RU2716115C1 - Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования - Google Patents
Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2716115C1 RU2716115C1 RU2018133636A RU2018133636A RU2716115C1 RU 2716115 C1 RU2716115 C1 RU 2716115C1 RU 2018133636 A RU2018133636 A RU 2018133636A RU 2018133636 A RU2018133636 A RU 2018133636A RU 2716115 C1 RU2716115 C1 RU 2716115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteria
- sequencing
- pathogenic
- food
- colibria
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования. Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности при идентификации патогенных и условно-патогенных бактерий и оценке их количественных соотношений благодаря высокой чувствительности способа и его высокой точности. 1 з.п. ф-лы.
Description
Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности и лабораториях по контролю качества продукции при количественной оценки бактерий, как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию, а также при контроле продукции надзорными ведомствами и лабораториями.
В настоящее время производители продуктов питания сталкиваются с проблемой обсеменения продукции микроорганизмами. Некоторые из них являются патогенными и условно-патогенными. К поражению этими микроорганизмами склонны пожилые люди, младенцы и люди с ослабленным иммунитетом [The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013, EFSA Journal, 2015, vol. 13, no. 1, pp. 1-165]. Наиболее часто встречающимися пищевыми патогенами, вызывающими заболевания являются Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Campylobacter spp., Yersinia spp., Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, а также энтерогеморрагический штамм O157:H7 Escherichia coli [Newell D.G. Koopmans M, Verhoef L, Duizer E, Aidara-Kane A, Sprong H, Opsteegh M, Langelaar M, Threfall J, Scheutz F, van der Giessen J, Kruse H. Food-borne diseases - The challenges of 20years ago still persist while new ones continue to emerge. International Journal of Food Microbiology, 2010, vol. 139, no. 1, pp. 3-15].
На данный момент идентификацию микроорганизмов, в том числе их количественную оценку, в продуктах питания и входящем сырье пищевых предприятий в большинстве случаев проводят классическими методами с использованием посева на питательные среды, их микроскопическом наблюдении и биохимическом анализе [Мао Z., Zheng Н., Wang X., Lin S., Sun Y., Jiang B. DNA microarray for direct identification of bacterial pathogens in human stool samples, Digestion, 2008, vol. 78, no. 2-3, pp.131-138], что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог. Кроме того, такой анализ для ряда патогенных бактерий длится от 5 до 7 дней. Другой альтернативой является проведение реакции ПЦР с праймерами и зондами, специфичным к конкретным патогенным микроорганизмам [Rodriguez-Lazaro D. Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications, 2013, Caister Academic Press]. Главным недостатком ПЦР является невозможность количественной оценки идентифицируемых бактерий в субстрате. Кроме того, полимеразная цепная реакция позволяет выявить только какой-либо один микроорганизм, либо небольшую группу микроорганизмов.
Анализ всего микробного сообщества пищевых субстратов возможен с помощью методов секвенирования нового поколения. Для этого чаще всего применяют метод, основанный на анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, который предварительно амплифицируется в ДНК, выделенной из сообществ бактерий [Мауо В., Rachid С.Т., 
A., Leite A.M., Peixoto R.S., Delgado S. Impact of Next Generation Sequencing Techniques in Food Microbiology, Curr. Genomics., 2014, vol. 15, no. 4, pp. 293-309]. При количественной оценке микроорганизмов методами с использованием высокопроизводительного секвенирования оценивается параметр «relative species abundances», который рассчитывается исходя из количества полученных «ридов» - количество «ридов» прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате. Главным недостатком такого подхода является возможность оценивать только относительные количественные соотношения микробов (процентное соотношение различных видов бактерий в исследуемом субстрате). Кром того, по данным высокопроизводительного секвенирования известных количественных соотношений микроорганизмов, полученных в Воронежском государственном университете, количество «ридов» не прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате, чаще всего наблюдается картина, при которой подавляющее большинство ридов «оттягивает» ДНК наиболее представительного в смеси вида бактерий. Еще одной проблемой анализа таких данных является полное «доверие» международным биоинформатическим базам данных, которые зачастую содержат ошибочно задепонированные нуклеотидные последовательности. Наличие «контрольных» штаммов значимых для пищевой индустрии микроорганизмов значительно упростит процедуру их идентификации в исследуемых субстратах.
Известен способ профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (патент RU 2605913, опубл. 27.12.2016), взятый за прототип, включающий амплификацию ДНК микробных сообществ с помощью праймеров, специфичных к последовательности 16S рРНК для наиболее значимых таксонов микроорганизмов, а также гибридизацию зондов к амплифицированным нуклеотидным последовательностям. Метод позволяет в том числе оценивать количественные соотношения идентифицируемых бактерий. Недостатком данного способа является то, что спектр анализируемых таксонов бактерий ограничивается набором олигонуклеотидных зондов, что не делает данную систему универсальной для широкого круга таксонов бактерий. Кроме того, для большей достоверности необходимо проведение секвенирования амплифицированных последовательностей, что не предусмотрено в этом способе.
Задачей настоящего изобретения является разработка универсального метода идентификации и количественной оценки бактерий в пищевой продукции с применением высокопроизводительного секвенирования.
Технический результат заключается в разработке универсального высокочувствительного способа идентификации и количественной оценки значимых для пищевой индустрии бактерий в пищевых субстратах и сокращении времени анализа присутствия микроорганизмов в исследуемой среде с 5-7 суток (при стандартном микробиологическом посеве) до 1-2 суток (в зависимости от проведения или не проведения предварительного обогащения бактерий в питательной среде).
Технический результат достигается тем, что в способе идентификация и количественная оценка бактерий в пищевых продуктах осуществляется с помощью проведения ПЦР с универсальными праймерами к 16S рРНК, с последующим высокопроизводительным секвенированием амплифицированных последовательностей и их сопоставлением с международной базой данной и полученными в ходе секвенирования контрольными нуклеотидными последовательностями. В анализе используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии, секвенированные последовательности которых выступают в качестве контрольных последовательностей, что позволяет резко повысить точность используемого метода, как в идентификации таксонов бактерий, так и оценки их количественных соотношений.
Способ идентификации патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах в представленном способе реализуется следующим образом:
1. Производится асептический сбор биологического материала (молоко, мясо, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-25 мл (г) биологического материала.
2. При необходимости проводится предварительное обогащение микроорганизмов в универсальной жидкой питательной среде (например, пептонная вода в соотношении 1:10 в течение 24 часов).
3. Проводится отбор необходимого для выделения ДНК количества биологического материала, либо обогащенной среды полученной в ходе выполнения пункта 2.
4. Производится выделение ДНК из отобранного биологического материала, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.
5. Проводят ПЦР с универсальными к бактериям праймерами: 785F (GGATTAGATACCCTGGTA)/ 1100R (GGGTTGCGCTCGTTG). Могут быть использованы другие универсальные для бактерий праймеры (например, 515F/ 806R, 341F/ 806R, 515F/ 907R и др.). Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 37 циклов (94°С 30 сек, 50-54°С 30 сек, 72°С 30-40 сек).
6. Отличительной особенностью данного способа является то, что параллельно с анализом исследуемых проб проводится ПНР с праймерами из пункта 5, но при этом используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии: Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus.
7. Продукты реакции ПЦР далее используются для приготовления библиотек ДНК для высокопроизводительного секвенирования, включающее очистку ампликона от коротких неспецифических нуклеотидных последовательностей и праймеров, лигирование адаптеров к концам амплифицированных последовательностей и оценку качества приготовленных библиотек. При этом для анализа известных количественных смесей микроорганизмов используются отдельные адаптеры с «баркодами» которые позволяют отфильтровать эти данные при биоинформатическом анализе.
8. Проводится другие этапы необходимые для конкретного способа секвенирования нового поколения и выбранной платформы секвенирования (например, эмульсионная ПЦР при использовании платформы для полупроводникового секвенировакния Ion torrent).
9. Осуществляется секвенирование приготовленных в процессе выполнения п. 1-п. 8. нуклеотидных последовательностей.
10. Проводиться биоинформатический анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей с использованием пользовательской базы данных и программного обеспечения, либо с использованием международных баз данных. При этом учитываются данные секвенирования известных смесей бактерий, верифицированные «риды» которых используются как контрольные нуклеотидные последовательности. Относительное изобилие (relative abundance) бактерий также рассчитывается исходя из полученных данных секвенирования известных микробиологических смесей.
11. При совпадении (идентичность свыше 99,5%) секвенированных нуклеотидных последовательностей с последовательностями, полученными в ходе секвенирования известных смесей бактерий говорят наличие того или иного патогенного либо условно-патогенного микроорганизма. По соотношению полученных «ридов» контрольных смесей бактерий и «ридов» полученных в ходе секвенирования анализируемых образцов пищевой продукции судят о количестве идентифицированных бактерий в субстрате.
Примечание: для высокопроизводительного секвенирования используются платформы и наборы химических реактивов, способные секвенировать последовательности длинной до 400 п.н.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, универсальным и быстрым по отношению к другим методам определения патогенных микроорганизмов в пищевых субстратах. Кроме того, представленный метод позволяет оценить количественное соотношение микроорганизмов в анализируемом субстрате.
Claims (2)
1. Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования, включающий отбор биологического материала и выделение ДНК с проведением ПЦР с универсальными праймерами к 16S рРНК, отличающийся тем, что ДНК выделяется с проведением ПЦР с универсальными праймерами к 16S рРНК: прямой праймер - GGATTAGATACCCTGGTA и обратный праймер - GGGTTGCGCTCGTTG, осуществляется высокопроизводительное секвенирование полученных после ПЦР нуклеотидных последовательностей, а также секвенирование известных количественных смесей Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus, секвенированные последовательности, полученные из отобранного биологического материала, сравнивают с полученными секвенированными последовательностями известных количественных смесей, при идентичности последовательностей свыше 99,5% принимают решение о наличии соответствующих бактерий; при этом известные количественные смеси бактерий и их соотношение формируются, исходя из ожидаемого количества бактерий в образце, и не являются строго фиксированными; о количестве идентифицированных бактерий в субстрате судят по соотношению полученных «ридов» известных количественных смесей бактерий и «ридов» полученных в ходе секвенирования анализируемых образцов пищевой продукции.
2. Способ по п. 1, отличающийся обогащением бактерий перед выделением ДНК из бактерий в универсальной жидкой питательной среде.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018133636A RU2716115C1 (ru) | 2018-09-24 | 2018-09-24 | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018133636A RU2716115C1 (ru) | 2018-09-24 | 2018-09-24 | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2716115C1 true RU2716115C1 (ru) | 2020-03-05 |
Family
ID=69768458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018133636A RU2716115C1 (ru) | 2018-09-24 | 2018-09-24 | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2716115C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2810569C1 (ru) * | 2023-10-17 | 2023-12-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии-МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина) | Синтетические олигонуклеотидные последовательности для определения бактерий рода campylobacter методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
-
2018
- 2018-09-24 RU RU2018133636A patent/RU2716115C1/ru active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| КОРОСТИК Е.В. Универсальные 16S праймеры для описания генетического разнообразия прокариот. Экологическая генетика. 2006 г. * |
| Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР. Методические указания. Москва. Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 2011 г. * |
| РЕБРИКОВ Д.В. Высокопроизводительное секвенирование. Москва. Бином. Лаборатория знаний. 2014 г. * |
| РЕБРИКОВ Д.В. Высокопроизводительное секвенирование. Москва. Бином. Лаборатория знаний. 2014 г. КОРОСТИК Е.В. Универсальные 16S праймеры для описания генетического разнообразия прокариот. Экологическая генетика. 2006 г. Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР. Методические указания. Москва. Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 2011 г. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2812147C1 (ru) * | 2023-04-12 | 2024-01-23 | Ярослава Михайловна Чаленко | Способ дифференциации Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp. методом дот-блоттинга с использованием конъюгированных антител против фактора патогенности InlB |
| RU2810569C1 (ru) * | 2023-10-17 | 2023-12-27 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии-МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина) | Синтетические олигонуклеотидные последовательности для определения бактерий рода campylobacter методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rohde et al. | FISHing for bacteria in food–A promising tool for the reliable detection of pathogenic bacteria? | |
| Gasanov et al. | Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review | |
| Jasson et al. | Alternative microbial methods: An overview and selection criteria | |
| O'Sullivan | Methods for analysis of the intestinal microflora | |
| Boughner et al. | Microbial ecology: where are we now? | |
| Lin et al. | Immuno-and nucleic acid-based current technique for Salmonella detection in food | |
| Jin et al. | A real-time LAMP-based dual-sample microfluidic chip for rapid and simultaneous detection of multiple waterborne pathogenic bacteria from coastal waters | |
| Bonadonna et al. | Innovative analytical methods for monitoring microbiological and virological water quality | |
| Arnandis-Chover et al. | Detection of food-borne pathogens with DNA arrays on disk | |
| EP4041906A1 (en) | Highly multiplexed detection of nucleic acids | |
| Giraffa et al. | Molecular techniques in food fermentation: principles and applications | |
| Vasavada et al. | Conventional and novel rapid methods for detection and enumeration of microorganisms | |
| Osek et al. | Listeria monocytogenes in foods—From culture identification to whole‐genome characteristics | |
| Fricker-Feer et al. | Evaluation of three commercially available real-time PCR based systems for detection of Cronobacter species | |
| Baraketi et al. | Foodborne pathogens detection: persevering worldwide challenge | |
| RU2716115C1 (ru) | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования | |
| Galluzzi et al. | Current molecular techniques for the detection of microbial pathogens | |
| US20160017407A1 (en) | Methods for Microorganism Detection and Identification | |
| Missoum | Methods for Isolation and Identification of Microorganisms | |
| Sudhakaran V et al. | Approaches for detection of dairy microorganisms: An update | |
| RU2712527C2 (ru) | Способ идентификации патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования | |
| Withee et al. | Genomics‐based food‐borne pathogen testing and diagnostics: Possibilities for the US department of agriculture's food safety and inspection service | |
| Rathnayaka et al. | Rapid Detection of Food Pathogens Using Molecular Methods | |
| Khan et al. | Molecular strategies: detection of foodborne bacterial pathogens | |
| Rusul et al. | Molecular Methods for the Detection and Characterization of Food‐Borne Pathogens |