CN114891868A - 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114891868A
CN114891868A CN202210609186.5A CN202210609186A CN114891868A CN 114891868 A CN114891868 A CN 114891868A CN 202210609186 A CN202210609186 A CN 202210609186A CN 114891868 A CN114891868 A CN 114891868A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
target
microorganism
nucleic acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210609186.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈丹
李秋芳
朱鹏远
吴春求
余成鹏
吴静
王杨
陈嘉昌
柳俊
胡朝晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Jinqirui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Jinqirui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Jinqirui Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Jinqirui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210609186.5A priority Critical patent/CN114891868A/zh
Publication of CN114891868A publication Critical patent/CN114891868A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒。所述方法包括：将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合，进行文库制备及测序，根据测序结果计算目标微生物含量，所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。本发明针对不同目标微生物的特异性序列，设计相对应的镜像序列，共同进行建库及测序，镜像序列可以作为靶标序列的理想对照，等比换算得到准确的目标微生物含量，计算出目标微生物的真实含量。

Description

一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒。
背景技术
随着高通量量测序技术(NGS)的发展，基于NGS平台的分子生物学技术在微生物检测中应用越来越广泛。目前基于高通量测序技术的微生物检测方法主要有两种方式：一种方式为微生物全基因组测序(mNGS)，可以广覆盖的一次性检测2万种以上的微生物，也是目前实验室广泛使用的检测技术之一；另一种方式为靶向测序技术(tNGS)，利用探针捕获或多重PCR进行富集后进行测序，即设计特异性引物或探针，进行目标微生物富集，选择性富集目标基因组上的靶标基因或序列，然后进行测序和下游分析。靶向测序一次性可以检测几十至几千种微生物，灵敏度和检测成本较mNGS都具有较大优势，也是目前临床应用的新兴技术。
但目前两种NGS的方法虽然可以实现微生物的广谱检测，却在微生物定量方面存在一定的不足，mNGS和tNGS主要通过各样本中微生物的reads数来计算种类和含量、丰度、相对量等指标，存在以下几个问题：(1)对于mNGS在不同的宿主背景，和背景菌，其他强阳微生物的干扰下，即使相同浓度的微生物，检测的序列数相差很大，因此，微生物序列数并不能充分反映样本微生物含量，微生物浓度定量非常困难；(2)比较与mNGS技术，tNGS不受宿主和背景菌影响，影响因素少，但在其他强阳微生物干扰下，目标微生物的序列数也会受到较大的影响；(3)tNGS靶标的序列成分：序列的GC含量差异和引物的长短，引物的退火温度，探针的捕获效率等均影响富集效率；(4)tNGS目标区域的富集效率差异，也会使得不同微生物的序列数不能客观反映其含量，因此，通过其他引入的靶标内参也无法直接定值。
综上所述，提供一种进行能够准确定量的微生物检测方法，且操作简单、成本低，对于微生物检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒，设计目标微生物的镜像序列，共同进行建库及高通量测序，能够进行准确定量检测，且操作简单、成本低。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于NGS平台的微生物定量方法，所述方法包括：
将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合，进行文库制备及测序，根据测序结果计算目标微生物含量；
所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。
本发明中，对于DNA片段，在目标区域(非引物区)可设计其核酸片段(如示意图1)，即3’-5’端反向序列或5’-3’互补序列，镜像序列和原序列享有相同的序列成分，共享相同的扩增引物，在湿实验过程中，如引物的退火温度，引物长度，GC含量，PCR扩增效率、测序效率等多方面相当，具有可比性，并且与真实的微生物目标序列可以明显区分，可以作为目标序列的理想对照，即，基于镜像序列实现靶向扩增子测序中的定量。
本发明的微生物定量方法可广泛应用，包括农业病害鉴定与预测、食品安全检测和病原微生物检测等。
优选地，所述计算的公式如式(1)所示。
Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；
其中，Cp为目标微生物的含量，Rp为目标微生物扩增到序列数，Ci为镜像序列的投入浓度，Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比，Ri为镜像序列扩增到序列数。
优选地，所述镜像序列被插入到质粒中。
优选地，所述方法还包括设计引物的步骤。
优选地，所述设计引物包括：获取目标微生物基因组序列，筛选目标区域，针对目标区域设计引物。
本发明中，目标微生物基因组序列来自NCBI的GenBank/RefSeq已收录的基因组序列，或者专家共识、已发表文章中建议或使用的相关序列，使用生物信息比对软件对上述搜集到的微生物序列进行多序列比对分析，设计微生物特异性良好的目标序列引物。
本发明中，目标微生物包括细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、藻类和原生动物中的至少一种。
本发明中，可使用Primer3软件进行引物设计。
优选地，所述文库制备包括：对目标微生物的基因组上目标区域及其镜像序列进行PCR扩增，得到文库。
优选地，所述PCR包括多重PCR。
优选地，所述测序包括靶向测序(tNGS)。
优选地，所述目标微生物包括鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌或结核分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述鲍曼不动杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述鲍曼不动杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，所述金黄色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。
优选地，所述金黄色葡萄球菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
优选地，所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列。
优选地，所述肺炎克雷伯菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
优选地，所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列。
优选地，所述卡他莫拉菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
优选地，所述铜绿假单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列。
优选地，所述铜绿假单胞菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.15所示的序列。
优选地，所述结核分枝杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列。
优选地，所述结核分枝杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.18所示的序列。
SEQ ID NO.1：CTAACCAAATCAGCCATAAAA。
SEQ ID NO.2：GACTGGGGCCGTTTAATTTAA。
SEQ ID NO.3：
CCTTGAACATTGTAGCGTAACCCGTTAACGTATGGTCGTACGGTCAGTTTAAAGA GTGCGACTAGTTTTTTCGCTATAACGTCGAGCGAAAATAGTACATTGTCTGATCGGTCT G。
SEQ ID NO.4：TTGCTTATGTTTATAAACCTAA。
SEQ ID NO.5：GCCACTAGCAGCAGTGACACTTT。
SEQ ID NO.6：
GTTATGTGTACTTGTTGAAAATTCTTTTTCACTTCGTGTTCGTTTTTTTCTCTTTAAT TTATAAACCTCGCTTCTGTTGCGACTAAGTCCAGTTATTACGAGTAACAT。
SEQ ID NO.7：GTTGTCTTGGCAGGTGATACA。
SEQ ID NO.8：GAGAAGTACCATTACCACCGCC。
SEQ ID NO.9：
CACCAGTCACTAGCGGTTCCACGTTTTTAATTTTGGTTACAACAATGGAATGCTCT TTTTCTGCTTTCGTGCCGATGTCTAAACGCACCAAACAATGTTCTACTTGGACGGTAGC CAAAA。
SEQ ID NO.10：GATGCTTCCGGTGAAGGTGC。
SEQ ID NO.11：CAGGTCGGAGCTGTCGTACT。
SEQ ID NO.12：
GTTACCGCCGCAGCTGGGCTTGCGTCCGATACCGCGGTTGTCGCCACGGCAACTG CCGTCGGACTCGCTGCTTCGGCGAGACGCACGCTAGTGGTGGAAGATGAAGC。
SEQ ID NO.13：TCCGTCCGCTGACTGGAT。
SEQ ID NO.14：GAAGAAAATCGCTGATAAGTGG。
SEQ ID NO.15：
TTTCCGTAAACTATGGTACCGCGGAAGAAATCGCAGATTCATCATGGTTCACAGG AACATGAACTGGGTCGGACAGAAGTACCGTGGAAGAAGCAACTTTATCAT。
SEQ ID NO.16：GTCGATGTTGGCGCTCAACC。
SEQ ID NO.17：TTTGACCATGGGTTACTACACGCG。
SEQ ID NO.18：
TCATCTCGGCCAACCCGTCCCACGGGCAGTCGTCGCTCGTTACCATCGGCAGCGT CTACCACTTGCACAGCCGGTCGTCTATCACCTAGCCCTACAGAACC。
作为优选的技术方案，所述基于NGS平台的微生物定量方法包括以下步骤：
(1)获取目标微生物基因组序列，筛选目标区域，针对目标区域设计引物；
设计镜像序列，所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列；
(2)将引物和镜像序列与待测样本混合，进行PCR扩增，得到文库；
(3)对文库进行测序，根据测序结果按式(1)计算目标为生物含量；
Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；
其中，Cp为目标微生物的含量，Rp为目标微生物扩增到序列数，Ci为镜像序列的投入浓度，Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比，Ri为镜像序列扩增到序列数。
第二方面，本发明提供一种微生物定量检测试剂盒，所述试剂盒应用于第一方面所述的基于NGS平台的微生物定量方法中。
所述试剂盒包括针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列；
所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
优选地，所述目标微生物包括鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌或结核分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述鲍曼不动杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。优选地，所述鲍曼不动杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，所述金黄色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。优选地，所述金黄色葡萄球菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
优选地，所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列。优选地，所述肺炎克雷伯菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
优选地，所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列。优选地，所述卡他莫拉菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
优选地，所述铜绿假单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列。优选地，所述铜绿假单胞菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.15所示的序列。
优选地，所述结核分枝杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列。优选地，所述结核分枝杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.18所示的序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明中，建立了一种微生物定量方法，即针对不同目标微生物的特异性序列，设计相对应的镜像序列，共同进行建库及测序，镜像序列可以作为靶标序列的理想对照，等比换算得到准确的目标微生物含量，实现了在不引入额外实验的前提下，计算出目标微生物的真实含量。
附图说明
图1为镜像序列原理示意图；
图2为实施例1中本发明微生物定量方法和ddPCR定量方法结果相关系数图；
图3为实施例2中本发明微生物定量方法和ddPCR定量方法结果相关系数图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例中，根据目标微生物的特异性靶标，设计对应的镜像序列，按已知含量投入待测核酸，然后进行文库制备和上机测序，以检测样本中目标微生物种类和镜像序列含量。
选择常见的5种目标微生物的5个靶标区域，按引物信息和参考序列提取靶标所在原序列，互补后得到相应镜像序列，如表1所示。
表1
Figure BDA0003671403620000041
Figure BDA0003671403620000051
将以上设计镜像序列组合用于多重PCR体系，其扩增产物用于下游建库和测序，具体步骤如下：
(1)样本前处理
选取由5份微生物培养物(外购自广东省微生物菌种保藏中心)，稀释至不同浓度梯度，按不混合、双混合及四混合获得20例终浓度不一的模拟样本进行研磨破壁，破壁后离心5min，取400μL上清用于核酸提取；
(2)核酸提取
按照提取试剂盒SOP提取相应的样本，完成提取后取部分核酸进行数字PCR(ddPCR)实验，ddPCR使用BioRad公司的数字PCR系统及其配套试剂，并按照试剂所述方法对每份样本提取的核酸进行ddPCR定量，用于本实施例所述的定量的对比方法，剩余核酸中加入5种镜像序列，投入后镜像序列后与投入前的体积比为1.1:1，混合后每种镜像序列浓度104copies/mL，该混合核酸进入到文库制备过程；
(3)文库制备
(a)使用常规的tNGS文库制备方法，即PCR扩增法进行目标区域富集和文库扩增。PCR扩增包括PCR1和PCR2，每轮PCR扩增结束后使用1×磁珠进行纯化回收产物，第二轮PCR纯化产物即为目标文库，2轮PCR反应体系及PCR反应程序如表2所示；
表2
Figure BDA0003671403620000061
(b)使用Qubit 3.0测定样本文库浓度，并记录文库浓度；
(c)每个文库均取等质量(依据出库浓度选择范围)进行pooling，文库取样体积按公式文库取样量(ng)/文库浓度(ng/μL)进行计算；
使用Qubit 3.0测定pooling文库浓度，并记录文库浓度；
(d)采用全自动核酸蛋白分析仪检测文库片段；
(4)测序
根据测定的pooling文库浓度及相应的文库片段大小，计算pooling文库的摩尔浓度，并使用无核酸酶水稀释至1nmol/L，使用0.1mol/L的氢氧化钠溶液变性后，进行二代测序；
(5)生物信息分析
数据质量要求：Q30≥75％，最低有效数据量≥50k，使用生物信息比对软件，确定比对到目标微生物和镜像序列的序列数，依据式(1)，计算目标微生物浓度；
Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；
其中，Cp为目标微生物的含量，Rp为目标微生物扩增到序列数，Ci为镜像序列的投入浓度，Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比，Ri为镜像序列扩增到序列数。
本实施例中，使用ddPCR定量和本发明微生物定量方法平行检测，结果如表3所示，并将本发明微生物定量方法结果和已知ddPCR定量结果进行相关性分析，结果如图2所示，相关系数为99.9％，显示出较高的一致性。
表3
Figure BDA0003671403620000062
Figure BDA0003671403620000071
Figure BDA0003671403620000081
综合以上结果，表明本发明微生物定量方法能准确的计算出目标微生物的含量。
实施例2
选择除实施例1中PCR引物体系检测目标微生物外，选择其他常见的微生物，设计其引物序列(不含镜像序列)，如表4所示，用于比较在更多重更复杂引物体系下以及有强阳竞争抑制的情况下，目标微生物定量结果的准确性和可靠性。
将新设计的微生物引物序列与实施例1中的PCR引物组合，获得新PCR引物体系，选择实施例1中所述的20例模拟样本混入不同浓度的微生物培养物(1～2种，其中真菌外购自广东省微生物菌种保藏中心，病毒及支原体外购自广州邦德盛生物科技有限公司)进行检测，分析不同引物体系、弱阳微生物、强阳微生物及混合检测外微生物对目标微生物的抑制情况。本实施例实验过程和分析过程参照实施例1，本实施例检测结果如表5所示。
检测结果显示，20例样本中有14例检测结果与实施例1中检测结果一致，其目标微生物定量结果准确，证明新加入的引物不影响镜像质粒的定量效果；6例检出新引物所覆盖范围的微生物，目标微生物定量准确，证明携带的其他微生物不影响目标微生物的定量检测；1例强阳竞争抑制测试结果显示，强阳微生物的检出不影响目标微生物的定量效果。综合所有结果，将本实施例微生物定量方法结果和已知ddPCR定量结果进行相关性分析，结果如图3所示，相关系数为99.9％。
表4
Figure BDA0003671403620000091
Figure BDA0003671403620000101
表5
Figure BDA0003671403620000111
Figure BDA0003671403620000121
Figure BDA0003671403620000131
Figure BDA0003671403620000141
由表5和图3可知，本发明的微生物定量方法，可用于多重PCR技术中进行定量，且在更多重复杂的体系下以及在强阳压制的情况下，定量并不受影响，从而反应高通量测序(NGS)实验过程的目标微生物真实含量。
综上所述，本发明建立了一种微生物定量方法，即针对不同目标微生物的特异性序列，设计相对应的镜像序列，共同进行建库及测序，镜像序列可以作为靶标序列的理想对照，等比换算得到准确的目标微生物含量，实现了在不引入额外实验的前提下，计算出目标微生物的真实含量，同时，在更多重复杂的体系下以及在强阳压制的情况下，定量并不受影响，从而反应高通量测序(NGS)实验过程的目标微生物真实含量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110>广州市金圻睿生物科技有限责任公司
<120> 一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒
<130> 2022-05-25
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaaccaaat cagccataaa a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactggggcc gtttaattta a 21
<210> 3
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccttgaacat tgtagcgtaa cccgttaacg tatggtcgta cggtcagttt aaagagtgcg 60
actagttttt tcgctataac gtcgagcgaa aatagtacat tgtctgatcg gtctg 115
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgcttatgt ttataaacct aa 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccactagca gcagtgacac ttt 23
<210> 6
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttatgtgta cttgttgaaa attctttttc acttcgtgtt cgtttttttc tctttaattt 60
ataaacctcg cttctgttgc gactaagtcc agttattacg agtaacat 108
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttgtcttgg caggtgatac a 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagaagtacc attaccaccg cc 22
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caccagtcac tagcggttcc acgtttttaa ttttggttac aacaatggaa tgctcttttt 60
ctgctttcgt gccgatgtct aaacgcacca aacaatgttc tacttggacg gtagccaaaa 120
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gatgcttccg gtgaaggtgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caggtcggag ctgtcgtact 20
<210> 12
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gttaccgccg cagctgggct tgcgtccgat accgcggttg tcgccacggc aactgccgtc 60
ggactcgctg cttcggcgag acgcacgcta gtggtggaag atgaagc 107
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tccgtccgct gactggat 18
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaagaaaatc gctgataagt gg 22
<210> 15
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tttccgtaaa ctatggtacc gcggaagaaa tcgcagattc atcatggttc acaggaacat 60
gaactgggtc ggacagaagt accgtggaag aagcaacttt atcat 105
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtcgatgttg gcgctcaacc 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tttgaccatg ggttactaca cgcg 24
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcatctcggc caacccgtcc cacgggcagt cgtcgctcgt taccatcggc agcgtctacc 60
acttgcacag ccggtcgtct atcacctagc cctacagaac c 101

Claims (10)

1.一种基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述微生物定量方法包括：
将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合，进行文库制备及测序，根据测序结果计算目标微生物含量；
所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。
2.根据权利要求1所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述计算的公式如式(1)所示；
Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；
其中，Cp为目标微生物的含量，Rp为目标微生物扩增到序列数，Ci为镜像序列的投入浓度，Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比，Ri为镜像序列扩增到序列数。
3.根据权利要求1或2所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述镜像序列被插入到质粒中。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述方法还包括设计引物的步骤；
优选地，所述设计引物包括：获取目标微生物基因组序列，筛选目标区域，针对目标区域设计引物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述文库制备包括：对目标微生物的基因组上目标区域及其镜像序列进行PCR扩增，得到文库；
优选地，所述PCR包括多重PCR。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述测序包括靶向测序。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述目标微生物包括鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌或结核分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求7所述的基于NGS平台微生物定量方法，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；
优选地，所述鲍曼不动杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
优选地，所述金黄色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；
优选地，所述金黄色葡萄球菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；
优选地，所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列；
优选地，所述肺炎克雷伯菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；
优选地，所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的序列；
优选地，所述卡他莫拉菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列；
优选地，所述铜绿假单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的序列；
优选地，所述铜绿假单胞菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.15所示的序列；
优选地，所述结核分枝杆菌的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的序列；
优选地，所述结核分枝杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ ID NO.18所示的序列。
9.根据权利要求1-8任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法，其特征在于，所述微生物定量方法包括以下步骤：
(1)获取目标微生物基因组序列，筛选目标区域，针对目标区域设计引物；
设计镜像序列，所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列；
(2)将引物和镜像序列与待测样本混合，进行PCR扩增，得到文库；
(3)对文库进行测序，根据测序结果按式(1)计算目标为生物含量；
Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri 式(1)；
其中，Cp为目标微生物的含量，Rp为目标微生物扩增到序列数，Ci为镜像序列的投入浓度，Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比，Ri为镜像序列扩增到序列数。
10.一种微生物定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒应用于权利要求1-9任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法中；
所述试剂盒包括针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列；
所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列；
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
CN202210609186.5A 2022-05-31 2022-05-31 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒 Pending CN114891868A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210609186.5A CN114891868A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210609186.5A CN114891868A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114891868A true CN114891868A (zh) 2022-08-12

Family

ID=82726108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210609186.5A Pending CN114891868A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114891868A (zh)

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1386865A (zh) * 2001-03-02 2002-12-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用对照物测定核酸的方法
JP2006211982A (ja) * 2005-02-04 2006-08-17 Univ Of Tokyo Ｄｎａコンピュータ技術による核酸の定量検出方法
CN101351559A (zh) * 2005-11-09 2009-01-21 普里梅拉生物系统有限公司 病原体的多元定量检测
CN101405411A (zh) * 2006-01-23 2009-04-08 斯蒂鲁斯全球解决方案有限公司 高通量检测生物样品中微生物的存在
US20150275294A1 (en) * 2012-10-18 2015-10-01 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic Acid Amplification Controls and Kits and Methods of Use Thereof
JP2015204813A (ja) * 2014-04-23 2015-11-19 国立研究開発法人産業技術総合研究所 微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子定量用内部標準遺伝子
CN105331606A (zh) * 2014-08-12 2016-02-17 焦少灼 应用于高通量测序的核酸分子定量方法
CN109072203A (zh) * 2015-08-18 2018-12-21 清华大学 镜像核酸复制体系
CN111304300A (zh) * 2019-12-17 2020-06-19 北京金匙基因科技有限公司 一种检测待测样品中各个微生物物种的基因组dna拷贝数的方法
CN111607639A (zh) * 2020-05-08 2020-09-01 深圳华大因源医药科技有限公司 基于内参进行宏基因组病原定量检测的方法和装置
CN112166200A (zh) * 2018-05-25 2021-01-01 三菱化学株式会社 目标核酸的定量方法
CN112492883A (zh) * 2018-04-20 2021-03-12 拜奥法尔诊断有限责任公司 用于测序数据的归一化和定量的方法
CN113207299A (zh) * 2018-10-04 2021-08-03 阿克生物公司 用于管理下一代测序中的低样本输入的归一化对照
CN113265453A (zh) * 2021-05-21 2021-08-17 上海慕柏生物医学科技有限公司 一种全流程质控的菌群高通量测序检测方法及应用
WO2022045843A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Seegene, Inc. Method for positive control reaction using pre-positive control composition
CN114555835A (zh) * 2019-07-23 2022-05-27 生物梅里埃公司 通过宏基因组分析检测和定量感兴趣的生物物种的方法

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1386865A (zh) * 2001-03-02 2002-12-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用对照物测定核酸的方法
JP2006211982A (ja) * 2005-02-04 2006-08-17 Univ Of Tokyo Ｄｎａコンピュータ技術による核酸の定量検出方法
CN101351559A (zh) * 2005-11-09 2009-01-21 普里梅拉生物系统有限公司 病原体的多元定量检测
CN101405411A (zh) * 2006-01-23 2009-04-08 斯蒂鲁斯全球解决方案有限公司 高通量检测生物样品中微生物的存在
US20150275294A1 (en) * 2012-10-18 2015-10-01 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic Acid Amplification Controls and Kits and Methods of Use Thereof
JP2015204813A (ja) * 2014-04-23 2015-11-19 国立研究開発法人産業技術総合研究所 微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子定量用内部標準遺伝子
CN105331606A (zh) * 2014-08-12 2016-02-17 焦少灼 应用于高通量测序的核酸分子定量方法
CN109072203A (zh) * 2015-08-18 2018-12-21 清华大学 镜像核酸复制体系
CN112492883A (zh) * 2018-04-20 2021-03-12 拜奥法尔诊断有限责任公司 用于测序数据的归一化和定量的方法
CN112166200A (zh) * 2018-05-25 2021-01-01 三菱化学株式会社 目标核酸的定量方法
CN113207299A (zh) * 2018-10-04 2021-08-03 阿克生物公司 用于管理下一代测序中的低样本输入的归一化对照
CN114555835A (zh) * 2019-07-23 2022-05-27 生物梅里埃公司 通过宏基因组分析检测和定量感兴趣的生物物种的方法
CN111304300A (zh) * 2019-12-17 2020-06-19 北京金匙基因科技有限公司 一种检测待测样品中各个微生物物种的基因组dna拷贝数的方法
CN111607639A (zh) * 2020-05-08 2020-09-01 深圳华大因源医药科技有限公司 基于内参进行宏基因组病原定量检测的方法和装置
WO2022045843A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Seegene, Inc. Method for positive control reaction using pre-positive control composition
CN113265453A (zh) * 2021-05-21 2021-08-17 上海慕柏生物医学科技有限公司 一种全流程质控的菌群高通量测序检测方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUSANNE PAHLOW等: "Rapid Isolation and Identification of Pneumonia-Associated Pathogens from Sputum Samples Combining an Innovative Sample Preparation Strategy and Array-Based Detection", 《ACS OMEGA》 *
李巍等: "重组PCR构建bcr-abl mRNA竞争RT-PCR内标物", 《中华医学遗传学杂志》 *
陈燃等: "定量PCR的非同源对照模板的构建", 《遗传》 *
黄思敏等: "核酸适配子SELEX技术筛选研究进展", 《中国公共卫生》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111187813B (zh) 全流程质控的病原微生物高通量测序检测方法
CN111304300B (zh) 一种检测待测样品中各个微生物物种的基因组dna拷贝数的方法
WO2017059084A1 (en) Immunorepertoire normality assessment method and its use
CN114438214B (zh) 结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置
CN112226538A (zh) 用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法
CN105316418B (zh) 用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物、探针、试剂盒及其检测方法
Feng et al. Recent advancements in intestinal microbiota analyses: a review for non-microbiologists
CN110724731A (zh) 一种在多重pcr体系内加入内参定量核酸拷贝数的方法
CN113265452A (zh) 一种基于Nanopore宏基因组RNA-seq的生物信息学检测病原体的方法
CN111304286B (zh) 基于纳米孔测序的泌尿宏基因组样本建库和检测方法
CN116732151A (zh) 一种多重pcr体系的靶向检测半定量方法
CN112029881A (zh) 用于检测副干酪乳杆菌n1115的引物对及应用
CN116179664A (zh) 基于内参确定微生物的高通量检测方法和系统及试剂盒
CN114891868A (zh) 一种基于ngs平台的微生物定量方法及试剂盒
CN110846424A (zh) 出入境口岸微生物的快速检验检疫方法
Yan et al. Biofilm formation risk assessment for psychrotrophic Pseudomonas in raw milk by MALDI-TOF mass spectrometry
CN115011695A (zh) 基于游离环状dna基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用
CN114921530B (zh) 一种基于内参进行血浆微生物游离dna宏基因组定量检测的方法及系统
CN116334189B (zh) 一种监测qPCR反应干扰的内标系统及应用
RU2716115C1 (ru) Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования
CN115976221B (zh) 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用
Ceko et al. Comparison Test of Sensitivity Between Next Generation Sequencing (NGS) Hotspot Panel and Droplet Digital PCR of KRAS G12/G13 Mutation
CN117106981A (zh) 用于靶向富集病原的探针组、方法以及试剂盒
Geisenberger et al. A cost-effective and scalable approach for DNA extraction from FFPE tissues
CN117417988A (zh) 一种检测待测样本中目标dna的方法、试剂盒以及检测装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220812

RJ01 Rejection of invention patent application after publication