CN105331606A

CN105331606A - 应用于高通量测序的核酸分子定量方法

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Publication number: CN105331606A
Application number: CN201410393914.9A
Authority: CN
Inventors: 焦少灼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2016-02-17

Abstract

本发明旨在通过改进高通量测序中样本文库制备过程及对应的数据分析方法实现对特异核酸分子在样本内或样本间的相对与绝对定量。将具有一系列已知浓度的不同序列的核酸分子混合物（标准品）加入固定量的样本或者抽提后的核酸样本中，均匀混合后进行建库测序并生物信息学分析。分析过程中依据不同标准品分子的浓度与读取的次数（reads，或矫正后的reads）的关系确定浓度-读取次数数理模型，然后利用该数理模型将感兴趣的核酸分子reads数转换为浓度从而得到绝对或相对定量。

Description

应用于高通量测序的核酸分子定量方法

技术领域

本发明涉及分子生物学，涉及核酸序列测序与分子定量，尤其是利用高通量测序方法对DNA与RNA直接定量。

背景技术

相对于sanger测序方法，高通量测序可以快速高效的确定样本中所含DNA与RNA序列信息，并以特异序列和读取频率为基础分析包含染色体变异、基因突变、RNA表达与剪切以及甲基化在内的分子水平事件，从而对生物研究以及临床诊断提供可靠的检测方法。

目前高通量测序在临床上的应用方兴未艾。对癌症患者血液循环肿瘤DNA（ctDNA）测序获取体突变位点及ctDNA的含量用于伴随诊断指导用药与复发检测，也可以用于健康人群全身的防癌体检[1-4]。对器官移植患者的血液游离DNA高通量测序可以有效的区分自体与供体的单核苷酸多态（SNP）的碱基差异，通过检测移植器官DNA在受体患者血液中的含量变化可以有效的检测移植排斥反应[5,6]。利用数以万计的16S序列信息鉴定环境微生物种群及相对丰度极大的加深了我们对肠道微生物的理解，并将微生物生态与人体健康关联起来[7,8]。同时高通量测序还可以高效的识别侵染生物的病原体，在传染病检测与预防方面也发挥重要作用[9-11]。虽然高通量测序广泛的应用于以上研究领域，包括确定序列信息与序列间的相对丰度，但目前还没有有效的方法利用高通量测序直接对原始样本中每条特异核酸绝对定量，必须额外依靠实时荧光PCR定量法（qRT-PCR）[12]或者数字PCR法[4]（digitalPCR）。本发明对现有的高通量测序方法进行改进，在样本处理过程中加入一系列已知浓度的标准核酸序列标准品，通过后期信息分析构建出标准浓度曲线从而可以对样本所有的序列进行绝对定量。

发明内容

本发明提供一种标准品，该标准品是由若干种已知浓度的不同序列的核酸分子组成，该标准品与待测样本混合后可以用于高通量测序的样本制备。特别强调的是该核酸标准品的分子序列可以用信息学分析与待测样本的中的核酸序列区别。

标准品的设计与采用不同的测序方法相关，目的是使标准品与待测核酸分子无偏差的共同进行下一步的建库测序与分析。利用PCR捕获测序方法时，例如16S的PCR建库测序，标准品中的核酸分子应该在分子两端具有PCR所需引物互补序列。实施方式之一，将16S的PCR引物515F与806R之间插入一段GAPDH序列，并且在GAPDH与引物之间插入经过编码的4位碱基来区分不同浓度的分子，该实施例中的标准品中核酸分子的具体序列与对应浓度见表1。对于使用核酸探针捕获测序，需要将核酸标准品的序列作为捕获区域的一部分进行探针设计。实施方式之一，标准品中的核酸分子是每隔20bp进行碱基转换编码的人源GAPDH序列，不同浓度的标准品分子碱基转换的分子位置不同，以便正常人源GAPDH及不同标准品核酸分子相互区分，该实施例中的标准品中核酸分子的具体序列与对应浓度见表3。在使用DNA随机打断建库方法时，标准品种的核酸分子应该与打断后DNA具有相当的碱基数量，例如最终打断DNA片度为180-250，则标准品分子的长度也应该在这个范围内。测定基因表达谱实验中利用polyT与具有polyA尾巴的mRNA互补结合方法中，标准品中不同浓度的核酸分子也应该具有与待测样本一样的polyA尾巴。以上不同应用的实验与分子序列设计方法都是本领域有经验的技术人员以“使标准品与待测核酸分子无偏差的共同进行下一步的建库测序与分析”为目的时所熟悉的。

本发明还提供一种样本处理与建库方法，该方法以标准品与待测样本以一定比例混合物为原始样本进行测序前样本处理与建库。该比例根据待测样本的浓度以及标准品的浓度可以适当调节，以达到标准品最优的浓度覆盖范围和测序数据量大小。所述的建库方法，比如直接打断建库，PCR富集目标片段建库与探针杂交捕获方法是本领域技术人员所熟悉，具体方法包括单不局限于实施方式之一中使用IlluminaTruSeq建库试剂盒建库，AgilentSureSelect探针进行目标区域捕获。

本发明还提供一种信息分析方法原理，利用标准品中不同的已知浓度的分子在样本数据中对应的reads数拟合数理模型。最后根据感兴趣的分子序列reads数代入该数理模型，从而得到同一样本中感兴趣分子的最终浓度，也可以比较不同样本间相同或不同序列的相对浓度。其中，拟合数理模型中使用的reads数可以是数据质控后直接得到Reads数，例如实施方式之一中的16SPCR产物中标准品的Reads数，也可以是校正后的reads数，例如实施方式之一中根据捕获外显子大小校正后的单位长度的Reads数。拟合数理模型采用的方法是本领域有经验的技术人员所熟悉的方法，包括但不限于线性回归方程。

本发明还提供一种直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的方法，包括标准品的制备，样本处理和文库制备方法，高通量核酸测序分子的方法以及对应的信息分析处理方法。

实施方式之一中，检测肠道提取物中厚壁菌门16S的含量:

(1)从人体粪便中提取固定体积的DNA样本，作为待测样本；

(2)将待测样本与标准品以9:1比例混合，该混合物作为模板利用16S特异引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物建库并使用MiSeq测序；

(4)利用生物信息学工具构建标准品浓度与Reads数（Tags）数理模型；

(5)将厚壁菌门16S所包含的Tags数量代入模型得出待测样本中的绝对浓度。

在另一实施方式中，检测结直肠癌患者血浆游离DNA中含有V600EctDNA的浓度：

(1)将患者血浆与标准品99:1进行混合后提取血浆总游离DNA（cfDNA）；

(2)提取的cfDNA建库后使用探针捕获感兴趣的DNA区域，包括肿瘤相关的的BRAF外显子与标准品对应的GAPDH同源分子；

(3)使用高通量测序仪对捕获文库测序；

(4)利用生物信息学工具构建标准品浓度与Reads数数理模型；

(5)将含有BRAFV600E突变的Reads数量代入模型得出待测样本中的绝对浓度。

本发明还提供一种直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的系统，包括：定制好的标准品，建库所需的试剂，测序与分析所需的仪器以及生物信息学分析需要的软件系统。可以将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器和关于使用该试剂盒对感兴趣核酸分子进行相对和绝对定量的说明。

本发明提供的直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的方法，集成了高通量测序的高分辨率与传统定量方法准确的双重优点。RealTimePCR定量与digitalPCR定量方法可以准确的对特定序列和低频突变进行准确定量，但缺点是只能针对已知的特定位点进行检测，不能用于对未知或者不确定的序列或突变分子定量，而且检测通量很小，一次机器运行最多只能检测几十种分子指标。高通量测序可以高通量的对所有感兴趣的核酸序列进行无偏差分析，预先不需要知道样本中的序列信息，所以可以发现未知的序列或突变。但由于实验方法所限，高通量测序只能得到同一个文库中序列的相对浓度，无法比较不同样本间的相对浓度，更不能对某条序列进行绝对定量。本方法通过引入可以在不同样本间横向比较的标准品实现了样本间的相对定量，而且利用标准品中具有已知浓度的不同分子的reads数构建数理模型实现了对测序结果中所有序列的绝对定量。

本发明还提供了使用高通量测序对核酸分子进行定量的重要临床应用。循环肿瘤DNA与癌症的发生发展具有重要的相关性。鉴于人体中血浆总游离DNA含量不稳定性，受多种因素影响[13]，对含有特定突变的ctDNA绝对定量而非相对比例可以为肿瘤的预防、复发监测及用药提供确切的指导作用[4]，例如本发明实施例中对结直肠癌患者进行BRAFV600E突变的定量检测。在另一实施例中，对某种肠道微生物进行定量检测可以和人体健康关联起来。基于高通量测序的定量方法有许多临床诊断应用，包括但不局限于上述方向。研究表明ICU患者的线粒体cfDNA绝对量与死亡率具有很强的相关性，可以最为临床监护中的一个重要预后指标[14]。另外，移植物发生排斥，自身免疫性疾病及外源病原体感染的情况下都可以通过检测血浆游离DNA对疾病进行诊断与监控。

附图说明：

图1.原始浓度样本与稀释浓度样本的16Sreads与浓度关系数理模型构建。

图2.三个ctDNA技术重复样本的reads与浓度关系数理模型构建。

本发明的实施方式举例

除非特别说明，本发明所用术语的含义均按照相关领域公知的广义含义来理解。

一．针对PCR扩增产物进行定量测序

利用高通量测序分析16SrRAN基因序列可以鉴定环境中的细菌种群及相对丰度。目前的测序方法简要包括以下步骤：a.样本准备；b.PCR扩增16S可变区域；c.扩增产物加测序街头以构建文库；d.文库上机测序；e.数据下机分析。目前的流程只能分析出单个样本中细菌种群（OTU）的相对丰度而无法比较不同样本中的相对丰度以及单个样本中单类细菌的浓度（特异16SrRNA基因浓度）。本文通过改良的实验过程与信息分析流程实现了通过高通量测序对原始样本中特异16S序列的绝对定量。

A.样本准备：

i.使用QiAampStoolDNAMiniKit从180mg(M1)人类粪便中提取总DNA溶解于100ul(V1)蒸馏水中，设定此原始样本为OS（OriginalSample），然后将样本OS用无菌蒸馏水稀释20倍(D1)，此稀释后样本为DS（DilutedSample）。实验目的为通过高通量测序可以计算验证样本OS与DS的特定OUT的浓度关系，并寻找绝对浓度aS的方法。

ii.取出9ulDNA(V2)样本加入1ul(V3)标准品（StardardSample，SS）均匀混合后作为PCR模板待用。标准品是经过编码的具有不同浓度的GAPDH序列的双链DNA，且两端具有16SrRNA基因V4区序列用于结合扩增引物。标准品具体序列及浓度参见表1。

表1：16S标准品序列及浓度举例。标准品序列是由扩增引物序列和能够与目标区域区分的序列组成。此次选用的是与目标区域16SV4区序列不同的人GAPDH基因片段为基础序列。区分不同浓度标准品主要依靠改变GAPDH序列（正体小写碱基）与扩增引物（红色小写斜体碱基）之间碱基序列（黑色大写碱基），从而可以编码和区分各个标准品。此例中我们依据四位碱基进行编码，分子生物学经验告知我们此处加入编码核苷酸易于大批量制造标准品。

B.PCR扩增i.使用特异引物扩增16SV4区,体系30ul：PhusionMasterMix(2×):15ulPrimer(2μM)：3ulgDNA(1ng/μL)：5ulH2O：7ul

引物序列：

ii.PCR反应程序:98°C1min;(98°C,10s;50°C30s;72°C,30s)×25-35cycles;72°C,5min。

iii.PCR产物片段回收并混样：根据PCR产物的电泳检测结果估测PCR产物浓度,按项目样品个数确定PCR产物混样的个数,通常混样个数为5-20个。每个样品取100ng(5-10μL)PCR产物混样,混匀后浓缩体积至30μL。1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,割胶回收目标条带。

C.建库：按照illuminaTruseq^TMDNASamplePreparationKit说明书进行对混合样本建库测序。

D.建好的文库使用qPCR定量后，根据数据量产出要求使用MiSeq得到数据产出。

E.数据分析：

i：数据质控:

由于IlluminaMiseq/Hiseq测序平台得到的下机数据(RawData)存在一定的低质量数据，会干扰分析的结果，因此在进一步分析前，需要对下机数据进行预处理，具体处理步骤如下：

数据拆分：根据Barcode序列将数据拆分为不同样品数据，并截去Barcode序列和PCR扩增引物序列和Adaptor污染的数据。

Tags拼接：将拆分的数据使用FLASH(V1.2.7)对每个样品的Reads进行拼接，得到的拼接序列为RawTags；

Tags截取：将Tags从连续低质量值(默认设定<=10)碱基数达到设定长度(默认是5)的第一个低质量碱基位点截断；

Tags长度过滤：过滤去除截取后得到的Tags集合中长度小于Tags平均长度的70%的Tags；

Tags去嵌合体序列：将以上过滤得到的Tags序列与数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（CleanTags）。

ii.物种注释与丰度分析：

为了研究样品中物种的多样性，首先使用Uparse软件对所有样品的全部Tags序列进行聚类。以97%序列一致性（Identity）为前提，将聚在一组的序列作为一个OTUs（OperationalTaxonomicUnits），OTUs中的序列可能来源于某一个相同分类单元。

从每一个OTUs中选出一条代表性序列，再用RDPClassifier和GreenGene数据库对代表性的序列进行物种注释从而得到代表性序列的物种分类信息。根据OTUs代表序列的物种注释结果，统计每个样品在各分类水平上（Phylum，Class，Order，Family，Genus）能被注释到的Tags数目。均一化后统计各个样品在Phylum水平上的物种组成。

iii.构建标准品浓度-Tags对应模型：

将cleantags与各标准品序列进行比对，统计出样本OS与DS中不同的标准品对应的Tags数量（Reads数），如表2所示。以此数据为基础，构建数据模型。此例中的数据模型为Cc=[a+b*N(Tags)]*，见图1。其中，

Cc(OS)=；

Cc(DS)=。

表2：各标准品对应的tags数量。

iv.计算特定OTU的在样本中的原始浓度:

将样本OS与DS包含的相同OTU（可分为门纲目科属五个水平）所有Tags数量代入iii中的数据模型得到Cc(OS)与Cc(DS)，然后根据实验过程中的稀释关系得到该OTU在提取DNA原样本中的真实浓度。

此例中选取变形菌门（Proteobacteria）的OTU数量的分别为Tags(OS)=3974；Tags(DS)=561

则建库前混合样本中厚壁菌门对应的16S序列浓度为：

Cc(OS)=；

Cc(DS)=。

==19.02，与原始稀释比例20×相近，证明此定量方法可靠有效。

结合实验中所用样本量M1以及稀释关系，可以计算出原始粪便样本中厚壁菌门的绝对浓度：

aC(OS)===1.94×10¹⁰copies/mg；aC(DS)===2.04×10¹⁰copies/mg.

实验过程中亦发现不同DNA片段的不同PCR效率会影响最终浓度，必要时需要利用不同片段的扩增效率进行浓度矫正。

二、针对探针杂交捕获进行目标区域定量测序

HiSeqXTen的推出使人全基因组测序（数据100Gb，深度30×）降至万元水平，但检测低频突变需要有效测序深度至少100×以上的数据，对临床应用来说人全基因组测序仍然费用不菲。针对感兴趣的基因区域进行选择测序分析是性价比极高的必然选择。除了前文提到的使用PCR方法富集感兴趣片段之外，使用定制的核酸探针捕获目标序列也是常用的方法之一。目前探针杂交捕获测序法主要用于低频突变的定性检测，没有有效的方法可以同时进行绝对定量。本文通过改良的实验过程与信息分析流程实现了利用高通量测序对原始样本中特异序列的绝对定量。同时应该注意，根据分子学实验原理与专业人士的推理，对于核酸样本直接建库测序而非捕获测序实验流程更为简单，应用具有不同浓度的标准品进行对此类样本的绝对定量应该包括在杂交捕获的技术方法中。

A.样本准备：

i.本实验样本使用具有BRAFV600E结直肠癌患者血浆，实验目的为通过高通量测序计算此样本中具有特定点突变(V600E)的序列的绝对浓度aC。考虑到cellfreeDNA的提取效率问题，第一步需要将标准品DNA直接以一定比例与待检测血浆或血清混合。此例中990ul（V1）血浆中加入10ul（V2）标准品，得到血浆与标准品混合物1ml（V3），血浆与标准品比例为99:1。此例病人血浆分为三份990ul血浆，分别独立与10ul标准品混合，标记为MS1，MS2，MS3作为三次技术重复，以验证实验的可重复性。标准品的设计为可以在测序结果中与正常序列区别的DNA片段，包括与人类无任何同源性的序列，而且不同的标准品也可以用不同的基础序列。此例中标准品是经过编码的不同浓度的GAPDH序列类似物的混合液。标准品的长度可变，此例中由于血液游离DNA的长度是140-170bp左右，而且最终采用的是PE100的测序策略，我们选择的标准品长度为154bp。具体序列及浓度如表3：

表3：用于目标区域测序的不同浓度的标准品。标准品序列是能够与目标分析有效区分的序列组成。此次选用的是与目标区域1序列不同的humanGAPDH基因片段为基础序列。为了区分人体中正常的GAPDH序列，我们将选择区段每隔20位引入一个碱基转换。不同浓度标准品的区别主要在于GAPDH序列上不同的固定位点上的单核苷酸转换。例如标准品1是在位点1，21，41，61，81，101，121，141上引入碱基转换（大写碱基），标准品2则是在位点2，22，42，62，82，102，122，142上引入碱基转换（大写碱基），以此类推。

ii.使用QiagenCirculatingNucleicAcidKit分别从三管1mL（V3）标准品血浆混合物中提取总血浆游离DNA溶解于50ulAE缓冲液中。

B.探针设计：通过AgilentSureDesign平台进行探针设计。目标覆盖区域（TargetRegions）除了包含EGFR，KRAS，BRAF，NRAS，PIK3Ca和PTEN外，还需要包含标准品的参考核酸序列，此例中的标准品参考核酸序列为人GAPDH154bp。由于标准品序列基于人源GAPDH序列，设计的探针也会将正常GAPDH基因捕获，所以设计时需要尽量提高探针浓度避免探针被目标GAPDH序列饱和，此处的探针密度设为最高的5×。标准品序列也可以设计为非人源序列，并且不同标准品序列可以不同源，这种设计可以比较好的解决上述探针问题，但不同标准品的捕获效率可能不一致，而且会增加捕获区域与探针数量。

C．建库捕获将混匀后的DNA按照illuminaTruseqTMDNASamplePreparationKit说明书末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库pooling后与定制的生物素标记SureSelect探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将目标基因区域捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行PE100测序。

此处应该特别注意的是文库与探针进行液相杂交时要保证探针相对于目标DNA区域过量。

D.测序结果

i．测序得到的原始图像数据经basecalling转化为rawdata，结果以fastq。去除掉原始测序数据中会包含接头信息，低质量碱基，未测出的碱基（以N表示）最终得到的数据为cleandata。原始数据过滤方法如下：

(1).需要过滤掉含有接头序列的reads；

(2).当单端测序read中含有的N的含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对pairedreads；

(3).当单端测序read中含有的低质量（<=5）碱基数超过该条read长度比例的50%时，需要去除此对pairedreads。

经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的cleandata。

ii．有效数据通过BWA软件比对到参考基因组，用于游离DNA的断裂位点相似，并不是随机打断，而且标准品的两端序列基本一致，所以比对reads不去除重复。

对reads在参考基因组上的比对情况进行统计，计算探针的捕获效率。对于比对到GAPDH上的reads符合标准品编码序列的reads单独做统计，见表4。

表4.标准品比对到GAPDH上的reads数统计。

iii．根据表4为基础，得到标准品原始浓度与reads数之间的数据模型，见图2。

iv．假设Et为探针捕获待分析目标区域的效率，Es为探针捕获参考标准品的效率，此例中的数据模型为血浆中特定DNA片段的浓度Cc=[a+b*N(Reads)]。那么，患者目标序列在各混合样品中的浓度计算公式如下所示，

Cc(MS1)=；

Cc(MS2)=；

Cc(MS3)=。

v．计算具有BrafV600E突变的序列浓度。

如ii中所述，要测的BrafV600E突变序列的浓度，需要先确定V600E区域探针捕获效率与标准品GAPDH的捕获效率比值。血液循环DNA来自于凋亡或者坏死的人体细胞，一般认为cfDNA是整个基因组均匀断裂而来，所以整个基因组DNA片段是均一游离在血液中。当均一的DNA片段与过量探针杂交后得到的不均一测序产出可以反映出不同探针的捕获效率。此实验中我们利用比对到含有V600的BRAF第15外显子的reads数（R₁₅）与比对到GAPDH154bp模板上的非标准品reads数（Rg）估计捕获效率比，即，其中S₁₅=45，指捕获的BRAF第15个外显子长度，Sg=154，为GAPDH捕获目标区域的长度。三个重复样本中比对到BRAF第15个外显子与含有V600E的Reads数R_V600E见表5.

表5.三个重复样本中BRAF比对Reads数统计。其中R15表示所有比对到BRAF第15各外显子上的reads数，R_V600E指所有含有BRAFV600E对应的碱基突变的Reads数。

Cc(MS1)=；

Cc(MS2)=839；

Cc(MS3)=。

三个技术重复样本得到相似的绝对浓度，证明此技术重复性好，稳定可靠。

Claims

1.一种可以用于正常建库的核酸标准品。

2.如权利要求1所述的核酸标准品，是由一系列不同浓度的具有不同核酸序列的核酸分子组成。

3.如权利要求1所述的核酸标准品，核酸标准品的编码序列可以利用信息学分析与待测样本的中的核酸序列区别。

4.一种混合标准品与样品的文库制备方法，将权利要求1中的核酸标准品混合物与定量样本或者从定量样本提取的核酸样本按比例混合，用于测序前的文库制备。

5.如权利要求4中制备的文库，不但包括用于直接建库测序，还包括目标区域富集建库测序。

6.如权利要求4中的文库制备，不但包括单个样本的建库测序，还包括多个样本的混合建库与混合捕获。

7.如权利要求4中的核酸标准品，如果使用多重PCR建库方法，需要将标准品的特异编码序列置于上下游引物识别序列的中间，本发明优选的PCR建库标准品是经过编码的引物与人GAPDH基因片段的重组分子。

8.如权利要求4中的核酸标准品，如果使用杂交探针捕获目标区域进行测序，需要将核酸标准品的序列作为捕获区域的一部分进行探针设计，本发明优选的捕获建库标准品是经过精心编码的人GAPDH基因片段。

9.一种高通量测序方法，包含将权利要求4-8中构建好的文库上机进行高通量测序，本案中使用的仪器包括但不局限于illuminaMiseq与HiSeq测序仪，可以适用于其它高通量测序的平台，例如LifeIon测序平台，Roche454平台，ABISolid平台以及PacBioRS平台等测序平台。

10.一种基于高通量测序的特异序列浓度分析信息方法，对权利要求9中的测序原始数据进行序列比对与统计分析，得出不同浓度标准品的reads数与样本中感兴趣序列的reads数。

11.如权利要求10中所述的reads数，也可以是根据序列长度矫正后的reads数，包括但不局限于RPKM（ReadsPerKilobasesperMillionreads）。

12.如权利要求10中所述，将不同标准品的真实浓度与其reads数（或矫正后的reads数）进行函数拟合构建数学模型；将同一样本中感兴趣的序列reads数（或矫正后的reads数）代入权利要求12中数学模型，从而得到该序列的真实浓度。

13.一种利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的方法，包括：利用权利要求1-3中的标准品与待测样本或处理后的样本接触，检测测序结果中标准品与被定量分子的reads数。

14.一种利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的系统，包括权利要求1-3中的标准品的制备，权利要求4-8中的文库制备方法，权利要求9中的高通量测序方法和权利要求10-12中的数据分析方法。

15.权利要求1-8中的任一项所述标准品设计与文库制备方法和权利要求10-13中的信息分析方法用于制造核酸样本定量的制剂的用途，所述的用途例如人全基因组CNV检测，血液游离核酸定量检测，16SrRNA定量检测，并由此引申出的临床应用，例如孕妇血液游离核酸定量检测胎儿基因信息，器官移植患者的血液循环DNA定量检测排斥反应，循环肿瘤DNA的定量检测肿瘤发生与用药信息，微生物在特定环境中的数量等。