば、例えば、同時にベンジルペニシリン（ＰＣＧ）やクリンダマイシンの感受性も検査することができ、治療薬の選択に有用な情報が、例えば、約３時間で取得できる。さらに、本発明によれば、例えば、PBP2’をラテックス凝集法で検出する方法と比較して、高い検出感度で簡易的に検査できる。本発明によれば、例えば、ｍｅｃＡ遺伝子をＰＣＲで検出する方法と比較して、簡便な操作でＭＲＳを検出できる。

本発明のＭＲＳ検査デバイスは、前記本発明のＭＲＳ検査方法に使用するマイクロデバイスであり、後述する本発明のＭＲＳ検査方法における説明を援用できる。本発明において「検査」とは、例えば、定性検査（例えば、ＭＲＳの有無）を意味する。

本発明において、メチシリン耐性ブドウ球菌属（ＭＲＳ）は、メチシリンに耐性のブドウ球菌属でもよいし、多剤（複数の抗菌薬）耐性ブドウ球菌属でもよい。また、本発明において、院内感染型は、例えば、主に、Ｉ型、II型またはIII型ＳＣＣｍｅｃ遺伝子を含むことが多く、市中感染型は、メチシリン耐性レベルが低く、IV型またはＶ型のＳＣＣｍｅｃ遺伝子を含むことが多い。

本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法は、ＣＡ－ＭＲＳＡ等のＭＲＳも検出できる。このため、本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳ検査デバイスおよびＣＡ－ＭＲＳ検査方法、またはＣＡ－ＭＲＳＡ検査デバイスおよびＣＡ－ＭＲＳＡ検査方法ということもできる。

本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法は、ＣＡ－ＭＲＳＡ等のＭＲＳも検出できる。また、ＣＡ－ＭＲＳＡを含むＭＲＳは、一般的にｍｅｃＡ遺伝子を有すると考えられている。このため、本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法によれば、被検菌が、ＭＲＳか否かを判定することにより、ｍｅｃＡ遺伝子を保有しているか否かを、間接的に推定することができる。したがって、本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法は、例えば、ｍｅｃＡ遺伝子の検査デバイスおよびｍｅｃＡ遺伝子の検査方法、またはｍｅｃＡ遺伝子の保有推定デバイスおよびｍｅｃＡ遺伝子の保有推定方法ということもできる。

以下、本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳ検査方法について、図面を参照して詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明に限定されない。なお、以下の図１Ａ～Ｆおよび図２～４において、同一部分には、同一符号を付し、その説明を省略する場合がある。また、図面においては、説明の便宜上、各部の構造は適宜簡略化して示す場合があり、各部の寸法比等は、実際とは異なり、模式的に示す場合がある。

（実施形態１）
本実施形態は、ＭＲＳ検査デバイスの一例である。図１に、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの構成の一例を示す。図１Ａは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの構成の一例を示す斜視図であり、図１Ｂは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスにおける上基板の一例を示す下面図であり、図１Ｃは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの図１ＢにおけるＩ－Ｉ方向からみた断面図であり、図１Ｄは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの図１ＢにおけるII－II方向からみた断面図であり、図１Ｅは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの図１ＢにおけるIII－III方向からみた断面図であり、図１Ｆは、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスの図１Ｂにおける二点鎖線で囲った部分の拡大図である。図１Ａ～Ｆに示すように、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、上基板２ａと下基板２ｂとからなる基板２を含む。上基板２ａは、複数の貫通孔１０、１１と、下表面における凹部１３、１４、１５とを含む凹部１２を有し、これらは、上基板２ａと、下基板２ｂとの積層により、それぞれ、第１の開口部１０、複数の第２の開口部１１、培養部１３、ネック部１４、および狭窄部１５を含む流路１２を形成している。第１の開口部１０および複数の第２の開口部１１は、下基板２ｂとの積層面側（以下、「下方向」ともいう）で、流路１２と連通している。流路１２は、第１の開口部１０側から第２の開口部１１側に向かって、狭窄部１５、ネック部１４、および培養部１３を含む。また、各流路１２は、第１の開口部１０と、いずれか１つの第２の開口部１１とを連通している。このため、各流路１２は、例えば、その第１の開口部１０側で互いに連通しているということもできる。培養部１３は、第２の開口部１１側において、第１の開口部１０側から第２の開口部１１側に向かって、観察導入部１３１、観察部１３２および観察導出部１３３を含む。観察導入部１３１は、第１の開口部１０側から観察部１３２側に向かって狭まるテーパ状である。観察部１３２は、隣接する培養部１３より内寸が狭くなるように形成されている。各流路１２の観察部１３２は、その幅（長手方向Ｙおよび厚み方向Ｚに対して垂直方向Ｘの距離）および長さ（長手方向Ｙの距離）が略同一である。各流路１２の観察部１３２は、略平行となるように配置されている。観察導出部１３３は、第２の開口部１１側において、観察部１３２側から第２の開口部１１側に向かって広がる逆テーパ状に形成されている。ネック部１４は、第１の開口部１０側に隣接する流路１２よりも内寸（例えば、幅）が狭く形成されている。また、ネック部１４は、第１の開口部１０側から培養部１３に向かって、ネック導入部１４１、ネック最狭部１４２、およびネック拡大部１４３を含む。ネック最狭部１４２は、ネック導入部１４１およびネック拡大部１４３と連接している、すなわち、ネック導入部１４１、ネック最狭部１４２およびネック拡大部１４３は、連続的に配置されている。ネック導入部１４１は、第１の開口部１０側から培養部１３側に向かって狭まるテーパ状である。ネック拡大部１４３は、培養部１３に臨む対向面であり、前記対向面は、流路１２の延在方向（Ｙ方向）に略直交して内側へのびる面である。狭窄部１５は、第１の開口部１０側からネック部１４側に向かって、狭窄導入部１５１、狭窄最狭部１５２および狭窄拡大部１５３を含む。狭窄最狭部１５２は、狭窄導入部１５１および狭窄拡大部１５３と連接している、すなわち、狭窄導入部１５１、狭窄最狭部１５２および狭窄拡大部１５３は、連続的に配置されている。狭窄導入部１５１は、第１の開口部１０側からネック部１４側に向かって狭まるテーパ状である。狭窄拡大部１５３は、狭窄最狭部１５２からネック部１４に向かって広がる逆テーパ状である。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、流路１２は、基板２に設けられているが、他の基材に設けられてもよい。また、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、２枚の基板を積層することで形成されているが、１枚の基板で形成されてもよいし、２枚以上の基板で形成されてもよい。また、ＭＲＳ検査デバイス１が２枚の基板から構成される場合、上基板２ａが、複数の貫通孔１０および１１を有し、複数の貫通孔１０および１１を除き、上基板２ａの下表面が平らであり、下基板２ｂの上表面が、培養部１３、ネック部１４、および狭窄部１５を含む流路１２となる凹部を有してもよい。この場合、上基板２ａと下基板２ｂとを積層することにより、上基板２ａの複数の貫通孔１０および１１により、第１の開口部１０および第２の開口部１１が形成され、下基板２ｂの凹部と上基板２ａの下表面とにより、培養部１３、ネック部１４、および狭窄部１５を含む流路１２が形成される。

上基板２ａおよび下基板２ｂの形成材料は、特に制限されず、例えば、顕微鏡等により観察可能であることから、透明基材が好ましい。前記透明基材の原料は、特に制限されず、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のポリマー（シリコーンゴム）、ガラス等があげられる。検査対象のＭＲＳが好気性の場合、前記基板は、例えば、通気性基板が好ましい。上基板２ａは、例えば、ＰＤＭＳで形成されており、下基板２ｂは、例えば、ガラスで形成されている。

第１の開口部１０は、例えば、被検菌懸濁液を導入可能な開口であり、導入口ということもできる。また、第１の開口部１０および第２の開口部１１は、例えば、前記被検菌懸濁液をＭＲＳ検査デバイス１に導入するときに、流路１２内の空気を抜くことが可能な開口であることから、空気口ということもできる。第１の開口部１０および第２の開口部１１の形状は、特に制限されず、例えば、三角柱状、四角柱状等の多角柱状、真円柱状、楕円柱状等の円柱状、錐体状等があげられる。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、４つの流路１２を含むが、流路１２の数は、２つ以上であればよく、例えば、流路１２に配置する抗菌薬の数、抗菌薬の濃度の数、後述するコントロール流路の数に応じて、適宜設定できる。具体例として、流路１２の数は、例えば、２～２５つ、４つである。流路１２は、中空である。流路１２の大きさは、特に制限されず、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１に導入する被検菌懸濁液の量、後述する培養部１３、ネック部１４、および狭窄部１５の大きさに応じて、適宜設計できる。流路１２の断面形状は、特に制限されず、例えば、円、真円、楕円等の円形；半円形；三角形、四角形、正方形および長方形等の多角形等があげられる。

ＭＲＳ検査デバイス１には、前記抗菌薬が配置されている（図１において図示せず）前記抗菌薬は、各流路１２の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置されている。ＭＲＳ検査デバイス１において、前記抗菌薬の配置箇所は、特に限定されず、例えば、第１の開口部１０、第２の開口部１１、流路１２等があげられる。前記抗菌薬は、例えば、複数箇所に配置されてもよい。

ＭＲＳ検査デバイス１において、各流路１２が、それぞれ、前記抗菌薬を流路１２内へ配置可能な第３の開口部を含み、前記第３の開口部は、対応する各流路１２と連通されていてもよい。具体例として、ＭＲＳ検査デバイス１において、各流路１２は、培養部１３と連通する第３の開口部を含んでもよい。この場合、ＭＲＳ検査デバイス１において、例えば、前記第３の開口部の下方の流路内に前記抗菌薬を配置してもよい。さらに、前記第３の開口部を含む場合、前記第３の開口部は、ネック部１４と観察部１３２との間で、流路１２と連通するように設けることが好ましい。また、前記第３の開口部は、各流路１２に独立して（別個に）設けることが好ましい。

配置する抗菌薬の量は、特に制限されず、例えば、後述する被検菌懸濁液の量および推定臨床有効濃度（ブレイクポイント）等に応じて、適宜設定できる。各流路１２の抗菌薬の量は、例えば、予め規定した量の被検菌懸濁液をＭＲＳ検査デバイス１に導入したときに、所望の抗菌薬の濃度となるように設定できる。前記抗菌薬の量は、例えば、前記抗菌薬の耐性基準濃度に基づき設定してもよい。前記耐性基準濃度は、例えば、ＣＬＳＩ（Clinical & Laboratory Standards Institute）または日本化学療法学会が公表するガイドラインを参照できる。ＣＬＳＩのガイドラインは、例えば、ＣＬＳＩのホームページ（http://em100.edaptivedocs.info/Login.aspx）からCLSI M100 S27の規格を参照できる。前記抗菌薬は、例えば、第２の開口部１１または流路１２の第２の開口部１１端側に配置されることが好ましい。この場合、前記抗菌薬は、例えば、各流路１２において、培養部１３に配置される。このように配置することで、被検菌懸濁液をＭＲＳ検査デバイス１に導入した際に、培養部１３において、第２の開口部１１側から第１の開口部１０側に向かって前記抗菌薬の濃度勾配が形成されるため、培養部１３において、より第１開口部１０に近い箇所へと観察場所を移動させて検査することにより、異なる抗菌薬の濃度における検査対象のブドウ球菌の状態を観察できる。前記抗菌薬は、特に制限されず、例えば、オキサシリン（ＭＰＩＰＣ）、ベンジルペニシリン（ＰＣＧ）等のペニシリン系抗菌薬、セフォキシチン（ＣＦＸ）等のセファマイシン系抗菌薬、セファゾリン（ＣＥＺ）、セフチゾキシム（ＣＺＸ）等のセファロスポリン系抗菌薬、クリンダマイシン（ＣＬＤＭ）等のリンコマイシン系抗菌薬、バンコマイシン（ＶＣＭ）等のグリコペプチド系抗菌薬、アルベカシン（ＡＢＫ）等のアミノ配糖体系抗菌薬、リネゾリド（ＬＺＤ）等があげられる。前記抗菌薬は、例えば、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を併用してもよい。後者の場合、各抗菌薬の量が、例えば、各抗菌薬の耐性基準濃度に基づき設定されてもよい。ＭＲＳ検査デバイス１を用いてＭＲＳＡを検査する場合、前記抗菌薬は、オキサシリン（ＭＰＩＰＣ）およびセフォキシチン（ＣＦＸ）の少なくとも一方を含むことが好ましい。前記抗菌薬がＭＰＩＰＣおよびＣＦＸを含む場合、ＭＲＳ検査デバイス１において、異なる流路１２が、ＭＰＩＰＣおよびＣＦＸをそれぞれ単独で含むことが好ましい。

前記抗菌薬の配置方法は、特に制限されず、例えば、前記抗菌薬を含む抗菌薬液を流路１２の所望の部位、例えば、第２の開口部１１に供給し、乾燥することによって配置できる。また、第２の開口部１１から流路１２内に通液して、流路１２内に前記抗菌薬を配置してもよい。ＭＲＳ検査デバイス１に前記抗菌薬液を導入した後、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１を乾燥することが好ましい。

各流路１２は、前記抗菌薬が配置されていないコントロールの流路を含んでもよい。このようにコントロールの流路を含むことで、ＭＲＳ検査デバイス１は、例えば、前記抗菌薬の効果をより簡便に確認できるため、より簡便にＭＲＳの検査を実施できる。前記コントロールの流路の数は、特に制限されず、例えば、１つまたは２つ以上である。

各流路１２は、前記混合液における前記抗菌薬の濃度が、前記耐性基準濃度未満となるように、前記抗菌薬が配置されている流路（以下、「耐性基準濃度未満の流路」ともいう）を含んでもよい。また、各流路１２は、例えば、前記耐性基準濃度未満の流路と、前記混合液における前記抗菌薬の濃度が、前記耐性基準濃度以上の濃度、好ましくは、前記ブレイクポイントＭＩＣ以上となるように、前記抗菌薬が配置されている流路（以下、「耐性基準濃度以上の流路」ともいう）を含んでもよい。前述のように、ＣＡ－ＭＲＳＡ等のＣＡ－ＭＲＳは、薬剤耐性のレベルが低い傾向にある。このため、前記耐性基準濃度未満の流路を設けることで、ＭＲＳ検査デバイス１は、例えば、より高い検出感度でＣＡ－ＭＲＳＡ等の薬剤耐性レベルが低いＣＡ－ＭＲＳも検出できる。前記耐性基準濃度未満の流路において、前記混合液における前記抗菌薬の濃度（ＰＢ）は、前記耐性基準濃度未満であればよく、例えば、前記耐性基準濃度（Ｂ）を基準として、１／４×Ｂ≦ＰＢ＜Ｂであり、ＣＡ－ＭＲＳタイプを検出でき、かつ感受性の被検菌を耐性と誤判定する可能性を低減できることから、好ましくは、１／２×Ｂ≦ＰＢ＜Ｂ、より好ましくは、１／２×Ｂ＝ＰＢである。前記耐性基準濃度未満の流路の流路の数は、特に制限されず、例えば、１つまたは２つ以上である。前記耐性基準濃度未満の流路を含むＭＲＳ検査デバイス１によれば、ＣＡ－ＭＲＳを簡便に検出できるため、例えば、ＣＡ－ＭＲＳ検査デバイスということもできる。具体例として、CLSI M100 S27の規格を参照すると、前記抗菌薬がＭＰＩＰＣの場合、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記混合液における前記抗菌薬の濃度は、０．５～２μｇ／ｍＬ、好ましくは、１～２μｇ／ｍＬである。また、CLSI M100 S27の規格を参照すると、前記抗菌薬がＣＦＸの場合、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記混合液における前記抗菌薬の濃度は、１～４μｇ／ｍＬ、好ましくは、２～４μｇ／ｍＬである。

培養部１３は、流路１２において、前記抗菌薬と、前記被検菌懸濁液との混合液を培養する領域である。培養部１３は、第１の開口部１０と第２の開口部１１との間に配置されており、ネック部１４の第２の開口部１１側に配置されている。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、培養部１３は、観察導入部１３１および観察導出部１３３を含むが、観察導入部１３１および観察導出部１３３は、任意の構成であり、あってもよいし、なくてもよい。

観察導入部１３１は、観察部１３２の第１の開口部１０側に隣接する流路１２と観察部１３２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、観察導入部１３１は、第１の開口部１０側から観察部１３２側に向かって狭まるテーパ状であるが、その形状は、これに限定されず、観察部１３２の内寸および観察部１３２の第１の開口部１０側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。

観察部１３２は、例えば、前記混合液の培養後に、顕微鏡等により、前記混合液由来のブドウ球菌を観察する領域である。観察部１３２は、例えば、前記顕微鏡等による観察がより簡便になることから、各流路１２の観察部１３２の少なくとも一部が、１つの評価領域内に収まるように収束して配置されていることが好ましい。前記評価領域は、各流路１２の培養状況を観察するための各観察部１３２が、一視野で比較観察できるように配置した領域であって、例えば、図１Ｂにおいて破線で囲って示すように、各流路１２の観察部１３２を並列配置した領域である。この評価領域の各観察部１３２は、各流路１２において、それぞれの第１の開口部１０から観察部１３２までの流路内距離がおおよそ等しく、かつ各流路１２において、それぞれの第２の開口部１１から観察部１３２までの流路内距離がおおよそ等しいことが好ましい。前記１つの評価領域は、例えば、前記顕微鏡の一視野、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ等により１回で撮像できる領域等があげられる。各流路１２の観察部１３２の間隔、収束の程度等は、前記顕微鏡の倍率等に応じて適宜決定できる。また、各流路１２の観察部１３２は、前記顕微鏡による観察がさらに簡便になることから、略平行に配置されていることが好ましい。さらに、各流路１２における前記混合液の培養条件を均一化でき、ＭＲＳの検査のぶれを抑制できることから、各流路１２の観察部１３２の内寸（例えば、幅）および長さは、同じであることが好ましい。

観察導出部１３３は、観察部１３２の第２の開口部１１側に隣接する流路１２と観察部１３２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、観察導出部１３３は、第２の開口部１１側において、観察部１３２側から第２の開口部１１側に向かって広がる逆テーパ状であるが、その形状は、これに限定されず、観察部１３２の内寸および観察部１３２の第２の開口部１１側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、ネック部１４を含むが、ネック部１４は、任意の構成であり、あってもよいし、なくてもよい。ネック部１４は、第１の開口部１０側に隣接する流路１２の内寸より狭く形成された領域である。ネック部１４は、流路１２において、第１の開口部１０と培養部１３との間に配置されている。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、ネック部１４を含むことで、後述するように、例えば、毛細管現象により生じる前記混合液の第１の開口部１０側への移動を抑止することができる。このため、各流路１２内の混合液のコンタミネーションを抑止することができ、より正確にＭＲＳを検査できる。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、ネック部１４は、ネック導入部１４１、ネック最狭部１４２およびネック拡大部１４３を含むが、ネック導入部１４１、ネック最狭部１４２およびネック拡大部１４３は、任意の構成であり、あってもよいし、なくてもよい。

ネック導入部１４１は、ネック最狭部１４２の第１の開口部１０側に隣接する流路１２とネック最狭部１４２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、ネック導入部１４１は、第１の開口部１０側からネック最狭部１４２側に向かって狭まるテーパ状であるが、その形状は、これに限定されず、ネック最狭部１４２の内寸およびネック最狭部１４２の第１の開口部１０側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。ネック導入部１４１の他の例として、図２（ａ）に示すように、第１の開口部１０側の流路１２に臨む対向面とすることもできる。前記対向面は、例えば、流路１２の延在方向に略直交して内側へのびる面、または第１の開口部１０側の流路１２に向かって流路１２の内側へ延びる面があげられる。

ネック最狭部１４２は、ネック部１４において、最も内寸（例えば、幅）が狭い領域である。

ネック拡大部１４３は、ネック最狭部１４２の第２の開口部１１側に隣接する流路１２とネック最狭部１４２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、ネック拡大部１４３は、第２の開口部１１側において、培養部１３に臨む対向面であり、前記対向面は、流路１２の延在方向に略直交して内側へのびる面であるが、その形状は、これに限定されず、ネック最狭部１４２の内寸およびネック最狭部１４２の第２の開口部１１側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。ネック拡大部１４３の他の例として、図２（ｂ）に示すように、前記対向面は、例えば、培養部１３に向かって流路１２の内側へ延びる面があげられる。この場合、培養部１３の側面と前記対向面との角度θは、例えば、０＜θ＜９０°等があげられる。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、狭窄部１５を含むが、狭窄部１５は、任意の構成であり、あってもよいし、なくてもよい。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は狭窄部１５を含むことで、後述するように、例えば、毛細管現象により生じる前記混合液の第１の開口部１０側への移動をさらに効果的に抑止することができる。このため、各流路１２内の混合液のコンタミネーションをさらに効果的に抑止することができ、さらに正確にＭＲＳを検査できる。また、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、狭窄部１５は、狭窄導入部１５１、狭窄最狭部１５２および狭窄拡大部１５３を含むが、狭窄導入部１５１、狭窄最狭部１５２および狭窄拡大部１５３は、任意の構成であり、あってもよいし、なくてもよい。

狭窄導入部１５１は、狭窄最狭部１５２の第１の開口部１０側に隣接する流路１２と狭窄最狭部１５２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、狭窄導入部１５１は、第１の開口部１０側から狭窄最狭部１５２側に向かって狭まるテーパ状であるが、その形状は、これに限定されず、狭窄最狭部１５２の内寸および狭窄最狭部１５２の第１の開口部１０側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。

狭窄最狭部１５２は、狭窄部１５において、最も内寸（例えば、幅）が狭い領域である。

狭窄拡大部１５３は、狭窄最狭部１５２のネック部１４側に隣接する流路１２と狭窄最狭部１５２とを接続する領域である。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１において、狭窄拡大部１５３は、狭窄最狭部１５２側からネック部１４側に向かって広がる逆テーパ状であるが、その形状は、これに限定されず、狭窄最狭部１５２の内寸および狭窄最狭部１５２のネック部１４側の流路１２の内寸に応じて適宜設定できる。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１の各構成の大きさは、特に制限されない。ＭＲＳ検査デバイス１の大きさは、例えば、流路数や評価領域の大きさなどに応じて、適宜設定できる。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１においては、流路１２の内寸は、幅５００μｍ、高さ５０μｍ、狭窄部（観察部１３２）の内寸は、幅１００μｍ、高さ５０μｍとした。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、第１の開口部１０と、複数の第２の開口部１１と、第１の開口部１０といずれか１つの第２の開口部１１とを連通する複数の流路１２とを１セットの流路群とした場合、基板２上に１セットの流路群が設けられているが、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１の基板２上には、図３に示すように、複数セットの流路群が設けられてもよい。具体例として、基板２に設けられる前記流路群の数は、例えば、５セットである。前記流路群の数は、例えば、試験上の要求、培養機器、顕微鏡等の計測機器の大きさ、ハンドリングの容易さ等の事由に応じて適宜変更することができる。

つぎに、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１を用いたＭＲＳの検査方法について、図面を参照し、説明する。

本実施形態のＭＲＳの検査方法において、検査対象のＭＲＳは、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腐性ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）、その他コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（Coagulase-negative staphylococci、ＣＮＳ）等のＭＲＳがあげられる。

まず、ＭＲＳ検査デバイス１の培養部１３で、前記抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する（培養工程）。前記被検菌懸濁液は、特に制限されず、例えば、臨床検体、臨床検体等から分離培養したコロニーから調製した分離培養検体等があげられる。前記臨床検体を用いる場合、前記臨床検体は、例えば、コンタミネーションの可能性が低い検体が好ましく、また、十分なブドウ球菌の密度（濃度）が確保できる検体が好ましい。また、前記臨床検体を使用する場合、例えば、前記臨床検体からのブドウ球菌の回収と、培地への再懸濁を行うことが好ましい。前記培地は、例えば、検査対象のブドウ球菌に応じて適宜決定できる。前記臨床検体は、例えば、微量液体希釈法等の他のＭＲＳの検査方法によって、ＭＲＳでないと判定された臨床検体でもよい。前記被検菌懸濁液は、液体であることが好ましい。ＭＲＳ検査デバイス１に導入する被検菌懸濁液の量は、特に制限されず、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１の容積、特に培養部１３の容積に応じて適宜設定できる。前記被検菌懸濁液に含まれるブドウ球菌の濃度は、特に制限されず、例えば、その濁度（ＯＤ_６００）が、０．０６～０．０８、０．０７前後である。

前記培養工程において、前記混合液は、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１に、前記被検菌懸濁液を、第１の開口部１０から導入することにより調製できる。このため、本実施形態のＭＲＳの検査方法は、ＭＲＳ検査デバイス１に、前記被検菌懸濁液を、第１の開口部１０から導入する導入工程を含んでもよい。

具体例として、ＭＲＳ検査デバイス１への前記被検菌懸濁液の導入は、以下のように実施できる。図４（Ａ）に示すように、ＭＲＳ検査デバイス１の４本の流路１２には、第２の開口部１１（流路１２の第２の開口部１１端側）の下方向に、それぞれ、異なる抗菌薬１１１ａ～ｄが配置されている。まず、図４（Ｂ）に示すように、第１の開口部１０から４本の流路１２の内部に、例えば、マイクロピペッター等の分注手段を用いて、前記被検菌懸濁液（図中の斜線部）を導入する。すると、前記被検菌懸濁液は、例えば、毛細管現象により第２の開口部１１側に移動する。つぎに、図４（Ｃ）に示すように、第１の開口部１０から４本の流路１２の内部に空気を圧入し、先に導入した被検菌懸濁液を４本の流路１２における第２の開口部１１側に押し込む。そして、これにより、各流路１２の下流（第２の開口部１１）側に連通された第２の開口部１１内の一部が満たされるように、前記被検菌懸濁液を移動させる。このように、前記被検菌懸濁液の導入後に、前記空気を導入することで、前記被検菌懸濁液が流路１２毎に独立する。前記空気により、各流路１２の連通箇所を通じた各流路１２内の混合液の移動を阻止できるため、コンタミネーションを防止することができ、例えば、より正確にＭＲＳを検査できる。

そして、各流路１２において、前記被検菌懸濁液が、第２の開口部１１の下方向に配置された抗菌薬１１１ａ～ｄと接触することにより、各流路において、抗菌薬１１１ａ～ｄと、前記抗菌薬と、前記被検菌懸濁液との混合液が調製される。また、ＭＲＳ検査デバイス１にはネック部１４および狭窄部１５を含むため、図４（Ｄ）に示すように、前記混合液が、例えば、毛細管現象により第１の開口部１０側に移動した際も、ネック部１４および狭窄部１５により、前記混合液の移動が抑止される。このため、各流路１２内の混合液のコンタミネーションを抑制することができ、より正確にＭＲＳを検査できる。

前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、例えば、対象となるブドウ球菌の至適生育条件に応じて、適宜選択できる。培養温度は、特に制限されず、例えば、３０～３７℃であり、具体例として、例えば、３７℃である。培養時間は、特に制限されず、例えば、２～４時間、３時間である。培養時間は、これには制限されず、例えば、前記抗菌薬が非存在下での検査対象のブドウ球菌の増殖（コントロール）が、判定に十分なレベルに達した時点で終了してもよい。前記培養時の湿度は、例えば、９５～１００％、９７～１００％である。

つぎに、培養部１３の観察部１３２における前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する。観察部１３２において、前記ブドウ球菌を検出する位置は、特に制限されず、観察部１３２の任意の箇所とできるが、図１Ｂにおいて最も下の部分が望ましい。各流路１２の観察部１３２の少なくとも一部が、一評価領域内に収まるように配置されている場合、例えば、前記顕微鏡等により、前記評価領域内の観察部１３２を一度に観察でき、より簡便に検査できることから、前記評価領域の各流路１２の観察部１３２における前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌について、前記顕微鏡等により検出することが好ましい。前記ブドウ球菌の検出は、例えば、培養部１３の観察部１３２における、前記ブドウ球菌の数、形態および集落（コロニー）からなる群から選択された少なくとも１つ、より具体的には、前記ブドウ球菌の数の増減、形態変化、および集落形成（例えば、集落形成の有無）からなる群から選択された少なくとも１つを検出することにより実施できる。前記検出工程では、例えば、数の増減、形態変化、および集落形成のいずれか１つを検出してもよいし、いずれか２つを検出してもよいし、全部を検出してもよいが、例えば、大腸菌等の他の細菌と比較して大きさが小さいブドウ球菌について、薬剤による影響をより顕著に検出でき、かつ前記顕微鏡等により検出しやすいことから、好ましくは、集落形成（例えば、集落形成の有無）による検出である。前記形態変化は、例えば、伸長化（例えば、膨化・縮小）、スフェロプラスト化等があげられる。前記集落形成は、例えば、集落形成の有無、集落の大きさ、集落群の形態等があげられる。前記形態は例えば、前記ブドウ球菌の外観的な形でもよいし、前記ブドウ球菌の動きでもよい。また、前記ブドウ球菌が集落を形成するまたは集落が成長する場合、前記形態は、例えば、集落外観、集落同士の結合状態、集落の動き等でもよい。前記検出工程において、例えば、前記ブドウ球菌の粗密度合を観察してもよい。前記検出工程において、例えば、前記ブドウ球菌の数、形態、集落および／または粗密度合について、培養工程の前後における変化または経時的な変化を観察してもよい。つぎに、各流路１２の観察部１３２の検出結果を比較し、評価する。前記ブドウ球菌が前記抗菌薬に耐性を示す場合、例えば、前記培養を行うと、増殖によりブドウ球菌の数が増加する、すなわち集落を形成する、または集落が成長する。他方、前記ブドウ球菌が前記抗菌薬に感受性を示す場合、例えば、培養を行っても、前記ブドウ球菌の数が増加しない、すなわち、集落を形成せず、死滅により数が減少する、または形態が変化する等の徴候が見られる。また、一般的にメチシリン耐性のブドウ球菌は、他の抗菌薬、例えば、全てのβ－ラクタム薬に対しても耐性傾向を示すことが知られている。したがって、例えば、前記ブドウ球菌の数の増減、形態変化、および／または集落形成を観察することによって、前記ブドウ球菌がＭＲＳか否かを判定できる。また、例えば、前記ブドウ球菌の数の増減、形態変化、集落形成および／または粗密度合を観察することによって同様に、前記ブドウ球菌の各抗菌薬への感受性を判定することもできる。このため、本実施形態のＭＲＳの検査方法によれば、前記ブドウ球菌（例えば、ＭＲＳ）に対して効果的な抗菌薬をスクリーニングできる。したがって、本実施形態のＭＲＳの検査方法は、ブドウ球菌（例えば、ＭＲＳ）の抗菌薬感受性の検査方法ということもできる。

前記顕微鏡の種類は、特に制限されず、光学顕微鏡等があげられる。前記光学顕微鏡は、例えば、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡等があげられ、数および形態の検出が容易であることから、好ましくは、前記位相差顕微鏡である。前記顕微鏡は、例えば、小型化顕微鏡が好ましい。前記顕微鏡は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）を備えることが好ましい。前記顕微鏡は、例えば、ＣＣＤを備えるカメラを有してもよい。本実施形態のＭＲＳの検査方法は、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１と前記顕微鏡とを使用することにより、例えば、高額な機器を使用する必要がなく、また、機器によって場所をとることも回避できる。このため、例えば、容易に既存の検査室および研究室に導入可能であり、非常に容易な実施が可能になる。また、前記顕微鏡による検出は、例えば、前記顕微鏡から出力した画像による検出の意味も含む。前記顕微鏡は、例えば、その視野における画像を得るために、出力手段に連結していることが好ましい。前記出力手段は、例えば、モニタ、プリンタ等があげられる。また、本実施形態のＭＲＳの検査方法は、例えば、前記顕微鏡に代えて、電子スチルカメラ、ビデオカメラ等の撮像手段による観察、これらから得た電子データを電子処理した画像による観察、評価をしてもよい。

本実施形態のＭＲＳの検査方法は、さらに、前記培養工程後に加え、前記培養工程前に前記検出工程を実施してもよい（前検出工程）。この場合、ＭＲＳ検査デバイス１に前記被検菌懸濁液を導入後に、前記前検出工程を実施することが好ましい。これによって、例えば、培養前の数と培養後の数、培養前の形態と培養後の形態、培養前の集落の数と培養後の集落の数とを比較できるため、例えば、より簡便にＭＲＳを検査できる。

本実施形態の検査方法は、例えば、ＭＲＳ検査用デバイス１が前記耐性基準濃度未満の流路を含む場合、前記耐性基準濃度未満の流路の培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌が市中感染型ＭＲＳ（ＣＡ－ＭＲＳ）タイプであるかを判定（推定）する判定工程（推定工程）を含むことが好ましい。この場合、例えば、前記検出工程では、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する。前記検出は、例えば、集落（例えば、集落形成の有無）の検出である。つぎに、前記判定工程では、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が検出された場合、前記被検菌は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳタイプであると判定する。また、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が検出されない場合、前記被検菌は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳタイプでない、例えば、感受性であると判定できる。各流路１２がコントロールの流路を含む場合、前記耐性基準濃度未満の流路において、例えば、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が、コントロールの流路に比べると明らかに抑制されているように見えながらも集落形成が検出された場合、前記被検菌は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳタイプであると判定する。また、各流路１２がコントロールの流路を含む場合、前記耐性基準濃度未満の流路において、コントロールの流路とほぼ同等の前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の増殖が検出された場合、前記被検菌は、例えば、Ｈ－ＭＲＳタイプと判定する。前記ブドウ球菌の検出は、例えば、集落（例えば、集落形成の有無）の検出であることが好ましい。なお、前記判定工程が推定工程である場合、前記判定工程は、例えば、前記被検菌がＣＡ－ＭＲＳタイプであるかを推定する。ＭＲＳ検査用デバイス１が前記耐性基準濃度以上の流路および前記耐性基準濃度未満の流路を含む場合、両流路の培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌がＣＡ－ＭＲＳタイプであるかを判定（推定）する判定工程（推定工程）を含むことが好ましい。この場合、例えば、前記検出工程では、両流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する。つぎに、前記判定工程では、前記耐性基準濃度未満の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が検出され、前記耐性基準濃度以上の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が検出されない場合、前記被検菌は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳタイプであると判定する。さらに、前記耐性基準濃度以上の流路において、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌が検出される場合、前記被検菌は、例えば、ＭＲＳであると判定してもよい。本実施形態の検査方法は、例えば、前記判定工程を含むことにより、前記耐性基準濃度未満の流路におけるブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌がＣＡ－ＭＲＳタイプか否かを簡便に判定できる。また、前記判定工程を含む場合、本実施形態の検査方法は、ＣＡ－ＭＲＳタイプかを判定できるため、例えば、ＣＡ－ＭＲＳの判定方法ということもできる。具体例として、前記抗菌薬がＭＰＩＰＣであり、ＭＲＳ検査用デバイス１がＭＰＩＰＣ濃度０、２、４、または８μｇ／ｍＬの流路を含む場合、例えば、以下のように判定できる。なお、ＭＰＩＰＣ濃度２μｇ／ｍＬの流路が、前記耐性基準濃度未満の流路であるとして説明するが、ＭＰＩＰＣおよびその他抗菌薬の耐性基準濃度は、これに限定されない。まず、ＭＰＩＰＣ濃度０、２、４、または８μｇ／ｍＬの流路の培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する。つぎに、前記検出結果に基づき、ＭＲＳか否かを判定する。具体的には、２μｇ／ｍＬの検出結果において耐性と判定された場合、前記被検菌は、例えば、ＭＲＳであると判定する。また、２μｇ／ｍＬの流路の検出結果において、集落形成がみられ耐性と判定されたものの、コントロールの流路（ＭＰＩＰＣ濃度０μｇ／ｍＬの流路）の発育に比べて明らかな増殖抑制がみられた場合、前記被検菌は、例えば、ＣＡ－ＭＲＳＡタイプと判定（推定）する。本実施形態の検査方法は、例えば、前記判定工程を含むことにより、前記耐性基準濃度未満の流路におけるブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌がＣＡ－ＭＲＳ（タイプ）か否かを簡便に判定（推定）できる。また、前記判定工程を含む場合、本実施形態の検査方法は、ＣＡ－ＭＲＳかを判定できるため、例えば、ＣＡ－ＭＲＳの判定方法ということもできる。

本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１の複数の流路１２には、異なる種類の抗菌薬および異なる濃度の抗菌薬の少なくとも一方が配置されている。このため、本実施形態のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳの検査方法によれば、例えば、ＭＲＳ検査デバイス１の複数の流路１２に、被検菌懸濁液を導入し、複数の流路１２内で、前記抗菌薬および前記被検菌懸濁液との混合液を培養し、各流路１２における培養部１３を、例えば、顕微鏡等で観察することによって、ＭＲＳを簡便かつ迅速に確認できる。また、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、ネック部１４および狭窄部１５を含むため、例えば、毛細管現象により生じる前記混合液の第１の開口部１０側への移動を効果的に抑止することができる。このため、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１によれば、各流路１２内の混合液のコンタミネーションを抑止することができ、正確にＭＲＳを検査できる。さらに、本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１は、耐性か否かを個々の細胞の増殖の有無で判別することから、ＣＡ－ＭＲＳＡ等の耐性レベルが低いＣＡ－ＭＲＳも高い検出感度で簡易的に検査できる。本実施形態のＭＲＳ検査デバイス１によれば、例えば、同時にベンジルペニシリン（ＰＣＧ）やクリンダマイシンの感受性も検査することができ、治療薬の選択に有用な情報が、例えば、約３時間で取得できる。

つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。

［実施例１］
（１）検査デバイス
図３に示す検査デバイス１’を以下に示すようにして作製した。検査デバイス１’の上基板２ａは、ＰＤＭＳ製、下基板２ｂは、ガラス製とした。検査デバイス１’の大きさは、以下の通りとした。なお、検査デバイス１’は、１枚のガラス製の下基板２ｂ上に、図１に示す検査デバイス１の上基板２ａが、連接して５つ配置された形態である。検査デバイス１’における各流路群の寸法は、実施形態１の検査デバイス１の寸法とした。

（１－１）鋳型の作製
１） ４０ｍｍ×５０ｍｍのカバーガラス（Ｎｏ．５、厚み１ｍｍ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｄ．， Ｌｔｄ．，）、または、シリコンウェハー（３ｉｎｃｈ、Ｆｅｒｒｏｔｅｃ Ｃｏ．，）に、コーティング剤（商品名オムニコート、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を、４０００ｒｐｍ、１０秒でスピンコートし、１８０℃で１分焼成。
２） フォトレジスト（ＳＵ８－２５、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を、２０００ｒｐｍ、３０秒でスピンコート。膜厚は、１６～１７μｍ。
３） ６５℃、３分および９５℃、７分でプリベーク。
４） マスクアライナー（商品名、ＥＳ２０、Ｎａｎｏｍｅｒｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，）で、１１秒間、マイクロパターンを露光。
５） 露光後、６５℃、１分および９５℃、３分で、ベーク。
６） ＳＵ８－Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（商品名、マイクケム社）で、２分現像。
７） 固く焼き付けるため、１８０℃、３０分でハードベーク。
８） 後述するＰＤＭＳが剥がれやすいように、０．８４ｗｔ％のＣｙｔｏｐ８０９ＭＥ（商品名、Ａｓａｈｉ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）を、４０００ｒｐｍでスピンコートし、１８０℃で１時間処理。

（１－２）ＰＤＭＳ流路の成型
１） ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（商品名Ｓｉｌｐｏｔ １８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｏｒａｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）と重合触媒とを、重量比１０：１で混合し、３０分脱気。
２） モールドにディップし、１００℃、３０分で焼き固める。

（１－３）ガラス基板とＰＤＭＳの張り合わせ
１） 固めたＰＤＭＳ基材を剥がす。予めエタノールで洗浄したカバーガラス（Ｎｏ．１、厚み０．１２～０．１７ｍｍ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｄ．， Ｌｔｄ．，）とともに、前記ＰＤＭＳを、リアクティブイオンエッチング装置（商品名ＲＩＥ－１０ＮＲ、Ｓａｍｃｏ）に入れる。
２） 前記カバーガラスと前記ＰＤＭＳ基材を、酸素流量１００ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｂｉｃ／分（ｓｃｃｍ）、圧力５０Ｐａ、ＲＦ ｐｏｗｅｒ ３０Ｗの条件の酸素プラズマに、２０秒さらす。
３） 前記カバーガラスと前記ＰＤＭＳ基材とを、プラズマ処理した面で張り合わせ、ボンディングを行う。
４） 前記ボンディングした積層体に、パンチャー（商品名ＢＰ－１５Ｆ、Ｋａｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）で、第１の開口部１０および第２の開口部１１となる貫通孔をあける。

（２）抗菌薬の配置
前記抗菌薬としては、下記の５種類の抗菌薬を使用した。
・抗菌薬
ＭＰＩＰＣ
ＣＦＸ
ＣＥＺ
ＰＣＧ
ＣＬＤＭ

前記抗菌薬をＰＢＳに混合（溶解）し、抗菌薬液を調製した。そして、検査デバイス１’の５つの流路群が、それぞれ、下記条件Ｆ～Ｊを満たし、かつ各流路群における各流路１２が、それぞれ、下記条件Ｆ～Ｊの（ｉ）～（iv）を満たすように、前記抗菌薬液を、対応する第２の開口部１１から配置した。以下、下記条件Ｆ～Ｊの配置を行なった検査デバイス１’の流路群を、それぞれ、検査デバイスＦ～Ｊともいう。前記配置後、検査デバイス１’を室温で約１５分乾燥させた。なお、下記条件Ｆ～Ｊにおける濃度は、２．５μＬの被検菌懸濁液を検査デバイス１’の流路１２に導入したと仮定した場合の濃度である。下記条件ＦおよびＧの（ii）が、前記耐性基準濃度未満の流路であり、下記条件ＦならびにＧの（iii）および（iv）が、前記耐性基準濃度以上の流路である。
条件Ｆ：（ｉ）なし、（ii）MPIPC 2μg/mL、（iii）MPIPC 4μg/mL、（iv）MPIPC 8μg/mL
条件Ｇ：（ｉ）なし、（ii）CFX 4μg/mL、（iii）CFX 8μg/mL、（iv）CFX 16μg/mL
条件Ｈ：（ｉ）なし、（ii）CEZ 1μg/mL、（iii）CEZ 2μg/mL、（iv）CEZ 4μg/mL
条件Ｉ：（ｉ）なし、（ii）PCG 1μg/mL、（iii）PCG 2μg/mL、（iv）PCG 4μg/mL
条件Ｊ：（ｉ）なし、（ii）CLDM 0.5μg/mL、（iii）CLDM 1μg/m、（iv）CLDM 2μg/mL

（３）被検菌懸濁液の調製
被検菌懸濁液の調製には、ｍｅｃＡ遺伝子をＰＣＲにより検出する方法でＣＡ－ＭＲＳＡと判定された臨床分離のＣＡ－ＭＲＳＡ２１株を用いた。まず、各株について、ハート・インヒュージョン寒天培地を用いて、３７℃で一晩、前培養した。コロニーを、Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ培地（栄研化学社製）に懸濁し、ＯＤ_６００＝約０．０７（０．０６２～０．０７６）に調製した。

（４）培養
前記実施例１（３）で調製した各株の懸濁液を、それぞれ、図４に示す手順で、前記検査デバイスＦ～Ｊに導入した。各流路１２に導入された懸濁液は、約２．５μＬである。そして、シャーレに検査デバイス１’を入れ、さらに、密閉容器に前記シャーレを入れた。なお、前記シャーレおよび前記密閉容器には、それぞれ、水を含ませたキムワイプを入れた。前記密閉容器を３７℃のインキュベーターに入れ、検査デバイス１’を、３時間培養した。前記密閉容器および前記シャーレ内の相対湿度は、９７％であった。

（５）判定
前記密閉容器から検査デバイス１’を取り出し、位相差顕微鏡により、検査デバイスＦ～Ｊの観察部１３２について、コントロール（各条件の（ｉ）の流路）に対する集落形成を確認した。条件ＦおよびＧの結果を図５に示す。図５は、各流路の結果を示す写真であり、（Ａ）は、条件Ｆにおける各流路を示す写真であり、（Ｂ）は、条件Ｇにおける各流路を示す写真である。また、図５（Ａ）のＭＰＩＰＣ濃度２、４、または８μｇ／ｍＬ、または図５（Ｂ）のＣＦＸ濃度４、８、または１６μｇ／ｍＬにおいて、図中の円で囲った領域が、ブドウ球菌の集落が形成されている領域の代表例である。なお、図５に示すように、コントロールでは、多数の集落形成が観察されたため、集落形成がされている領域は円で囲って示していない。図５に示すように、条件ＦおよびＧにおいては、（ii）および（iii）において、集落が形成されており、被検菌がＭＰＩＰＣおよびＣＦＸに対して耐性であった。また、条件Ｈ～Ｊについても、同様にして耐性の有無を判定し、前記条件ＦおよびＧと同様の結果を得た。

そして、条件ＦおよびＪについて、以下の判定基準に基づき、ＣＡ－ＭＲＳＡであると判定した。
・ＣＡ－ＭＲＳＡの判定基準
検査デバイスＦにおいて、（ii）が耐性（Ｒ）であり、（ｉ）の発育に比べて明らかな増殖抑制がみられた場合
検査デバイスＧにおいて、（ii）が耐性（Ｒ）であり、（ｉ）の発育に比べて明らかな増殖抑制がみられた場合

また、比較例として、全菌株について、標準法ＣＬＳＩ基準に則った微量液体希釈法により、ＭＰＩＰＣ、ＣＦＸ、ＣＥＺ、ＰＣＧ、およびＣＬＤＭのＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定し、ＭＩＣに基づき、ＣＡ－ＭＲＳＡの判定を実施した。

この結果、微量液体培地希釈法では、ｍｅｃＡ遺伝子をＰＣＲにより検出する方法でＣＡ－ＭＲＳＡと判定されたＭＲＳＡのうち３８．１％について、ＣＡ－ＭＲＳＡと判定できた。これに対し、本発明のＭＲＳＡの検査デバイスを用いたＣＡ－ＭＲＳＡの検査方法では、全株について、ＣＡ－ＭＲＳＡであると判定できた。このため、本発明のＭＲＳＡの検査デバイスおよびＭＲＳＡの検査方法によれば、ＣＡ－ＭＲＳＡを高い検出感度で簡易的に検査できることが分かった。また、前述のように、前記被検菌懸濁液の調製に用いた各株は、ｍｅｃＡ遺伝子を有していることをＰＣＲにより確認している。このため、ＭＲＳを検出することにより、ｍｅｃＡ遺伝子を保有していることが推定できることがわかった。

以上のように、本発明のＭＲＳ検査デバイスおよびＭＲＳの検査方法によれば、例えば、前記ＭＲＳ検査デバイスの複数の流路に、被検菌懸濁液を導入し、前記複数の流路内で、前記抗菌薬および前記被検菌懸濁液との混合液を培養し、各流路における培養部の観察部を、例えば、顕微鏡等で観察することによって、ＭＲＳを簡便かつ迅速に確認できる。また、本発明によれば、例えば、耐性か否かを個々の細胞の増殖の有無で判別することから、ＣＡ－ＭＲＳＡ等の耐性レベルが低いＣＡ－ＭＲＳも高い検出感度で簡易的に検査できる。本発明によれば、例えば、同時にベンジルペニシリン（ＰＣＧ）やクリンダマイシンの感受性も検査することができ、治療薬の選択に有用な情報が、例えば、約３時間で取得できる。

このため、本発明は、例えば、臨床検査、環境試験等において、極めて有用である。特に、臨床検査においては、例えば、対象となる微生物について、適切な抗菌薬の選択が早期に可能となるため、救命率の向上、不要な薬剤使用量の減少等の効果が期待でき、長期的に見れば、薬剤耐性菌の増加を抑制できる可能性がある。

この出願は、２０１７年１月１９日に出願された日本出願特願２０１７－００７９８９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。

１、１’ ＭＲＳ検査デバイス、検査デバイス
２ 基板
２ａ 上基板
２ｂ 下基板
１０ 第１の開口部
１１ 第２の開口部
１１１ａ～ｄ 抗菌薬
１２ 流路
１３ 培養部
１３１ 観察導入部
１３２ 観察部
１３３ 観察導出部
１４ ネック部
１４１ ネック導入部
１４２ ネック最狭部
１４３ ネック拡大部
１５ 狭窄部
１５１ 狭窄導入部
１５２ 狭窄最狭部
１５３ 狭窄拡大部

Claims (11)

1. 第１の開口部、複数の第２の開口部、前記第１の開口部といずれか１つの第２の開口部とを連通する複数の流路、および抗菌薬を含み、
   前記各流路は、前記第１の開口部と前記第２の開口部との間において、前記抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養部を含み、
   前記第１の開口部と前記培養部との間にネック部を含み、
   前記培養部は、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の集落形成の有無、集落の大きさ、および／または集落の形態を検出可能に構成された観察部を含み、
   前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置され、
   前記ネック部は、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって、ネック導入部、ネック最挟部、およびネック拡大部を含み、
   前記ネック最挟部は、前記ネック導入部および前記ネック拡大部と連接して配置されており、
   前記ネック導入部は、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって狭まるテーパ状であることを特徴とする、メチシリン耐性ブドウ球菌属（ＭＲＳ）検査用マイクロデバイス。
2. 前記各流路の観察部の前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の集落は、光学顕微鏡により観察可能に構成される、請求項１に記載のＭＲＳ検査用マイクロデバイス。
3. 前記ネック拡大部は、前記培養部に臨む対向面を有し、前記対向面は、前記流路の延在方向に直交して内側へ延びる面、または前記培養部に向かって前記流路の内側へ延びる面である、請求項１または２に記載のＭＲＳ検査用マイクロデバイス。
4. 前記各流路の観察部の少なくとも一部が、１つの評価領域内に収まるように配置されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のＭＲＳ検査用マイクロデバイス。
5. 前記複数の流路は、前記混合液における前記抗菌薬の濃度が、耐性基準濃度未満となるように、前記抗菌薬が配置されている流路を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＭＲＳ検査用マイクロデバイス。
6. 前記複数の流路は、前記抗菌薬が配置されていないコントロールの流路を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＭＲＳ検査用マイクロデバイス。
7. ＭＲＳ検査用マイクロデバイスを用いたＭＲＳの検査方法であって、
   前記ＭＲＳ検査用マイクロデバイスは、第１の開口部、複数の第２の開口部、前記第１の開口部といずれか１つの第２の開口部とを連通する複数の流路、および抗菌薬を含み、
   前記各流路は、前記第１の開口部と前記第２の開口部との間において、前記抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養部を含み、
   前記培養部は、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌を検出する観察部を含み、
   前記抗菌薬は、前記各流路の混合液における、前記抗菌薬の種類および前記抗菌薬の濃度の少なくとも一方が異なるように、配置され、
   前記ＭＲＳ検査用マイクロデバイスの培養部で、抗菌薬と、被検菌懸濁液との混合液を培養する培養工程、
   前記培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の集落形成の有無、集落の大きさ、および／または集落の形態を検出し、各流路の検出結果を比較して評価する検出工程を含むことを特徴とする、ＭＲＳの検査方法。
8. 前記各流路の観察部の前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の集落は、光学顕微鏡により観察される、請求項７に記載のＭＲＳの検査方法。
9. 前記ＭＲＳ検査用マイクロデバイスは、前記第１の開口部と前記培養部との間にネック部を含み、
   前記ネック部は、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって、ネック導入部、ネック最挟部、およびネック拡大部を含み、
   前記ネック最挟部は、前記ネック導入部および前記ネック拡大部と連接して配置されており、
   前記ネック導入部は、前記第１の開口部側から前記培養部側に向かって狭まるテーパ状である、請求項７または８に記載のＭＲＳの検査方法。
10. 前記ネック拡大部は、前記培養部に臨む対向面を有し、前記対向面は、前記流路の延在方向に直交して内側へ延びる面、または前記培養部に向かって前記流路の内側へ延びる面である、請求項９に記載のＭＲＳの検査方法。
11. 前記複数の流路は、前記混合液における前記抗菌薬の濃度が、耐性基準濃度未満となるように、前記抗菌薬が配置されている流路を含み、
    前記耐性基準濃度未満となるように前記抗菌薬が配置されている流路の培養部の観察部における、前記被検菌懸濁液由来のブドウ球菌の検出結果に基づき、前記被検菌がＭＲＳであるかを判定する判定工程を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載のＭＲＳの検査方法。
    

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