JP2022086982A - デバイスの製造方法、デバイス及びキット - Google Patents
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Abstract
【課題】既知数の試薬が確実に反応場に固定され、常温で保存可能であり、且つ、リアルタイムPCR装置の性能を正しく評価できるデバイスの製造方法を提供する。【解決手段】少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む、デバイスの製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、デバイスの製造方法、デバイス及びキットに関する。
PCR、qPCR(定量PCR)は、核酸の定性および定量評価に使用されている。例えば、特定遺伝子の存在を調べることで品種識別や遺伝病の評価ができたり、ウイルスの存在有無を評価できる。これまで、結果を保証するための、装置の性能保証や測定系の品質管理は、装置のヒーティングブロックの温度測定やユーザーの管理に担われていた。
また、近年では、PCRは、遺伝子組み換え作物・食品(GMO)否定試験や再生医療に代表されるウイルス混入否定試験に利用されることもあり、結果に対する信頼性が求められ、測定系そのものが否定試験に耐えうる精度を有しているのか、維持しているのかを保証することが求められている。
例えば、特許文献1では、少なくとも1つのウェル内の核酸が特定コピー数で規定されてなるデバイスが記載されている。
例えば、特許文献1では、少なくとも1つのウェル内の核酸が特定コピー数で規定されてなるデバイスが記載されている。
しかしながら、従来のデバイスでは、既知数のDNAが溶液で提供されているため、DNAが劣化するといった有効期限が短いという課題がある。その他、輸送時など、溶液の移動に伴いDNAが反応場外に付着してしまい所望の性能を有しなくなってしまうことも考えられる。
この課題に対して、冷凍保存(-20℃以下の保存)及び冷凍輸送を利用することも考えられるが、冷凍状態を維持・管理する必要があるという課題が生じる。
本発明は、既知数の試薬が確実に反応場に固定され、常温で保存可能であり、且つ、リアルタイムPCR装置の性能を正しく評価できるデバイスの製造方法を提供する。
この課題に対して、冷凍保存(-20℃以下の保存)及び冷凍輸送を利用することも考えられるが、冷凍状態を維持・管理する必要があるという課題が生じる。
本発明は、既知数の試薬が確実に反応場に固定され、常温で保存可能であり、且つ、リアルタイムPCR装置の性能を正しく評価できるデバイスの製造方法を提供する。
本発明のデバイスの製造方法は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む。
本発明のデバイスの製造方法によれば、既知数の試薬が確実に反応場に固定され、常温で保存可能であり、且つ、リアルタイムPCR装置の性能を正しく評価できるデバイスの製造方法を提供することができる。
以下、本発明の一実施形態に係るデバイスの製造方法、デバイス及びキット(以下、それぞれ単に「本実施形態の製造方法」、「本実施形態のデバイス」及び「本実施形態のキット」と称する場合がある)について、必要に応じて特定の実施形態及び図面を参照して説明する。かかる実施形態及び図面は、本発明の理解を容易にするための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。すなわち、以下に説明する部材の形状、寸法、配置等については、本発明の趣旨を逸脱することなく、変更、改良され得るとともに、本発明にはその等価物が含まれる。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
また、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
<デバイスの製造方法>
本実施形態のデバイスの製造方法は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む。
本実施形態のデバイスの製造方法は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む。
本実施形態のデバイスの製造方法は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含むため、前記核酸が、確実に反応場に固定され、且つ、常温で保存可能となるデバイスを製造することができる。
実施例において後述するように、本実施形態のデバイスの製造方法によれば、ウェル内の反応場に核酸が確実に固定化されることにより、常温で保存可能であり、リアルタイムPCR装置を正しく評価できるデバイスが供給される。
リアルタイムPCR装置とは、PCRによる増幅を経時的(リアルタイム)に測定することで、増幅率に基づいて核酸を定量するものである。定量は蛍光色素を用いて行われ、主に、インターカレーション法とハイブリダイゼーション法が存在する。
インターカレーション法では、二本鎖DNAに特異的に挿入(インターカレート)して蛍光を発するインターカレーターの存在下で核酸の増幅反応を行う。インターカレーターとしては、SYBR Green I(CAS番号:163795-75-3)又はその誘導体が挙げられる。一方、ハイブリダイゼーション法ではTaqMan(登録商標)プローブを用いる方法が最も一般的であり、対象核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光物質及び消光物質を結合させたプローブが用いられる。
本実施形態のデバイスの製造方法で製造されたデバイスを用いるリアルタイムPCR装置の性能評価方法においては、まず、リアルタイムPCR装置を用いて、核酸の増幅反応を行う。続いて、増幅反応を評価する。増幅反応の評価は、Cq値の値に基づいて行うことが好ましい。これらの値は1種を単独で評価に用いてもよいし、2種以上を組み合わせて評価に用いてもよい。
Cq値とは、Ct値(Threshhold Cycle)と同義であり、一定の増幅産物量になるPCRサイクル数を意味する。Cq値が小さいことは核酸量が多いことを示し、Cq値が大きいことは核酸量が少ないことを示す。本実施形態の性能評価方法において、Cq値のばらつきとは、複数の反応空間内で同条件の増幅反応を行った場合に、各反応空間で求められたCq値同士のばらつきをいう。Cq値のばらつきが小さいことはリアルタイムPCR装置の性能が高いことを意味する。
本実施形態のデバイスの製造方法において、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されており、コピー数は1コピー以上200コピー以下が好ましい。本実施形態の製造方法においては、200以下のコピー数が固定されている反応場と、200コピーを超えるコピー数が固定されている反応場の双方が存在していてもよい。
実施例において後述するように、反応場に固定されているコピー数が200コピー以下、例えば180コピー以下、例えば170コピー以下、例えば160コピー以下、例えば150コピー以下、例えば140コピー以下、例えば130コピー以下、例えば120コピー以下、例えば110コピー以下、例えば100コピー以下、例えば90コピー以下、例えば80コピー以下、例えば70コピー以下、例えば60コピー以下、例えば50コピー以下、例えば40コピー以下、例えば30コピー以下、例えば20コピー以下、例えば10コピー以下、例えば5コピー以下、例えば1コピーであると、非特異増幅産物が増加する傾向にあるため、リアルタイムPCR装置の性能評価を高い精度で行うことができる。
(特定コピー数)
本明細書において、核酸が特定コピー数反応場に固定されているとは、1ウェルあたりの反応場に固定されている核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際にウェルの反応場に固定されている核酸の数が既知であるということができる。つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数(算出推定値)よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、1,000以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
本明細書において、核酸が特定コピー数反応場に固定されているとは、1ウェルあたりの反応場に固定されている核酸の数が一定以上の精度で特定されていることを意味する。すなわち、実際にウェルの反応場に固定されている核酸の数が既知であるということができる。つまり、本明細書における特定コピー数は、従来の系列希釈により得られる所定のコピー数(算出推定値)よりも、数としての精度、信頼性が高く、特に、1,000以下の低コピー数領域であってもポアソン分布によらない制御された値となる。
制御された値は、概ね、不確かさを表す変動係数CVが平均コピー数xに対し、CV<1/√x又はCV≦20%のどちらかの値の大きさの中に収まっていることが好ましい。
本実施形態の性能評価方法では、1ウェルあたりの反応場に固定されている核酸のコピー数が特定されていることにより、従来よりも正確にリアルタイムPCR装置の性能評価を行うことが可能となる。
ここで、核酸の「コピー数」と「分子数」が対応付けられる場合もある。具体的には、例えば、核酸の塩基配列をゲノム上の2箇所に導入したG1期の酵母菌の場合、酵母菌数=1なら核酸分子数(同一の染色体数)=1、核酸のコピー数=2となる。本明細書においては、核酸の特定コピー数を核酸の絶対数という場合がある。
核酸を含むウェルが複数存在する場合、各ウェル内に含まれる核酸のコピー数が同一であるとは、増幅反応を行うための試薬をウェルに充填する際に生じる、核酸の数のばらつきが許容範囲内であることを意味する。核酸の数のばらつきが許容範囲内にあるか否かについては、以下に示す不確かさの情報に基づいて判断することができる。
核酸の特定コピー数に関する情報としては、例えば、不確かさの情報、後述する担体の情報、核酸の情報等が挙げられる。
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」であるとISO/IEC Guide99:2007[国際計量計測用語-基本及び一般概念並びに関連用語(VIM)]に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。すなわち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器等に起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。不確かさは、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値であってもよい。
不確かさは、Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement(GUM:ISO/IEC Guide98-3)及びJapan Accreditation Board Note 10試験における測定の不確かさに関するガイドライン等に基づいて算出することができる。
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値等の統計を用いたタイプA評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報等から得られる不確かさの情報を用いたタイプB評価法の2つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定等の要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ(標準偏差)を算出する。続いて、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。
不確かさの情報としては、反応空間に充填される試薬の変動係数を用いてもよい。変動係数とは、例えば、核酸を反応空間に充填する際に生じる各反応空間に充填される核酸の数のばらつきの相対値を意味する。すなわち、変動係数とは、反応空間に充填した核酸の数の充填精度を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値xで除した値である。ここでは、標準偏差σを平均コピー数(平均充填コピー数)xで除した値を変動係数CVとすると、下記式1の関係式になる。
一般的に、核酸は分散液中でポアソン分布のランダムな分布状態を取っている。そのため、段階希釈法、すなわち、ポアソン分布におけるランダムな分布状態では、標準偏差σは、平均コピー数xと下記式2の関係式を満たすとみなすことができる。これより、核酸の分散液を段階希釈法により希釈した場合、標準偏差σと平均コピー数xとから平均コピー数xの変動係数CV(CV値)を、上記式1及び式2から導出された下記式3を用いて求めると、表1及び図27に示すようになる。ポアソン分布に基づくばらつきを持ったコピー数の変動係数のCV値は図27から求めることができる。
表1及び図27の結果から、例えば、反応空間に100コピー数の核酸を段階希釈法により充填する場合には、最終的に反応溶液中に充填される核酸のコピー数はその他の精度を無視しても、少なくとも10%の変動係数(CV値)を持つことがわかる。
核酸のコピー数は、変動係数のCV値と、核酸の平均特定コピー数xとが、次式、CV<1/√xを満たすことが好ましく、CV<1/2√xを満たすことがより好ましい。
不確かさの情報としては、核酸を含む反応空間が複数存在する場合、反応空間に含まれる核酸の特定コピー数に基づく、反応空間全体としての不確かさの情報を用いることが好ましい。
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、核酸を細胞に導入して当該細胞を反応空間に計数及び分注する場合には、細胞内の核酸の数(例えば、細胞の細胞周期等)、細胞を反応空間に配置する手段(インクジェット装置、インクジェット装置の動作のタイミングを制御する装置等の各部位の動作による結果を含む。例えば、細胞懸濁液を液滴化した時の液滴に含まれる細胞数等)、細胞が反応空間の適切な位置に配置された頻度(例えば、反応空間内に配置された細胞数等)、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより核酸が細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション(夾雑物の混入、以下、「コンタミ」という場合がある。)等が挙げられる。
核酸の情報としては、例えば、核酸の数に関する情報が挙げられる。核酸の数に関する情報としては、例えば、ウェルに含まれる核酸の数の不確かさの情報等が挙げられる。
本実施形態のデバイスの製造方法は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃、好ましくは10~45℃、より好ましくは、20~45℃、さらに好ましくは、10~40℃、特に好ましくは、20~40℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む。乾燥失活方法は、前記温度範囲で、酵素を失活させることができる方法あれば、特に制限はなく、大気圧(1atm)下での乾燥でも、減圧乾燥でもよいが、減圧乾燥が好ましい。
反応場としては、ウェル内の特定の反応空間であれば、特に制限はないが、ウェルの底面が好ましい。ウェルが密閉部材で密閉される場合は、密閉部材となる不溶性担体の反応場に接する面であってもよい。また、核酸は、反応場に直接固定されていてもよいが、核酸を不溶性担体に固定した後、核酸が固定された不溶性担体を反応場に添加することにより、間接的に核酸を反応場に固定してもよい。
不溶性担体の材質としては、反応液に不溶性であれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、環状オレフィン・コポリマー(COC)等が挙げられる。
本実施形態のデバイスの製造方法は、核中に核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、ウェル内の細胞から酵素により核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程と、を含み、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程において推定した核酸の数の確からしさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことがより好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
(細胞懸濁液生成工程)
細胞懸濁液生成工程は、核中に核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
細胞懸濁液生成工程は、核中に核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する工程である。溶剤とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。生成とは、作り出すことを意味する。
《細胞懸濁液》
細胞懸濁液は、核中に核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中に核酸を有する複数の細胞については、上述した通りである。
細胞懸濁液は、核中に核酸を有する複数の細胞及び溶剤を含み、添加剤を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。核中に核酸を有する複数の細胞については、上述した通りである。
《溶剤》
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris-EDTA緩衝液(TE)がより好ましい。
溶剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液又はこれらの混合液体等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Tris-EDTA緩衝液(TE)がより好ましい。
《添加剤》
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
添加剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。界面活性剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)がより好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル(Brijシリーズ等)、オクチルフェノールエトキシレート(Triton Xシリーズ、Igepal CAシリーズ、Nonidet Pシリーズ、Nikkol OPシリーズ等)、ポリソルベート類(Tween20等のTweenシリーズ等)、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、0.001質量%以上30質量%以下が好ましい。含有量が、0.001質量%以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、30質量%以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸のコピー数を厳密に制御することができる。
核酸としては、検査対象の核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ColE1 DNA等が挙げられる。核酸を添加すると、核酸が、ウェルの壁面等に付着することを防ぐことができる。
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミド等が挙げられる。
《その他の成分》
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、pH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
その他の成分としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、pH調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤等が挙げられる。
細胞を分散する方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式が好ましい。メディア方式では、解砕能力が強いため、細胞膜や細胞壁を破壊することや、メディアがコンタミとして混入することがある。
細胞のスクリーニング方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニング等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から核酸の数を推定することが好ましい。細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。核酸の数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数を求めることを意味する。
計数対象が細胞数ではなく核酸が何個入っているかであってもよい。通常は、細胞1個につき核酸が1コピー導入されたものを選択するか、又は、遺伝子組換えにより核酸を細胞に導入するため、核酸の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすため、細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞1個中に含まれる核酸の数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
確からしさとは、いくつかの事象の生じる可能性がある場合に、特定の1つの事象が起こる可能性の程度を事前に予測して、その事象の起こる確率を意味する。算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
図1は、DNA複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図1に示すように、ヒストグラム上でDNAの複製有無により2つのピークが現れるため、DNA複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から1細胞中に含まれる平均的な核酸の数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、上述したような複製が起きる前又は後の状態に揃えることによって、核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
推定する特定コピー数は、確からしさ(確率)を算出することが好ましい。確からしさ(確率)を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のDNA数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率等を用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
(液滴着弾工程)
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
液滴着弾工程は、細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる工程である。液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。着弾とは、液滴をウェルに到達させることを意味する。
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段(以下、「吐出ヘッド」とも称することがある)を好適に用いることができる。
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、インクジェット法におけるオンデマンド方式、コンティニュアス方式等が挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、ウェル間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本実施形態では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため、上記2つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式等が挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本実施形態の製造方法では、液滴を受けるためのプレートが対向して配置されており、プレート構成の自由度を上げるため電極の配置は無いことが好ましい。サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き(コゲーション)が懸念される。熱による影響は、含有物やプレートの用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式等が挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図2~4に示す。
図2は、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機13a、電磁弁112、液室11a、細胞懸濁液300a及びノズル111aを有する。電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、TechElan社のディスペンサ等を好適に用いることができる。
図3は、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子13b、液室11b、細胞懸濁液300b及びノズル111bを有する。ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Cytena社のシングルセルプリンター等を好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、プレートの生成のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子13bを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図4に示した構成等が挙げられる。図4は、図3における圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図4の吐出ヘッドは、圧電素子13c、液室11c、細胞懸濁液300c及びノズル111cを有する。
図4の吐出ヘッドでは、図示していない制御装置から圧電素子13cに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン12cを紙面上下方向に変形させることができる。
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式等が挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。更に、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名:セルソーターSH800Zを用いることができる。
図5(a)は、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図5(b)は、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図5(a)は、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧(VA、VB、VC)の強弱により、液滴を形成することができる。図5(b)は、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
本実施形態において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図6(a)~(c)は、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。
まず、図6(a)に示すように、圧電素子13cに電圧を印加することにより、メンブレン12cが急激に変形し、それにより、液室11c内に保持された細胞懸濁液とメンブレン12cとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。
次に、図6(b)に示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図6(c)に示すように、メンブレン12cが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン12cとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴310’が形成される。
本実施形態の製造方法では、ウェルが形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、ウェルに順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
プレートとしては、特に制限はなく、バイオ分野において一般的に用いられるウェルが形成されたものを用いることができる。プレートにおけるウェルの数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。
図7は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるための分注装置400の一例を示す概略図である。図7に示すように、液滴を着弾させるための分注装置400は、液滴形成装置401と、プレート700と、ステージ800と、制御装置900とを有している。
分注装置400において、プレート700は、移動可能に構成されたステージ800上に配置されている。プレート700には液滴形成装置401の吐出ヘッドから吐出された液滴310が着滴する複数のウェル710(凹部)が形成されている。制御装置900は、ステージ800を移動させ、液滴形成装置401の吐出ヘッドとそれぞれのウェル710との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置401の吐出ヘッドからそれぞれのウェル710中に順次、蛍光染色細胞350を含む液滴310を吐出することができる。
制御装置900は、例えば、CPU、ROM、RAM、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置900の各種機能は、ROM等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてCPUにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置900の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、制御装置900は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
吐出する液滴としては、ウェル内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴をウェル内に着弾させることが好ましい。複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。複数の水準としては、例えば、ウェル内に核酸を有する複数の細胞が所定の濃度勾配が挙げられる。複数の水準は、センサによって計数される値を用いて制御することができる。
プレートとしては、1穴マイクロチューブ、8連チューブ、96穴、384穴のウェルプレート等を用いることが好ましいが、ウェルが複数である場合には、これらのプレートにおけるウェルには同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数の細胞を入れることも可能である。また、細胞が含まれないウェルが存在していてもよい。
なお、ウェルを密閉部材となる不溶性担体で密閉する場合は、密閉部材となる不溶性担体の反応場に接する面、例えば、密閉部材の裏面に、液滴を吐出してもよい。また、核酸の反応場への固定が、不溶性担体に固定された核酸の反応場への添加である場合は、液滴を当該不溶性担体に吐出する。ウェルを密閉部材となる不溶性担体で密閉する場合は、上記工程において、ウェルの代わりに、密閉部材となる不溶性担体を用いてもよく、核酸を不溶性担体に固定し、当該不溶性担体を反応場に添加する場合は、上記工程において、ウェルの代わりに不溶性担体を用いる。
(細胞数計数工程)
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程は、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する工程である。センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的又は化学的性質、あるいはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。計数とは、数を数えることを意味する。
細胞数計数工程としては、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでいてもよい。
液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、液滴に含まれる細胞数の計数としては、液滴がプレートのウェルに確実に入ることが予測されるウェル開口部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を観測することが好ましい。
液滴中の細胞を観測する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的又は磁気的に検出方法等が挙げられる。
なお、ウェルを密閉部材となる不溶性担体で密閉する場合は、上記工程において、ウェルの代わりに、密閉部材となる不溶性担体を用いてもよく、また、核酸を不溶性担体に固定して、当該不溶性担体を反応場に添加する場合は、上記工程において、ウェルの代わりに不溶性担体を用いる。
《光学的に検出する方法》
図8、図12及び図13を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図8は、液滴形成装置401の一例を示す模式図である。図12及び図13は、液滴形成装置の他の一例(401A、401B)を示す模式図である。図8に示すように、液滴形成装置401は、吐出ヘッド(液滴吐出手段)10と、駆動手段20と、光源30と、受光素子60と、制御手段70とを有する。
図8、図12及び図13を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。図8は、液滴形成装置401の一例を示す模式図である。図12及び図13は、液滴形成装置の他の一例(401A、401B)を示す模式図である。図8に示すように、液滴形成装置401は、吐出ヘッド(液滴吐出手段)10と、駆動手段20と、光源30と、受光素子60と、制御手段70とを有する。
図8では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質(例えば、GFP(Green Fluorescent Protein))をコードする遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。光を照射するとは、光をあてることを意味する。
吐出ヘッド10は、液室11と、メンブレン12と、駆動素子13とを有しており、蛍光染色細胞350を懸濁した細胞懸濁液300を液滴として吐出することができる。
液室11は、蛍光染色細胞350を懸濁した細胞懸濁液300を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル111が形成されている。液室11は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞350としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子等が挙げられる。
メンブレン12は、液室11の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン12の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
駆動素子13は、メンブレン12の上面側に設けられている。駆動素子13の形状は、メンブレン12の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン12の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子13を設けることが好ましい。
駆動素子13に駆動手段20から駆動信号を供給することにより、メンブレン12を振動させることができる。メンブレン12の振動により、蛍光染色細胞350を含有する液滴310を、ノズル111から吐出させることができる。
駆動素子13として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段20から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン12を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛(PZT)を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
光源30は、飛翔中の液滴310に光Lを照射する。なお、飛翔中とは、液滴310が液滴吐出手段10から吐出されてから、着滴対象物に着滴するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴310は、光Lが照射される位置では略球状となっている。又、光Lのビーム形状は略円形状である。
ここで、液滴310の直径に対し、光Lのビーム直径が10倍~100倍程度であることが好ましい。これは、液滴310の位置ばらつきが存在する場合においても、光源30からの光Lを確実に液滴310に照射するためである。
ただし、液滴310の直径に対し、光Lのビーム直径が100倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴310に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Lを励起光として発する蛍光Lfの光量が低下し、受光素子60で検出し難くなるからである。
光源30から発せられる光Lはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Lがパルス光である場合のパルス幅は10μs以下が好ましく、1μs以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね0.1μJ以上が好ましく、1μJ以上がより好ましい。
受光素子60は、飛翔中の液滴310に蛍光染色細胞350が含有されていた場合に、蛍光染色細胞350が光Lを励起光として吸収して発する蛍光Lfを受光する。蛍光Lfは、蛍光染色細胞350から四方八方に発せられるため、受光素子60は蛍光Lfを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源30から出射される光Lが直接入射しない位置に受光素子60を配置することが好ましい。
受光素子60は、蛍光染色細胞350から発せられる蛍光Lfを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子60としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の1次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子60として、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)、ゲートCCD等の2次元素子を用いてもよい。
なお、光源30が発する光Lと比較して蛍光染色細胞350の発する蛍光Lfが弱いため、受光素子60の前段(受光面側)に光Lの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子60において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞350の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Lの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
また、前述のように、光源30から発せられる光Lはパルス光であることが好ましいが、光源30から発せられる光Lを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴310に照射されるタイミングで受光素子60が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子60に蛍光Lfを受光させることが好ましい。
制御手段70は、駆動手段20及び光源30を制御する機能を有している。また、制御手段70は、受光素子60が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴310に含有された蛍光染色細胞350の個数(ゼロである場合も含む)を計数する機能を有している。以下、図9~図11を参照し、制御手段70の動作を含む液滴形成装置401の動作について説明する。
図9は、図8の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図10は、図8の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図11は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
図9に示すように、制御手段70は、CPU71と、ROM72と、RAM73と、通信インターフェイス(通信I/F)74と、バスライン75とを有している。CPU71、ROM72、RAM73及びI/F74は、バスライン75を介して相互に接続されている。
CPU71は、制御手段70の各機能を制御する。記憶手段であるROM72は、CPU71が制御手段70の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるRAM73は、CPU71のワークエリア等として使用される。また、RAM73は、所定の情報を一時的に記憶することができる。I/F74は、液滴形成装置401を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置401は、I/F74を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
図10に示すように、制御手段70は、機能ブロックとして、吐出制御手段701と、光源制御手段702と、細胞数計数手段(細胞数検知手段)703とを有している。
図10及び図11を参照しながら、液滴形成装置401の細胞数計数について説明する。まず、ステップS11において、制御手段70の吐出制御手段701は、駆動手段20に吐出の指令を出す。吐出制御手段701から吐出の指令を受けた駆動手段20は、駆動素子13に駆動信号を供給してメンブレン12を振動させる。メンブレン12の振動により、蛍光染色細胞350を含有する液滴310が、ノズル111から吐出される。
次に、ステップS12において、制御手段70の光源制御手段702は、液滴310の吐出に同期して(駆動手段20から液滴吐出手段10に供給される駆動信号に同期して)光源30に点灯の指令を出す。これにより、光源30が点灯し、飛翔中の液滴310に光Lを照射する。
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段10による液滴310の吐出と同時に(駆動手段20が液滴吐出手段10に駆動信号を供給するのと同時に)発光することではなく、液滴310が飛翔して所定位置に達したときに液滴310に光Lが照射されるタイミングで、光源30が発光することを意味する。つまり、光源制御手段702は、液滴吐出手段10による液滴310の吐出(駆動手段20から液滴吐出手段10に供給される駆動信号)に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源30を制御する。
例えば、液滴吐出手段10に駆動信号を供給した際に吐出する液滴310の速度vを予め測定しておく。そして、測定した速度vに基づいて液滴310が吐出されてから所定位置まで到達する時間tを算出し、液滴吐出手段10に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源30が光を照射するタイミングをtだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源30からの光を確実に液滴310に照射することができる。
次に、ステップS13において、制御手段70の細胞数計数手段703は、受光素子60からの情報に基づいて、液滴310に含有された蛍光染色細胞350の個数(ゼロである場合も含む)を計数する。ここで、受光素子60からの情報とは、蛍光染色細胞350の輝度値(光量)や面積値である。
細胞数計数手段703は、例えば、受光素子60が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞350の個数を計数することができる。この場合には、受光素子60として1次元素子を用いても2次元素子を用いても構わない。
受光素子60として2次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段703は、受光素子60から得られた2次元画像に基づいて、蛍光染色細胞350の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段703は、画像処理により蛍光染色細胞350の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞350の個数を計数することができる。
なお、蛍光染色細胞350は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。染色細胞において、蛍光色素としては、上述したものを用いることができる。また、蛍光タンパク質としては、上述したものを用いることができる。
このように、液滴形成装置401では、蛍光染色細胞350を縣濁した細胞懸濁液300を保持する液滴吐出手段10に、駆動手段20から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞350を含有する液滴310を吐出させ、飛翔中の液滴310に光源30から光Lを照射する。そして、飛翔する液滴310に含有された蛍光染色細胞350が光Lを励起光として蛍光Lfを発し、蛍光Lfを受光素子60が受光する。更に、受光素子60からの情報に基づいて、細胞数計数手段703が、飛翔する液滴310に含有された蛍光染色細胞350の個数を計数(カウント)する。
つまり、液滴形成装置401では、飛翔する液滴310に含有された蛍光染色細胞350の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞350の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴310に含有された蛍光染色細胞350に光Lを照射して蛍光Lfを発光させて蛍光Lfを受光素子60で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞350の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞350の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
図12は、図8の液滴形成装置401の変形例を示す模式図である。図12に示すように、液滴形成装置401Aは、受光素子60の前段にミラー40を配置した点が、液滴形成装置401(図8参照)と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
このように、液滴形成装置401Aでは、受光素子60の前段にミラー40を配置したことにより、受光素子60のレイアウトの自由度を向上することができる。
例えば、ノズル111と着滴対象物を近づけた際に、図8のレイアウトでは着滴対象物と液滴形成装置401の光学系(特に受光素子60)との干渉が発生するおそれがあるが、図12のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
図12に示すように、受光素子60のレイアウトを変更することにより、液滴310が着滴する着滴対象物とノズル111との距離(ギャップ)を縮めることが可能となり、着滴位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
図13は、図8の液滴形成装置401の他の変形例を示す模式図である。図13に示すように、液滴形成装置401Bは、蛍光染色細胞350から発せられる蛍光Lf1を受光する受光素子60に加え、蛍光染色細胞350から発せられる蛍光Lf2を受光する受光素子61を設けた点が、液滴形成装置401(図8参照)と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
ここで、蛍光Lf1及びLf2は、蛍光染色細胞350から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子60及び61は、蛍光染色細胞350から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞350から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に3つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
受光素子が1つであると、飛翔する液滴310に複数個の蛍光染色細胞350が含まれる場合に、蛍光染色細胞350同士が重なることに起因して、細胞数計数手段703が液滴310に含有された蛍光染色細胞350の個数を誤計数する(カウントエラーが発生する)おそれがある。
図14(a)及び図14(b)は、飛翔する液滴に2個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図14(a)に示すように、蛍光染色細胞3501と3502とに重なりが発生する場合や、図14(b)に示すように、蛍光染色細胞3501と3502とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を2つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
前述のように、細胞数計数手段703は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
受光素子を2つ以上設置する場合,それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図15を参照して、より詳しく説明する。
図15は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Liと、実測される輝度値Leとの関係を例示する図である。図15に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Le=Liとなる。例えば、細胞1個の輝度値をLuとすると、細胞数/滴=1個の場合はLe=Luであり、細胞数/滴=n個の場合はLe=nLuである(n:自然数)。
しかし、実際には、nが2以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はLu≦Le≦nLu(図15の網掛部分)となる。そこで、細胞数/滴=n個の場合、例えば、閾値を(nLu-Lu/2)≦閾値<(nLu+Lu/2)と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより細胞数を決定づけてもよい。このように、液滴形成装置401Bでは、蛍光染色細胞350が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞350の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
図16は、図8の液滴形成装置401の他の変形例を示す模式図である。図16に示すように、液滴形成装置401Cは、液滴吐出手段10が液滴吐出手段10Cに置換された点が、液滴形成装置401(図8参照)と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
液滴吐出手段10Cは、液室11Cと、メンブレン12Cと、駆動素子13Cとを有している。液室11Cは、液室11C内を大気に開放する大気開放部115を上部に有しており、細胞懸濁液300中に混入した気泡を大気開放部115から排出可能に構成されている。
メンブレン12Cは、液室11Cの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン12Cの略中心には貫通孔であるノズル121が形成されており、液室11Cに保持された細胞懸濁液300はメンブレン12Cの振動によりノズル121から液滴310として吐出される。メンブレン12Cの振動の慣性により液滴310を形成するため、高表面張力(高粘度)の細胞懸濁液300でも吐出が可能である。メンブレン12Cの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
メンブレン12Cの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン12Cが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン12Cの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
特に、蛍光染色細胞350として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があるといわれており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック(金属酸化物)を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー(例えば、日油株式会社製、Lipidure)によってコーティングすることが可能である。
ノズル121は、メンブレン12Cの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル121の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞350がノズル121に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞350の大きさの2倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞350が例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に5μm~50μm程度であるため、ノズル121の径を、使用する細胞に合わせて10μm以上が好ましく、100μm以上がより好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル121の径は200μm以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段10Cにおいては、ノズル121の径は、典型的には10μm~200μmの範囲となる。
駆動素子13Cは、メンブレン12Cの下面側に形成されている。駆動素子13Cの形状は、メンブレン12Cの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン12Cの平面形状が円形である場合には、ノズル121の周囲に平面形状が円環状(リング状)の駆動素子13Cを形成することが好ましい。駆動素子13Cの駆動方式は、駆動素子13と同様とすることができる。
駆動手段20は、メンブレン12Cを振動させて液滴310を形成する吐出波形と、液滴310を形成しない範囲でメンブレン12Cを振動させる撹拌波形とを駆動素子13Cに選択的に(例えば、交互に)付与することができる。
例えば、吐出波形及び撹拌波形をいずれも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴310が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン12Cの振動状態(振動の程度)を制御することができる。
液滴吐出手段10Cでは、駆動素子13Cがメンブレン12Cの下面側に形成されているため、駆動素子13Cによりメンブレン12が振動すると、液室11Cの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
この時、蛍光染色細胞350の動きは下から上への運動となり、液室11C内で対流が発生して蛍光染色細胞350を含有する細胞懸濁液300の撹拌が起きる。液室11Cの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞350が液室11Cの内部に均一に分散する。
つまり、駆動手段20は、吐出波形を駆動素子13Cに加え、メンブレン12Cの振動状態を制御することにより、液室11Cに保持された細胞懸濁液300をノズル121から液滴310として吐出させることができる。又、駆動手段20は、撹拌波形を駆動素子13Cに加え、メンブレン12Cの振動状態を制御することにより、液室11Cに保持された細胞懸濁液300を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル121から液滴310は吐出されない。
このように、液滴310を形成していない間に細胞懸濁液300を撹拌することにより、蛍光染色細胞350がメンブレン12C上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞350を細胞懸濁液300中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル121の詰まり及び吐出する液滴310中の蛍光染色細胞350の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞350を含有する細胞懸濁液300を、長時間連続して安定的に液滴310として吐出することができる。
また、液滴形成装置401Cにおいて、液室11C内の細胞懸濁液300中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置401Cでは、液室11Cの上部に大気開放部115が設けられているため、細胞懸濁液300中に混入した気泡を、大気開放部115を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴310を形成することが可能となる。
即ち、ノズル121の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン12C上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン12C上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン12Cの振動によって上方に移動するが、液室11Cには大気開放部115が設けられているため、混入した気泡を大気開放部115から排出可能となる。そのため、液室11Cに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴310を形成することができる。
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン12Cを振動させ、積極的に気泡を液室11Cの上方に移動させてもよい。
《電気的又は磁気的に検出する方法》
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図17に示すように、液室11’から細胞懸濁液を液滴310’としてプレート700’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル200がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のDynabeads(商標登録)が利用可能である。
電気的又は磁気的に検出する方法としては、図17に示すように、液室11’から細胞懸濁液を液滴310’としてプレート700’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞計数のためのコイル200がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のDynabeads(商標登録)が利用可能である。
《吐出前に細胞を観測する処理》
吐出前に細胞を観測する処理としては、図18に示すマイクロ流路250中を通過してきた細胞350’をカウントする方法や、図19に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
吐出前に細胞を観測する処理としては、図18に示すマイクロ流路250中を通過してきた細胞350’をカウントする方法や、図19に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法等が挙げられる。
図18に示す方法は、セルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターSH800Zを用いることができる。図18では、マイクロ流路250中に光源260からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ265を用いて検出器255により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路250中に通過した細胞の数から所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。
また、図19に示す吐出ヘッド10’としては、Cytena社製のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図19では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ265’を介して、画像取得部255’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞350”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定のウェル中に着弾した細胞の数を推測することができる。図18に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図19は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
《着弾後の細胞をカウントする処理》
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェル又は不溶性担体を蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation and total RNA analysis, PLoS One, 6 (3), e17455, 2011等に記載されている。
着弾後の細胞をカウントする処理としては、プレートにおけるウェル又は不溶性担体を蛍光顕微鏡等により観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Moon S., et al., Drop-on-demand single cell isolation and total RNA analysis, PLoS One, 6 (3), e17455, 2011等に記載されている。
液滴の吐出前及び着弾後に細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があり、生成するプレートの種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することが最も好ましい。
吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前(及び吐出後)の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。
また、着弾後のプレート上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、プレートとして顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能なプレートとして、一般的に底面が透明かつ平坦なプレート、特に底面がガラス製となっているプレートが用いられるが、特殊なプレートとなってしまうため、一般的なウェルを使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個等多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。
そのため、液滴の吐出後、かつ液滴のウェル又は不溶性担体への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び細胞数計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
受光素子としては1又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に2次元アレイ状に受光素子が設けられたCCD(Charge Copuled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)、ゲートCCD等二次元センサを用いることも可能である。
1又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が1個又は0個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。
細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布にしたがうと考えられ、液滴中に細胞数が2個以上入る確率P(>2)は下記式4で表される。
P(>2)=1-(1+λ)×e-λ …式4
P(>2)=1-(1+λ)×e-λ …式4
図20は、確率P(>2)と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
二値的な検出で細胞計数を行う場合には、確率P(>2)が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率P(>2)が1%以下となるλ<0.15であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプ等の一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、LED(Light Emitting Diode)、レーザー等を用いることが可能である。ただし、特に1nL以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザー等一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
(細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程における推定する核酸の数の確からしさを算出する工程)
本工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
本工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。推定する核酸の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、まとめて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程及び細胞数計数工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。いいかえれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
(出力工程)
出力工程は、ウェル又は不溶性担体内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該ウェル又は不溶性担体に含まれる細胞数を意味する。
出力工程は、ウェル又は不溶性担体内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数として、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段にて計数された値を出力する工程である。計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、細胞数計数手段にて当該ウェル又は不溶性担体に含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機等の装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各ウェル又は不溶性担体の細胞数又は標的核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値を外部の記憶部に出力する。出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
(記録工程)
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。記録工程は、記録部において好適に実施することができる。記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む。
(核酸抽出工程)
核酸抽出工程は、ウェル又は不溶性担体内の細胞から酵素により核酸を抽出する工程である。抽出とは、細胞膜や細胞壁等を破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。酵素としては、細胞から核酸を抽出することができれば特に制限はないが、例えば、細胞が酵母である場合は、Zymolyase等が好ましい。
核酸抽出工程は、ウェル又は不溶性担体内の細胞から酵素により核酸を抽出する工程である。抽出とは、細胞膜や細胞壁等を破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。酵素としては、細胞から核酸を抽出することができれば特に制限はないが、例えば、細胞が酵母である場合は、Zymolyase等が好ましい。
細胞壁を保有している細胞に関しては、酵素のみでは十分にDNA抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、DNA抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザー等を併用してもよい。
(酵素失活工程)
酵素失活工程は、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素を失活させる工程である。本実施形態のデバイスの製造方法において、酵素の失活は、酵素を5~45℃、好ましくは10~45℃、より好ましくは、20~45℃、さらに好ましくは、10~40℃、特に好ましくは、20~40℃で乾燥させることにより行う。乾燥失活方法は、前記温度範囲で、酵素を失活させることができる方法あれば、特に制限はなく、大気圧(1atm)下での乾燥でも、減圧乾燥でもよいが、減圧乾燥が好ましい。酵素を前記範囲で乾燥させて失活させることにより、ウェルの反応場に、核酸を確実に固定することができ、且つ、反応場に固定された核酸を常温で保存しても、デバイスの精度を担保することができる。なお、保存は、シリカゲル等の乾燥剤と一緒に真空で保存することが好ましい。
酵素失活工程は、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素を失活させる工程である。本実施形態のデバイスの製造方法において、酵素の失活は、酵素を5~45℃、好ましくは10~45℃、より好ましくは、20~45℃、さらに好ましくは、10~40℃、特に好ましくは、20~40℃で乾燥させることにより行う。乾燥失活方法は、前記温度範囲で、酵素を失活させることができる方法あれば、特に制限はなく、大気圧(1atm)下での乾燥でも、減圧乾燥でもよいが、減圧乾燥が好ましい。酵素を前記範囲で乾燥させて失活させることにより、ウェルの反応場に、核酸を確実に固定することができ、且つ、反応場に固定された核酸を常温で保存しても、デバイスの精度を担保することができる。なお、保存は、シリカゲル等の乾燥剤と一緒に真空で保存することが好ましい。
(その他の工程)
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、追加の試薬を添加する工程等が挙げられる。
その他の工程は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、追加の試薬を添加する工程等が挙げられる。
追加の試薬としては、例えば、インターカレーター、プライマー、増幅試薬等が挙げられる。増幅試薬については上述したものと同様である。
[デバイス]
1実施形態において、本発明は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイスを提供する。
1実施形態において、本発明は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイスを提供する。
本実施形態のデバイスは、リアルタイムPCR装置の性能評価の用途に特に適している。具体的には、例えば、本実施形態のデバイスは、遺伝子検査装置としての定量PCR装置に適用することができる。
本実施形態のデバイスは、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されている。本実施形態のデバイスは、特定されたコピー数の核酸の他にも、増幅反応を可能とする追加の試薬を含んでいてもよい。
追加の試薬としては、例えば、プライマー、増幅試薬等が挙げられる。プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、鋳型DNAに特異的な18~30塩基の相補的塩基配列を持つ合成オリゴヌクレオチドであり、増幅対象領域を挟むようにフォワードプライマー(センスプライマー)とリバースプライマー(アンチセンスプライマー)の2か所(一対)設定される。
増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、例えば、酵素としてDNAポリメラーゼ、基質として4種の塩基(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)、Mg2+(終濃度約2mMの塩化マグネシウム)、最適pH(pH7.5~9.5)を保持するバッファー等が挙げられる。
ウェル内の核酸は、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されている。ウェル内の核酸は、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、核酸を前記反応場に確実固定することができ、且つ、核酸を常温で保存してもデバイスの精度を担保することができる。また、増幅反応を可能にする試薬(以下、「増幅試薬」とも称する)を添加すると、反応場に固定された核酸が、反応場から溶離し、特定数の核酸のPCR反応を、より正確に評価することが可能になる。
ウェルは、デバイスの使用直前に、固体乾燥状態の試薬をバッファーや水に溶解させることで、すぐに反応液として用いることができるよう、適正量の試薬を含んでいることが好ましい。
本実施形態のデバイスは、複数のウェルの全部に特定されたコピー数の核酸が反応場に固定されていてもよいし、複数のウェルの一部に特定されたコピー数の核酸が反応場に固定されていてもよい。後者の場合、残部のウェルは、例えば空であってもよいし、異なる組成の試薬を含んでいてもよい。特定されたコピー数については上述した通りである。
本実施形態のデバイスにおいて、ウェルの形態は特に限定されず、例えば、本実施形態のデバイスはウェルプレートの形態であってもよい。
本実施形態のデバイスにおいて、核酸の反応場への固定は、反応場に直接固定することであっても、特定されたコピー数の核酸が固定化された不溶性担体を反応場に添加することであってもよい。
特定されたコピー数の核酸が固定化された不溶性担体を反応場に添加することにより、反応場に、特定されたコピー数の核酸が固定された不溶性担体を、不溶性担体毎にウェルに添加することが可能となり、特定されたコピー数の核酸を反応させる反応場を選択することが可能になる。
不溶性担体の材質としては、反応液に不溶性であれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、環状オレフィン・コポリマー(COC)等が挙げられる。
(ウェル)
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、特定されたコピー数の核酸及びインターカレーター、並びに、存在する場合、追加の試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、U底、V底等の凹部、等が挙げられる。
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ウェルの形状としては、特定されたコピー数の核酸及びインターカレーター、並びに、存在する場合、追加の試薬を含むことができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、U底、V底等の凹部、等が挙げられる。
ウェルの数は複数であり、5以上が好ましく、50以上がより好ましい。ウェルの数が2以上であるマルチウェルプレートが好適に用いられる。マルチウェルプレートとしては、ウェル数が、例えば、24、48、96、384、1,536等であるウェルプレートが挙げられる。
ウェルの容積は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、一般的なリアルタイムPCR装置に用いられる試料量を考慮すると、10μL以上1,000μL以下が好ましい。
ウェルの材質は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
ウェルの色は、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光等であってよい。ウェルの濡れ性は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撥水性であってもよい。ウェルの濡れ性が、撥水性であると、ウェル内壁への試薬の吸着を低減化することができる。また、ウェルの濡れ性が撥水性であると、ウェル内の試薬を溶液状態で移動することが容易である。
ウェル内壁の撥水化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フッ素系樹脂被膜を形成する方法、フッ素プラズマ処理、エンボス加工等が挙げられる。特に、接触角が100°以上となる撥水化処理を施すことで、液体の取りこぼしによる試薬の減少、不確かさ、変動係数の増大を抑えることができる。
(基材)
本実施形態のデバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、8連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
本実施形態のデバイスは、ウェルが基材に設けられたプレート状のものが好ましいが、8連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。基材としては、その材質、形状、大きさ、構造等について特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックス等が挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
プラスチックスとしては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
基材の形状は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、プレート状等が挙げられる。基材の構造は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であってもよいし、複数層構造であってもよい。
(識別手段)
本実施形態のデバイスは、核酸の特定コピー数の情報を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ICチップ、バーコード、QRコード(登録商標)、Radio Frequency Identifier(以下、「RFID」とも称することがある)、色分け、印刷等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、核酸の特定コピー数の情報を識別可能な識別手段を有していてもよい。識別手段は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ICチップ、バーコード、QRコード(登録商標)、Radio Frequency Identifier(以下、「RFID」とも称することがある)、色分け、印刷等が挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
識別手段に記憶させる情報としては、核酸の特定コピー数の情報以外にも、例えば、分析結果(例えば、Cq値、Cq値のばらつき等)、ウェルに配置した核酸の数(例えば、細胞の数)、細胞の生死、複数のウェルのうちどのウェルに核酸が充填されているのか、核酸の種類、測定日時、測定者の氏名等が挙げられる。
識別手段に記憶された情報は、各種読取手段を用いて読み取ることができ、例えば、識別手段がバーコードであれば読取手段としてバーコードリーダーが用いられる。
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、ウェルに核酸を分注する際に核酸の個数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送等が挙げられる。
(密閉部材)
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
その他の部材は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、密閉部材等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、ウェルへの異物混入又は充填物の流出等を防ぐために、密閉部材を有することが好ましい。密閉部材としては、少なくとも1つのウェルを密閉可能であり、1つ1つのウェルを個別に密閉又は開封できるように、切り取り線により切り離し可能に構成してもよい。
密閉部材の形状としては、ウェル内壁径と一致するキャップ状、ウェル開口部を被覆するフィルム状等が挙げられる。
本実施形態のデバイスが密閉部材を有する場合、核酸を固定する反応場としては、ウェル内の特定の反応空間であれば、特に制限はないが、ウェルの底面であっても、密閉部材となる不溶性担体の反応場に接する面であってもよい。例えば、ウェル内壁径と一致するキャップのウェル内に接する面(裏面)等であってもよい。核酸を密閉部材となる不溶性担体の反応場に接する面に固定する場合は、核酸が反応する際に、不溶性担体の反応場に接する面に固定された核酸を不溶性担体から遊離させる必要がある。そのため、核酸を密閉部材となる不溶性担体に固定する場合は、密閉部材で密閉されたウェルを、転倒混和等をすることにより、不溶性担体に固定された核酸を遊離させる。
核酸を密閉部材となる不溶性担体の反応場に接する面に固定する場合は、核酸を固定した密閉部材で任意のウェルを密閉することができるため、核酸の可搬性があり、核酸を反応させる反応場を選択することできる。
密閉部材となる不溶性担体の材質としては、例えば、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂等が挙げられる。密閉部材としては、全てのウェルを一度に密閉可能なフィルム状であることが好ましい。また、使用者の誤使用を低減化できるように再開封が必要なウェルと不必要なウェルとの接着強度が異なるように構成されていてもよい。
本実施形態のデバイスは、一のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数と、他のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数とが全て同一であってもよいし、互いに異なる2以上であってもよい。前者の場合、具体的なコピー数としては、例えば、全てのウェルのコピー数が1コピーの場合、5コピーの場合、10コピーの場合、20コピーの場合、40コピーの場合、80コピーの場合、160コピーの場合、200コピーの場合等が挙げられる。後者の場合、具体的なコピー数としては、例えば、1、5、20、40、80、160、200の場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の場合、1、3、5、7、9の場合、2、4、6、8、10の場合等が挙げられる。また、ウェルの一部に核酸を含有させず、ネガティブコントロールとして用いてもよい。
一のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数と、他のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数とが全て同一であるデバイスは、ウェル間の増幅反応の評価結果を比較しやすい。このため、上述した、リアルタイムPCR装置の性能評価方法に好適に用いることができる。
また、本実施形態のデバイスは、一のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数が10N1であり、他のウェルの反応場に固定された核酸の特定コピー数が10N2であってもよい(ただし、N1及びN2は互いに連続した整数である)。具体的なコピー数としては、例えば、1、10、100、1,000の場合、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000の場合等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、反応場に固定された核酸の特定コピー数が異なる2以上のウェルのグループ(群)を有していてもよい。例えば、デバイスの基材が、複数のウェルを有するプレートである場合には、プレート上で各グループにより各グループ「領域」が形成される。なお、核酸の特定コピー数が異なる2以上のグループで形成される「領域」は、ウェル同士が隣接していてもよく、また、離れていてもよい。
これにより、例えば、本実施形態のデバイスを用いてリアルタイムPCRを行って得られた結果において、異なる位置の特定コピー数が同じウェルを比較し使用に適さないウェル(不適合ウェル)があった場合に、再度リアルタイムPCR装置の校正を行うか、実際のサンプルでは不適合ウェルにおけるサンプルを適用除外とするかの判断ができる。
(核酸)
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DNA、RNA、cDNA等が挙げられる。核酸は核酸断片であってもよいし、細胞の核中に組み込まれていてもよいが、細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。核酸としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DNA、RNA、cDNA等が挙げられる。核酸は核酸断片であってもよいし、細胞の核中に組み込まれていてもよいが、細胞の核中に組み込まれていることが好ましい。
核酸は、生物から得られる天然物であってもよいし、その加工物であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して製造されたものであってもよいし、化学的に合成された人工合成核酸であってもよい。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。人工合成核酸とすることにより、不純物が少なくなり、低分子化することが可能となるため、初期反応効率を向上させることができる。
人工合成核酸とは、天然に存在するDNA又はRNAと同様の構成成分(塩基、デオキシリボース、リン酸)からなる核酸を人工的に合成した核酸を意味する。人工合成核酸は、例えば、タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸であってもよいし、任意の塩基配列を有する核酸であってもよい。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの(例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ)、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させた人工核酸(例えば、PNA、BNA、LNA等)が挙げられる。
核酸の形態は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸、一本鎖核酸、部分的に二本鎖又は一本鎖である核酸等が挙げられ、環状又は直鎖状のプラスミドであってもよい。また、核酸は修飾又は変異を有していてもよい。
核酸は、塩基配列が明らかな特定の塩基配列を有することが好ましい。特定の塩基配列は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない非天然の塩基配列、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列、真菌細胞由来の塩基配列、細菌由来の塩基配列、ウイルス由来の塩基配列等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
非天然の塩基配列を用いる場合、塩基配列のGC含有率が30%以上70%以下であることが好ましく、GC含量が一定であることが好ましい。核酸の塩基長は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、20塩基対(又はmer)以上10,000塩基対(又はmer)以下の塩基長等が挙げられる。
核酸として感染症検査に用いられる塩基配列を用いる場合、その感染症特有の塩基配列を含んでいれば、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、公定法や通知法で指定されている塩基配列を含むことが好ましい。
核酸は、使用する細胞由来の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された核酸であってもよい。核酸の種類は、1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。核酸として、細胞の核中に遺伝子導入により組み込まれた核酸を使用する場合には、1細胞に特定コピー数(例えば、1コピー)の核酸が導入されていることを確認することが好ましい。特定コピー数の核酸が導入されていることの確認方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンス、PCR法、サザンブロット法等が挙げられる。
細胞の核中に核酸を導入する場合、遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が目的の場所に目的のコピー数導入できれば特に限定されず、例えば、相同組換え、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALEN、Zinc finger nuclease、Flip-in、Jump-in等が挙げられる。あるいは、プラスミド、人工染色体等の形態で細胞の核中に核酸を導入してもよい。例えば、細胞として酵母菌(酵母細胞)を用いる場合、これらの中でも効率の高さ及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。
(担体)
核酸は、担体に担持された状態で扱われることが好ましい。例えば、核酸が粒子形状の担体(担体粒子)に担持(より好ましくは内包)されている態様等が挙げられる。担体としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセル等が挙げられる。
核酸は、担体に担持された状態で扱われることが好ましい。例えば、核酸が粒子形状の担体(担体粒子)に担持(より好ましくは内包)されている態様等が挙げられる。担体としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、樹脂、リポソーム、マイクロカプセル等が挙げられる。
《細胞》
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位であり、核中の特定配列を核酸として用いることができる。核酸は、核中に本来存在する塩基配列であってもよいし、外部から導入されたものであってもよい。
細胞は、生物体を形成する構造的及び機能的単位であり、核中の特定配列を核酸として用いることができる。核酸は、核中に本来存在する塩基配列であってもよいし、外部から導入されたものであってもよい。
細胞としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞等が挙げられる。細胞は、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
真核細胞としては、特に限定されず、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、藻類、原生動物等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌細胞が好ましい。
動物細胞は接着性細胞であってもよいし、浮遊性細胞であってもよい。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞であってもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものであってもよく、分化した細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよい。
分化した細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、星細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞、類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞;繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞;気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞;乳腺細胞、ペリサイト;平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞;末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞;軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。
未分化の細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の全能性幹細胞;間葉系幹細胞等の多能性幹細胞;血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞等が挙げられる。
真菌細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、1倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞(娘細胞)が再び細胞分裂を行う細胞(母細胞)となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
酵母菌は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、G0/G1期に同調して同調培養され、G1期で固定されたものが好ましい。また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をG1期に制御するフェロモン(性ホルモン)の感受性が増加したBar-1欠損酵母が好ましい。酵母菌がBar-1欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、ウェル内に収容された細胞中の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
原核細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等の真正細菌、古細菌等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
細胞は、死細胞であることが好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。細胞は、光を受光したときに発光可能であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してウェル内に着弾させることができる。
細胞は、光を受光した時に発光可能であることが好ましい。受光とは、光を受けることを意味する。細胞の発光は、光学センサで検出する。光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状等を画像データとして取得する受動型センサを意味する。
光を受光したときに発光可能な細胞は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素で染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞等が挙げられる。細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜等が挙げられる。
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等が挙げられる。これらは1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、シアニン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン6G、ローダミンB、ローダミン123、Cy3がより好ましい。
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名:EosinY(和光純薬工業株式会社製)、商品名:エバンスブルー(和光純薬工業株式会社製)、商品名:トリパンブルー(和光純薬工業株式会社製)、商品名:ローダミン6G(和光純薬工業株式会社製)、商品名:ローダミンB(和光純薬工業株式会社製)、商品名:ローダミン123(和光純薬工業株式会社製)等が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、例えば、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGR等が挙げられる。これらは1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
蛍光標識抗体は、対象細胞に結合することができ、蛍光標識されていれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、FITC標識抗CD4抗体、PE標識抗CD8抗体等が挙げられる。これらは1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
細胞の体積平均粒径は、遊離状態において、30μm以下が好ましく、10μm以下がより好ましく、7μm以下が特に好ましい。体積平均粒径が、30μm以下であれば、インクジェット法やセルソーター等の液滴吐出手段に好適に用いることができる。
細胞の体積平均粒径は、例えば、次のような測定方法で測定することができる。細胞として酵母を用いた場合、作製した染色済み酵母分散液から10μL取り出してPMMA製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター(商品名:Countess Automated Cell Counter、invitrogen社製)を用いること等により体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
細胞懸濁液における細胞の密度は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができるが、5×104個/mL以上5×108個/mL以下が好ましく、5×104個/mL以上5×107個/mL以下がより好ましい。細胞密度が上記の範囲であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞密度は、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター(商品名:Countess Automated Cell Counter、invitrogen社製)等を用いて測定することができる。
《樹脂》
樹脂としては、核酸を担持することができれば、その材質、形状、大きさ、構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
樹脂としては、核酸を担持することができれば、その材質、形状、大きさ、構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
《リポソーム》
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームとは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体であり、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する閉鎖された脂質を含む小胞体を意味する。
リポソームは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相(内水相)を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームはシングルラメラ(単層ラメラ、ユニラメラ、二重層膜が一重)であっても、多層ラメラ(マルチラメラ、タマネギ状の構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている)であってもよい。
リポソームは、核酸を内包することができることが好ましく、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して核酸が内水相又は膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に核酸を封入する形態、膜自体に核酸を内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
リポソームの大きさ(平均粒子径)は、核酸を内包することができれば特に限定されない。また、形態は球状又はそれに近い形態が好ましい。
リポソームの脂質二重層を構成する成分(膜成分)は、脂質から選ばれる。脂質としては、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。具体的な脂質としては、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、それらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、1種を単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
《マイクロカプセル》
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルとは、壁材と中空構造とを有する微小な粒体を意味し、中空構造に核酸を内包することができる。マイクロカプセルは、特に限定されず、適宜目的に応じて、壁材、大きさ等を選択することができる。
マイクロカプセルの壁材としては、例えば、ポリウレタン樹脂、ポリ尿素、ポリ尿素-ポリウレタン樹脂、尿素-ホルムアルデヒド樹脂、メラミン-ホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンアミド、ポリカーボネート、ポリスルフィネート、エポキシリ、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、ゼラチン等が挙げられる。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
マイクロカプセルの大きさは、核酸を内包することができれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。マイクロカプセルの製造方法は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、in-situ法、界面重合法、コアセルベーション法等が挙げられる。
本実施形態のデバイスは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業及び医療産業等において幅広く使用することができ、例えば、リアルタイムPCR装置の性能評価、精度管理等に好適に用いることができる。また、感染症検査等において、公定法や通知法等に定められている方法に適用することができる。
図21(a)は、本実施形態のデバイスの一例を示す斜視図である。図21(b)は、図21(a)のb-b’線における矢視断面図である。
デバイス1は、基材2と、基材2に形成された複数のウェル3を有しており、ウェル3の反応場(例えば、底面)に特定コピー数の核酸4が固定化されている。図21(a)及び図21(b)の例では、ウェルの開口部が密閉部材5で覆われている。
また、例えば、各ウェル3の反応場に固定する核酸4の特定コピー数の情報、その他の情報を記憶するICチップ又はバーコード(識別手段6)が、密閉部材5と基材2との間で且つウェルの開口部以外の位置に配置されている。識別手段6がこの位置に配置されていることにより、例えば識別手段6の意図しない改変等を防止することができる。また、デバイス1が識別手段6を有することにより、識別手段6を有しない一般のウェルプレートとの区別が可能である。このため、デバイスの取り違えを防止することができる。
[リアルタイムPCR装置の性能評価用キット]
1実施形態において、本発明は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイス、を含む、リアルタイムPCR装置の性能評価用キットを提供する。
1実施形態において、本発明は、少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイス、を含む、リアルタイムPCR装置の性能評価用キットを提供する。
本実施形態のキットは、上述したリアルタイムPCR装置の性能評価の用途に特に適しており、上述したリアルタイムPCR装置の性能評価方法に好適に利用することができる。本実施形態のキットにおいて、ウェル、特定されたコピー数、核酸、デバイス、反応場、酵素、乾燥等については上述したものと同様である。
[リアルタイムPCR装置の性能評価装置及び性能評価プログラム]
1実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、核酸の増幅反応を行い、前記増幅反応の情報を取得する情報取得部と、情報取得部の情報に基づき、リアルタイムPCR装置の性能を評価する評価部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する、リアルタイムPCR装置の性能評価装置を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、核酸の増幅反応を行い、前記増幅反応の情報を取得する情報取得部と、情報取得部の情報に基づき、リアルタイムPCR装置の性能を評価する評価部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する、リアルタイムPCR装置の性能評価装置を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述したデバイスを用いて、核酸の増幅反応を行い、増幅反応の情報に基づいてリアルタイムPCR装置の性能を評価する処理をコンピュータに実行させる、リアルタイムPCR装置の性能評価プログラムを提供する。
本実施形態の性能評価装置における制御部等が行う制御は、上述したリアルタイムPCR装置の性能評価方法を実施することと同義であるので、本実施形態の性能評価装置の説明を通じてリアルタイムPCR装置の性能評価方法の詳細についても明らかにする。また、本実施形態の性能評価プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、リアルタイムPCR装置の性能評価装置が実現することから、本実施形態の性能評価装置の説明を通じて本実施形態の性能評価プログラムの詳細についても明らかにする。
(増幅反応情報取得工程及び情報取得部)
増幅反応を評価する工程は、上述したデバイスを用いた増幅反応の情報を取得する工程であり、情報取得部により実施される。増幅反応の情報は、上述したデバイスを用い、リアルタイムPCRを行うことにより求めることができる。
増幅反応を評価する工程は、上述したデバイスを用いた増幅反応の情報を取得する工程であり、情報取得部により実施される。増幅反応の情報は、上述したデバイスを用い、リアルタイムPCRを行うことにより求めることができる。
増幅反応の情報としては、Cq値、Cq値のばらつき等が挙げられる。これらの情報は1種を単独で評価に用いてもよいし、2種以上を組み合わせて評価に用いてもよい。Cq値のばらつきについては上述したものと同様である。Cq値のばらつきとしては、例えば標準偏差、CV値等が挙げられる。
(評価工程及び評価部)
評価工程は、増幅反応の情報に基づきリアルタイムPCR装置の性能を評価する工程であり、評価部により実施される。
評価工程は、増幅反応の情報に基づきリアルタイムPCR装置の性能を評価する工程であり、評価部により実施される。
例えば、定性的な評価では、上述したデバイスを用い、リアルタイムPCRを行ってCq値を測定し、平均Cq値を算出してもよい。各ウェルのCq値が平均Cq値の10%以内であれば「○」、各ウェルのCq値が平均Cq値の10%より大きい場合を「×」として、面内特性を評価することができる。
また、本実施形態のデバイスを用い、一定期間の計測を行うことにより、増幅反応の情報の経時変化を得ることができる。それによって、面内特性と同様に、例えば、各ウェルのCq値が平均Cq値の10%を超える場合は、検査装置の校正を行うか、その計測場所を使用しないという対応をとることができる。また、配置された特定コピー数が絶対値であることから、同じ特定コピー数を配置したデバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
定量的な評価では、本実施形態のデバイスを用い、一定期間の計測を行うことにより、増幅反応の情報の経時変化を得ることができる。それによって、面内特性と同様に、品質管理値から逸脱した数値が得られた場合は、検査装置の校正を行うか、その計測場所を使用しないという対応をとることができる。また、配置されたコピー数が絶対値であることから、同じコピー数を配置したデバイスを用いることにより、検査装置間の性能を比較することができる。
また、定量的な評価の場合には、例えば、Cq値そのものではなく、校正曲線及びPCR効率からCq値に対応したコピー数(コピー数又は濃度)を求めることができるため、コピー数(コピー数又は濃度)、又はコピー数(コピー数又は濃度)に換算したCV値、コピー数(コピー数又は濃度換算)の(Max-Min)/2平均値×100等の数値を用いて検査装置間の性能を評価してもよい。
(その他の工程及びその他の部)
その他の工程及びその他の部は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表示工程及び表示部等が挙げられる。
その他の工程及びその他の部は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表示工程及び表示部等が挙げられる。
本実施形態の性能評価プログラムによる処理は、性能評価装置を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。以下、性能評価装置のハードウェア構成及び機能構成について説明する。
(性能評価装置のハードウェア構成)
図22は、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。図22に示すように、性能評価装置100は、CPU(Central Processing Unit)101、主記憶装置102、補助記憶装置103、出力装置104、入力装置105、通信インターフェイス(通信I/F)106の各部を有する。これらの各部は、バス107を介してそれぞれ接続されている。
図22は、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。図22に示すように、性能評価装置100は、CPU(Central Processing Unit)101、主記憶装置102、補助記憶装置103、出力装置104、入力装置105、通信インターフェイス(通信I/F)106の各部を有する。これらの各部は、バス107を介してそれぞれ接続されている。
CPU101は、種々の制御や演算を行う処理装置である。CPU101は、主記憶装置102等が記憶するOS(Operating System)やプログラムを実行することにより、種々の機能を実現する。すなわち、CPU101は、リアルタイムPCR装置の性能評価プログラムを実行することにより、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100の制御部130として機能する。
また、CPU101は、検査装置の性能評価装置100全体の動作を制御する。なお、ここでは、性能評価装置100全体の動作を制御する装置をCPU101としたが、これに限ることなく、例えば、FPGA(Field Programmable Gate Array)等としてもよい。
検査装置の性能評価プログラムや各種データベースは、必ずしも主記憶装置102や、補助記憶装置103等に記憶されていなくともよい。インターネット、LAN(Local Area Network)、WAN(Wide Area Network)等を介して、検査装置の性能評価装置100に接続される他の情報処理装置等に検査装置の性能評価プログラムや各種データベースを記憶させてもよい。検査装置の性能評価装置100がこれら他の情報処理装置から検査装置の性能評価プログラムや各種データベースを取得して実行するようにしてもよい。
主記憶装置102は、各種プログラムを記憶し、各種プログラムを実行するために必要なデータ等を記憶する。主記憶装置102は、図示しない、ROM(Reed Only Memory)と、RAM(Random Access Memory)と、を有する。
ROMは、BIOS(Basic Input/Output System)等の各種プログラム等を記憶している。RAMは、ROMに記憶された各種プログラムがCPU101により実行される際に展開される作業範囲として機能する。RAMとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。RAMとしては、例えば、DRAM(Dynamic Random Access Memory)、SRAM(Static Random Access Memory)等が挙げられる。
補助記憶装置103としては、各種情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ等が挙げられる。また、補助記憶装置103は、例えば、CD(Compact Disc)ドライブ、DVD(Digital Versatile Disc)ドライブ、BD(Blu-ray(登録商標) Disc)ドライブ等の可搬記憶装置としてもよい。
出力装置104としては、ディスプレイやスピーカー等を用いることができる。ディスプレイは、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、液晶ディスプレイ、有機ELディスプレイが挙げられる。
入力装置105は、検査装置の性能評価装置100に対する各種要求を受け付けることができれば、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、キーボード、マウス、タッチパネル等が挙げられる。
通信インターフェイス(通信I/F)106は、特に限定されず、適宜公知のものを用いることができ、例えば、無線又は有線を用いた通信デバイス等が挙げられる。
以上のようなハードウェア構成によって、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100の処理機能を実現することができる。
(性能評価装置の機能構成)
図23は、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100の機能構成の一例を示す図である。図23に示すように、性能評価装置100は、入力部110、出力部120、制御部130、記憶部140を有する。
図23は、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100の機能構成の一例を示す図である。図23に示すように、性能評価装置100は、入力部110、出力部120、制御部130、記憶部140を有する。
制御部130は、情報取得部131と、評価部132とを有する。制御部130は、性能評価装置100全体を制御する。記憶部140は、情報データベース141、評価結果データベース142を有する。以下、「データベース」を「DB」という場合がある。情報取得部131は、記憶部140の情報DB141で記憶されているデータを用い、増幅反応の情報を取得する。情報DB141には、例えば、上述したように予め実験により得られたCq値等のデータが記憶されている。
なお、デバイスに紐付けられている情報が、情報DB141に記憶されていてもよい。DBへの入力は、性能評価装置100に接続される他の情報処理装置から行ってもよいし、作業者が行ってもよい。
評価部132は、増幅反応の情報に基づき、リアルタイムPCR装置の性能を評価する。リアルタイムPCR装置の性能を評価する具体的な手法は、上述した通りである。評価部132で求められた、リアルタイムPCR装置の性能評価結果は、記憶部140の評価結果DB142に記憶される。
続いて、本実施形態の性能評価プログラムの処理手順を示す。図24は、リアルタイムPCR装置の性能評価装置100の制御部130における性能評価プログラムの処理手順を示すフローチャートである。
ステップS110では、性能評価装置100の制御部130の情報取得部131は、記憶部140の情報DB141に記憶された増幅反応の情報データを取得し、処理をS111に移行する。
ステップS111では、性能評価装置100の制御部130の評価部132は、取得した情報に基づきリアルタイムPCR装置の性能を評価し、処理をS112に移行する。
ステップS112では、性能評価装置100の制御部130は、得られたリアルタイムPCR装置の性能評価結果を記憶部140の評価結果DB142へ保存し、本処理を終了する。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実験例1]
(デバイスの作製)
インクジェット方式により、ウェルの反応場(底面)に特定コピー数の核酸が固定化されたデバイスを製造した。
(デバイスの作製)
インクジェット方式により、ウェルの反応場(底面)に特定コピー数の核酸が固定化されたデバイスを製造した。
《遺伝子組換え酵母の作製》
出芽酵母w303-1a(商品名:ATCC4001408、ATCC社製)を1コピーの特定DNA配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。特定DNA配列は配列番号1とし、選択マーカーとしたURA3とタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞のBAR1領域を対象に相同組換えによって1コピーの特定DNA配列を酵母染色体に導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
出芽酵母w303-1a(商品名:ATCC4001408、ATCC社製)を1コピーの特定DNA配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。特定DNA配列は配列番号1とし、選択マーカーとしたURA3とタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞のBAR1領域を対象に相同組換えによって1コピーの特定DNA配列を酵母染色体に導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
《培養、及び細胞周期制御》
続いて、50g/L のYPD培地(商品名:YPD Medium、Clontech社製)で培養した遺伝子組換え酵母を90mL分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Thermofisher社製、以下、「DPBS」とも称することがある)を用いて500μg/mLとなるように調製したαファクター(Sigma-Aldrich社製、α1-Mating Factor acetate salt)を900μL添加し、バイオシェイカー(装置名:BR-23FH、タイテック株式会社製)を用いて、振盪速度:250rpm、温度:28℃にて2時間インキュベートし、酵母をG0/G1期に同調して酵母懸濁液を得た。同調細胞の細胞周期の確認は、SYTOX Green Nucleic Acid Stain(装置名:S7020、Thermofisher社製)を用いて染色し、フローサイトメーター(装置名:SH800、ソニー株式会社製)を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長488nmで、G0/G1期に同調していることを確認した。G1期の割合は97.1%、G2期の割合は2.9%であった。
続いて、50g/L のYPD培地(商品名:YPD Medium、Clontech社製)で培養した遺伝子組換え酵母を90mL分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Thermofisher社製、以下、「DPBS」とも称することがある)を用いて500μg/mLとなるように調製したαファクター(Sigma-Aldrich社製、α1-Mating Factor acetate salt)を900μL添加し、バイオシェイカー(装置名:BR-23FH、タイテック株式会社製)を用いて、振盪速度:250rpm、温度:28℃にて2時間インキュベートし、酵母をG0/G1期に同調して酵母懸濁液を得た。同調細胞の細胞周期の確認は、SYTOX Green Nucleic Acid Stain(装置名:S7020、Thermofisher社製)を用いて染色し、フローサイトメーター(装置名:SH800、ソニー株式会社製)を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長488nmで、G0/G1期に同調していることを確認した。G1期の割合は97.1%、G2期の割合は2.9%であった。
《固定》
続いて、同調確認済み酵母懸濁液を遠心管(ビオラモ、商品名:VIO-50R、アズワン株式会社製)に45mL移し、遠心分離機(装置名:CF16RN、株式会社日立製作所製)を用いて、回転速度:3,000rpmにて5分間遠心分離し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン(和光純薬工業株式会社製、062-01661)を4mL添加し、5分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを10mL添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
続いて、同調確認済み酵母懸濁液を遠心管(ビオラモ、商品名:VIO-50R、アズワン株式会社製)に45mL移し、遠心分離機(装置名:CF16RN、株式会社日立製作所製)を用いて、回転速度:3,000rpmにて5分間遠心分離し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン(和光純薬工業株式会社製、062-01661)を4mL添加し、5分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを10mL添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
《染色》
続いて、固定化済み酵母懸濁液を1.5mL遮光チューブ(ワトソン株式会社製、131-915BR)に500μL移し、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmにて5分間遠心し、上澄み液を除去し、1mM EDTA(TOCRIS社製、200-449-4)となるように調製したDPBS(1mM EDTA)を400μL添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。得られたペレットに1mg/mLに調製したエバンスブルー水溶液(和光純薬工業株式会社製、054-04061)を1mL添加し、ボルテックスを用いて5分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去し、DPBS(1mM EDTA)を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得た。
続いて、固定化済み酵母懸濁液を1.5mL遮光チューブ(ワトソン株式会社製、131-915BR)に500μL移し、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmにて5分間遠心し、上澄み液を除去し、1mM EDTA(TOCRIS社製、200-449-4)となるように調製したDPBS(1mM EDTA)を400μL添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。得られたペレットに1mg/mLに調製したエバンスブルー水溶液(和光純薬工業株式会社製、054-04061)を1mL添加し、ボルテックスを用いて5分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去し、DPBS(1mM EDTA)を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得た。
《分散》
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー(装置名:LUH150、ヤマト科学株式会社)を用いて、出力:30%,10秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmにて5分間遠心分離し、上澄み液を除去し、DPBSを1,000μL添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計2回実施し、最後にDPBSで懸濁させて酵母懸濁インクを得た。
続いて、染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー(装置名:LUH150、ヤマト科学株式会社)を用いて、出力:30%,10秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度:3,000rpmにて5分間遠心分離し、上澄み液を除去し、DPBSを1,000μL添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計2回実施し、最後にDPBSで懸濁させて酵母懸濁インクを得た。
《分注及び細胞数計測》
以下のようにして、液滴中の酵母数を計数(カウント)して、細胞数が既知のプレートを作製した。具体的には、図8に示す液滴形成装置を用いて、96プレート(商品名:MicroAmp 96-well Reaction plate、Thermofisher社製)の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド(社内製)を用いて10Hzにて酵母懸濁インクを順次吐出し、吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ(東京インスツルメンツ株式会社製、sCMOS pco.edge)を用いて撮影し、光源としてはYAGレーザー(スペクトラ・フィジックス社製、Explorer ONE-532-200-KE)を用いて、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるImage Jを用いて画像処理して細胞数を計数し、細胞数既知プレートを作製した。
以下のようにして、液滴中の酵母数を計数(カウント)して、細胞数が既知のプレートを作製した。具体的には、図8に示す液滴形成装置を用いて、96プレート(商品名:MicroAmp 96-well Reaction plate、Thermofisher社製)の各ウェルに、液滴吐出手段として圧電印加方式の吐出ヘッド(社内製)を用いて10Hzにて酵母懸濁インクを順次吐出し、吐出された液滴中の酵母の受光手段としては高感度カメラ(東京インスツルメンツ株式会社製、sCMOS pco.edge)を用いて撮影し、光源としてはYAGレーザー(スペクトラ・フィジックス社製、Explorer ONE-532-200-KE)を用いて、撮影した画像の粒子計数手段として画像処理ソフトウェアであるImage Jを用いて画像処理して細胞数を計数し、細胞数既知プレートを作製した。
《核酸抽出》
Tris-EDTA(TE) Bufferを用いてColE1 DNA(和光純薬工業株式会社製、312-00434)を5ng/μLとなるようにColE1/TEを調製し、ColE1/TEを用いてZymolyase(R) 100T(ナカライテスク株式会社製、07665-55)を1mg/mLとなるようにZymolyase溶液を調製した。作製した細胞数既知プレートの各ウェルにZymolyase溶液を4μL添加し、37℃にて30分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理してプレートを作製した。
Tris-EDTA(TE) Bufferを用いてColE1 DNA(和光純薬工業株式会社製、312-00434)を5ng/μLとなるようにColE1/TEを調製し、ColE1/TEを用いてZymolyase(R) 100T(ナカライテスク株式会社製、07665-55)を1mg/mLとなるようにZymolyase溶液を調製した。作製した細胞数既知プレートの各ウェルにZymolyase溶液を4μL添加し、37℃にて30分間インキュベートすることにより、細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理してプレートを作製した。
続いて、40℃で60分間、60℃で30分間、又は80℃で15分間加温して、プレートを乾燥させた。対照として、加温乾燥なしのプレートを作製した。
《PCR反応》
次に96ウェルプレートを遠心分離機にかけ、細胞数を計測して1細胞であったウェルに対してプライマー、酵素、水を添加し、リアルタイムPCR装置(製品名「QuantStudio(TM)12K Flex Real-Time PCR System」、アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR反応を実施した。1細胞であったウェルの数に対して、増幅されたウェルの数の割合を検出率として評価した。
次に96ウェルプレートを遠心分離機にかけ、細胞数を計測して1細胞であったウェルに対してプライマー、酵素、水を添加し、リアルタイムPCR装置(製品名「QuantStudio(TM)12K Flex Real-Time PCR System」、アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR反応を実施した。1細胞であったウェルの数に対して、増幅されたウェルの数の割合を検出率として評価した。
プライマーとして、フォワードプライマー(配列番号2)及びリバースプライマー(配列番号3)を使用した。プライマーの濃度は、フォワードプライマー(配列番号2)0.5μM、リバースプライマー(配列番号3)0.5μMとした。
図25(a)は、目的の増幅産物のCq値の面内分布を示す図である。図25(b)は、増幅反応の評価結果を示す図である。図25(a)中、一番左の列の「A」~「H」は、96ウェルプレートの行記号を示し、一番上の行の「1」~「10」は96ウェルプレートの列番号を示し、「UD」は、増幅が認められなかったウェルを示す。
また、図25(b)中、「Cq Ave」はCq値の平均値を示し、「Cq σ」はCq値の標準偏差を示し、「Cq CV%」はCq値のCV値を示し、「ΔCq」はCq値の面内差(Cq max-Cq min)を示し、「Cq max」はCq値の最大値を示し、「Cq min」はCq値の最小値を示し、「UD数」は、増幅が認められなかったウェルの数を示し、「検出率」は下記式6により算出された値を示す。
検出率(%)=核酸の増幅が検出されたウェル数/(増幅反応を行ったウェル数-ネガティブコントロールのウェル数)×100 …式6
また、図25(b)中、「Cq Ave」はCq値の平均値を示し、「Cq σ」はCq値の標準偏差を示し、「Cq CV%」はCq値のCV値を示し、「ΔCq」はCq値の面内差(Cq max-Cq min)を示し、「Cq max」はCq値の最大値を示し、「Cq min」はCq値の最小値を示し、「UD数」は、増幅が認められなかったウェルの数を示し、「検出率」は下記式6により算出された値を示す。
検出率(%)=核酸の増幅が検出されたウェル数/(増幅反応を行ったウェル数-ネガティブコントロールのウェル数)×100 …式6
図26(a)は、加温温度とCq Aveとの関係を示したグラフである。グラフの縦軸は、Cq Aveを示し、グラフの横軸は加温温度を示す。図26(b)は、加温温度とCq σとの関係を示したグラフである。グラフの縦軸は、Cq σを示し、グラフの横軸は加温温度を示す。
その結果、Cq Ave、Cq σともに、プレートの乾燥温度が高くなるに従い、上昇した。このことから、プレートを加温乾燥した場合には、PCR反応を精確に評価することができないことが明らかとなった。
[実験例2]
実験例1と同様にして核酸抽出を行ったプレートを、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、容器内の液を乾燥させた。
実験例1と同様にして核酸抽出を行ったプレートを、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、容器内の液を乾燥させた。
続いて、実験例1と同様にして、PCR反応を行い、Cq AveとCq σを算出した。結果を表2に示した。表2中、一番左の列の「A」~「H」は、96ウェルプレートの行記号を示し、「乾燥無し」は、真空乾燥しなかったプレートのCq値、「乾燥有り」は、真空乾燥したプレートのCq値を示す。
表2に示すように、Cq Ave、Cq σともに、プレートの乾燥の有無により、大きな変化は認められなかった。
[実験例3]
細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理せず、Zymolyaseを失活させない以外は実験例1と同様にして核酸抽出を行ってプレートを作製し、その後、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、容器内の液を乾燥させた。Zymolyaseは、減圧乾燥により失活する。
細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理せず、Zymolyaseを失活させない以外は実験例1と同様にして核酸抽出を行ってプレートを作製し、その後、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、容器内の液を乾燥させた。Zymolyaseは、減圧乾燥により失活する。
続いて、得られたプレートを40℃で6日間保存し、実験例1と同様にして、PCR反応を行い、Cq AveとCq σを算出した。
また、実験例2で得られたプレートについても、40℃で6日間保存し、実験例1と同様にして、PCR反応を行い、Cq AveとCq σを算出した。結果を下記表3に示した。表3中、一番左の列の「A」~「H」は、96ウェルプレートの行記号を示し、「加熱失活」は、Zymolyaseを95℃で2分間処理することによりZymolyaseを失活させて減圧乾燥した実験例2のプレートのCq値、「乾燥失活」は、Zymolyaseを95℃で2分間処理することなく、減圧乾燥によりZymolyaseを失活させた実験例3のプレートのCq値を示す。
表3に示したように、核酸抽出において、Zymolyaseを95℃で2分間処理して失活させず、常温で減圧乾燥させて、Zymolyaseを失活させたプレートは、Zymolyaseを95℃で2分間処理して失活させて、常温で減圧乾燥させたプレートと比較して、40℃で6日間保存しても、Cq AveとCq σともに変化が小さく、保存安定性に優れることが明らかとなった。
[実験例4]
実験例3と同様にして、プレートを作製した。得られたプレートをそのまま、又はシリカゲルと一緒に真空パックし、23℃で28日間保存後、実験例1と同様にして、PCR反応を行い、Cq Ave、Cq σ、Cq CV%、ΔCq、Cq max、Cq min、UD数及び検出率を算出した。結果を表4に示した。表4中、「室温」は、プレートをそのまま23℃で保存したもの、「室温真空」は、シリカゲルと一緒に真空パックしたプレートを23℃で保存したものを示し、「初期値」は、保存する前のCq σを示す。
実験例3と同様にして、プレートを作製した。得られたプレートをそのまま、又はシリカゲルと一緒に真空パックし、23℃で28日間保存後、実験例1と同様にして、PCR反応を行い、Cq Ave、Cq σ、Cq CV%、ΔCq、Cq max、Cq min、UD数及び検出率を算出した。結果を表4に示した。表4中、「室温」は、プレートをそのまま23℃で保存したもの、「室温真空」は、シリカゲルと一緒に真空パックしたプレートを23℃で保存したものを示し、「初期値」は、保存する前のCq σを示す。
表4に示したように、核酸抽出において、Zymolyaseを95℃で2分間処理して失活させず、常温で減圧乾燥させて、Zymolyaseを失活させたプレートは、シリカゲルと一緒に真空パックすることにより、23℃で28日間保存しても、保存安定性に優れることが明らかとなった。
[実験例5]
96プレートの代わりに8連チューブを用い、細胞懸濁液を8連チューブキャップ(MicroAmp(TM) Optical 8-Cap Strip、Thermo Fisher Scientific社)に吐出し、細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理せず、Zymolyaseを失活させない以外は実験例1と同様にして、核酸が固定された8連チューブキャップを作製し、その後、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、キャップ内の液を乾燥させた。
96プレートの代わりに8連チューブを用い、細胞懸濁液を8連チューブキャップ(MicroAmp(TM) Optical 8-Cap Strip、Thermo Fisher Scientific社)に吐出し、細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理せず、Zymolyaseを失活させない以外は実験例1と同様にして、核酸が固定された8連チューブキャップを作製し、その後、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、キャップ内の液を乾燥させた。
次に、プライマー、酵素及び水(以下、PCR反応液と称する)を入れた8連チューブ(MicroAmp(TM) Fast Reaction Tubes、Thermo Fisher Scientific社)を、上記で得られた8連チューブキャップで密閉し、キャップで密閉されたチューブを逆さにして2分間静置した後、10回転倒混和し、不溶性担体サンプルを得た。
続いて、上記で得られた不溶性担体サンプルを遠心分離機にかけ、リアルタイムPCR装置(製品名「QuantStudio(TM)12K Flex Real-Time PCR System」、アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR反応を実施した。
次に、96プレートの代わりに8連チューブを用い、細胞壁溶解後(核酸抽出)、95℃で2分間処理せず、Zymolyaseを失活させない以外は実験例1と同様にして、核酸がチューブの底に固定された8連チューブを作製し、その後、真空乾燥機を用いて、常温(23℃)で1Mpa程度の真空で3時間真空引きし、チューブ内の液を乾燥させ、対照サンプル(Reference)を作製した。
対照サンプルに、PCR反応液を添加し、遠心分離機にかけ、リアルタイムPCR装置(製品名「QuantStudio(TM)12K Flex Real-Time PCR System」、アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR反応を実施した。
図28(a)は、対照サンプル及び不溶性担体サンプルの増幅産物の理論コピー数を示す図である。図28(b)は、対照サンプル及び不溶性担体サンプルの増幅産物のCq値の面内分布を示す図である。図28(a)及び図28(b)中、一番左の列の「A」~「H」は、8連チューブの各チューブの位置を示し、一番上の行の「1」~「9」は各8連チューブ(チューブNo.1~No.9)を示す。なお、空欄はサンプルを入れない空のチューブを示し、「UD」は、増幅が認められなかったチューブを示す。なお、理論コピー数とは、計測した液滴中の細胞数から算出したDNAのコピー数を指す。
次に、対照サンプル及び不溶性担体サンプルのCq Ave、Cq σ、Cq CV%、ΔCq、Cq max及びCq minを算出した。対照サンプルについての結果を表5に、不溶性担体サンプルの結果を表6に示した。なお、不溶性担体サンプルについては、Cq Aveの対照サンプルのCq Aveとの差も算出した。
表5及び表6に示したように、不溶性担体サンプルと、対照サンプルのCq値はほぼ一致していた。このことから、核酸を8連チューブのキャップに固定した場合でも、キャップに固定された核酸を減圧乾燥した場合には、核酸は分解することなく、キャップから溶出され、PCR反応により増幅されることが明らかとなった。
次に、対照サンプルの理論コピー数とCq値から検量線を作成した。作成した検量線を図29に示す。この検量線から、Cq値とコピー数との関係は、下記の式7で表されることが分かった。
コピー数=10^((Cq値-38.218)/-3.413・・・式7
コピー数=10^((Cq値-38.218)/-3.413・・・式7
式7を用いて、対照サンプル及び不溶性担体サンプルのCq値からコピー数を算出した。その結果を表7に示す。
表7の結果から、対照サンプルと不溶性担体サンプルのコピー数を評価した。対照サンプルのコピー数の評価結果を表8に、不溶性担体サンプルのコピー数の評価結果を表9に示す。表8及び表9中、「Ave」は、3チューブの平均コピー数を示し、「σ」は、3チューブのSDコピー数を示し、「CV%」は、(σ÷Ave)×100を示し、「max」は3チューブのコピー数の最大値を示し、「min」は3チューブのコピー数の最小値を示し、「max-min」は、最大値から最小値を引いた値を示し、「溶出率」は下記式8により算出された値を示す。
溶出率(%)=不溶性担体サンプルのAve/理論コピー数・・・式8
溶出率(%)=不溶性担体サンプルのAve/理論コピー数・・・式8
表8及び表9に示したように、検量線から算出したDNAのコピー数についても、不溶性担体サンプルのDNAのコピー数は、対照サンプルのDNAのコピー数と同等であり、キャップからの溶出率は、89.4%以上と高かった。このことからも、核酸を8連チューブのキャップに固定した場合でも、キャップに固定した核酸を減圧乾燥した場合には、核酸は分解することなく、キャップから溶出され、PCR反応により増幅されることが明らかとなった。
本発明は、以下の態様を含む。
[1] 少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む、デバイスの製造方法。
[2] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[3] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[4] 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[5] 前記乾燥が、減圧乾燥である、[1]~[4]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[6] 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた[1]~[5]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[7]前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、[1]~[6]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[8] 少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイス。
[9] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、[8]に記載のデバイス。
[10] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、[8]に記載のデバイス。
[11] 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、[8]に記載のデバイス。
[12] 前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、[8]~[11]のいずれか一項に記載のデバイス。
[13] [8]~[12]のいずれか一項に記載のデバイスを含む、リアルタイムPCR装置の性能評価用キット。
[1] 少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程を含む、デバイスの製造方法。
[2] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[3] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[4] 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、[1]に記載のデバイスの製造方法。
[5] 前記乾燥が、減圧乾燥である、[1]~[4]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[6] 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた[1]~[5]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[7]前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、[1]~[6]のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
[8] 少なくとも1つのウェルを有し、少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイス。
[9] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、[8]に記載のデバイス。
[10] 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、[8]に記載のデバイス。
[11] 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、[8]に記載のデバイス。
[12] 前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、[8]~[11]のいずれか一項に記載のデバイス。
[13] [8]~[12]のいずれか一項に記載のデバイスを含む、リアルタイムPCR装置の性能評価用キット。
1…デバイス、2…基材、3…反応空間(ウェル)、4…核酸、5…密閉部材、6…識別手段、10,10’,10C…吐出ヘッド(液滴吐出手段)、11,11a,11b,11c,11C,11’…液室、12,12C…メンブレン、13,13C…駆動素子、13a…電動機、13b,13c…圧電素子、20…駆動手段、30,260…光源、40…ミラー、60,61…受光素子、70…制御手段、71,101…CPU、72…ROM、73…RAM、74,106…I/F、75…バスライン、100…性能評価装置、102…主記憶装置、103…補助記憶装置、104…出力装置、105…入力装置、107…バス、111,111a,111b,111c,121…ノズル、112…電磁弁、115…大気開放部、200…コイル、250…マイクロ流路、255…検出器、255’…画像取得部、265,265’…レンズ、300,300a,300b,300c…細胞懸濁液、310,310’…液滴、350,3501,3502,350’,350”…細胞、400…分注装置、401,401A,401B,401C…液滴形成装置、700,700’…プレート、710…ウェル、800…ステージ、900…制御装置、L…光、Lf,Lf1,Lf2…蛍光。
Claims (13)
- 少なくとも1つのウェルを有し、
少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスの製造方法であって、
前記核酸を酵素により抽出する核酸抽出工程、及び、
前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより失活させる乾燥失活工程
を含む、デバイスの製造方法。 - 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、請求項1に記載のデバイスの製造方法。
- 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、請求項1に記載のデバイスの製造方法。
- 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、請求項1に記載のデバイスの製造方法。
- 前記乾燥が、減圧乾燥である、請求項1~4のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
- 前記核酸が細胞の核中の核酸に組み込まれた請求項1~5のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
- 前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、請求項1~6のいずれか一項に記載のデバイスの製造方法。
- 少なくとも1つのウェルを有し、
少なくとも1つの前記ウェル内の核酸が、反応場に特定コピー数固定されているデバイスであって、
前記核酸が、酵素により抽出され、前記酵素を5~45℃で乾燥させることにより、前記反応場に固定されているデバイス。 - 前記核酸の前記反応場への固定が、前記ウェルの底面への固定である、請求項8に記載のデバイス。
- 前記核酸の前記反応場への固定が、前記反応場に接する不溶性担体への固定である、請求項8に記載のデバイス。
- 前記核酸の前記反応場への固定が、不溶性担体に固定された前記核酸の前記反応場への添加である、請求項8に記載のデバイス。
- 前記特定コピー数が、1コピー以上200コピー以下である、請求項8~11のいずれか一項に記載のデバイス。
- 請求項8~12のいずれか一項に記載のデバイスを含む、リアルタイムPCR装置の性能評価用キット。
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