CN111334566A - 核酸分析方法、核酸分析程序和文库制备装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸分析方法、核酸分析程序和文库制备装置。在一个实施方式中，提供分析至少一种核酸的方法，其可便捷地和高度准确地分析甚至极少量的分析物至少一种核酸。在一个实施方式中，本发明涉及分析至少一种核酸的方法，包括：文库制备步骤，在相同体系中制备包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；校准曲线数据生成步骤，基于特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸的拷贝数生成校准曲线数据；和分析物核酸分析步骤，鉴定分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用校准曲线数据鉴定至少一种分析物核酸的至少一个核苷酸序列的数量。

Description

核酸分析方法、核酸分析程序和文库制备装置

技术领域

在一个实施方式中，本发明涉及核酸分析方法、核酸分析程序和文库制备装置。

在一个实施方式中，本发明涉及分析高通量测序反应数据的方法、执行该方法的试剂盒、和允许计算机执行该方法的程序等。

背景技术

DNA测量技术中新一代测序仪(next-generation sequencers，NGS)被广泛用于基因检验等，因为从样本或样品中提取的DNA可获取大量核苷酸序列数据。具体地，利用新一代测序仪高精确度检测极少量样品的研究已在近年来蓬勃发展。

例如，为了精确地定量16S rRNA基因，已经提出了一种内标核酸样品，该内标核酸样品具有可以用用于扩增微生物16S rRNA基因的引物扩增但明显区别于16S rRNA基因的核苷酸序列(参见例如专利文献1(日本专利公开号(Kokai)2015-204813号公报))。

诸如新一代测序仪(NGS)的高通量测序仪是对大量DNA分子并行测序的技术，并且广泛用于基因检验等，因为可以从样本或样品中提取的DNA获取大量核苷酸序列数据。数据以称为“读数(read)”的单位管理。在例如Illumina，Inc.的测序仪的情况下，1读数相应于从流动室(flow cell)的1个集群(cluster)获得的核苷酸序列数据。在高通量测序仪中，在制备文库时通过PCR扩增核酸分子。因此，扩增产物形成多个集群，并且从多个集群获得相同的核苷酸序列。其管理单位称为“读数数量(read number)”，并以短语“序列A具有N读数”或“序列A的读数数量为N”等表示。

高通量测序仪中的分析挑战是确定在分析中是否使用了读数数量少的序列。读数数量少的序列可归因于各种错误源，例如源自测序PCR后被污染的样品源序列以及流动池中保留的前轮样品源序列(在高通量测序仪具有可重复使用的流动池的情况下)所导致的错误的序列。到目前为止，尚无明确的标准来判断哪个读数数量表明其序列值得用于分析。已知基于利用诸如clcleanseqv或Vsearch的软件所确定的阈值去除数据的方法，以选择要分析的序列。

专利文献2(JP专利公开号(Kohyo)2018-514207)公开了一种使用唯一分子标识符(UMI)来确定样品的核酸片段序列的方法，目的是开发一种确定少量的和/或等位基因频率低的DNA分子的序列同时抑制由各种错误源引起的测序不精确的方法。

发明内容

在一个实施方式中，本发明的一个目标是提供可便捷地和高度准确地分析甚至极少量分析物核酸的核酸分析方法。

基于利用软件确定的阈值而去除数据的常规方法仅基于输出数据预期阈值，和基于此阈值修正读数。因此，这些方法不能根据明确的标准区分输出数据，因为不清楚充当阈值的读数数量数值是否适当。

专利文献2中描述的发明仅涉及抑制测序反应中的错误所导致的测序不准确，而无法涉及不值得分析的序列产生的所有原因。因此，该发明不能解决无法确定用于去除不值得分析序列的阈值的问题等。

在一个实施方式中，本发明的一个目标是提供分析高通量测序反应数据的方法，该方法能够基于根据明确的标准所确定的阈值区分输出数据。

在一个实施方式中，本发明的核酸分析方法包括：文库制备步骤，在相同体系中制备包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；校准曲线数据生成步骤，基于特定拷贝数的标准品核酸的拷贝数生成校准曲线数据；和分析物核酸分析步骤，鉴定分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用校准曲线数据鉴定至少一种分析物核酸的至少一个核苷酸序列的数量。

在一个实施方式中，本发明涉及利用包括特定拷贝数的核酸的至少一个标准品样品分析高通量测序反应数据的方法，方法包括：a)在相同条件下制备所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库；b)使步骤a)中制备的文库进行测序反应以获得输出数据，包括从所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品获得的读数；和c)基于参考由输出数据中所述至少一个标准品样品获得的读数数量确定的阈值，将输出数据中的读数划分成等于或小于阈值的至少一个读数和等于或大于阈值的至少一个读数。

本说明书包括日本专利申请号2018-236746、2019-015126、2019-046689和2019-047881中公开的内容，本申请要求其优先权。

在一个实施方式中，本发明可提供可便捷地和高度准确地分析甚至极少量分析物核酸的核酸分析方法。

在一个实施方式中，本发明能够实现基于根据明确标准确定的阈值区分输出数据。这允许例如在输出数据中应当用于分析的数据和其它数据之间进行区分，以获得可靠性较高的分析结果。

附图说明

图1A是示例本发明装置的一个实例的透视图。

图1B是示例本发明装置的另一实例的透视图。

图2是示例本发明装置的一个实例的侧视图。

图3是示例本发明装置中核酸将填充的孔位置的一个实例的图。

图4是示例本发明装置中核酸将填充的孔位置的另一实例的图。

图5是示例已复制DNA细胞频率与荧光强度之间的关系的一个实例的图。

图6A是示例电磁阀模式的排放头的一个实例的示意图。

图6B是示例压电模式的排放头的一个实例的示意图。

图6C是图6B的压电模式的排放头的变型实例的示意图。

图7A是示例施加于压电元件的电压的一个实例的示意图。

图7B是示例施加于压电元件的电压的另一实例的示意图。

图8A是示例液滴状态的一个实例的示意图。

图8B是示例液滴状态的一个实例的示意图。

图8C是示例液滴状态的一个实例的示意图。

图9是示例用于相继将液滴降落到孔中的分配设备的一个实例的示意图。

图10是示例液滴形成设备的一个实例的示意图。

图11是示例图10的液滴形成设备中控制单元的硬件区块的图。

图12是示例图10的液滴形成设备中控制单元的功能区块的图。

图13是示例液滴形成设备的行为的一个实例的流程图。

图14是示例液滴形成设备的变型实例的示意图。

图15是示例液滴形成设备的另一变型实例的示意图。

图16A是示例飞行液滴包含两个荧光粒子的情况的图。

图16B是示例飞行液滴包含两个荧光粒子的情况的图。

图17是示例亮度值Li与无粒子重叠情况下实际测量亮度值Le之间的关系的图。

图18是示例液滴形成设备的替代性变型实例的示意图。

图19是示例液滴形成设备的另一实例的示意图。

图20是示例计数流过微通道的细胞的方法的一个实例的示意图。

图21是示例获取排放头的喷嘴部附近的图像的方法的一个实例的示意图。

图22是示例概率P(>2)与平均细胞数之间的关系的图。

图23是示例具有基于泊松(Poisson)分布的分散的拷贝数与变异系数(CV)之间的关系的图。

图24是示例核酸分析设备的硬件配置的一个实例的框图。

图25是示例核酸分析设备的功能配置的一个实例的图。

图26是示例核酸分析的程序处理的一个实例的流程图。

图27是示例实例中获得的结果的一个实例的图。

图28是示例实例中获得的结果的另一实例的图。

图29是示例实例中获得的结果的替代性实例的图(来自Sagami River的样品的校准曲线)。

图30显示实施例6中通过NGS获得的读数的序列的百分比。图30显示原始数据以及从原始数据去除读数数量等于或小于DNA600-G的序列(去除叠影(ghost)后)所获得的数据。图30显示在排除读数数量等于或小于10拷贝的DNA600-G的序列时，两种微生物(不动杆菌(Acinetobacter)和坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus))的读数和"其它"的读数被去除。

具体实施方式

(核酸分析方法和核酸分析程序)

在一个实施方式中，本发明的核酸分析方法包括：文库制备步骤，在相同体系中制备包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；校准曲线数据生成步骤，基于特定拷贝数的标准品核酸的拷贝数生成校准曲线数据；和分析物核酸分析步骤，鉴定分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用校准曲线数据鉴定至少一种分析物核酸的至少一个核苷酸序列的数量，以及任选地进一步包括另外的步骤。

在一个实施方式中，本发明的核酸分析程序允许计算机执行下列过程：关于在相同体系中制备的包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库，基于特定拷贝数的标准品核酸的拷贝数，通过校准曲线数据生成单元生成关于所述至少一种标准品核酸的校准曲线数据；和通过分析物核酸分析单元鉴定分析物核酸的核苷酸序列，同时利用校准曲线数据鉴定分析物核酸的核苷酸序列数量，以及任选地进一步允许计算机执行另外的过程。

在一个实施方式中，核酸分析方法可通过核酸分析方法相关的核酸分析设备适当地执行。文库制备步骤可通过文库制备单元适当地执行。校准曲线数据生成步骤可通过校准曲线数据生成单元适当地执行。分析物核酸分析步骤可通过分析物核酸分析单元适当地执行。另外的步骤可通过另外的单元执行。

本发明人已研究了可便捷地和高度准确地分析甚至多种类型和极少量分析物核酸的核酸分析方法，并因此得到下列发现。

在常规技术中，浓度已知的样品具有核酸本身的浓度测量值，并且在用于制备标准品样品进行定量分析前被连续稀释。因此，对于稀释比高(稀释倍数高)的极少量标准品样品，不确定具有目标拷贝数的稀释溶液被精确地制备出来。因此，对于极少量分析物核酸，难以进行精确定量。在一个实施方式中，本发明基于这些发现。

在一个实施方式中，本发明进一步基于下列发现：不清楚对于极少量分析物核酸，利用用于微生物16S rRNA基因定量的内标基因是否可进行精确定量。

在一个实施方式中，本发明核酸分析方法相关核酸分析设备充当通过检索和运行本发明的核酸分析程序实施本发明的核酸分析方法的设备。具体地，本发明核酸分析方法相关核酸分析设备具有本发明的核酸分析程序，该核酸分析程序允许计算机执行与本发明的核酸分析方法相似的功能。本发明的核酸分析程序不限于本发明核酸分析方法相关核酸分析设备运行的程序。例如，本发明的核酸分析程序可由另外的计算机或服务器运行，或可由本发明核酸分析方法相关核酸分析设备与任何另外的计算机和服务器合作运行。

换句话说，本发明核酸分析方法相关核酸分析设备与实施本发明的核酸分析方法同义。因此，本发明核酸分析方法相关核酸分析设备的细节也将参考关于本发明核酸分析方法的描述而明确。此外，本发明的核酸分析程序通过利用硬件资源如计算机来实现本发明的核酸分析方法。因此，本发明核酸分析程序的细节也将通过关于本发明核酸分析方法的描述而明确。

<文库制备步骤和文库制备单元>

文库制备步骤是在相同体系中布置特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸而制备文库的步骤。文库制备步骤被文库制备单元适当地实施。

文库意为包括被处理成允许核酸分析的状态的分析物核酸的集合。文库优选地包括一种或多种，更优选两种以上分析物核酸。包括两种以上分析物核酸的文库可被适当地用于例如环境调查，以鉴定生物物种。

标准品核酸意为用于后述在核酸分析中获取校准曲线数据的特定拷贝数的核酸。分析意图包括核苷酸序列的鉴定和/或各核苷酸序列的拷贝数的鉴定。特定拷贝数在后述关于用于本发明的核酸分析方法的装置的描述中被详细描述，因此关于特定拷贝数的描述在此省略。

分析物核酸意为将样品作为被分析的核酸(核苷酸序列)。其类型没有具体限制并且可根据目的被适当选择。一种类型的分析物核酸可被单独使用，或者两种以上类型的分析物核酸可被组合使用。所述至少一种分析物核酸的数量没有具体限制并且可根据目的被适当选择。一种分析物核酸可被单独使用，或者两种以上分析物核酸可被组合使用。

分析物核酸没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括DNA、RNA、和cDNA。分析物核酸可包括具有不同核苷酸序列的两种以上核酸(片段)。

对所述至少一种分析物核酸的形成允许核酸分析的状态的处理没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括结合接头序列的处理、和进行核酸扩增的处理。

结合接头序列的处理没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括使寡核苷酸结合至所述至少一种分析物核酸的5'和3'端中至少任一个的处理、使待结合寡核苷酸结合至所述至少一种分析物核酸的5'和3'端中至少任一个的处理、和结合肽或蛋白质的处理。

结合寡核苷酸的处理没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括相同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸来制备文库的方法、和不同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸来制备文库的方法。相同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸来制备文库的方法的采用可使扩增效率差异几乎可忽略不计。不同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸来制备文库的方法的采用允许引物的选择独立于分析物核酸的核苷酸序列，并可因此提高多样性(versatility)。

结合寡核苷酸的处理的其它实例包括利用转座子的方法、利用连接酶的方法、和利用同源重组的方法。例如，描述于http://www.epibio.com/docs/default-source/forum-archive/forum-16-3---nextera-technology-for-ngs-dna-library-preparation---simultaneous-fragmentation-and-标签ging-by-in-vitro-transposition.pdf？sfvrsn＝4的方法可被适当地用作这种结合寡核苷酸的处理。

结合肽或蛋白质的处理没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括利用MinION(Oxford Nanopore Technologies Ltd.)的快速测序试剂盒的方法。

例如，被描述于https://store.nanoporetech.com/catalog/product/view/id/219/s/rapid-sequencing-kit/category/28/的方法可被适当地用作结合肽或蛋白质的处理。

接头序列没有具体限制并且可根据目的被适当选择。

进行核酸扩增的处理没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要样品中包括的所述至少一种分析物核酸中涉及的特定核苷酸序列(例如，基因)可扩增。

本发明的核酸分析方法在相同体系中扩增所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸，并且可从而提高关于所述至少一种分析物核酸的结果可靠性，因为所述至少一种标准品核酸的数量已被确定。

在此环境下，在相同体系中包括所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸的情况的实例包括在相同体系中包括具有不同核苷酸序列的标准品核酸的实施方式、和在不同体系中包括具有相同核苷酸序列的标准品核酸的实施方式。

在相同体系中包括具有不同核苷酸序列的标准品核酸的实施方式意为，具有不同核苷酸序列的标准品核酸以彼此不同的特定拷贝数被包括在相同体系中，即，两种以上类型的标准品核酸以彼此不同的特定拷贝数被包括在相同体系中。此实施方式可提高分析所述至少一种分析物核酸的结果可靠性。以彼此不同的特定拷贝数被包括在相同体系中的情况的实例包括相互不同的核苷酸序列A、B和C以3个水平扩增，例如，1拷贝的核苷酸序列A，10拷贝的核苷酸序列B，和50拷贝的核苷酸序列C，在相同体系中。"水平"意为当某拷贝数被定义为"1"时，可选的特定拷贝数为"10"，并且进一步可选的特定拷贝数为"50"，其被表示为"3个水平"。

在不同体系中包括具有相同核苷酸序列的标准品核酸的实施方式意为，使用具有相同核苷酸序列的标准品核酸，即，体系相对于标准品核酸的对应水平(对应特定拷贝数)存在，并且这些体系包括相同的分析物核酸。具有相同核苷酸序列的标准品核酸的使用可使所用标准品核酸类型减少。

文库制备是预处理至少一种核酸样品的步骤。文库制备步骤的细节是本领域技术人员已知的。文库制备步骤可依据各测序方法而不同，并且包括，例如但不限于，下列步骤的一个或多个或全部：1)依据测序仪的读数长度(read length)，酶促地或机械地片段化核酸；2)通过PCR或类似手段添加后续测序步骤所需的接头序列；3)任选地，在进行步骤2)之前或之后通过PCR或类似手段扩增特定核酸片段(基因区域的扩增可通过例如4至50个循环的扩增步骤进行)；和4)纯化核酸分子。各步骤可通过本领域技术人员已知的方法进行。参见例如本申请实施例中描述的条件。文库制备步骤可利用市售试剂盒进行，例如，TruSeqDNAPCR-Free(Illumina，Inc.)、ACCEL-NGS^TM文库制备试剂盒(Swift Biosciences^TM，Inc.)、或快速测序试剂盒(Oxford Nanopore Technologies Ltd.)。

文库制备步骤没有具体限制并且可根据目的被适当选择。参见例如Illumina，Inc公开的新一代测序仪的分析方法(https://www.adres.ehime-u.ac.jp/news/NGS1.pdf)、非专利文献1(MiFish，a set of universal PCR primers for metabarcodingenvironmental DNA from fishes:detection of more than 230 subtropical marinespecies.M.Miya,et al.,2015)、利用纳米孔装置测序的分析方法(Oxford NanoporeTechnologies Ltd..)、利用PacBio RS II/Sequel体系测序的分析方法(PacificBiosciences of California，Inc.)、和Ion Torrent^TM半导体测序体系系列的分析方法(Thermo Fisher Scientific Inc.)。

在此，详细描述本发明核酸分析方法中的短语"标准品核酸的特定拷贝数已被确定"。在一个实施方式中，本发明的核酸分析方法基于下列前提：使用具有确定特定拷贝数的标准品核酸的装置。

-装置-

本发明的核酸分析方法中使用的装置具有至少一个填充位点，并且所述至少一个填充位点中包含特定拷贝数的标准品核酸。

该装置在本发明的核酸分析方法中的使用允许高度准确地分析(定量)甚至极少量的分析物核酸。在本发明中，术语"极少量"意为核酸"数量极少"，以及意为例如1,000以下。

特定拷贝数意为填充位点中包含的标准品核酸的目标或特定核酸(或核苷酸序列)的数量。

目标核苷酸序列指代至少引物区域已被确定的核苷酸序列。特定核酸地，具有确定的全长的核苷酸序列也被称为特定核苷酸序列。

特定数量意为在多个核酸(核苷酸序列)数量中已在某个准确度水平以上被确定的目标核酸(核苷酸序列)的数量。

具体地，可以这么说：填充位点中实际包含的目标核酸(核苷酸序列)的数量是已知的。换句话说，根据本申请的特定拷贝数的数值准确度和可靠性高于通过连续稀释获得的常规预定的数量(计算或估测值)，并且是独立于泊松分布受控的数值，具体地甚至对于极少量(1,000以下)区域也是。关于受控值，变异系数(CV)——其表示不肯定性(不确定性，uncertainty)——优选地相对于特定拷贝数的平均值x落入CV<1/√x或CV≤20％的数值范围。因此，填充位点包含特定拷贝数的至少一种目标核酸(核苷酸序列)的装置的使用能够以高于以往的精确度定性地和定量地检验具有目标核酸(核苷酸序列)的样品。

在此环境下，当各目标核苷酸序列的拷贝数与具有该序列的核酸分子的数量一致时，"特定拷贝数"可相应于"分子数量"。

具体地，在例如诺如病毒(norovirus)的情况下，如果病毒数量为1，则核酸分子数量为1，并且拷贝数为1。在GI期的酵母的情况下，如果酵母数量为1，则核酸分子数量(相同染色体的数量)为1，并且拷贝数为1。在G0/GI期的人细胞的情况下，如果人细胞的数量为1，则核酸分子数量(相同染色体的数量)为2，并且拷贝数为2。

在GI期的在两个位置引入了目标核苷酸序列的酵母的情况下，如果酵母数量为1，则核酸分子数量(相同染色体的数量)为1，并且拷贝数为2。

在本发明中，核酸的特定拷贝数也被称为核酸的预定数量或绝对数量。

核酸的特定拷贝数优选为1个(拷贝)或多个，和1,000(拷贝)以下，更优选100(拷贝)以下，还更优选20(拷贝)以下，进一步优选10(拷贝)以下。

核酸的特定拷贝数优选为两个或更多个不同的整数。

核酸特定拷贝数的组合的实例包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、和10的组合；1、3、5、7、和9的组合；和2、4、6、8、和10的组合。

可选地，核酸的特定拷贝数的组合可以是例如1、10、50、100和500的组合——4个水平1、10、100和1,000。校准曲线可利用本发明核酸分析方法中的装置基于多个不同特定拷贝数的组合生成。

包含多个不同特定拷贝数的核酸的填充位点可以相同或不同。然而，当多个包含核酸的填充位点存在，需要添加相同分析物核酸至对应填充位点。

用于在装置中布置文库制备步骤中制备的具有特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸的文库的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，优选添加限定量的通过连续稀释文库以多个水平制备的溶液或分散液，或基于具有已知数量的核酸分子的微型区域或载体的计数添加文库。最佳方法优选依据各水平所需填充准确度或填充时间选自这些方法。对于各填充位点确定的不肯定性优选通过上述填充方法或连续稀释制备方法被适当地计算。

关于核酸特定拷贝数的信息没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该信息相关于装置中的核酸。其实例包括不肯定性信息、载体信息(后述)、和核酸信息。

"不肯定性"被ISO/IEC Guide 99：2007[International vocabulary ofmetrology–Basic and general concepts and associated terms(VIM)]定义为"与测量结果相关的、表征可合理归因于被测变量的数值离差(分散，dispersion)的参数"。

在此环境下，"可合理归因于被测变量的数值"意为被测变量的真值的候选值。具体地，不肯定性意为关于归因于产生测量目标相关的操作、仪器等的测量结果离差的信息。不肯定性越大，表示作为测量结果预期的离差越大。

不肯定性可以是例如由测量结果获得的标准偏差，或可以是某置信水平的值的一半——以预定概率以上的包括真值的数值宽度表示。

不肯定性可通过基于例如Guide to the Expression of Uncertainty inMeasurement(GUM:ISO/IEC Guide 98-3)或Guideline regarding Uncertainty inMeasurement of the Japan Accreditation Board Note 10test的方法计算。例如，计算不肯定性的方法包括两种方法，即，利用统计学如测量值的A型评价和利用由校准证书、制造商说明、公开信息、或类似信息获得的不肯定性信息的B型评价。

不肯定性可通过相同置信水平、通过将所有由操作和测量等获得的不肯定性成分转换成标准不肯定性来表示。标准不肯定性指代由测量值获得的平均值的离差。

计算不肯定性的一种示例性方法包括例如，提取造成不肯定性的成分，和计算各成分的不肯定性(标准偏差)。通过平方和方法进一步组合计算的不肯定性成分，以计算组合的标准不肯定性。由于利用平方和方法计算组合的标准不肯定性，在造成不肯定性的成分中，不肯定性足够小的成分可被忽略。

在本发明中的装置，填充到填充位点中的核酸的变异系数可用作不肯定性信息。

变异系数意为将核酸填充到凹处中时填充到对应凹处中的核酸数量的离差相对值。具体地，变异系数意为填充到凹处中的核酸数量的填充准确度。变异系数是通过标准偏差σ除以核酸数量平均值x而获得的数值。在此环境下，下列式1的关系式为：

[式1]

其中变异系数(CV)是通过标准偏差σ除以核酸拷贝数平均值x(被添加核酸拷贝数的平均值)而获得的数值。

总体上，核酸在分散液中处于泊松分布的无规分散状态。因此，标准偏差σ可被认为与核酸拷贝数平均值x在连续稀释方法中满足下文给出的式2的关系式，即，处于泊松分布的无规分布状态。在通过连续稀释方法稀释核酸分散液的情况下，核酸拷贝数平均值x的变异系数(CV数值)根据下文给出的式3由标准偏差σ和核酸拷贝数平均值x确定，如表1和图23所示，式3由式1和2获得。具有基于泊松分布的离差的拷贝数的变异系数(CV数值)可由图23确定。

[式2]

[式3]

[表1]

平均拷贝数x	变异系数(CV)
		1.00E+00	100.00％
1.00E+01	31.62％
		1.00E+02	10.00％
1.00E+03	3.16％
		1.00E+04	1.00％
1.00E+05	0.32％
		1.00E+06	0.10％
1.00E+07	0.03％
		1.00E+08	0.01％

由表1和图23的结果显见，在通过连续稀释方法在填充位点中填充例如100拷贝(拷贝数＝100)的核酸的情况下，最终填充到反应溶液中的标准品核酸(核苷酸序列)拷贝数平均值具有至少10％的变异系数(CV数值)，即使忽略其它因子的准确度。

核酸的特定拷贝数优选地满足式CV<1/√x，更优选CV<1/2√x，其中CV表示变异系数，并且x表示核酸的特定拷贝数的平均值。

不肯定性信息优选是由具有多个包含核酸的孔的全装置获得的并且基于填充位点中包含的核酸的特定拷贝数的不肯定性信息。

有一些可能的成分造成不肯定性。在例如将目标核酸引入细胞并且计数和分配细胞用于制备的情况下，造成不肯定性的成分的实例包括细胞中的核酸数量、装置中布置细胞的单元(包括喷墨设备、或可归因于设备各位点的行为的结果，如设备行为时机(timing))、细胞被布置在装置中适当位置的频率、和因细胞悬浮液中细胞破裂而造成的细胞悬浮液中的核酸污染(杂质混合)。

核酸信息的实例，例如，关于核酸数量的信息，包括关于装置中包含的核酸数量的不肯定性信息。

<填充位点>

填充位点的形状、数量、容量、材料、颜色等没有具体限制并且可根据目的被适当选择。填充位点可与孔同义。

填充位点的形状没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要核酸或类似物可被布置在其中。其实例包括基底上的平底、圆底、U型底、和V型底凹处、以及隔室。填充位点的形状优选地与一般热循环仪的模具形状一致。

填充位点的数量是至少1，优选2以上，更优选5以上，还更优选50以上。

填充位点数量为1的情况的实例包括PCR管。

例如，多孔板在填充位点数量为2以上时被适当地使用。

多孔板的实例包括24-、48-、96-、384-、或1,536-孔板。

填充位点的容量没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，鉴于一般核酸检验设备中的样品用量，容量优选为1μL以上并且1,000μL以下。

填充位点的材料没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，氟树脂，丙烯酸树脂，聚碳酸酯，聚氨酯，聚氯乙烯，和聚对苯二甲酸乙二醇酯。

填充位点的颜色的实例包括透明、半透明、着色、和完全遮光。

填充位点的润湿性没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，填充位点优选是拒水的。当填充位点的润湿性是拒水时，其可减少核酸至填充位点内壁的吸附。此外，当填充位点的润湿性是拒水时，核酸、引物、和扩增试剂可以溶液状态在填充位点中移动。

赋予填充位点内壁拒水性的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括形成氟树脂涂层的方法、氟等离子体处理、和压纹。具体地，赋予内壁拒水性从而获得100°以上接触角可降低因液体溢出而减少核酸数量和增加不肯定性(或变异系数)的风险。

<基材>

装置优选是具有配备有填充位点的基材的(平)板型，并且可以是连接型孔管如8条管(8-strip tube)、或不连接孔的组合。

基材的材料、形状、尺寸、结构等没有具体限制并且可根据目的被适当选择。

基材的材料没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括半导体、陶瓷、金属、玻璃、石英玻璃、和塑料。其中，塑料是优选的。

塑料的实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯、和聚对苯二甲酸乙二醇酯。

基材的形状没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，片形或(平)板形是优选的。

基材的结构没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，可采用单层结构或多层结构。

<鉴定单元>

装置优选地具有允许鉴定核酸的特定拷贝数和其相关不肯定性信息的鉴定单元。

鉴定单元没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括存储器、IC芯片、条码、QR码(R)、射频识别器(在下文中也被称为"RFID")、颜色代码、和印记。

鉴定单元的位置和鉴定单元的数量没有具体限制并且可根据目的被适当选择。

存储在鉴定单元中的信息的实例包括核酸的特定拷贝数和其相关不肯定性信息以及分析结果(活性值、光强度等)、核酸数量(例如，细胞计数)、活或死细胞、特定核苷酸序列的拷贝数、多个填充位点中哪个填充位点填充核酸、核酸类型、测量日期和时间、和测量者名称。

存储在鉴定单元中的信息可用各种读取单元读取。例如，在条码用作鉴定单元时，条码读取器用作读取单元。

在鉴定单元中写入信息的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括手动输入、在核酸被分配至填充位点时由计数核酸的液滴形成设备直接在其中写入数据的方法、传输服务器存储的数据、和传输云存储的数据。

<另外的构件>

另外的构件没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括封闭构件。

-封闭构件-

装置优选具有封闭构件，以防止外源物质污染到填充位点中或填充物泄露等。

封闭部件优选地被配置以能够封闭至少一个填充位点，并且能够在切割线处被拆卸，使得填充位点可被单独封闭或打开。

封闭构件的形状优选是匹配填充位点内壁直径的盖、或覆盖孔开口的膜形状。

封闭构件的材料实例包括聚烯烃树脂、聚酯树脂、聚苯乙烯树脂、和聚酰胺树脂。

封闭构件优选具有能够一次封闭全部填充位点的膜形状。封闭构件优选被配置以使需要再打开的填充位点和不需要再打开的填充位点之间粘合强度不同，以减少被使用者错误使用。

填充位点优选包含引物和扩增试剂中的至少任一种。

引物是具有聚合酶链反应(PCR)模板DNA的特异性18碱基至30碱基互补核苷酸序列的合成寡核苷酸。两个引物(一对引物)，即正向引物和反向引物，被设置以侧接待扩增区域。

扩增试剂的实例包括DNA聚合酶作为酶，4个碱基(dGTP、dCTP、dATP、和dTTP)作为底物，Mg²⁺(2mM氯化镁)，和维持最优pH(pH 7.5至9.5)的缓冲剂，用于聚合酶链反应(PCR)。

装置优选具有具有0拷贝的核酸的阴性对照填充位点、和具有10拷贝以上的核酸的阳性对照填充位点。

当在阴性对照中感测到检出而在阳性对照中感测到未检出时，表明检测体系(试剂或设备)有异常。通过使用阴性对照和阳性对照，使用者可在问题发生时立即发现，并中止测量和检查何处发生问题。

填充位点中核酸、引物和扩增试剂的状态没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，这些组分可以是任何溶液或固体状态。具体地，从可用性角度来说，溶液状态是优选的。当组分处于溶液状态时，使用者可在检验中直接使用该组分。具体地，从运输角度来说，固体状态是优选的，并且干燥状态是更优选的。当组分处于干燥状态时，可扩增试剂通过降解酶或类似物降解的反应速率可降低，并且核酸、引物和扩增试剂的可保存性可提高。

可期望填充位点将被适量干燥固体状态的核酸、引物和扩增试剂填充，使得这些组分可在装置使用前刻被溶解在缓冲剂或水中，以直接用作反应溶液。

干燥方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括冷冻干燥、加热干燥、热风干燥、真空干燥、蒸汽干燥、抽吸干燥、红外干燥、滚筒干燥、和旋转干燥。

在此环境下，图1A是示例本发明核酸分析方法相关的一个实例装置(也被称为核酸样品填充容器)1的透视图。图1B是示例本发明核酸分析方法相关的另一实例装置1的透视图。图2是图1B的装置1的侧视图。装置1具有配备有多个填充位点(孔)3的基材2，并且特定拷贝数的核酸4被填充到填充位点(孔)3(被构成填充位点(孔)的填充位点(孔)壁包围的内部空间区域)(也被称为核酸样品填充位点)中。在此装置1中，核酸的特定拷贝数与关于核酸特定拷贝数的不肯定性信息相关。图1B和2分别示例了其中填充位点(孔)3的开口被封闭构件5覆盖的实例装置1。

如图1B和2示例，例如，存储填充到各填充位点(孔)3中的试剂数量和关于该数量的不肯定性(概率)信息、或这些信息的相关信息的IC芯片或条码(鉴定单元6)被布置在封闭构件5和基材2之间的和填充位点(孔)的开口以外的位置。这适于防止鉴定单元意外变更等。

具有鉴定单元的这种装置可区别于不具有鉴定单元的一般填充位点(孔)板。这可防止混淆。

图3是示例本发明核酸分析方法相关装置中待被核酸填充的填充位点(孔)的一个实例位置的图。图3中填充位点(孔)上的数字表示核酸的特定拷贝数。图3中无数字的填充位点(孔)是样品或对照测量的填充位点(孔)。

图4是示例本发明核酸分析方法相关装置中待被核酸填充的填充位点(孔)的另一实例位置的图。图4中填充位点(孔)上的数字表示核酸的特定拷贝数。图4中无数字的填充位点(孔)是样品或对照测量的填充位点(孔)。

-核酸-

核酸或核酸分子是通过由嘌呤或嘧啶、糖、和磷酸基获得的含氮碱基规律性结合而形成大分子有机化合物，并且还包括核酸片段、或核酸类似物或其片段等。

核酸没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括DNA、RNA、和cDNA。

核酸或核酸片段可以是由生物体获得的天然产物、或其加工产物，并且可以通过利用基因重组技术产生，或可以是通过化学合成等获得的人工合成核酸。这些核酸(片段)可被单独使用或其两种以上可被组合使用。人工合成核酸可被制备成杂质量减少的低分子，并且可因此提高初始反应效率。

人工合成核酸意为通过人工合成由与天然存在的DNA或RNA类似的组分(碱基、脱氧核糖、和磷酸基)构成的核酸而获得的核酸。人工合成核酸不仅包括例如具有编码蛋白质的核苷酸序列的核酸，而且包括具有任何核苷酸序列的核酸。

核酸或核酸片段类似物的实例包括结合非核酸组分的核酸或核酸片段、用标记剂如荧光染料或同位素标记的核酸或核酸片段(例如，用荧光染料或放射性同位素标记的引物或探针)、和通过部分改变构成核酸或核酸片段的核苷酸的化学结构而获得的人工核酸(例如，PNA、BNA、和LNA)。

核酸的形式没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括双链核酸，单链核酸，和部分双链或单链核酸。可使用环状或线性质粒。

核酸可被修饰或突变。

核酸优选具有目标核苷酸序列。

目标核苷酸序列没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括用于感染性疾病检验的核苷酸序列、不是天然存在的非天然核苷酸序列、源自动物细胞的核苷酸序列、源自植物细胞的核苷酸序列、源自真菌细胞的核苷酸序列、源自细菌的核苷酸序列、和源自病毒的核苷酸序列。这些目标核苷酸序列可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

在使用非天然核苷酸序列的情况下，GC含量百分比优选为目标核苷酸序列的30％以上并且70％以下，并且GC含量优选是恒定的(参见例如SEQ ID NO：6)。

目标核苷酸序列的碱基长度没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括20碱基对(或mer)以上并且10,000碱基对(或mer)以下的碱基长度。

在使用感染性疾病检验中使用的核苷酸序列的情况下，核苷酸序列没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该核苷酸序列包括感染性疾病独有的核苷酸序列。核苷酸序列优选包括通过权威方法或指示方法指定的核苷酸序列。

核酸可以是源自所用细胞的核酸，或可以是通过转染引入的核酸。在使用通过转染引入的核酸并且质粒作为核酸的情况下，优选验证1拷贝的核酸被引入1个细胞。验证1拷贝的核酸被引入的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。这可通过利用例如测序仪、PCR、或Southern印迹来验证。

具有通过转染引入的目标核苷酸序列的核酸的类型可以是一种类型或可以是两种以上类型。在通过转染引入一种核酸类型的情况下，类似的核苷酸序列可根据目的被串联(in tandem)引入。

转染方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要特定核酸序列可被以预期拷贝数引入预期位点。其实例包括同源重组、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、TALEN、锌指核酸酶、Flip-in、和Jump-in。其中，同源重组因高效率和容易控制而对于酵母真菌是优选的。

-载体-

核酸优选以载体承载状态处理。核酸优选是例如被具有粒子形状的载体(载体粒子)承载(更优选地被包封在其中)的形式。

载体没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括细胞、树脂、脂质体、微胶囊、金属粒子、磁性粒子、陶瓷粒子、聚合物粒子、和蛋白质粒子。

--细胞--

细胞意为具有核酸并且构成生物体的结构和功能单元。

细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，每种细胞均可被使用，无论是真核细胞、原核细胞、多细胞生物细胞、或单细胞生物体细胞。这些细胞可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

真核细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌、藻类、和原生动物。这些真核细胞可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，动物细胞或真菌是优选的。

粘附细胞可以是直接从组织或器官收集的原代细胞，或可通过直接从组织或器官收集的原代细胞的数次传代而获得，并且可根据目的被适当选择。其实例包括分化细胞和未分化细胞。

分化细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括：肝细胞，即肝实质细胞；星形细胞；Kupffer细胞；血管内皮细胞；内皮细胞，如窦状内皮细胞和角膜内皮细胞；成纤维细胞；成骨细胞；破骨细胞；牙周组织源细胞；表皮细胞，如表皮角质化细胞；气管上皮细胞；胃肠道上皮细胞；颈上皮细胞；上皮细胞，如角膜上皮细胞；乳腺细胞；周细胞；肌肉细胞，如平滑肌细胞和心肌细胞；肾细胞；胰岛细胞；神经细胞，如周围神经细胞和视神经细胞；软骨细胞；和骨细胞。

未分化细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择。未分化细胞的实例包括：多能干细胞，如具有多能性的胚胎干细胞和间充质干细胞；单能干细胞，如具有单能性的血管内皮祖细胞；和iPS细胞。

真菌没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括霉菌和酵母真菌。这些真菌可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，酵母真菌是优选的，因为其细胞周期可调并且可使用单倍体。

细胞周期意为在细胞生长时发生细胞分裂并且细胞分裂所产生的细胞(子细胞)变成再次进行细胞分裂的细胞(母细胞)以产生新的子细胞的过程。

酵母真菌没有具体限制并且可根据目的被适当选择。例如，酵母真菌优选与G0/G1期同步地被同步培养并且被固定至G1期。

酵母真菌优选是例如对信息素(性激素)——其将细胞周期控制至G1期——的敏感性增加的Bar-1缺陷型酵母。当酵母真菌是Bar-1缺陷型酵母时，具有不可控细胞周期的酵母真菌的丰度比可减少。例如，这可防止填充位点(孔)中包含的细胞中的特定核酸的数量增加。

原核细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括真细菌和古细菌。这些原核细胞可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

细胞优选是死细胞。当细胞是死细胞时，可防止分离后细胞分裂。

细胞优选是能够在接收光后发光的细胞。能够在接收光后发光的细胞可被降落到填充位点(孔)中，并且其细胞计数被高度准确地控制。

接收光意为细胞受光。

光学传感器意为通过透镜收集从可人眼检出的可见光到波长高于可见光的近红外区、短波长红外区和热红外区光的任何光并且获取目标细胞的形状等作为图像数据的无源传感器。

--能够在接收光后发光的细胞--

能够在接收光后发光的细胞没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该细胞能够在接收光后发光。其实例包括用荧光染料染色的细胞、表达荧光蛋白的细胞、和用荧光标记抗体标记的细胞。

细胞中的荧光染料染色位点、荧光蛋白表达位点、或荧光标记抗体标记位点的实例包括但不具体限于全细胞、细胞核、和细胞膜。

--荧光染料--

荧光染料的实例包括荧光素、偶氮类、罗丹明、香豆素、芘类、和花青。这些荧光染料可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，荧光素、偶氮类、或罗丹明是优选的，并且曙红、Evans蓝、台盼蓝、罗丹明6G、罗丹明B、或罗丹明123是更优选的。

市售产品可用作荧光染料。市售产品的实例包括商品名：曙红Y(由Wako PureChemical Industries,Ltd.制造)，商品名：Evans蓝(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)，商品名：台盼蓝(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)，商品名：罗丹明6G(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)，商品名：罗丹明B(由Wako PureChemical Industries,Ltd.制造)，和商品名：罗丹明123(由Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造)。

--荧光蛋白--

荧光蛋白的实例包括Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、标签CFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、标签GFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、标签YFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、标签RFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、和KikumeGR。这些荧光蛋白可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

--荧光标记抗体--

荧光标记抗体没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该荧光标记抗体具有荧光标记。其实例包括CD4-FITC和CD8-PE。这些荧光标记抗体可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

在游离状态下，细胞的体积平均粒度优选是30μm以下，更优选地10μm以下，特别优选7μm以下。体积平均粒度30μm以下的细胞可被适当地用于液滴排出单元如喷墨方法或细胞分选机。

细胞的体积平均粒度可通过例如下列测量方法测量。

从制备的已染色酵母分散液取样10μL等份，并将其置于PMMA塑料滑片(slide)上，并且体积平均粒度可利用自动细胞计数器(商品名：Countess Automated Cell Counter，由Invitrogen Corp.制造)测量。细胞数量也可通过类似的测量方法确定。

细胞悬浮液中的细胞浓度没有具体限制并且可根据目的被适当选择。该浓度优选是5×10⁴细胞/mL以上并且5×10⁸细胞/mL以下，更优选5×10⁴细胞/mL以上并且5×10⁷细胞/mL以下。细胞数量为5×10⁴细胞/mL以上并且5×10⁸细胞/mL以下的细胞可被可靠地包含在排出液滴中。细胞数量可利用自动细胞计数器(商品名：Countess Automated CellCounter，由Invitrogen Corp.制造)测量，如测量体积平均粒度的方法。

具有所述核酸的细胞的细胞数量没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要细胞数量为2以上。

-树脂-

树脂的材料、形状、尺寸和结构没有具体限制，并且可根据目的被适当选择，只要树脂可承载核酸。

-脂质体-

脂质体是由包含脂质分子的脂质双层形成的脂质囊泡，并且具体地意为含脂质封闭囊泡，其具有通过产生脂质分子的疏水基团和亲水基团极性的脂质双层与外界隔离的空间。

脂质体是由利用脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，并且封闭囊泡其空间内具有水相(内部水相)。内部水相包含水和类似物。脂质体可具有单个层结构(单层结构或单个双层膜)，或可具有多个层结构(多层结构或多个双层膜，具有洋葱状结构，其中各个层被水样层隔开)。

脂质体优选是可将核酸封装在其中的脂质体。其形式没有具体限制。术语"封装"意为核酸被包含在内部水相和脂质体膜自身中的实施方式。其实例包括核酸被包含在通过膜形成的封闭空间中或核酸被包封在膜自身中的实施方式。可采用其组合。

脂质体的尺寸(平均粒度)没有具体限制，只要脂质体可将核酸封装在其中。脂质体优选是球形或近球形形式。

构成脂质体的脂质双层(膜组分)的组分选自脂质。可使用任何可溶于水溶性有机溶剂和酯有机溶剂的混合溶剂的脂质。脂质的具体实例包括磷脂、磷脂以外的脂质、胆固醇和其衍生物。这种组分可由单类型的组分或多类型的组分构成。

-微胶囊-

微胶囊意为具有壁材和中空结构并且可在中空结构中封装核酸的微小粒子。

微胶囊没有具体限制，并且其壁材、尺寸等可根据目的被适当选择。

微胶囊的壁材的实例包括聚氨酯树脂、聚脲、聚脲-聚氨酯树脂、脲-甲醛树脂、三聚氰胺-甲醛树脂、聚酰胺、聚酯、聚磺酰胺、聚碳酸酯、聚亚磺酸酯、环氧树脂、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯酯、和明胶。这些壁材可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

微胶囊的尺寸没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要微胶囊可将核酸封装在其中。

产生微胶囊的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括原位方法、界面聚合方法、和凝聚方法。

核酸的其它形式可以是上述核酸分子的溶液、或具有用微型区域或载体创建的微小隔室的分散液。溶液或分散液的介质优选是水或水溶性溶剂如乙醇、DMSO、丙酮、或DMF。载体可具有任何形式，如金属粒子、磁性粒子、陶瓷粒子、聚合物粒子、或蛋白质粒子。微型区域的实例包括液滴和乳液。包括核酸分子的样品可具有任何形式，如细胞、病毒、液滴、或乳液。

<产生装置的方法>

在下文中，描述产生利用具有特定核酸作为所述核酸的细胞的装置的方法。

产生本发明核酸分析方法相关装置的方法包括：细胞悬浮液产生步骤，产生包含具有特定核酸的多个细胞和溶剂的细胞悬浮液；液滴降落步骤，通过以液滴排出细胞悬浮液，将液滴相继降落到平板的填充位点(孔)中；细胞计数步骤，在排出液滴后和将液滴降落到填充位点(孔)前，利用传感器计数液滴中包含的细胞；和核酸提取步骤，从填充位点(孔)中的细胞提取核酸。此方法优选地包括各步骤的不肯定性计算步骤、输出步骤、和记录步骤，以及任选地进一步包括另外的步骤。

<<细胞悬浮液产生步骤>>

细胞悬浮液产生步骤是产生包含具有特定核酸的多个细胞和溶剂的细胞悬浮液的步骤。

溶剂意为用于分散细胞的液体。

细胞悬浮液的悬浮意为细胞分散在溶剂中的状态。

产生(production)意为创建(creation)。

-细胞悬浮液-

细胞悬浮液包含具有特定核酸的多个细胞和溶剂。细胞悬浮液优选包含添加剂，以及任选地进一步包括另外的组分。

具有特定核酸的多个细胞如上所述。

--溶剂--

溶剂没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括水、培养基、分离液、稀释液、缓冲溶液、有机物裂解溶液、有机溶剂、聚合物凝胶溶液、胶体分散液、电解质水溶液、有机盐水溶液、金属水溶液、和其混合液体。这些溶剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，水或缓冲溶液是优选的，并且水、磷酸缓冲盐水(PBS)、或Tris-EDTA缓冲溶液(TE)是更优选的。

--添加剂-

添加剂没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括表面活性剂、核酸、和树脂。这些添加剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

表面活性剂可防止细胞之间聚集和提高连续排出稳定性。

表面活性剂没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。这些表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，非离子型表面活性剂是优选的，因为非离子型表面活性剂不使蛋白质变性和去活，虽然取决于表面活性剂添加量。

离子型表面活性剂的实例包括脂肪酸钠盐、脂肪酸钾盐、α-磺基脂肪酸酯钠、线性烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸酯钠、和α-烯烃磺酸钠。这些离子型表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，脂肪酸钠盐是优选的，并且十二烷基硫酸钠(SDS)是更优选的。

非离子型表面活性剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(Brij系列等)、辛基酚乙氧基化物(Triton X系列、Igepal CA系列、Nonidet系列、Nikkol OP系列等)、聚山梨酯(吐温系列如吐温20等)、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、和脂肪酸单甘油酯。这些非离子型表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，聚山梨酯是优选的。

表面活性剂的含量没有具体限制并且可根据目的被适当选择。该含量优选是相对于细胞悬浮液总量0.001质量％以上并且30质量％以下。0.001质量％以上的含量可产生添加表面活性剂所提供的效果。含量为30质量％以下的表面活性剂可抑制细胞聚集，并且可因此严格控制细胞悬浮液中的核酸拷贝数。

核酸没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要核酸对待检测核酸的检测不具有影响。其实例包括ColE1 DNA。该核酸可防止具有目标核苷酸序列的核酸粘附至填充位点(孔)的壁面等。

树脂没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括聚乙烯亚胺。

--其它材料--

其它材料没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括交联剂、pH调节剂、抗菌剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、润湿剂、和分散剂。

[分散细胞的方法]

分散细胞的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括介质模式如珠磨机、超声模式如超声均质机、和利用压力差的模式如French压力机。这些方法可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，超声模式是更优选的，因为此模式不损害细胞。介质模式可能因破碎能力强而破坏细胞膜或细胞壁，或介质可作为污染被混入细胞分散液。

[筛选细胞的方法]

筛选细胞的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括湿法分类、和利用细胞分选机或过滤器筛选。这些方法可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，利用细胞分选机或过滤器筛选是优选的，因为此方法不损害细胞。

对于细胞，优选通过测量细胞的细胞周期由细胞悬浮液的细胞数量估测具有目标核苷酸序列的核酸的数量。

测量细胞周期意为将数值转换基于细胞分裂的细胞数量。

估测核酸数量意为由细胞数量确定核酸拷贝数。

计数目标可以是目标核苷酸序列掺入数量，而非细胞数量。通常，目标核苷酸序列的数量可被认为等于细胞数量，因为选择了每个细胞掺入一个区域作为目标核苷酸序列的细胞，或通过基因重组引入目标核苷酸序列。然而，细胞在特定周期进行细胞分裂以胞内复制核酸。虽然细胞周期依据细胞类型而不同，但每个细胞包含的目标核苷酸序列数量的预期度和不肯定性可通过从细胞悬浮液取样预定量溶液和测量多个细胞的周期来计算。这例如通过利用流式细胞仪观察核染色细胞来实现。

不肯定性意为关于归因于产生测量目标相关的操作、仪器等的测量结果离差的信息。

计算意为计算数值。

图5是示例已复制DNA的细胞频率与荧光强度之间的关系的一个实例的图。如图5示例，依据目标核苷酸序列复制是否存在，两个峰出现在直方图(histogram)上。因此，可计算已复制DNA的细胞的存在百分比。每个细胞包含的目标核苷酸序列平均数量可由计算结果计算，并且可乘以上述细胞计数结果，以计算目标核苷酸序列的估测值。

还优选进行在制备细胞悬浮液前控制细胞周期的处理。通过将细胞周期控制到如上所述发生复制之前或之后的状态，目标核苷酸序列的数量可由细胞数量准确地计算。

优选计算待估测特定拷贝数的不肯定性。由此计算的不肯定性可基于数值被表示为方差或标准偏差，然后输出。在组合多个影响因子的情况下，可采用一般采用的标准偏差的平方和的平方根。例如，关于排出细胞的数量、细胞的DNA数量、和排出细胞降落到填充位点(孔)中的降落率的正确答案的百分比可作为该因子采用。其中，显著性(significantitem)可被选择和计算。

<<液滴降落步骤>>

液滴降落步骤是通过排出细胞悬浮液作为液滴，将液滴相继降落到装置的填充位点(孔)中的步骤。

液滴意为通过表面张力结合的液体团。

排出意为使细胞悬浮液作为液滴飞行。

术语"相继"意为有序和顺序。

降落意为使液滴到达填充位点(孔)。

使细胞悬浮液作为液滴排出的单元(在下文中，也被称为"排放头")可被适当地用作排出单元。

细胞悬浮液作为液滴排出模式的实例包括在喷墨方法中的按需模式和连续模式。其中，连续模式倾向于增加细胞悬浮液的使用死体积，因为液滴形成甚至在达到稳定排出状态前的空排、液滴量调节、和在填充位点(孔)之间移动的过程中也持续进行。在本发明中，从调节细胞数量的角度而言，优选减少死体积的影响。因此，在上述两种模式中，按需模式是更适当的。

按需模式的实例包括多个已知的模式，如通过向液体施压而排出液体的施压模式、通过加热造成膜沸腾而排出液体的热模式、和通过静电吸引拉动液滴而形成液滴的静电模式。其中，施压模式是优选的，理由如下。

静电模式需要建立面对保持细胞悬浮液和形成液滴的排出部的电极。在制备根据本发明的装置的方法中，液滴接收(平)板被布置使得该(平)板面对排出部。因此，不存在电极布置对于增强(平)板配置自由度是优选的。

热模式生成局部热，其可能影响作为生物材料的细胞或导致加热部粘连(结垢)。热的影响取决于(平)板的内容物和目的，因此不一定需要被排除。然而，施压模式是优选的，因为此模式比热模式更不易发生加热部粘连。

施压模式的实例包括利用压电元件向液体施压的模式、和利用阀门如电磁阀向其施压的模式。可用于细胞悬浮液液滴排出的液滴形成装置的配置实例被示例在图6A至6C中。

图6A是示例电磁阀模式的一个实例排放头的示意图。电磁阀模式的排放头具有电力马达13a、螺线阀112、液体室11a、细胞悬浮液300a、和喷嘴111a。

例如，TechElan LLC的分配器可适当地用作电磁阀模式的排放头。

图6B是示例压电模式的一个实例排放头的示意图。压电模式的排放头具有压电元件13b、液体室11b、细胞悬浮液300b、和喷嘴111b。

例如，Cytena GmbH的单细胞打印机可适当地用作压电模式的排放头。

虽然可使用这些排放头中任意种，但利用电磁阀的施压模式不能高速反复形成液滴。因此，压电模式优选用于提高(平)板生产通量。此外，利用压电元件13b的压电模式的一般排放头的问题可以是沉降导致细胞浓度不均匀、或喷嘴堵塞。

因此，更优选的配置包括图6C示例的配置。图6C是图6B中利用压电元件的压电模式排放头的变型实例的示意图。图6C的排放头具有压电元件13c、液体室11c、细胞悬浮液300c、和喷嘴111c。

在图6C的排放头中，控制设备(未示例)施加电压至压电元件13c，从而可在横向方向上对图6C的片材生成压应力，以使图6C的片材上的膜沿竖直方向变形。

按需模式以外的模式实例包括连续形成液滴的连续模式。在连续模式下，压电元件或加热器提供液滴在压力下被推出喷嘴时的规律间隔的波动。因此，微小液滴可被连续创建。进一步可以通过沿排出方向施加电压控制飞行中的液滴而在降落到填充位点(孔)中或回收到回收部中之间做出选择。这种模式用于细胞分选机或流式细胞仪。例如，可使用由Sony Corp.制造的名称为细胞分选机SH800的设备。

图7A是示例施加至压电元件的一个实例电压的示意图。图7B是示例施加至压电元件的另一实例电压的示意图。图7A显示用于形成液滴的驱动电压。可依据电压(V_A、V_B和V_C)的振幅而形成液滴。图7B显示用于在不排出液滴的情况下搅拌细胞悬浮液的电压。

在液滴不排出期间，液体室中的细胞悬浮液可通过输入强度不足以排出液滴的多个脉冲而被搅拌。这可防止可归因于细胞沉降的浓度分布。

本发明中可利用的排放头的液滴形成行为如下所述。

排放头施加脉冲电压至压电元件中形成的上电极和下电极，并且可从而排出液滴。图8A至8C是示例对应时机的液滴状态的示意图。

在图8A中，首先，通过施加电压至压电元件13c使膜12c迅速变形，使得液体室11c中保存的细胞悬浮液和膜12c之间存在高压力。通过此压力，液滴被推出喷嘴部。

然后，如图8B示例，经过使该压力向上放松的时间，液体被连续推出喷嘴部，使得液滴生长。

最后，如图8C示例，当膜12c恢复其原始状态时，在细胞悬浮液与膜12c之间的界面附近液体压力下降，以形成液滴310'。

在产生装置的方法中，配备有填充位点(孔)的(平)板被固定到可移动平台上，并且通过结合平台的驱动与液滴自排放头的形成，液滴被相继降落到凹处中。在此，移动(平)板的方法被示例为移动平台。自然，排出头可被移动。

(平)板没有具体限制，并且可使用常用于生物技术领域的配备有填充位点(孔)的(平)板。

(平)板中的填充位点(孔)的数量没有具体限制并且可根据目的被适当选择。可采用一个或多个填充位点(孔)。

图9是示例用于将液滴相继降落到(平)板的填充位点(孔)中的一个实例分配设备400的示意图。

如图9示例，用于降落液滴的分配设备400具有液滴形成设备401、(平)(平)板700、平台800、和控制设备900。

在分配设备400中，(平)板700被布置在平台800上，平台800被配合为可移动。(平)板700配备有多个填充位点(孔)710(凹处)，其中降落从液滴形成设备401的排放头排出的液滴310。控制设备900通过移动平台800控制液滴形成设备401的排放头与各填充位点(孔)710之间的相对位置关系。因此，包含荧光染色细胞350的液滴310可相继从液滴形成设备401的排放头被排出到对应填充位点(孔)710中。

控制设备900可被配置以包括例如CPU、ROM、RAM、或主存储器。在此情况下，控制设备900的各种功能可通过读取ROM或类似装置中记录的程序的主存储器和运行该程序的CPU而实现。然而，控制设备900可仅通过硬件被部分或全部实现。控制设备900可在物理上由多个设备等等构成。

优选液滴被排出以使液滴降落到填充位点(孔)中，从而在细胞悬浮液降落到填充位点(孔)中时获得多个水平。

所述多个水平意为多个参考用作标准。

对于所述多个水平，优选在填充位点(孔)中具有特定核酸的多个细胞具有预定浓度梯度。这种具有浓度梯度的细胞可被适当地用作校准曲线试剂。所述多个水平可利用传感器计数的数值而被控制。

例如，1孔微管、8条管、或96孔或384孔填充位点(孔)板优选用作(平)板。在多个填充位点(孔)的情况下，细胞可被以相同数量分配至(平)板中的这些填充位点(孔)，或可被以不同数量水平布置在其中。而且，可存在无细胞填充位点(孔)。例如，可以制备这样的(平)板：其中细胞(或核酸)以7个水平分配：约1、2、4、8、16、32、和64。

<<细胞计数步骤>>

细胞计数步骤是在排出液滴后和在填充位点(孔)中降落液滴前利用传感器计数液滴中包含的细胞的步骤。

传感器意为通过应用一定科学原理，用人或机器容易操纵的其它介质的信号替代自然现象或人工材料的机械、电磁、热学、声学、或化学性质、或者其指示的空间或时间信息的设备。

计数意为确定数量。

细胞计数步骤没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要在排出液滴后和在填充位点(孔)中降落液滴前利用传感器计数液滴中包含的细胞。细胞计数步骤可包括在排出前观察细胞的处理、或在降落后计数细胞的处理。

对于在排出液滴后和在填充位点(孔)中降落液滴前计数液滴中包含的细胞，优选在液滴位于紧邻填充位点(孔)开口上方(预期液滴稳妥进入(平)板的填充位点(孔)的位置)的时机观察液滴中的细胞。

观察液滴中的细胞的方法的实例包括光学检测方法和电力或磁性检测方法。

-光学检测方法-

下文参考图10、14和15描述光学检测方法。图10是示例一个实例液滴形成设备401的示意图。图14和15是示例另一实例液滴形成设备(分别为401A和401B)的示意图。如图10示例，液滴形成设备401具有排放头(液滴排出单元)10、驱动单元20、光源30、光接收元件60、和控制单元70。

在图10中，通过用具体染料使细胞荧光染色以及然后将细胞分散在预定溶液中而获得的液体用作细胞悬浮液。用从光源发出的具有具体波长的光照射由排放头形成的液滴，并通过光接收元件检测细胞发出的荧光，以计数细胞。关于这点，可利用用荧光染料染色细胞的方法以及细胞原来包含的分子所发出的自体荧光，或可通过提前向细胞引入荧光蛋白(例如，GFP(绿色荧光蛋白))产生基因而使细胞发出荧光。

用光照射意为暴露于光。

排放头10具有液体室11、膜12、和驱动元件13，并且可以液滴排出包含悬浮在其中的荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。

液体室11是保存包含悬浮在其中的荧光染色细胞350的细胞悬浮液300的液体储器，并且下侧配备有作为通孔的喷嘴111。液体室11可由例如金属、硅、或陶瓷形成。荧光染色细胞350的实例包括用荧光染料染色的无机精细粒子和有机聚合物粒子。

膜12是固定至液体室11的上端部分的膜状部件。膜12的平面形状可以例如是圆润的，并且可以例如是椭圆形或四边形。

驱动元件13被提供在膜12的顶侧上。驱动元件13的形状可根据膜12的形状而设计。例如，圆润的驱动元件13优选在膜12的平面形状圆润时被提供。

从驱动单元20向驱动元件13提供驱动信号，可使膜12振动。膜12的振动允许喷嘴111排出包含荧光染色细胞350的液滴310。

在利用压电元件作为驱动元件13的情况下，此驱动元件可具有例如在压电材料的上表面和下表面上配备有电极以施加电压的结构。在此情况下，驱动单元20施加电压至压电元件的上电极和下电极之间，使得可在图10的片材上沿横向方向生成压应力，以使膜12在图10的片材上沿竖直方向振动。例如，锆钛酸铅(PZT)可用作压电材料。另外，可使用各种压电材料，如氧化铋铁、金属铌酸盐、钛酸钡、和补充有金属或不同氧化物的这些材料。

光源30用光L照射飞行中的液滴310。术语"飞行中"意为从液滴310自液滴排出单元10排出至其降落至降落目标的状态。飞行中的液滴310是在光L照射位置处基本上球形的。光L的光束形状是基本上环形。

在此环境下，光L的光束直径优选是液滴310直径的10倍至100倍的数量级。这是因为液滴310稳妥地被来自光源30的光L照射——即使液滴310存在于不同的位置。

然而，光L的光束直径显著超过液滴310直径100倍是不优选的。这是因为，随着液滴310的照射光的能量密度减少，通过光L作为激发光发出的荧光Lf减少，并且难以被光接收元件60检出。

从光源30发出的光L优选是脉冲光。例如，固态激光器、半导体激光器、或染料激光器被适当地使用。当光L是脉冲光时，其脉冲宽度优选是10μs以下，更优选1μs以下。单位脉冲的能量很大程度上取决于光学系统，如是否存在光采集，并且总体优选为0.1μJ以上，更优选1μJ以上。

当飞行中的液滴310包含荧光染色细胞350时，光接收元件60接收从吸收光L作为激发光的荧光染色细胞350发出的荧光Lf。荧光Lf沿所有方向从荧光染色细胞350发出。因此，光接收元件60可被布置在允许接收荧光Lf的任何位置处。关于这点，为提高对比度，优选将光接收元件60布置在光源30的传出光L不是正直入射(directly incident)的位置处。

光接收元件60没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该元件可接收从荧光染色细胞350发出的荧光Lf。光接收元件优选是照射具有具体波长的光和接收来自液滴中的细胞的荧光的光学传感器。光接收元件60的实例包括一维元件如光电二极管和光传感器。光电倍增器管或雪崩光电二极管优选在需要高灵敏度测量时使用。例如，二维元件如CCD(电荷耦合装置)、CMOS(互补金属氧化物半导体)、或门CCD可用作光接收元件60。

由于荧光染色细胞350发出的荧光Lf弱于光源30发出的光L，使光L的波长区域衰减的滤波器可建立在平台上、光接收元件60前(光接收面侧)。因此，可在光接收元件60中获得对比度极高的荧光染色细胞350的图像。例如，使包括光L波长的具体波长区域衰减的陷波器可用作滤波器。

如上所述，从光源30发出的光L优选是脉冲光。从光源30发出的光L可以是连续振荡光。在此情况下，光接收元件60优选被控制以能够在飞行中的液滴310被连续振荡光照射的时机截获光并从而接收荧光Lf。

控制单元70具有控制驱动单元20和光源30的功能。控制单元70还具有基于光接收元件60接收的光量获得信息和计数液滴310中包含的荧光染色细胞350(还包括为0的情况)的功能。在下文中，参考图11至16描述液滴形成设备401的行为——包括控制单元70的行为。

图11是示例图10的液滴形成设备中的控制单元硬件区块的图。图12是示例图10的液滴形成设备中的控制单元的功能区块的图。图13是示例液滴形成设备的一个实例行为的流程图。

如图11示例，控制单元70具有CPU 71、ROM 72、RAM 73、I/F 74、和总线75。CPU 71、ROM 72、RAM 73、和I/F 74通过总线75相互连接。

CPU 71控制控制单元70的各功能。ROM 72，作为存储单元，存储通过CPU 71运行以控制控制单元70的各功能的程序和各种信息。RAM 73，作为存储单元，用作CPU 71的工作区或类似物。RAM 73还可暂时存储预定信息。I/F 74是连接液滴形成设备401与另外的仪器或类似物的界面。液滴形成设备401可通过I/F 74连接至外部网络或类似物。

如图12示例，控制单元70具有排出控制单元701、光源控制单元702、和细胞计数单元(细胞数量感测单元)703作为功能区块。

参考图12和13描述液滴形成设备401的细胞(粒子)计数。首先，在步骤S11中，控制单元70的排出控制单元701向驱动单元20发出排出命令。从排出控制单元701接收到排出命令的驱动单元20提供驱动信号至驱动元件13以使膜12振动。膜12的振动允许喷嘴111排出包含荧光染色细胞350的液滴310。

接着，在步骤S12中，与液滴310的排出同步(与从驱动单元20提供至液滴排出单元10的驱动信号同步)，控制单元70的光源控制单元702向光源30发出打开命令。因此，光源30被打开，使得飞行中的液滴310被光L照射。

在此环境下，同步不意为光源在液滴排出单元10排出液滴310的同时(在驱动单元20向液滴排出单元10提供驱动信号的同时)发出光，而是意为光源30在飞行液滴310到达预定位置后液滴310被光L照射的时机发出光。换句话说，光源控制单元702控制光源30，从而相对于液滴排出单元10排出液滴310(从驱动单元20至液滴排出单元10提供驱动信号)延迟预定时间后发出光。

例如，提前测量将在提供驱动信号至液滴排出单元10后排出的液滴310的速度v。然后，基于测量的速度v计算排出液滴310到达预定位置的时间t。从光源30进行光照射时机相对于提供驱动信号至液滴排出单元10的时机延迟t。这能够实现发光被有利地控制，并且允许液滴310被来自光源30的光稳妥地照射。

接着，在步骤S13中，控制单元70的细胞计数单元703基于来自光接收元件60的信息计数液滴310中包含的荧光染色细胞350(还包括为0的情况)。在此环境下，来自光接收元件60的信息是荧光染色细胞350的亮度值(光量)或面积值。

细胞计数单元703可计数荧光染色细胞350——例如通过比较光接收元件60中接收的光量与预设阈值。在此情况下，一维元件或二维元件可用作光接收元件60。

在利用二维元件作为光接收元件60的情况下，细胞计数单元703可采用基于由光接收元件60获得的二维图像进行图像处理以计算荧光染色细胞350的亮度值或面积的方法。在此情况下，细胞计数单元703可通过以下计数荧光染色细胞350：通过图像处理计算荧光染色细胞350的亮度值或面积值，和将计算的亮度值或面积值与预设阈值比较。

荧光染色细胞350可以是细胞或染色细胞。染色细胞意为用荧光染料染色的细胞、或能够表达荧光蛋白的细胞。

用于染色细胞的荧光染料没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括荧光素、罗丹明、香豆素、芘类、花青、和偶氮类。这些荧光染料可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，曙红、Evans蓝、台盼蓝、罗丹明6G、罗丹明B、或罗丹明123是更优选的。

荧光蛋白的实例包括Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、标签CFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、标签GFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、标签YFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、标签RFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、和KikumeGR。这些荧光蛋白s可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

因此，在液滴形成设备401中，驱动单元20提供驱动信号至液滴排出单元10(液滴排出单元10保存包含悬浮在其中的荧光染色细胞350的细胞悬浮液300)以排出包含荧光染色细胞350的液滴310，并且飞行中的液滴310被来自光源30的光L照射。然后，飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350随着光L作为激发光发出荧光Lf，并且光接收元件60接收荧光Lf。基于来自光接收元件60的信息，细胞计数单元703进一步计数飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350。

换句话说，在液滴形成设备401中，实际上当场观察到飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量。这可比以往提高荧光染色细胞350的计数准确度。由于飞行液滴310中包含的荧光染色细胞350被荧光Lf照射以发出光L并且光L被光接收元件60接收，可以高对比度获得荧光染色细胞350的图像。这可降低荧光染色细胞350的错误计数发生频率。

图14是示例图10的液滴形成设备401的变型实例的示意图。如图14示例，液滴形成设备401A与液滴形成设备401(参见图10)的区别在于镜40被布置在平台处光接收元件60前。关于与已述实施方式相同的构件部分的描述可被省略。

因此，在液滴形成设备401A中，布置在平台处光接收元件60前的镜40可提高光接收元件60的布局自由度。

例如，图10的布局可能在喷嘴111接近降落目标时造成降落目标与液滴形成设备401的光学系统(具体地，光接收元件60)之间的干扰。另一方面，图14的布局可避免造成该干扰。

如图14示例，光接收元件60的布局改变可减少液滴310降落的降落目标与和喷嘴111之间的间隙，并且可防止液滴降落位置变动。因此，可提高分配准确度。

图15是示例图10的液滴形成设备401另一变型实例的示意图。如图15示例，液滴形成设备401B与液滴形成设备401(参见图10)的区别在于在接收荧光染色细胞350发出的荧光Lf₁的光接收元件60以外还提供接收荧光染色细胞350发出的荧光Lf₂的光接收元件61。关于与已述实施方式相同或相似的构件部分的描述可省略。

在此环境下，荧光Lf₁或Lf₂指代从荧光染色细胞350沿所有方向发出的荧光的一部分。光接收元件60和61可被布置在任何允许接收从荧光染色细胞350沿不同方向发出的荧光的位置。三个以上光接收元件可被布置在允许接收从荧光染色细胞350沿不同方向发出的荧光的位置。对应光接收元件可具有相同规格或可具有不同规格。

在利用单个光接收元件的情况下，细胞计数单元703可能在飞行液滴310包含多个荧光染色细胞350时由于荧光染色细胞350重叠而错误计数(导致计数错误)液滴310中包含的荧光染色细胞350。

图16A和16B是示例飞行液滴包含两个荧光染色细胞的情况的图。例如，荧光染色细胞350₁和350₂可如图16A示例彼此重叠，同时荧光染色细胞350₁和350₂可如图16B示例不彼此重叠。提供两个以上光接收元件可减少重叠荧光染色细胞的影响。

如上所述，细胞计数单元703可通过以下计数荧光粒子：通过图像处理而计算荧光粒子的亮度值或面积值，和将计算的亮度值或面积值与预设阈值比较。

在设置两个以上光接收元件的情况下，可通过采用由对应光接收元件获得的亮度值或面积值之中呈现最大值的数据而防止计数错误。这被参考图17更详细描述。

图17是示例无粒子重叠情况下亮度值Li和实际测量亮度值Le之间的关系的图。如图17示例，在液滴中无粒子重叠的情况下Le＝Li。例如，当一个细胞的亮度值限定无Lu时，在细胞数量/液滴＝1时Le＝Lu，并且在粒子数量/液滴＝n时Le＝nLu(n：自然数)。

然而，实际上，当n为2以上时粒子可彼此重叠。因此，实际测量亮度值为Lu≤Le≤nLu(图16A的阴影区)。因此，例如，阈值可在细胞数量/液滴＝n时设置为(nLu-Lu/2)≤阈值<(nLu+Lu/2)。在设置多个光接收元件的情况下，可通过采用由对应光接收元件获得的数据之中呈现最大值的数据而防止计数错误。可使用面积值代替亮度值。

在设置多个光接收元件的情况下，可利用基于多个获得的形状数据估测细胞数量的算法来确定粒子数量。

因此，液滴形成设备401B具有接收荧光染色细胞350沿不同方向发出的荧光的多个光接收元件，并且可因此进一步降低荧光染色细胞350的错误计数发生频率。

图18是示例图10的液滴形成设备401的替代性变型实例的示意图。如图18示例，液滴形成设备401C与液滴形成设备401(参见图10)的区别在于液滴排出单元10被液滴排出单元10C替代。关于与已述实施方式相同的构件部分的描述可省略。

液滴排出单元10C具有液体室11C、膜12C、和驱动元件13C。液体室11C在其上部具有大气释放部(atmospheric relieving part)115，其使液体室11C内部对大气开放，并且被配置以能够从大气释放部115逐出混入细胞悬浮液300的气泡。

膜12C是被固定至液体室11C的下端部分的膜状部件。喷嘴121，作为通孔，在膜12C的基本上中心处形成。通过膜12C的振动，液体室11C中保存的细胞悬浮液300作为液滴310从喷嘴121排出。由于液滴310通过膜12C的振动惯性形成，甚至具有高表面张力(高粘度)的细胞悬浮液300也可被排出。膜12C的平面形状可以例如是圆润的，并且可以例如是椭圆形或四边形的。

膜12C的材料没有具体限制。当材料过软时，膜12C容易被振动，并且因此难以在排出不存在时立即抑制振动。因此优选使用具有一定程度的硬度的材料。例如，具有一定程度的硬度的金属材料、陶瓷材料、或聚合物材料可用作膜12C的材料。

具体地，当细胞用作荧光染色细胞350时，该材料优选对细胞或蛋白质具有低粘附性。总体上，细胞粘附性被认为取决于材料和水之间的接触角，和高亲水性或高疏水性材料对细胞粘附性低。各种金属材料或陶瓷(金属氧化物)可用作高亲水性材料。氟树脂或类似物可用作高疏水性材料。

这种材料的其它实例可包括不锈钢、镍、铝、二氧化硅、氧化铝、和氧化锆。另外，还可以通过涂覆材料表面降低细胞粘附性。例如，材料表面可用上述金属或金属氧化物材料涂覆，或可用模拟细胞膜的合成磷脂聚合物(例如，由NOF Corp.,Lipidure制造)涂覆。

喷嘴121优选在膜12C的基本上中心处作为基本上真圆形通孔形成。在此情况下，喷嘴121的直径没有具体限制和优选是荧光染色细胞350的尺寸2倍以上，以避免荧光染色细胞350堵塞喷嘴121。当荧光染色细胞350是例如动物细胞(具体地人细胞)时，根据所用细胞，喷嘴121的直径优选是10μm以上，更优选100μm以上，因为人细胞的尺寸总体上在5μm至50μm的数量级上。

另一方面，当液滴过大时，难以实现形成微小液滴的目的。因此，喷嘴121的直径优选是200μm以下。换句话说，液滴排出单元10C中的喷嘴121的直径一般在10μm至200μm的范围内。

驱动元件13C在膜12C的下侧上形成。驱动元件13C的形状可依据膜12C的形状设计。例如，在膜12C的平面形状圆润时，具有环样平面形状的驱动元件13C优选在喷嘴121周围形成。驱动元件13C的驱动模式可类似于驱动元件13。

驱动单元20可选择性地(例如，替代地)赋予驱动元件13C以排出波形，以使膜12C振动，以形成液滴310；和搅拌波形，以使膜12C振动，而不形成液滴310。

例如，通过通过将排出波形和搅拌波形塑形为矩形波，和使排出波形的驱动电压低于搅拌波形，可防止通过施加搅拌波形而形成液滴310。换句话说，膜12C的振动状态(振动程度)可通过驱动电压的振幅被控制。

在液滴排出单元10C中，驱动元件13C在膜12C的下侧上形成。因此，膜12C通过驱动元件13C的振动能够生成从液体室11C下部至上部方向的流动。

此时，荧光染色细胞350的移动是从下至上的移动，使得对流在液体室11C内发生，以搅拌包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。液体室11C下部至上部方向的流动使液体室11C内沉降和聚集的荧光染色细胞350均匀地分散。

换句话说，通过施加排出波形至驱动元件13C，和控制膜12C的振动状态，驱动单元20允许喷嘴121排出液体室11C中保存的细胞悬浮液300作为液滴310。驱动单元20还可通过施加搅拌波形至驱动元件13C，和控制膜12C的振动状态而搅拌液体室11C中保存的细胞悬浮液300。搅拌过程中无液滴310从喷嘴121排出。

因此，通过搅拌细胞悬浮液300——期间无液滴310形成，可防止荧光染色细胞350沉降和聚集在膜12C上，并且荧光染色细胞350可均匀地分散到细胞悬浮液300中。这可防止喷嘴121堵塞和排出液滴310中荧光染色细胞350的数量改变。由此，可长期连续地和稳定地排出包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300作为液滴310。

在液滴形成设备401C中，气泡可被混入液体室11C内的细胞悬浮液300中。也是在此情况下，液滴形成设备401C可通过大气释放部115将混入细胞悬浮液300的气泡逐出至外界空气，因为大气释放部115被提供在液体室11C的上部。这能够使液滴310连续和稳定形成，而不因气泡逐出而抛弃大量液体。

具体地，当气泡混入喷嘴121附近或大数量气泡混合到膜12C上时，其影响排出状态。因此，液滴长时间稳定形成需要逐出由此混合的气泡。通常，混合到膜12C上的气泡自发地或通过膜12C的振动向上移动。大气释放部115被提供在液体室11C中，并且因此能够逐出混合的气泡。因此，即使气泡被混合到了液体室11C上，也可防止排出故障。因此，液滴310可连续和稳定形成。

在无液滴形成的时机，通过振动膜12C，可积极地允许气泡在液体室11C中向上移动，而不形成液滴。

-电力或磁性检测方法-

关于电力或磁性检测方法，如图19示例，在从液体室11'至(平)板700'排出细胞悬浮液作为液滴310'的排放头下方紧邻处，用于细胞计数的线圈200被建立作为传感器。细胞可被用具体蛋白质修饰，并且被覆以能够粘附至细胞的磁珠。因此，可基于在附接磁珠的细胞通过线圈时产生的感应电流检测飞行液滴中是否存在细胞。总体上，细胞具有细胞其表面上独有的蛋白质。磁珠用能够结合此蛋白质的抗体修饰，并且可从而附接至细胞。现成制品可用作这种磁珠。例如，由VERITAS Corp.制造的Dynabeads(R)是可用的。

[在排出前观察细胞的处理]

在排出前观察细胞的处理的实例包括如图20示例计数已通过微通道250的细胞350'的方法、和如图21示例获取排放头喷嘴部附近的图像的方法。图20的方法用于细胞分选机设备，并且可利用例如由Sony Corp.制造的细胞分选机SH800。在图20中，在通过用来自光源260的激光照射微通道250内部，和通过检测器255利用聚光透镜265检测散射光或荧光来鉴定细胞是否存在或细胞类型时，液滴可形成。通过利用此方法，根据已通过微通道250的细胞数量可预测降落到预定填充位点(孔)中的细胞数量。

由Cytena GmbH制造的单细胞打印机可用作图21示例的排放头10'。在图21中，降落到预定填充位点(孔)中的细胞数量可在排出前通过由图像获取部255'中通过喷嘴部附近的透镜265'获取的图像的结果估测喷嘴部附近的细胞350"已被排出，或通过由排出之前和之后获得的图像之间的差异估测可能已被排出的细胞数量来预测。在如图20示例计数已通过微通道的细胞的方法中液滴连续形成，而在图21中按需液滴形成是可能的，其是更优选的。

[在降落后计数细胞的处理]

在降落后计数细胞的处理包括通过在荧光显微镜下观察(平)板中的填充位点(孔)而检测荧光染色细胞的方法。此方法被描述于例如Sangjun et al.,PLoS One,Volume6(3),e17455。

在液滴排出前和其降落后观察细胞的方法具有下述问题。依据产生的(平)板类型，最优选在排出过程中观察液滴中的细胞。在排出前观察细胞的方法中，基于已通过通道的细胞或根据排出前(和排出后)图像观察来计数看似已降落的细胞，因此没有验证细胞实际上是否已被排出并且可产生意外错误。例如，发生如下情况：污脏喷嘴部没能恰当排出液滴，液滴进而附着至喷嘴板；因此，液滴中的细胞不能降落。另外，如下问题可产生：细胞留在喷嘴部中的狭窄区域，细胞通过排出行为的移动大于预期并且落到观察范围之外。

在降落后检测(平)板上细胞的方法也可有问题。首先，需要制备可显微镜观察的(平)板。具有透明平底的(平)板，具体地具有玻璃底的(平)板一般被用作可观察的(平)板。由于这种(平)板是专用的，存在一般填充位点(孔)不可用的问题。还存在细胞数量高达数十等的细胞彼此重叠并且因此无法精确计数的问题。因此，优选除液滴排出后和在液滴降落到填充位点(孔)中前利用传感器和粒子(细胞)计数单元计数液滴中包含的细胞外还进行在排出前观察细胞的处理或在降落后计数细胞的处理。

具有一个或几个光接收部的光接收元件，例如，光电二极管、雪崩光电二极管、或光电倍增器管，可用作光接收元件。另外，可使用配备有二维阵列形式的光接收元件的二维传感器，如CCD(电荷耦合装置)、CMOS(互补金属氧化物半导体)、或门CCD。

在利用具有一个或几个光接收部的光接收元件的情况下，掺入液滴的细胞数量可利用提前制备的校准曲线由荧光强度确定。一般，飞行液滴中是否存在细胞被二元检测。当细胞悬浮液具有足够低的细胞浓度并且基本上以仅一个或零个细胞掺入液滴的状态被排出时，二元检测能够以足够的准确度计数细胞。假设细胞被无规布置在细胞悬浮液中，飞行液滴中的细胞数量可能遵循泊松分布。因此，两个以上细胞掺入液滴的概率P(>2)通过下文给出的式(1)表示。图22是示例概率P(>2)和平均细胞数之间的关系的图。在此环境下，λ表示液滴中的平均细胞数，并且通过细胞悬浮液的细胞浓度乘以排出液滴体积而获得。

P(>2)＝1-(1+λ)×e^-λ...式(1)

在通过二元检测计数细胞的情况下，足够小值的概率P(>2)对于确保准确度是优选的，并且概率P(>2)为1％以下时λ<0.15是优选的。光源没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要细胞的荧光可被激发。例如，可使用滤波以发出具体波长的普通灯如汞灯或卤素灯、LED(发光二极管)、或激光器。然而，具体地，对于形成1nL以下微小液滴，优选使用激光，因为需要用具有高强度的光照射狭窄区域。公知的各种激光器如固态激光器、气体激光器、和半导体激光器可用作激光光源。激发光源可以是被连续照射的液滴通过区域，或可与液滴排出同步在相对于液滴排出行为延迟预定时间的时机发出脉冲光。

<<不肯定性计算步骤>>

不肯定性计算步骤是计算各步骤如细胞悬浮液产生步骤、液滴降落步骤、和细胞计数步骤的不肯定性的步骤。

不肯定性可以与细胞悬浮液产生步骤中不肯定性相同的方式计算。

关于不肯定性的计算时机，不肯定性可在细胞计数步骤接下来的步骤中统一计算。可选地，不肯定性可在各步骤如细胞悬浮液产生步骤、液滴降落步骤和细胞计数步骤的最后阶段计算，并且计算的不肯定性成分可在细胞计数步骤接下来的步骤中组合，以计算组合不肯定性。换句话说，上述各步骤的不肯定性可在计算组合不肯定性前被适当地计算。

<<输出步骤>>

输出步骤是基于通过利用传感器测量获得的检测结果通过粒子计数单元输出降落在填充位点(孔)中的细胞悬浮液中包含的细胞计数值的步骤。

计数值意为根据通过利用传感器测量的获得的检测结果通过粒子计数单元计数的、填充位点(孔)中包含的细胞数量。

输出意为响应输入通过设备如原动机、通信设备、或计算机将计数值作为电子信息传输至服务器作为外部计数结果存储单元，或将计数值打印为打印物。

输出步骤包括观察或预测在(平)板产生时(平)板中各填充位点(孔)的细胞数量或核酸数量，和输出观察值或预测值至外部存储部。

输出可与细胞计数步骤同时进行，或可在细胞计数步骤后进行。

<<记录步骤>>

记录步骤是在输出步骤中记录观察值或预测值输出结果的步骤。

记录步骤可适当地在记录部中进行。

记录可与输出步骤同时进行，或可在输出步骤后进行。

记录意图不仅包括给予信息至记录介质，而且包括在记录部中存储信息。

<<核酸提取步骤>>

核酸提取步骤是从填充位点(孔)中的细胞提取核酸的步骤。

提取意为从细胞获得核酸——通过破坏其细胞膜或细胞壁。

已知90℃至100℃的热处理方法是一种从细胞提取核酸的方法。低于90℃的热处理可能不能提取DNA，而高于100℃的热处理可能分解DNA。这种热处理优选通过添加表面活性剂进行。

表面活性剂没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。这些表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，非离子型表面活性剂是优选的，因为非离子型表面活性剂不使蛋白质变性和去活，虽然取决于表面活性剂的添加量。

离子型表面活性剂的实例包括脂肪酸钠盐、脂肪酸钾盐、α-磺基脂肪酸酯钠、线性烷基苯磺酸钠、烷基硫酸酯钠、烷基醚硫酸酯钠、和α-烯烃磺酸钠。这些离子型表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，脂肪酸钠盐是优选的，并且十二烷基硫酸钠(SDS)是更优选的。

非离子型表面活性剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(Brij系列等)、辛基酚乙氧基化物(Triton X系列、Igepal CA系列、Nonidet P系列、Nikkol OP系列等)、聚山梨酯(吐温系列如吐温20等)、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、和脂肪酸单甘油酯。这些非离子型表面活性剂可被单独使用或其两种以上可被组合使用。其中，聚山梨酯是优选的。

表面活性剂的含量优选是相对于填充位点(孔)中的细胞悬浮液总量0.01质量％以上并且5.00质量％以下。0.01质量％以上的含量可对DNA提取发挥作用。含量为5.00质量％以下的表面活性剂可防止PCR扩增抑制。因此，在产生该双重作用的数值范围方面，含量优选是0.01质量％以上并且5.00质量％以下，如上所述。

上述方法可能未从具有细胞壁的细胞充分提取DNA。在此情况下，提取方法的实例包括诸如下列的模式：渗透休克方法、冻融方法、酶消化方法、DNA提取试剂盒使用、超声方法、French压力机方法、和均质机。其中，酶消化方法是优选的，因为此方法呈现较少提取DNA损失量。

<<其它步骤>>

其它步骤没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括酶去活步骤。

-酶去活步骤-

酶去活步骤是使酶去活的步骤。

酶的实例包括DNA酶、RNA酶、和用于在核酸提取步骤中提取核酸的酶。

酶去活方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。本领域已知的方法可被适当地使用。

用于本发明的核酸分析方法的装置可通过上述方法制备。

<校准曲线数据生成步骤和校准曲线数据生成部>

校准曲线数据生成步骤是基于特定拷贝数的标准品核酸的拷贝数生成关于至少一种标准品核酸的校准曲线数据的步骤。校准曲线数据生成步骤被校准曲线数据生成部和校准曲线数据生成单元适当地实施。

校准曲线数据意为关于所述至少一种标准品核酸的核苷酸序列(拷贝数)的数量的数据。校准曲线数据可以是生成的数据本身，并且也意图包括源自数据的校准曲线本身。

校准曲线意为诸如用于分析的具有已知量或活性的物质的量或活性的参数与不同于该参数的参数之间关的系式。该参数没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括特定核苷酸序列的"拷贝数(拷贝)"、和特定核苷酸序列的"读数数量"。

校准曲线数据可由关于通过校准曲线数据生成单元获取的文库中的标准品核酸的拷贝数的数据生成。校准曲线数据没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要该数据与后述利用分析仪器获取的文库中标准品核酸的拷贝数相关。由特定拷贝数的标准品核酸生成校准曲线数据的方法没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括通过核酸扩增方法扩增特定拷贝数的标准品核酸的和通过关系式表示扩增结果与原始特定拷贝数之间的关系方法。

通过在校准曲线数据生成步骤中利用特定拷贝数的标准品核酸，本发明的核酸分析方法可高度准确地分析(定量)甚至极少量的分析物核酸。

在校准曲线数据生成步骤中，优选地，特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸以数彼此不同的特定拷贝数被包括在两个以上不同体系中，并且因此由标准品核酸获得的校准曲线数据被标准化和组合以生成校准曲线。通过特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸以彼此不同的特定拷贝数被包括在两个以上不同体系中的实施方式，标准品核酸的使用类型可减少，并且因此由标准品核酸获得的校准曲线数据被标准化和组合以生成校准曲线。

<分析物核酸分析步骤和分析物核酸分析部>

分析物核酸分析步骤是在鉴定分析物核酸的核苷酸序列数量的同时鉴定分析物核酸的核苷酸序列的步骤。分析物核酸分析步骤被分析物核酸分析部适当地实施。

分析物核酸的核苷酸序列鉴定意为读取分析物核酸的核苷酸序列。

分析物核酸的核苷酸序列数量鉴定意为利用校准曲线数据生成步骤中生成的校准曲线由分析物核酸测量值(读数数量等)来计数分析物核酸中包括的核苷酸序列拷贝数。当分析物核酸包括两种以上具有不同核苷酸序列的核酸(片段)时，核苷酸序列鉴定和核苷酸序列数量鉴定关于分析物核酸中包括的各核苷酸序列进行。被读取分析物核酸的数据可关于各核苷酸序列以称为"读数数量"的单位被管理。

分析物核酸的数量也被称为"拷贝数"、"分子数量"等。

分析物核酸分析步骤可与上述校准曲线数据生成步骤并行进行(处理)。

关于分析物核酸分析步骤，参见例如Illumina，Inc.(https://www.adres.ehime-u.ac.jp/news/NGS1.pdf)公开的新一代测序仪分析方法(非专利文献1)中描述的方法、利用纳米孔装置(Oxford Nanopore Technologies Ltd..)测序的分析方法、利用PacBio RSII/Sequel系统(Pacific Biosciences of California，Inc.)测序的分析方法、和IonTorrent^TM半导体测序系统系列(Thermo Fisher Scientific Inc.)的分析方法。分析物核酸分析步骤可通过用于这些分析方法每一种的分析仪器进行。

分析仪器没有具体限制并且可根据目的被适当选择。其实例包括由Illumina，Inc.制造的测序仪、纳米孔装置、由Pacific Biosciences of California，Inc.制造的单分子测序仪、和由Thermo Fisher Scientific Inc.制造的Ion Torrent^TM半导体测序仪。市售产品可作为分析仪器使用。市售产品的实例包括：Miseq(由Illumina，Inc.制造)；MiION、GridION、和PromethION(由Oxford Nanopore Technologies Ltd.制造)；PacBio RS II(由Pacific Biosciences of California，Inc.制造)；和Ion Gene Studio S5(ThermoFisher Scientific Inc.)。

本发明核酸分析程序的处理可利用具有控制部构成核酸分析设备的计算机进行。

下文描述核酸分析设备的硬件配置和功能配置。

<核酸分析设备的硬件配置>

图24是示例核酸分析设备100的一个实例硬件配置的框图。

如图24示例，核酸分析设备100具有CPU(中央处理单元)101、主存储102、辅存储103、输出设备104、和输入设备105。这些部件通过总线106彼此连接。

CPU 101是多方面进行控制或操作的处理设备。CPU 101通过运行主存储102或类似物中存储的OS(操作系统)或程序而实现各种功能。具体地，本实例中的CPU 101通过运行核酸分析程序而充当核酸分析设备100的控制部130。

CPU 101控制全核酸分析设备100的行为。在本实例中，控制全核酸分析设备100的行为的设备被设置为CPU 101，虽然设备不限于此。这种设备可以是例如FPGA(现场可编程门阵列)。

核酸分析程序或各种数据库不一定需要被存储在主存储102、辅存储103、或类似物中。核酸分析程序或各种数据库可被存储在通过因特网、LAN(局域网)、WAN(广域网)、或类似物连接至核酸分析设备100的另外的信息处理设备等中。核酸分析设备100可从这种另外的信息处理设备获取和运行核酸分析程序或各种数据库。

主存储102存储运行这些程序所需的各种程序和存储数据等。

主存储102具有ROM(只读存储器)和RAM(随机存取存储器)(未示例)。

ROM存储各种程序如BIOS(基本输入/输出系统)。

RAM充当在通过CPU 101运行ROM中存储的各种程序时产生的一定范围的工作。RAM没有具体限制并且可根据目的被适当选择。RAM的实例包括DRAM(动态随机存取存储器)和SRAM(静态随机存取存储器)。

辅存储103没有具体限制并且可根据目的被适当选择，只要各种信息可被存储在其中。其实例包括固态驱动器和硬盘驱动器。可选地，辅存储103可以是例如可运输存储，如CD(压缩盘)驱动器、DVD(数字多功能盘)驱动器、或BD(Blu射线(R)盘)驱动器。

输出设备104可利用显示器、扬声器、或类似物。显示器没有具体限制，并且已知的显示器本领域可被适当地使用。其实例包括液晶显示器和有机EL显示器。

输入设备105没有具体限制，只要输入设备可接受对核酸分析设备100的各种请求。本领域已知的输入设备可被适当地使用。其实例包括键盘、鼠标和触摸板。

上述硬件配置可实现核酸分析设备100的处理功能。

<核酸分析设备的功能配置>

图25是示例核酸分析设备100的一个实例功能配置的图。

如此图25示例，核酸分析设备100具有输入部110、输出部120、控制部130、和存储部140。

控制部130具有文库制备部131、校准曲线数据生成部132、和分析物核酸分析部133。控制部130控制全核酸分析设备100。

存储部140具有校准曲线数据库141和分析物核酸分析数据库142。在下文中，"数据库"也被称为"DB"。存储部中存储的数据可存储在易失性和非易失性存储器中的任意种中。存储器也被称为"M"，并且可以与"DB"相同的含义使用。

文库制备部131基于从输入部110输入的关于分析物核酸的信息调节文库制备的反应条件。

校准曲线数据生成部132基于特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸的拷贝数数据生成标准品核酸的校准曲线数据。控制部130使校准曲线M141存储由此获取的校准曲线数据。

分析物核酸分析部133利用存储部140的分析物核酸分析M142中存储的分析物核酸分析数据鉴定分析物核酸的核苷酸序列，同时通过与校准曲线M141的数据比较而分析分析物核酸的核苷酸序列数量。

接着，示例处理本发明的核酸分析程序的工序。图26是示例核酸分析设备100的控制部130中处理核酸分析程序的一个实例工序的流程图。

在步骤S101中，核酸分析设备100中控制部130的文库制备部131，基于从输入部110输入的关于标准品核酸和分析物核酸的信息，通过向输出部120输出反应条件而调节文库制备的反应条件。该过程进行至步骤S102。

在步骤S102中，核酸分析设备100中控制部130的校准曲线数据生成部132，基于特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸的拷贝数，生成所述至少一种标准品核酸的校准曲线数据，并且使校准曲线M141记录获取的结果。该过程进行至步骤S103。例如，体系中标准品核酸的"读数数量"可用作校准曲线数据。

在步骤S103中，核酸分析设备100中控制部130的分析物核酸分析部133鉴定分析物核酸的核苷酸序列，同时利用由校准曲线M141获取的生成的校准曲线数据鉴定分析物核酸的核苷酸序列数量，并使分析物核酸分析M142记录分析数据。此过程终止。

S102和S103的过程可并行进行。

本发明核酸分析方法相关装置被广泛用于生物相关行业、生命科学行业和医疗行业等，并且可被适当地用于例如设备校准、校准曲线生成、检验设备的准确度管理、PCR设备的准确度评价、和核苷酸序列分析仪器的准确度管理。

装置可在被实施用于感染性疾病时应用于权威方法或指示方法等指定的方法。

(文库制备装置)

本发明的文库制备装置特别适合用于制备用于在本发明中的核酸分析方法的文库，并且具有特定拷贝数的至少一种标准品核酸。

本发明的文库制备装置与用于本发明核酸分析方法的装置相同或相似，因此省略关于文库制备装置的描述。

本发明的文库制备装置可被适当地用于涉及新一代测序仪的核酸分析。

在本发明的文库制备装置中，所述至少一种标准品核酸优选地满足式CV<1/√x，其由通过特定拷贝数的不肯定性除以特定拷贝数的平均值而获得的变异系数(CV数值)和标准品核酸的特定拷贝数的平均值x表示。

<数据分析方法概述>

一方面，本发明涉及利用包括特定拷贝数的核酸的至少一个标准品样品分析高通量测序反应数据的方法。

在此方面，"特定拷贝数"意为作为标准品样品中包括的核酸拷贝数的预定值。特定拷贝数在一定程度上接受数值不肯定性的存在(例如，±30％内、±20％内、±15％内、±10％内、±5％内、±3％内、或±1％内)。不肯定性可通过本文描述的"确定"而确定。

在此方面，"标准品样品"是包括特定拷贝数的核酸的样品，并且是充当参照物用于确定阈值以在后述输出数据区分步骤中分析包括源自至少一个序列样品的读数的输出数据的样品。

标准品样品没有具体限制并且可根据目的被适当选择。标准品样品可以是例如包括上述核酸分子或核酸的样品，例如细胞。每种细胞均可用作细胞，无论是真核细胞、原核细胞、多细胞生物细胞、还是单细胞生物细胞。这些细胞可被单独使用或其两种以上可被组合使用。

在此方面，"序列样品"意为包括将通过本发明方法分析的核酸的样品。序列样品的实例包括但不具体限于，包括上述核酸分子或核酸的样品，例如：细胞；体液，如血液、血浆、血清、唾液、脊髓液、和组织渗出物；活组织(例如、活检组织和组织制备物，如FFPE)、尿液、乳汁、和毛发；环境样品(海洋、河流、土壤、大气等)；食物(例如，肉和鱼肉)、补充剂、药物(例如，生物药物)、及其生产设备；和医疗设备。

本文描述的"高通量测序"意为相对于所谓第一代测序如Sanger测序产生大量数据的测序。在高通量测序中，例如，10²个以上、10³个以上、10⁴个以上、或10⁵个以上的分子被同时测序。本文描述的高通量测序包括新一代测序(NGS)。新一代测序包括第二代测序、第三代测序、第四代测序、和将在未来开发的高通量测序。新一代测序可利用各种市售测序仪，并且可利用测序仪，例如用于第二代测序的Miseq、Hiseq、或NexSeq(Illumina，Inc.)，例如用于第三代测序的PacBio RS II/Sequel(Pacific Biosciences of California，Inc.)，或例如用于第四代测序的MinION(Oxford Nanopore Technologies Ltd.)。本文描述的"第二代测序"包括例如这样的测序：其中接头序列介导与基底的连接并且充当反应起始位点(细节参见例如Rick Kamps et al.,Int.J.Mol.Sci.,2017,18(2),p.308)。本文描述的"第三代测序"包括例如这样的测序：涉及利用被称为SMRTbell的单链闭环DNA作为模板，将此模板引入被称为ZMW的测序单元，在各ZMW中利用四种荧光标记核苷酸用聚合酶进行核酸复制反应，和基于所得荧光脉冲进行反应(细节参见例如Anthony Rhoads et al.,Genomics Proteomics Bioinformatics,13,2015,pp.278-289)。本文描述的"第四代测序"包括基于获得的关于核酸分子通过纳米孔或靠近纳米孔时造成的电流变化的数据通过软件或类似物进行的测序(细节参见例如Hengyun Lu et al.,Genomics ProteomicsBioinformatics,14,2016,pp.265-279)。

<数据分析方法中包括的步骤>

根据本发明的分析数据的方法包括下列步骤：a)制备文库；b)使步骤a)中制备的文库进行测序反应以获得输出数据；和c)基于参考输出数据中源自所述至少一个标准品样品的读数数量确定的阈值，划分输出数据中的读数。本发明的方法可任意地包括下列步骤：x)在步骤a)前将样品填充到容器中。本发明方法可包括的各步骤在下文被详细描述。

x)样品填充步骤

将样品填充到容器中的步骤(也被称为"样品填充步骤")包括在容器中填充标准品样品和/或序列样品。样品填充方法没有具体限制。例如，各样品可以限定量不经稀释直接添加或作为通过其连续稀释制备的多个溶液和/或分散液添加，或基于包含已知数量的核酸分子的微型区域和载体的计数而添加。样品填充方法可根据填充准确度或各水平所需填充时间作为最优方法被选择。在样品填充后可进行确定。本文描述的确定意为实验确定不肯定性数值。在进行确定的情况下，对于各填充位点确定的不肯定性可在上述填充方法或连续稀释制备方法中被适当地计算。样品填充(和后续确定，如涉及)可如例如实施例所述进行。

样品填充容器

样品填充容器的形式没有具体限制，并且具有至少一个或多个填充位点。填充位点的形状可与一般热循环仪的模具形状一致，以进行后续测序步骤。填充容器的材料实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯、和聚对苯二甲酸乙二醇酯。填充位点的容量没有具体限制。考虑到一般核酸检测中的样品用量，填充位点可具有1μL至1000μL的容量。填充位点的颜色可以是透明、半透明、着色、和完全遮光等中的任意种。填充容器期望地被封闭，以防止外源物质混入填充物或填充物泄露。封闭单元可能够封闭至少一个填充位点并且能够隔离各填充位点，使得填充位点可被单独封闭或打开，或各填充位点可被隔离。封闭单元的形状可以是适于容器内壁直径的盖形、或覆盖填充位点开口的粘合膜形状。封闭单元可具有例如能够一次封闭全部填充位点的粘合膜形状。封闭单元的粘合强度可在需要再打开的位点和不需要再打开的位点之间不同，从而可减少使用者失误。封闭单元可在这些位点之间具有切割示线(cut-here line)。

当本发明方法不包括样品填充步骤时，例如，已填充有样品的容器可用于后述文库制备步骤，以执行文库制备步骤。

a)文库制备步骤

本方面的方法包括在相同条件下制备所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库的步骤(也被称为"文库制备步骤")。文库制备步骤细节如本文描述。

在相同条件下所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库制备能够实现基于后述测序反应中源自至少一个标准品样品的读数数量确定阈值。基于此阈值，输出数据中的读数可在后述区分步骤中被划分成例如值得分析的序列和可归因于错误来源的序列。

在相同条件下所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库制备意为上文示例各步骤的是否存在和顺序及其条件(例如，试剂浓度和反应温度)完全或本质相同的文库制备。在此环境下，短语"本质相同"意为接受非本质差异(例如，实验错误和反应条件细微差异)，但鉴于基于源自所述至少一个标准品样品的读数数量确定阈值的目的，文库制备条件是一致的。

在一个实施方式中，文库制备在相同反应体系中进行。相同反应体系包括例如相同溶液体系用于文库制备。例如，所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品的文库制备可在上述样品填充容器的相同孔中进行。

b)获得输出数据的步骤

本方面的方法包括，在步骤a)后，使步骤a)中制备的文库进行测序反应以获得包括源自一种或多种标准品样品和所述至少一种序列样品的读数的输出数据的步骤。

测序反应的细节是本领域技术人员已知的。测序反应的细节可依据新一代测序的类型而不同。在第二代测序中，例如，接头序列介导与基底的连接并且充当测序反应的起始位点(细节参见例如，Rick Kamps et al.，同上)。第三代测序涉及例如利用被称为SMRTbell的单链闭环DNA作为模板，将此模(平)板引入被称为ZMW的测序单元，在各ZMW中利用四种荧光标记核苷酸通过聚合酶进行核酸复制反应，和基于所得荧光脉冲进行测序(细节参见例如，Anthony Rhoads et al.，同上)。在第四代测序中，测序基于关于核酸分子通过纳米孔或靠近纳米孔时造成的电流变化的获得数据通过软件或类似物进行(细节参见例如，Hengyun Lu et al.，同上)。

各种测序仪已被提供以进行新一代测序，并且这些测序仪中的任意者可用于本发明的测序反应。可使用的测序仪的实例包括但不限于，Miseq、Hiseq、和NexSeq(Illumina,Inc.)、PacBio RS II/Sequel(Pacific Biosciences of California,Inc.)、和上述MinION((Oxford Nanopore Technologies Ltd.)以及Ion Torrent PGM^TM(Thermo FisherScientific Inc.)、Genome Sequencer(GS)FLX System(F.Hoffmann-La Roche,Ltd)、Support Oligonucleotide Ligation Detection(SOLiD)(Thermo Fisher ScientificInc.)、和HeliScope Gene Sequencing(HelicosBioSciences Corp.)。

通过测序反应获得的序列信息(读数)的收集被获得作为输出数据。由此输出的数据可用软件或类似物进一步分析，并且转换成更显著的结果，如读数数量。

c)区分输出数据的步骤

本发明的方法包括，在步骤b)后，基于参考源自输出数据中所述至少一个标准品样品的读数数量确定的阈值将步骤b)中获得的输出数据中的读数划分成等于或小于阈值的读数和等于或大于阈值的读数的步骤(也被称为"区分输出数据的步骤")。

本文描述的"划分"或"区分"意为将输出数据中的读数分离为读数数量等于或大于阈值的读数组和读数数量等于或小于阈值的读数组。当存在数值与阈值相同的读数时，此读数可被归至任何等于或大于阈值的读数组和等于或小于阈值的读数组中的任一个。

可使用单个阈值，或可设置多个阈值。单个阈值允许输出数据被分为两组。当设置多个阈值时，输出数据可被分为三组以上。

阈值可以是例如源自所述至少一个标准品样品本身的读数数量，或可通过此读数数量乘以预定系数而获得。通过其乘以预定系数，阈值可根据分析目的基于源自所述至少一个标准品样品的读数数量被灵活设置。预定系数可在分析前被确定，或可参考分析结果而确定。本领域技术人员可根据分析目的和/或所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品的类型等适当地设置预定系数。在例如从分析物排除较大数量的非必要序列的情况下，预定系数可被设置较高。在降低排除必要序列的风险的情况下，预定系数可被设置较低。预定系数可以是，但不限于，例如，0.01以上、0.05以上、0.1以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.75以上、0.8以上、或0.9以上。而且，预定系数可以是100以下、50以下、10以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1.5以下、1.2以下、或1.1以下。预定系数可以是例如0.01至100、0.1至10、0.3至4、0.5至2、0.8至1.2或0.9至1.1。

在一个实施方式中，在本发明方法的步骤a)中，使用包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品。本实施方式的方法可进一步包括，在步骤b)后和步骤c)前，选择用于在步骤c)中确定阈值的标准品样品的步骤。本实施方式的方法可具有以下效果：用于确定阈值的标准品样品可根据分析目的选自包括不同拷贝数的核酸的多个样品，因此放宽了阈值选择范围。此外，包括不同拷贝数的核酸的多个标准品样品的使用可降低产生过高阈值或过低阈值的风险。

在一个实施方式中，在本发明方法的步骤a)中，利用多个孔分析相同序列样品，并且使用包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品，以及在步骤c)中，利用多个孔之间标准化的数据确定阈值。标准化可按照常规方法进行，并且可例如通过以下进行：各孔中序列样品的读数数量乘以具体数值(或读数数量除以具体数值)，使得孔的整体读数数量相同或基本上相同。可选地，标准化可进行以使源自孔中包括的相同特定拷贝数的所述至少一个标准品样品的读数数量相同或基本上相同。如果序列样品以相同的量被加入孔，标准化可进行以使源自序列样品的读数数量总和相同或基本上相同。在基于序列样品进行标准化的情况下，当有一个或多个孔其中所述至少一个标准品样品和序列样品的文库制备在相同孔中进行时，其它孔可不包括标准品样品。标准化能够实现在孔与孔之间比较读数数量，和允许参考源自来自不同孔的所述至少一个标准品样品的读数数量确定阈值。在一个实施方式中，在本发明方法的步骤c)中，基于多个标准品样品之间标准化的数据绘制特定拷贝数和输出读数数量的关系式；利用其反函数由输出读数数量估测拷贝数；和参考估测的拷贝数确定阈值。关系式没有限制并且可由例如y＝ax+b表示，其中y表示输出读数数量，x表示拷贝数，a和b各自表示常数，并且b可以是0。在本实施方式中，充当阈值的拷贝数没有限制，并且可以是例如200拷贝以下、150拷贝以下、100拷贝以下、或50拷贝以下，以及例如20拷贝以下、10拷贝以下、5拷贝以下、4拷贝以下、3拷贝以下、2拷贝以下、或1拷贝。

本文描述的术语"多个"的范围没有限制，并且可以是例如2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、或10个以上并且100个以下、50个以下或20个以下。

在一个实施方式中，在本发明方法的步骤a)中，使用包括相同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品。在本实施方式方法的步骤c)中，可基于源自多个标准品样品的读数数量的平均值或中值确定阈值。本实施方式的方法可具有以下效果：通过基于源自包括相同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品的读数数量确定阈值，可获得可靠度较高的高阈值。

标准品样品中包括的核酸的特定拷贝数的范围没有限制。本领域技术人员可根据分析目的设置此范围。在例如从分析物排除较大数量的非必要序列的情况下，特定拷贝数可被设置较高。在降低排除必要序列的风险的情况下，特定拷贝数可被设置较低。特定拷贝数可以是，但不限于，例如，200拷贝以下、150拷贝以下、100拷贝以下、或50拷贝以下，以及例如、20拷贝以下、10拷贝以下、5拷贝以下、4拷贝以下、3拷贝以下、2拷贝以下、或1拷贝。

例如，读数数量小的序列(如读数数量等于或小于由包括1拷贝的核酸的标准品样品获得的读数数量的读数)可归因于各种错误来源，例如，由测序导致的错误获得的序列、PCR后被污染的样品源序列、和留在流动室中的前轮样品源序列(在高通量测序仪具有可重复使用的流动室的情况下)。这些错误在PCR过程中或之后被混入取样，并且几乎不参与扩增反应。因此，这些错误作为小读数数量被输出。因此，例如，通过基于参考源自包括特定拷贝数的核酸的所述至少一个标准品样品的读数数量确定的阈值划分输出数据中的读数，可区分源自这种错误的序列和其它序列。

在一个实施方式中，在本发明方法的步骤c)中，输出数据通过其中包括的等于或小于阈值的读数而被分析，而不排除输出数据中等于或小于阈值的读数。在另一实施方式中，在本发明方法的步骤c)中，输出数据中等于或小于阈值的读数被排除，并且数据分析对等于或大于阈值的读数进行。包括还是排除等于或小于阈值的读数可根据分析目的被自由确定。在排除等于或小于阈值的读数的情况下，例如，可排除可源自各种错误来源并且对于分析来说非必要的序列。例如，源自所述至少一个序列样品的读数的读数数量不能等于或小于源自1拷贝的核酸分子的读数数量。因此，当所述至少一个标准品样品包括1拷贝的核酸分子时，读数数量等于或小于源自所述至少一个标准品样品的读数数量或参考其确定的阈值的各序列可作为不值得分析的序列被排除。如上所述源自各种错误来源的不值得分析的序列在本文中也被称为"幽灵读数"。从分析物排除"幽灵读数"也被称为"去除幽灵"。

<试剂盒>

一方面，本发明涉及用于执行本文所述方法的试剂盒。本发明的试剂盒可包括下列至少一种：(平)板，其在至少一个孔中包括至少一个标准品样品，该标准品样品包括特定拷贝数的至少一种核酸；文库制备和/或测序反应所需的试剂(例如，引物、缓冲剂、和酶)；和说明书。

<程序>

一方面，本发明涉及允许计算机执行本文所述方法的程序、或用于执行本文所述方法的软件。

用于执行本文所述方法的计算机可在硬件配置方面由下列构成：处理获取的输出数据的CPU、作为主存储器的RAM、用于缓存获取的输出数据的非易失性存储器、和用于计算机和外部设备之间信息通信或电力需求的界面。如需，计算机可具有展示输出数据的显示器。

允许计算机执行本文所述方法的示例性方法如下：首先，CPU将本发明的程序从从非易失性存储器调出至RAM。本发明的程序是这样的程序：基于参考源自所述至少一个标准品样品的读数数量确定的阈值将输出数据分成等于或小于阈值的读数和等于或大于阈值的读数，以及任选地排除输出数据中等于或小于阈值的读数。此程序被提前输入非易失性存储器。接着，CPU从例如界面如测序仪获取输出数据，并且将输出数据存储在RAM中，处理，然后缓存至非易失性存储器。然后，CPU相继运行RAM中建立的程序，从而进行被存储输出数据的处理、累积、和输出。以这种方式，可实现本实施方式的程序或软件。

实施例

在下文中，参考实施例描述本发明。然而，本发明完全不受这些实施例限制。

(实施例1)

<文库制备装置的制备>

文库制备装置如下所述制备。

-制备标准品核酸-

--设计人工核苷酸序列--

建立质粒以包括致密核酸样品DNA600-G(由National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST)制造，NMIJ CRM 6205-a；参见SEQ ID NO：6)作为人工核苷酸序列、和与其串联布置的选择性标记URA3。

此外，创建质粒以包括这样的核酸：被合成以在具有50％的GC含量比的130-bp核苷酸序列的两端具有引物MiFish-U(参见非专利文献1；生产商名称：FASMAC Corp.；参见SEQ ID NO：7和8)的互补核苷酸序列，不在60℃下形成高阶(higher-order)结构，并且不具有重复序列(参见SEQ ID NO：1-5)。由于该人工核苷酸序列两端具有引物MiFish-U的互补核苷酸序列，在对分析物核酸中包含的鱼12S rRNA分析时可利用具有相同核苷酸序列的引物分析标准品核酸和分析物核酸。

--基因工程酵母--

发芽酵母YIL015W BY4741(由ATCC制造，ATCC4001408)被用于制备重组体作为1拷贝特定核酸序列的载体细胞。通过上述制备的质粒之间的同源重组，1拷贝的具体人工核酸序列被引入酵母基因组DNA，以及载体细胞的BAR1区域以制备基因工程酵母。DNA600-G具有关于核酸浓度的不肯定性信息作为DNA600-G的产品信息。

所用质粒的产生和分析要求外包合成公司(FASMAC Corp.)进行。简言之，具有期望序列的人工合成的核酸被引入大肠杆菌(E.coli)，然后按照常规方法培养，提取，和纯化，以产生质粒。利用测序仪确定所产生的质粒的全长序列，以验证仅1拷贝的目标核苷酸序列被插入1个质粒分子(数据未显示)。

根据利用测序仪进行基因组分析，验证酵母基因组DNA中可同源重组的位点为仅1拷贝(数据未显示)。对质粒序列的插入位点向内进行PCR，并且利用测序仪读取扩增产物，以验证仅1拷贝的质粒序列在插入位点被插入(数据未显示)。

--培养和细胞周期控制--

向包含90mL等份的基因工程酵母(在50g/L YPD介质(由Takara Bio Inc.制造，CLN-630409)中培养)的Erlenmeyer烧瓶，加入900μLα1-交配因子乙酸盐(由Sigma-AldrichCo.，LLC制造，T6901-5MG；在下文中，被称为"α因子")——利用Dulbecco磷酸缓冲盐水(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造，14190-144；在下文中，被称为"DPBS")调节至500μg/mL。

然后，利用Bioshaker(由制造TAITEC Corp.，BR-23FH)将烧瓶在250rpm的摇动速率、28℃的温度下温育2小时，使得酵母同步至G0/G1期，以获得酵母悬浮液。

-固定-

将45mL已被验证同步的酵母悬浮液转移至离心管(由AS ONE Corp.制造，VIO-50R)，然后利用离心机(由Hitachi，Ltd.制造，F16RN)将其在3000rpm的转速下离心5分钟。去除上清液，以获得酵母团粒。

向获得的酵母团粒，加入4mL福尔马林(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，062-01661)，并将混合物留置5分钟，然后离心。去除上清液，并通过添加10mL乙醇使残留物悬浮，以获得固定酵母悬浮液。

-核染色-

将200μL等份的固定酵母悬浮液用DPBS洗涤一次，然后重新悬浮于480μL DPBS中。

接着，将20μL的20mg/mL RNA酶A(由Nippon Gene Co.，Ltd.制造，318-06391)加入悬浮液，然后利用Bioshaker在37℃下温育2小时。

接着，将25μL的20mg/mL蛋白酶K(由Takara Bio Inc.制造，TKR-9034)加入混合物，然后利用Petite Cool(由WakenBtech Co.，Ltd.制造，Petite Pool MiniT-C)在50℃下温育2小时。

最后，将6μL的5mM SYTOX绿色核酸染料(由Thermo Fisher Scientific Inc.制造，S7020)加入混合物，并在暗处将核染色30分钟。

-分散液-

利用超声均质机(由Yamato Scientific Co.制造，Ltd.，LUH150)将由此染色的酵母悬浮液以30％的输出分散10秒，以获得酵母悬浮液。

-分配和细胞计数-

如下所述，将液滴中的酵母真菌计数并以1细胞/孔排出，以制备具有已知细胞数量的(平)板。具体地，使用图15示例的液滴形成设备。通过压电应用模式的排放头(由RichoCo.，Ltd.制造)作为液滴排出单元，将酵母悬浮液以10Hz相继排出至96孔板(商品名：MicroAmp 96孔反应板，由Thermo Fisher Scientific Inc.制造)的孔。

利用高灵敏度照相机(由Tokyo仪器s，Inc.制造，sCMOSpco.edge)作为光接收单元，对排出液滴中的酵母拍照。所用光源是YAG激光器(由Spectra-Physics，Inc.制造，Explorer ONE-532-200-KE)。利用图像处理软件图像J作为粒子计数单元处理拍摄的图像，并对细胞计数，以制备每孔包含一个细胞的(平)板(在下文中，也被称为"具有已知细胞数量的(平)板")。

-核酸提取-

利用Tris-EDTA(TE)缓冲剂制备具有5ng/μL ColE1 DNA(由Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造，312-00434)的ColE1/TE。利用ColE1/TE制备具有1mg/mL Zymolyase^(R)100T(由NacalaiTesque，Inc.制造，07665-55)的Zymolyase溶液。

将Zymolyase溶液以4μL/孔加入具有已知细胞数量的制备(平)板，然后将其在37.2℃下温育30分钟以溶解细胞壁(核酸提取)。然后，将溶胞产物在95℃下热处理2分钟，以制备参考装置(文库制备装置)。

接着，为考虑由具有已知细胞数量的(平)板获得的结果可靠性，产生已知细胞数量为1的(平)板，以计算细胞数量为1的不肯定性。通过利用下文关于各特定拷贝数给出的方法可计算各种拷贝数的不肯定性。

-计算不肯定性-

在本实施例中，所用的不肯定性成分是液滴中的细胞数量、细胞中的核酸拷贝数、孔中的细胞数量、和污染。

所用的液滴中的细胞数量是通过被排出单元所排出的液滴的图像分析而计数的液滴中的细胞数量、和通过显微镜观察而获得的关于被排出单元排出并且降落到玻片上的各液滴的细胞数量。

细胞中的核酸拷贝数(细胞周期)利用细胞周期G1期相应细胞百分比(99.5％)、和G2期相应细胞百分比(0.5％)来计算。具体地，将培养的酵母用核染色剂(SYTOX^TM绿色死细胞染色剂，Invitrogen^TM)染色，并测量其荧光亮度。1拷贝的DNA被掺入G1期细胞，并且2拷贝的DNA被掺入G2期细胞。G2期的亮度较高。因此，基于亮度计算细胞中的核酸拷贝数。

以降落到孔中的排出液滴数量计数孔中的细胞数量。然而，在对96个样品计数时，所有液滴都降落到孔中。因此，从不肯定性计算中排除孔中细胞数量作为成分。

通过3个试验验证污染，各试验涉及在实时PCR中使用4μL细胞悬浮液滤液，和检查滤液是否被细胞中的核酸以外的核酸污染。结果是，3个试验全部生成下限检测值。因此，污染也从不肯定性计算中被排除作为成分。

通过下列确定不肯定性：由各成分测量值确定标准偏差，使标准偏差乘以灵敏度系数以统一被测变量的单位，和基于该单位通过平方和方法由标准不肯定性确定组合标准不肯定性。组合标准不肯定性仅包括正态分布的大约68％的范围内的数值。因此，组合标准不肯定性被翻倍，从而可获得扩展的测量不肯定性作为考虑正态分布的大约95％的范围的不肯定性。结果示例在下表2的预算表中。

[表2]

在表2中，"符号"表示不肯定性成分相关的任意符号。

在表2中，"数值(±)"表示平均值的实验标准偏差，并且通过计算实验标准偏差除以数据数量的平方根而获得。

在表2中，"概率分布"表示不肯定性成分的概率分布，并且对A型不肯定性评价给出空白并且对B型不肯定性评价给出正态分布或矩形分布。在本实施例中，仅进行A型不肯定性评价，因此概率分布栏是空白的。

在表2中，"除数"表示用于标准化由各成分获得的不肯定性的数量。

在表2中，"标准不肯定性"表示通过"数值(±)"除以"除数"而获得的数值。

在表2中，"灵敏度系数"表示用于统一被测变量的单位的数值。

接着，计算填充到孔中的标准品核酸(核苷酸序列)的特定拷贝数的平均值、和其不肯定性。结果示例在表3中。通过不肯定性数值除以特定拷贝数平均值，计算变异系数(CV数值)。

[表3]

在上述方法中，所得的将特定拷贝数为1的标准品核酸(即，1拷贝的标准品核酸(核苷酸序列)(一个酵母))分配到各孔中的准确度为±0.1281拷贝。在各孔中填充1以上拷贝的情况下，通过堆积此准确度来确定填充特定拷贝数的标准品核酸(核苷酸序列)的准确度。

由上述结果可见，所得扩展的测量不肯定性(充当测量离差指数)被作为数据存储在装置上。因此，使用者在实验中可利用不肯定性指数作为关于各孔判断测量结果可靠性的标准。上述可靠性判断标准的使用允许分析检验的进行被高准确度评价。

-对各填充位点确定不肯定性-

对各孔确定上述计算的不肯定性(或变异系数)。

因此，能够对各孔计算和确定低浓度核酸样品系列的特定拷贝数平均值及其不肯定性和变异系数。

(实施例2)

<核酸分析方法-1的实践：计算鱼肌肉组织12S rRNA的拷贝数>

在实施例2中，利用从鱼肌肉组织提取的DNA样品进行NGS分析。

首先，制备3个物种(真鲷(Pagrus major)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、和远东拟沙丁鱼(Sardinopsmelanostictus))的肌肉组织作为鱼肌肉组织，并且；利用DNeasyBlood&Tissue试剂盒(Qiagen N.V.)从中提取DNA。各提取DNA用作分析物核酸。

-第一次PCR反应-

利用实施例1中设计的人工核苷酸序列(标准品核酸)1至3的三种鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：1至3)，分别制备核酸拷贝数为1拷贝的孔(包含1个酵母细胞)、核酸拷贝数为5拷贝的孔(包含5个酵母细胞)、核酸拷贝数为10拷贝的孔(包含10个酵母细胞)、和核酸拷贝数为50拷贝的孔(包含50个酵母细胞)。各孔填充有这3种人工核苷酸序列(在下文中，也被称为人工12S序列)。具体地，核酸拷贝数为1拷贝的孔包含1个包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：1的酵母细胞、1个包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：2的酵母细胞、和1个包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：3的酵母细胞。其它孔同样如此。然后，将5.0μL的分析物核酸填充到每个上述样品填充孔中。然后，将相同孔中的分析物核酸和人工核苷酸序列的鱼12SrRNA序列通过PCR进行扩增反应。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

第一次PCR的引物是MiFish-U(参见非专利文献1)，其具有添加序列，用于第二次PCR的引物的退火反应。

核酸扩增利用T100^TM热循环仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过PCR进行。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行35个温度循环每个涉及3个步骤：98℃，20秒；65℃，15秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-第二次PCR反应：接头序列的结合-

进行PCR反应，以在获得的第一次PCR扩增产物的两端添加用于区分测序样品的标签、和应用于测序反应的接头序列，以获得第二次PCR反应产物。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

利用T100^TM Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过PCR进行核酸扩增。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行12个温度循环，每个涉及2个步骤：98℃，20秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物

利用2％琼脂糖凝胶在100V下进行电泳20分钟。切下330至400bp的观察带，并利用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(由Nippon Genetics Co.，Ltd.制造)纯化PCR产物。

-核酸样品的浓度测量-

利用Bioanalyzer 2100(由Agilent Technologies，Inc.制造)定量第二次PCR产物。所用试剂盒是Agilent DNA7500试剂盒。基于定量结果，将第二次PCR产物用TE稀释为10ng/μL。将由四个孔获得的稀释的第二次PCR产物混入相同反应溶液。

-利用新一代测序仪(NGS)的测序反应-

利用新一代测序仪(设备名称：Miseq，由Illumina，Inc.制造)分析获得的第二次PCR产物。通过序列处理分析由新一代测序仪获得的数据，以获得关于核苷酸序列和读数数量的信息。获得的数据示例在表4中。表中的数值表示读数数量。

[表4]

-读数的标准化-

以人工12S序列读数以外其它读数的总和作为100,000读数而标准化的数据示例在表5中。表中的数值表示读数数量。

[表5]

基于表5中人工12S序列1、2、和3读数数量，绘制拷贝数(x)和输出读数数量(y)之间的关系式以获得式y＝31.343x(确定系数R²＝0.9612)。据此式估测各鱼物种的拷贝数，以获得表6。表中的数值表示拷贝数。

[表6]

(实施例3)

<核酸分析方法-2的实践：利用环境DNA测量鱼类区系>

在实施例3中，利用相模川河(Sagami River)中的环境DNA测量鱼类区系。

首先，取样相模川河的水并通过过滤器过滤。利用DNA提取试剂盒(商品名：DNeasyBlood&Tissue试剂盒，由Qiagen N.V.制造)，从过滤时使用的过滤器提取DNA。利用Qubit3荧光计(Invitrogen ^TM)定量所提取的DNA样品(分析物核酸)的核酸浓度。

-第一次PCR反应-

利用实施例1中设计的人工核苷酸序列(标准品核酸)1-5的5种类型的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：1-5)，以与实施例1相同的方式，向孔填充包括人工核苷酸序列1的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：1)的1个酵母细胞(拷贝数＝1)、包括人工核苷酸序列2的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：2)的10个酵母细胞(拷贝数＝10)、包括人工核苷酸序列3的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：3)的50个酵母细胞(拷贝数＝50)、包括人工核苷酸序列4的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：4)的100个酵母细胞(拷贝数＝100)、或包括人工核苷酸序列5的鱼12S rRNA序列(参见SEQ ID NO：5)的500个酵母细胞(拷贝数＝500)。将从相模川河水样品收集的提取DNA样品以2.0μL(0.25 ng/μL)填充至各孔，以制备布置有5个水平的标准品核酸的装置。然后，使孔中的提取DNA样品和人工核苷酸序列1-5在相同孔中通过PCR进行扩增反应。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

第一次PCR的引物是MiFish-U(参见非专利文献1)，其具有用于第二次PCR的引物退火反应的添加序列。

利用Thermal Cycler(设备名称：T100TM，由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)，通过PCR进行标准品核酸(人工核苷酸序列1-5)扩增。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行35个温度循环，每个涉及3个步骤：98℃，20秒；65℃，15秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-利用珠体纯化PCR产物-

利用AMPure XP试剂(Beckman Coulter，Inc.)纯化PCR产物。首先，将AMPure XP试剂在使用前在室温下留置30分钟以上。将AMPure XP试剂通过倒置混合1分钟以上。然后，将20μL的AMPure XP试剂加入进行PCR反应的各孔。通过10次重复吸取，使PCR反应溶液和AMPure XP试剂充分混合。然后，将混合物在室温下留置5分钟。将进行PCR反应的各孔置于磁板中并留置2分钟。在进行PCR反应的各孔被置于磁板中的这种状态下，利用移液器取出PCR反应溶液，从而避免与AM Pure XP试剂中包含的磁珠接触。以200μL/孔添加70％乙醇，并将混合物留置30秒。去除乙醇，并洗涤磁珠。上述洗涤步骤再重复一次。洗涤步骤在各孔处于磁板中的情况下进行。将各孔从磁板取出，并20μL的洗脱缓冲剂(纯净水，Tris/乙酸盐，pH 8.0，或Tris/EDTA溶液)加入各孔。通过10次重复吸取，将磁珠和洗脱缓冲剂充分混合。将各孔置于磁板中并留置1分钟。在各孔置于磁板中的情况下回收洗脱缓冲剂，并转移至另一容器。在此操作中，转移至PCR反应容器对于后续步骤是优选的。

-第二次PCR反应：接头序列的结合-

进行PCR反应，以在获得的第一次PCR扩增产物的两端添加用于区分测序样品的标签，和应用于测序反应的接头序列，以获得第二次PCR反应产物。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

利用Thermal Cycler(设备名称：T100(TM)，由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)进行第二次PCR产物扩增。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行12个温度循环，每个涉及2个步骤：98℃，20秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-利用珠体纯化PCR产物-

此步骤与第一次PCR后所进行的相同，因此省略描述。

-核酸样品的浓度测量-

利用ing Bioanalyzer 2100(由Agilent Technologies，Inc.制造)定量第二次PCR产物。所用试剂盒是Agilent DNA7500试剂盒。基于定量结果，将第二次PCR产物用TE稀释为10ng/μL。

-利用新一代测序仪(NGS)的测序反应-

利用新一代测序仪(设备名称：Miseq，由Illumina，Inc.制造)分析获得的第二次PCR产物。通过序列处理分析由新一代测序仪获得的数据，以获得关于核苷酸序列和读数数量的信息。获得的数据示例在表7中。

[表7]

-校准曲线生成和定量-

基于表7中示例的扩增标准品核酸的人工序列(人工核苷酸序列)1-5的结果，生成校准曲线。生成的校准曲线示例在图27中。在图27中，纵坐标表示Miseq中的读数数量，并且横坐标表示分析物核酸和标准品核酸(DNA)(拷贝数/孔)的数量。正方形显示的点分别表示1拷贝、10拷贝、50拷贝、100拷贝、和500拷贝的添加人工序列。基于这5点(5个水平)生成校准曲线。圆形显示的点表示由标准品核酸获得的读数数量在校准曲线上的作图。如图27示例，短棘缟虾虎鱼是相模川河中的主要物种，并且读数相当于全部样品的70％。其它鱼物种呈现读数少于4778读数——其是500拷贝的读数数量，并且允许通过插值法定量(可靠的定量，利用校准曲线中使用的数值范围)。由校准曲线估测的各鱼物种的拷贝数示例在表7中。

(实施例4)

<核酸分析方法-3的实践：利用环境DNA测量鱼类区系>

在实施例4中，利用相模川河中的环境DNA测量鱼类区系。

首先，取样相模川河的水并通过过滤器过滤。利用DNA提取试剂盒(商品名：DNeasyBlood&Tissue试剂盒，由Qiagen N.V.制造)，从过滤时使用的过滤器提取DNA。利用Qubit3荧光计(Invitrogen^TM)定量所提取的DNA样品(分析物核酸)的核酸浓度。

-第一次PCR反应-

利用实施例1中设计的人工核苷酸序列(标准品核酸)1至3的三种类型的鱼12SrRNA序列(参见SEQ ID NO：1至3)，分别制备核酸拷贝数为1拷贝的孔(包含1个酵母细胞)、核酸拷贝数为5拷贝的孔(包含5个酵母细胞)、核酸拷贝数为10拷贝的孔(包含10个酵母细胞)、和核酸拷贝数为50拷贝的孔(包含50个酵母细胞)。向各孔填充这3种类型的人工12S序列。具体地，核酸拷贝数为1拷贝的孔包含包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：1的1个酵母细胞、包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：2的1个酵母细胞、和包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：3的1个酵母细胞。其它孔同样如此。然后，将5.0μL的分析物核酸填充到上述各样品填充孔中。然后，使分析物核酸的鱼12S rRNA序列和人工12S序列在相同孔中通过PCR进行扩增反应。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

第一次PCR的引物是MiFish-U(参见非专利文献1)，其具有用于第二次PCR的引物的退火反应的添加序列。

利用T100^TM Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过PCR进行核酸扩增。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行35个温度循环，每个涉及3个步骤：98℃，20秒；65℃，15秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-第二次PCR反应：接头序列的结合-

进行PCR反应，以在获得的第一次PCR扩增产物的两端添加用于区分测序样品的标签、和应用于测序反应的接头序列，以获得第二次PCR反应产物。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

利用T100^TM Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.)通过PCR进行核酸扩增。首先，在95℃下进行温育3分钟。然后，进行12个温度循环，每个涉及2个步骤：98℃，20秒；和72℃，15秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物-

利用2％琼脂糖凝胶在100V下进行电泳20分钟。切下330至400bp的观察带，并利用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(Nippon Genetics Co.，Ltd.)纯化PCR产物。

-核酸样品的浓度测量-

利用Bioanalyzer 2100(由Agilent Technologies，Inc.制造)定量第二次PCR产物。所用试剂盒是Agilent DNA7500试剂盒。基于定量结果，将第二次PCR产物用TE稀释为10ng/μL。将由四个孔获得的稀释的第二次PCR产物混入相同反应溶液。

-利用新一代测序仪(NGS)的测序反应-

利用新一代测序仪(设备名称：Miseq，由Illumina，Inc.制造)分析获得的第二次PCR产物。通过序列处理分析由新一代测序仪获得的数据，以获得关于核苷酸序列和读数数量的信息。获得的数据示例在表8中。表中的数值表示读数数量。

[表8]

-读数的标准化-

以人工12S序列读数以外其它读数的总和作为100,000读数而标准化的数据示例在中表9。表中的数值表示读数数量。针对人工12S序列1、2和3计算的平均值和变异系数(CV)示例在表10中。分析的准确度管理可利用表10中的平均值和变异系数(CV)被适当地进行。

[表9]

[表10]

基于表9中的人工12S序列1、2和3的读数数量，绘制拷贝数(x)和输出读数数量(y)之间的关系式，以获得式y＝1239.9x(确定系数R²＝0.9884)。根据此式估测各鱼物种的拷贝数，以获得表12。表中的数值表示拷贝数。分析的准确度管理可利用获得的校准曲线的确定系数R²适当地进行。生成的校准曲线示例在图29中。图29中示例的鱼物种采用四个孔的平均值，并且为方便起见，估测具有1拷贝以下的鱼物种被排除。在生成图29时使用的各鱼物种的读数数量和拷贝数示例在中表11以参考。

[表11]

[表12]

(实施例5)

<核酸分析方法-4的实践：利用微生物混合DNA样品测量菌丛>

在实施例5中，利用微生物混合DNA样品(ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准品(由ZymoResearch Corp.制造))测量菌丛。

在实施例3中，标准品核酸的人工核苷酸序列1-5被布置在与包含核酸样品作为分析物核酸的孔相同的孔中。相比之下，在实施例5中，将具有标准品核酸DNA600-G的人工核苷酸序列的核酸布置在不同孔中，并且将其扩增结果组合以生成校准曲线。

-制备分析物核酸(核酸样品)-

以与实施例1相同的方式向孔填充实施例1中制备的包含DNA600-G的酵母。将酵母分别以4个水平分配至4个不同的孔：1个细胞(1拷贝)、5个细胞(5拷贝)、10个细胞(10拷贝)、和50个细胞(50拷贝)。接着，2.0μL(0.5pg/μL)的微生物混合DNA样品手动填充到包含具有DNA600-G的人工核苷酸序列核酸的各孔中。然后，使孔中的微生物混合DNA样品和DNA600-G在相同孔中通过PCR进行扩增反应。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

利用Thermal Cycler(设备名称：T100^TM，由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)，通过PCR使分析物核酸(微生物混合DNA样品)和标准品核酸(DNA600-G；人工序列6)扩增。首先，在94℃下进行温育2分钟。然后，进行23个温度循环，每个涉及3个步骤：94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，30秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-利用珠体纯化PCR产物-

利用AMPure XP试剂(Beckman Coulter，Inc.)纯化PCR产物。首先，将AMPure XP试剂在使用前在室温下留置30分钟以上。将AMPure XP试剂通过倒置混合1分钟以上。然后，将20μL的AMPure XP试剂加入进行PCR反应的各孔。通过10次重复吸取，使PCR反应溶液和AMPure XP试剂充分混合。然后，将混合物在室温下留置5分钟。将进行PCR反应的各孔置于磁板中并留置2分钟。在进行PCR反应的各孔被置于磁板中的这种状态下，利用移液器取出PCR反应溶液，从而避免与AM Pure XP试剂中包含的磁珠接触。以200μL/孔添加70％乙醇，并将混合物留置30秒。去除乙醇，并洗涤磁珠。将洗涤步骤再重复一次。洗涤步骤在各孔处于磁板中的情况下进行。将各孔从磁板取出，并将20μL的洗脱缓冲剂(纯净水，Tris/乙酸盐，pH 8.0，或Tris/EDTA溶液)加入各孔。通过10次重复吸取，将磁珠和洗脱缓冲剂充分混合。将各孔置于磁板中并留置1分钟。在各孔置于磁板中的情况下回收洗脱缓冲剂，并转移至另一容器。在此操作中，转移至PCR反应容器对于后续步骤是优选的。

-第二次PCR反应：接头序列的结合-

进行PCR反应，以在获得的第一次PCR扩增产物的两端添加用于区分测序样品的标签、和应用于测序反应的接头序列，以获得第二次PCR反应产物。反应溶液的组成如下。

[反应溶液的组成]

利用Thermal Cycler(设备名称：T100^TM，由Bio-Rad Laboratories，Inc.制造)进行第二次PCR产物扩增。首先，在94℃下进行温育2分钟。然后，进行8个温度循环，每个涉及3个步骤：94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，30秒。最后，在72℃下进行温育5分钟，然后冷却至4℃以终止反应。

-利用珠体纯化PCR产物-

此步骤与第一次PCR后所进行的相同，因此省略描述。

-核酸样品的浓度测量-

利用Bioanalyzer 2100(由Agilent Technologies，Inc.制造)定量第二次PCR产物。所用试剂盒是Agilent DNA7500试剂盒。基于定量结果，将第二次PCR产物用TE稀释为10ng/μL。将由4个孔获得的第二次PCR产物的稀释溶液混入相同反应溶液。

-利用新一代测序仪(NGS)的测序反应-

利用新一代测序仪(设备名称：Miseq，由Illumina，Inc.制造)，分析第二次PCR产物。通过序列处理分析由新一代测序仪获得的数据，以获得关于核苷酸序列和读数数量的信息。以获得的读数数量作为1,000,000读数，将数据标准化。4个样品的标准化读数的总和示例在表13中。

[表13]

物种名称	拷贝数	读数数量
			枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)	48.7	91045
单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)	28.8	53773
			金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)	29.4	55010
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)	21.8	40772
			发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)	16.7	31208
肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)	23.1	43099
			大肠肝菌(Escherichia coli)	17.9	33426
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)	8.3	15583
			其它	1879.1	3510155
人工序列6	1	2867
			人工序列6	5	8990
人工序列6	10	21155
			人工序列6	50	92919

-校准曲线生成和定量-

基于表13中示例的扩增标准品核酸DNA600-G(人工序列6)的结果，生成校准曲线。生成的校准曲线示例在图28中。在图28中，纵坐标表示通过添加Miseq中作为读数数量获得的以1,000,000读数/孔标准化的4孔读数数量而获得的读数数量，并且横坐标表示DNA数量(拷贝数/4孔)。正方形显示的点分别表示以1拷贝、5拷贝、10拷贝、和50拷贝加入孔的人工序列。基于这4点(4个水平)绘制校准曲线。圆形显示的点表示基于标准化读数数量由核酸样品获得的读数在校准曲线上的作图。微生物混合DNA样品(分析物核酸)中包含的八种类型的微生物呈现读数少于92919读数——其是50拷贝的读数数量，并且允许通过插值法定量(可靠的定量，利用校准曲线中使用的数值范围)。由校准曲线估测的各微生物的拷贝数示例在表13中。

(实施例6：在利用NGS–1的测序反应中去除幽灵读数)

在实施例6中，利用微生物混合DNA样品(ZymoBIOMICS微生物群落DNA标准品(ZymoResearch Corp.))测量菌丛。

第一次PCR反应

通过与实施例1相同的程序，向样品填充孔填充包含DNA600-G的酵母。在此操作中，分别制备核酸拷贝数为1拷贝的孔(包含1酵母细胞)、和核酸拷贝数为10拷贝的孔(包含10酵母细胞)。将微生物混合DNA样品以2.0μL/孔填充至样品填充孔。在此操作中，将0.5pg/μL的微生物混合DNA样品加入1拷贝核酸的孔，并将5pg/μL的微生物混合DNA样品加入10拷贝核酸的孔。具体地，分别制备包含10pg混合DNA样品和10拷贝DNA600-G孔、和包含1pg混合DNA样品和1拷贝DNA600-G的孔。

然后，使微生物混合DNA样品和DNA600-G在相同孔中通过PCR进行扩增反应。反应溶液的组成是由下列组成的共计20μL：6.3μL的蒸馏水、2.0μL的10×Ex Taq缓冲剂、1.6μL的dNTP(2.5mM)、1.0μL的用于微生物16S扩增的第一次PCR的引物F(SEQ ID NO：9、10μM)、1.0μL的用于微生物16S扩增的第一次PCR的引物R(SEQ ID NO：10、10μM)、1.0μL的用于DNA600-G扩增的第一次PCR的引物F(SEQ ID NO：11、10μM)、1.0μL的用于DNA600-G扩增的第一次PCR的引物F(SEQ ID NO：12、10μM)、2.0μL的微生物混合DNA样品、0.1μL的Ex Taq(5单位s/μL)、和4.0μL的包含DNA600-G的酵母DNA(包含0.4U Zymolyase)。

后续的核酸扩增、利用珠体纯化PCR产物、和第二次PCR反应遵循实施例5——除了下列引物用于第二次PCR反应：F-1(SEQ ID NO：13)、F-2(SEQ ID NO：14)、F-3(SEQ ID NO：15)、F-4(SEQ ID NO：16)、F-5(SEQ ID NO：17)、F-6(SEQ ID NO：18)、F-7(SEQ ID NO：19)、F-8(SEQ ID NO：20)、R-1(SEQ ID NO：21)、和R-2(SEQ ID NO：22)。

后续的核酸扩增、核酸样品浓度测量、和利用NGS的测序反应遵循实施例5。

<参考特定拷贝数的读数数量的阈值设置和分析>

获得的读数总结在表14中(看起来明显源自污染的读数被提前从读数排除)。

[表14]

表14显示原始数据以及通过从原始数据(去除幽灵后)去除等于或小于DNA600-G的读数数量的序列数据而获得的数据。去除幽灵意为去除源自各种错误来源和对于分析非必要的读数。

原始数据还包括源自微生物混合DNA样品中包含的8种类型的微生物(表14中，枯草芽孢杆菌至铜绿假单胞菌)的序列以外的大量其它序列。然而，当排除读数数量等于或小于10拷贝DNA600-G的读数数量的序列时，两种类型的微生物——不动杆菌和坚强芽孢杆菌——的读数、和"其它"的读数被去除。序列百分比的堆积条形图示例在图30中。

"其它"的读数也参考1拷贝DNA600-G(数据未显示)的读数数量被去除。两种类型的微生物——不动杆菌和坚强芽孢杆菌——的读数数量与DNA600-G处于相似水平。因此，其读数能够在DNA600-G的读数数量乘以系数2.0至3.0时被去除(数据未显示)。

(实施例7：在利用NGS–2的测序反应中去除幽灵读数)

在实施例7中，利用从鱼肌肉组织提取的DNA样品进行NGS分析。

DNA提取反应

3个物种(真鲷、虹鳟、和远东拟沙丁鱼)的肌肉组织被制备作为鱼肌肉组织，并且利用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen N.V.)从中提取DNA。

第一次PCR反应

通过与实施例1相同的程序向样品填充孔填充包含人工12S序列的酵母。人工12S序列是如下核酸的人工核苷酸序列(参见SEQ ID NO：1-5)：被合成以在具有大约50％的GC含量比130-bp核苷酸序列的两端具有能够结合引物MiFish-U(参见M.Miya et al.,2015,R.Soc.Open Sci.,22:2(7)；生产商名称：FASMAC Corp.；参见SEQ ID NO：7和8)的核苷酸序列，不在60℃下形成高阶结构，并且不具有重复序列。由于人工核苷酸序列在两端具有能够结合引物MiFish-U的核苷酸序列，在对分析物核酸中包含的鱼12S rRNA分析时，可利用具有相同核苷酸序列的引物分析标准品核酸和分析物核酸。对于填充，分别制备核酸拷贝数为1拷贝的孔(包含1个酵母细胞)、核酸拷贝数为5拷贝的孔(包含5个酵母细胞)、核酸拷贝数为10拷贝的孔(包含10个酵母细胞)、和核酸拷贝数为50拷贝的孔(包含50个酵母细胞)。向各孔填充包括人工12S序列的这3种类型的酵母。具体地，核酸拷贝数为1拷贝的孔包含包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：1的1个酵母细胞、包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：2的1个酵母细胞、和包括人工核苷酸序列SEQ ID NO：3的1个酵母细胞。其它孔同样如此。然后，将5.0μL的鱼肌肉组织源DNA样品填充到上述各样品填充孔中。

后续的核酸扩增、利用珠体纯化PCR产物、和第二次PCR反应遵循实施例5——除了下列引物用于第二次PCR反应：F-1(SEQ ID NO：13)、F-2(SEQ ID NO：14)、F-3(SEQ ID NO：15)、F-4(SEQ ID NO：16)、F-5(SEQ ID NO：17)、F-6(SEQ ID NO：18)、F-7(SEQ ID NO：19)、F-8(SEQ ID NO：20)、R-1(SEQ ID NO：21)、和R-2(SEQ ID NO：22)。

后续的核酸扩增、核酸样品浓度测量、和利用NGS的测序反应遵循实施例5——除了通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物在核酸扩增后和核酸样品浓度测量前按照实施例4进行。

<参考特定拷贝数的读数数量的阈值设置和分析>

获得的读数总结在表15中。

[表15]

对象	1拷贝	5拷贝	10拷贝	50拷贝
					真鲷	27431	26441	26526	26309
虹鳟	15525	15111	15547	14748
					远东拟沙丁鱼	2006	1349	1583	1390
白鲫	1	0	0	0
					鰤鱼(Seriola quinqueradiata)	3	1	1	1
黄檗(Phellodendron amurense)	0	0	0	5
					三长棘真鲷(Pagrus auriga)	0	2	0	2
真鲷	1	1	1	0
					序列15	18	131	98	624
序列16	69	61	61	636
					序列17	10	72	50	768

原始数据还包括源自鱼肌肉组织源DNA样品中包含的3种类型的鱼物种(真鲷、虹鳟、和远东拟沙丁鱼)以外的大量其它序列其它。然而，其读数数量等于或小于1拷贝人工DNA的读数数量。这些被评估为幽灵读数并且能够被去除。

(实施例8：在利用NGS–3的测序反应中去除幽灵读数)

在实施例8中，利用相模川河中的环境DNA测量鱼类区系。

首先，取样相模川河的水并通过过滤器过滤。将过滤时使用的过滤器切碎，并利用DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue试剂盒，由Qiagen N.V.制造)提取DNA。利用Qubit4荧光计(Invitrogen^TM)定量提取的DNA样品(分析物核酸)的核酸浓度。

后续程序遵循实施例6，以从相模川河水样品获得关于序列和读数数量的信息。

<参考特定拷贝数的读数数量的阈值设置和分析>

获得的读数总结在表16中。

[表16]

从源自表16示例的鱼物种的序列中，能够排除读数数量等于或小于1拷贝人工DNA的平均读数数量(550.7读数)的序列。

以人工12S序列的读数以外的其它读数的总和作为100,000读数标准化的数据示例在表17中。落到1拷贝人工DNA的平均读数数量(1050读数)以下的读数数量以黑体型显示。

[表17]

基于表17中的序列15、16、和17的读数数量，绘制拷贝数(x)和输出读数数量(y)之间的关系式，以获得式y＝1223.9x(确定系数R²＝0.9884)。根据此式估测各鱼物种的拷贝数，以获得表18。小于1拷贝的估测拷贝数以黑体型显示。

[表18]

对象	1拷贝	5拷贝	10拷贝	50拷贝
					三齿雅罗鱼	41.1	45.9	41.4	48.6
白鲫	18.6	16.3	18.4	15.5
					Opsariichthys platypus	9.3	8.9	7.3	7.1
鲻鱼	1.9	1.7	2.4	1.0
					大口黑鲈	1.3	1.4	1.2	1.9
短棘缟虾虎鱼	0.7	0.7	4.0	0.6
					乌鳢	0.8	1.8	0.0	0.4
尾纹裸头虾虎鱼	1.5	0.2	0.8	0.0
					麦穗鱼	0.0	1.2	1.8	0.2
沙塘鳢	1.2	0.0	0.7	0.0
					Rhynchocypris lagowskii steindachneri	0.6	1.0	0.0	0.0
琵琶湖银鮈	0.4	0.5	0.2	1.1
					纵纹鱲属	0.3	0.2	0.2	1.4
其它	2.9	1.0	2.4	2.8
					序列15	0.6	3.0	13.0	53.4
序列16	1.3	2.3	8.7	46.5
					序列17	0.6	3.4	7.5	50.9

如上所述，示例能够根据明确的标准排除源自各种错误来源的序列的本发明方法。

例如，本发明的方面包括下列：

<1>分析至少一种核酸的方法，包括：

文库制备步骤，制备在相同体系中包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；

校准曲线数据生成步骤，基于特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸的拷贝数生成校准曲线数据；和

分析物核酸分析步骤，鉴定所述分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用所述校准曲线数据鉴定所述至少一种分析物核酸的所述至少一个核苷酸序列的数量。

<2>根据<1>所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种标准品核酸包括在相同体系中具有彼此不同特定拷贝数的不同核苷酸序列的标准品核酸。

<3>根据<1>或<2>所述的分析至少一种核酸的方法，其中

所述至少一种标准品核酸包括在两种以上不同体系中标准品核酸具有彼此不同特定拷贝数的不同核苷酸序列的，并且

从所述至少一种标准品核酸获得的校准曲线数据被标准化和组合。

<4>根据<1>至<3>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种标准品核酸包括DNA。

<5>根据<1>至<4>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种分析物核酸包括DNA和cDNA中的至少任一种。

<6>根据<1>至<5>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中制备文库是相同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸而进行的。

<7>根据<1>至<5>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中制备文库是不同引物用于对所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸而进行的。

<8>用于分析至少一种核酸的程序，其允许计算机至进行下列过程：

关于在相同体系中制备的包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库，

基于关于特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸数据，通过校准曲线数据生成单元，生成关于所述至少一种标准品核酸的校准曲线数据；和

通过分析物核酸分析单元，鉴定所述至少一种分析物核酸的核苷酸序列，同时利用校准曲线数据鉴定所述至少一种分析物核酸的核苷酸序列的数量。

<9>用于根据<1>至<7>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法或根据下述<1'>至<10'>中任一项所述的方法的文库制备装置，所述装置具有特定拷贝数的至少一种标准品核酸。

<10>根据<9>所述的文库制备装置，其中所述至少一种标准品核酸满足式CV<1/√x，其由通过特定拷贝数的不肯定性除以特定拷贝数的平均值而获得的变异系数(CV数值)、和所述至少一种标准品核酸的特定拷贝数平均值x表示。

<11>根据<9>或<10>所述的文库制备装置，其中特定拷贝数的所述至少一种标准品核酸通过喷墨模式被布置。

根据<1>至<7>中任一项所述的分析至少一种核酸的方法、根据<8>所述的用于分析至少一种核酸的程序、和根据<9>至<11>中任一项所述的文库制备装置可解决上述常规问题和实现本发明的目标。

本发明还包括但不限于下列实施方式。

<1'>利用包括特定拷贝数的核酸的至少一个标准品样品分析高通量测序反应数据的方法，所述方法包括：a)在相同条件下制备所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库；b)使步骤a)中制备的文库进行测序反应以获得输出数据，所述输出数据包括源自所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品的读数；和c)基于参考输出数据中源自所述至少一个标准品样品的读数数量而确定的阈值，将输出数据中的读数划分成等于或小于所述阈值的至少一个读数和等于或大于所述阈值的至少一个读数。

<2'>根据<1'>所述的方法，其中步骤a)中由所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品制备文库在相同反应体系中进行。

<3'>根据<1'>或<2'>所述的方法，其中所述至少一种核酸包括DNA。

<4'>根据<1'>至<3'>中任一项所述的方法，其中所述阈值通过步骤b)中获得的源自所述至少一个标准品样品的读数数量乘以预定系数而获得。

<5'>根据<1'>至<4'>中任一项所述的方法，其中包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且所述方法进一步包括选择标准品样品以确定步骤c)中的所述阈值。

<6'>根据<1'>至<5'>中任一项所述的方法，其中利用多个孔分析相同序列样品，并且包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且多个孔之间数据被标准化，并且确定的阈值被应用于多个孔以进行步骤c)中的分析。

<7'>根据<6'>所述的方法，其中所述方法包括基于多个标准品样品之间被标准化的数据，绘制特定拷贝数和输出读数数量的关系式，以利用所述关系式的反函数由输出读数数量估测拷贝数；和参考估测的拷贝数确定所述阈值。

<8'>根据<1'>至<7'>中任一项所述的方法，其中包括相同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且所述阈值在步骤c)中基于所述多个标准品样品的读数数量的平均值或中值而确定。

<9'>根据<1'>至<8'>中任一项所述的方法，其中所述特定拷贝数为200拷贝以下。

<10'>根据<9'>所述的方法，其中所述特定拷贝数为10拷贝以下。

<11'>根据<1'>至<10'>中任一项所述的方法，其中所述输出数据中等于或小于阈值的读数被排除，并且对步骤c)中等于或大于所述阈值的读数进行数据分析。

<12'>用于执行根据<1'>至<11'>或<1>至<7>中任一项所述的方法的试剂盒。

<13'>允许计算机执行根据<1'>至<11'>或<1>至<7>中任一项所述的方法的程序。

参考编号描述

1：装置

2：基材

3：孔

4：核酸

5：封闭构件

引用列举

专利文献1：日本专利公开(Kokai)号2015-204813

专利文献2：日本专利公开(Kohyo)号2018-514207

非专利文献1：MiFish,a set of universal PCR primers for metabarcodingenvironmental DNAfrom fishes:detection of more than 230subtropical marinespecies.M.Miya,et al.,2015

本文引用的所有出版物、专利和专利申请其整体通过引用并入本文。

[序列表]

序列表

<110> 理光株式会社

<120> 核酸分析方法、核酸分析程序和文库制备装置

<130> PH-8014-US

<150> JP 2018-236746

<151> 2018-12-18

<150> JP 2019-015126

<151> 2019-01-31

<150> JP 2019-046689

<151> 2019-03-14

<150> JP 2019-047881

<151> 2019-03-15

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

gtcggtaaaa ctcgtgccag caactaaatc gtcttcggcg caagtcaccg cagtatcttc 60

gttggatctg tgggtaatac tcgtcataca gtccttgtta tgcggtctgg acccttgcca 120

cataaggatc ggctccgcat tgcaactgac tcaaactggg attagatacc ccactatg 178

<210> 2

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 2

gtcggtaaaa ctcgtgccag ctacgtgaac cactctttct gtcctacata ggcactaagc 60

ctgtgtggag actctatgga gggcggtagc ggtctcatcc gtgctctggg actatccagt 120

agcttgcgca aagacgacct ttccttgctc tcaaactggg attagatacc ccactatg 178

<210> 3

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 3

gtcggtaaaa ctcgtgccag caaacagact atcgatatga tctaagtaag agcctgaggt 60

gtttcgcgca acttcgcaga cgccttgcgc ggaaagttga tatacagcgt gtcgcaaacc 120

aaggacattt acacactgtc aggcgtcatt gcaaactggg attagatacc ccactatg 178

<210> 4

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 4

gtcggtaaaa ctcgtgccag cgcggctgcg atgcaagcac agcgctcaag gggccattcc 60

aggtaatcgg cgaggaccag tccatccagc cattgagctg ccttttatag acacaaacct 120

aggtacctag atagttgaat tcctcaaaac tcaaactggg attagatacc ccactatg 178

<210> 5

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 5

gtcggtaaaa ctcgtgccag caacaatcgt ttcctttgtg caaagctaaa gaagccacca 60

cattctaccc tcccttattt tacagaacga gatttgatat aacattcgtt tcgagtaaaa 120

gtgaatgatg gaagccttgg tcggcgctga ccaaactggg attagatacc ccactatg 178

<210> 6

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 6

attcgaaggg tgattggatc ggagatagga tgggtcaatc gtagggacaa tcgaagccag 60

aatgcaaggg tcaatggtac gcagaatgga tggcacttag ctagccagtt aggatccgac 120

tatccaagcg tgtatcgtac ggtgtatgct tcggagtaac gatcgcacta agcatggctc 180

aatcctaggc tgataggttc gcacatagca tgccacatac gatccgtgat tgctagcgtg 240

attcgtaccg agaactcacg ccttatgact gcccttatgt caccgcttat gtctcccgag 300

atcacacccg ttatctcagc cctaatctct gcggtttagt ctggccttaa tccatgcctc 360

atagctaccc tcataccatc gctcatacct tccgacattg catccgtcat tccaaccctg 420

attcctacgg tctaacctag cctctatcct acccagttag gttgcctctt agcatccctg 480

ttacgtacgc tcttaccatg cgtcttacct tggcactatc gatgggagta tggtagcgag 540

tatggaacgg actaacgtag gcagtaagct agggtgtaag gttgggacta aggatgccag 600

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 7

gtcggtaaaa ctcgtgccag c 21

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

catagtgggg tatctaatcc cagtttg 27

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 9

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgctcaat cctaggctga tagg 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 10

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtaac agggatgcta agag 54

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgccag cmgccgcggt aa 52

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggacta chvgggtwtc taat 54

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgactagaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tctagctaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ctagagtaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cgtaagaaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tattaagaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggctataca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg agccttaaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tatgcgaaca ctctttccct acacgacgc 59

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 21

caagcagaag acggcatacg agattcatga gcgtgactgg agttcagacg tgtg 54

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 22

caagcagaag acggcatacg agatcctgag atgtgactgg agttcagacg tgtg 54

Claims (20)

1.分析至少一种核酸的方法，包括：

文库制备步骤，在相同体系中制备包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；

校准曲线数据生成步骤，基于所述特定拷贝数的至少一种标准品核酸的拷贝数，生成校准曲线数据；和

分析物核酸分析步骤，鉴定所述分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用所述校准曲线数据鉴定所述至少一种分析物核酸的所述至少一个核苷酸序列的数量。

2.根据权利要求1所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种标准品核酸包括在相同体系中具有彼此不同特定拷贝数的不同核苷酸序列的标准品核酸。

3.根据权利要求1所述的分析至少一种核酸的方法，其中

所述至少一种标准品核酸包括在两种以上不同体系中具有彼此不同特定拷贝数的不同核苷酸序列的标准品核酸，并且

由所述至少一种标准品核酸获得的校准曲线数据被标准化和组合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种标准品核酸包括DNA。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中所述至少一种分析物核酸包括DNA和cDNA中的至少任一种。

6.根据权利要求中1至3任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中制备文库是相同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸而进行的。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的分析至少一种核酸的方法，其中制备文库是不同引物用于所述至少一种标准品核酸和所述至少一种分析物核酸而进行的。

8.利用包括特定拷贝数的核酸的至少一个标准品样品分析高通量测序反应数据的方法，所述方法包括：

a)在相同条件下制备所述至少一个标准品样品和至少一个序列样品的文库；

b)使步骤a)中制备的文库进行测序反应以获得输出数据，所述输出数据包括源自所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品的读数；和

c)基于参考源自所述输出数据中所述至少一个标准品样品的读数数量而确定的阈值，将所述输出数据中的读数划分成等于或小于所述阈值的至少一个读数和等于或大于所述阈值的至少一个读数。

9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤a)中制备所述至少一个标准品样品和所述至少一个序列样品的文库是在相同反应体系中进行的。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述至少一种核酸包括DNA。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述阈值通过步骤b)中获得的源自所述至少一个标准品样品的读数数量乘以预定系数而获得。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其中包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且所述方法进一步包括选择标准品样品以确定步骤c)中的所述阈值。

13.根据权利要求8或9所述的方法，其中利用多个孔分析相同序列样品，并且包括相同或不同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且多个孔之间数据被标准化，并且确定的阈值被应用于所述多个孔以进行步骤c)中的分析。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法包括基于多个标准品样品之间标准化的数据，绘制所述特定拷贝数和输出读数数量的关系式，以利用所述关系式的反函数估测输出读数数量的拷贝数；和参考估测拷贝数，确定所述阈值。

15.根据权利要求8或9所述的方法，其中包括相同特定拷贝数的核酸的多个标准品样品用于步骤a)，并且基于步骤c)中的所述多个标准品样品的读数数量的平均值或中值确定所述阈值。

16.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述特定拷贝数为200拷贝以下。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述特定拷贝数为10拷贝以下。

18.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述输出数据中等于或小于阈值的读数被排除，并且对步骤c)中等于或大于所述阈值的读数进行数据分析。

19.用于执行权利要求1至18中任一项所述的方法的试剂盒。

20.计算机可读介质，其上存储计算机程序，所述计算机程序在被处理器执行时造成所述计算机通过进行下列步骤而分析至少一种核酸：

文库制备步骤，在相同体系中制备包括特定拷贝数的至少一种标准品核酸和至少一种分析物核酸的文库；

校准曲线数据生成步骤，基于所述特定拷贝数的至少一种标准品核酸的拷贝数，生成校准曲线数据；和

分析物核酸分析步骤，鉴定所述分析物核酸的至少一个核苷酸序列，同时利用所述校准曲线数据鉴定所述至少一种分析物核酸的所述至少一个核苷酸序列的数量。

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