CN115976221B - 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用。本发明设计针对不同的免疫球蛋白链的内掺参考物制备方法，能够对不同的免疫球蛋白链定制不同的内掺参考物，从而对目标克隆序列进行全面的相对定量分析，能够稳定得到读序（reads）数目和数字PCR定量的拷贝数之间的皮尔逊（Pearson）相关系数>0.99，针对每类免疫球蛋白链定制的内掺参考物对不同的目标克隆重排序列均可进行相对定量，具有普适性，无须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，适合下一代高通量测序法，成本低，可操作性强。

Description

一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用。

背景技术

B细胞受体（BCR）及T细胞受体（TCR）是免疫细胞特异性识别抗原和产生特异性抗体的重要分子，其本质是一种膜表面免疫球蛋白。BCR由4条多肽链（2条重链和2条轻链）组成，TCR由两条（TCRαβ和TCRγδ）多肽链组成，BCR和TCR的重链和轻链都有可变区（V区）和恒定区（C区）组成，不同细胞（克隆）的恒定区可以相同，但可变区是不同的。重链的可变区是由胚系BCR或TCR基因的V基因片段、D基因片段及J基因片段通过随机重组而成，轻链的可变区是由V基因片段和J基因片段重组而成。每个成熟的B细胞和T细胞只含有1种确定的V-D-J或V-J组合，即每种BCR或TCR都对应着唯一的重排组合，因此可以通过V-D-J或V-J重排鉴定或追踪特定细胞克隆。

在血液肿瘤疾病中，免疫细胞往往会呈现出单克隆性，即某一种肿瘤细胞大量增殖。因此，可以通过鉴定某种特殊的V-D-J或V-J重排来判断肿瘤细胞的主克隆形式，并通过跟踪这种重排形式来评估肿瘤细胞的残留情况，即微小残留病(minimal residualdisease，MRD)。通常临床利用白血病细胞和正常细胞间抗原表达异常区分白血病细胞和正常细胞，是目前应用最广泛、最快速的方法。但是只有那些和正常细胞（包括正常幼稚细胞）间存在明显不重叠差别的抗原或抗原组合才能用于MRD监测；并且常规的流式细胞法检测的敏感性只有10^-4；同时白细胞表面抗原的免疫漂移现象会干扰MRD的检测。将高通量的NGS技术应用于MRD检测，针对BCR或TCR（BCR/TCR）基因重排，可获得所有的BCR/TCR克隆重排碱基序列，灵敏度可达10^-6，并且样本投入量只需要新一代流式细胞术同等灵敏度下的十分之一，且不需要严格要求是新鲜的样本，一次性可以监测所有克隆重排和免疫重建，更易标准化，具有较大的临床应用前景。目前常规的NGS检测MRD方法是采用多重扩增子测序，即通过一套引物组将所有的V-D-J或V-J的重排形式扩增出来，然后上机进行高通量测序。通过分析肿瘤细胞相应的V-D-J或V-J重排的读序（reads）数目有无来判断是否有肿瘤细胞残留，但是却无法计算MRD水平来评估患者的预后。

综上所述，提供一种适用于NGS法的BCR/TCR重排定量检测方法，可有效地对肿瘤细胞克隆数目进行相对定量，从而准确计算出对应的MRD水平，对于免疫球蛋白链基因重排检测检测及微小残留病检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用，能够对不同的免疫球蛋白链进行定制不同的内掺参考物，从而对目标克隆序列进行全面的相对定量分析。针对每类免疫球蛋白链定制的内掺参考物对不同的目标克隆重排序列均可进行相对定量，具有普适性，无须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，适合下一代高通量测序法，成本低，可操作性强。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物（spike-in）的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）构建或筛选具有目标重排链的细胞系组合；

（2）分别提取所述细胞系组合中各细胞系基因组DNA；

（3）对所述细胞系组合中各细胞系中的目标重排链序列进行定值拷贝数；

（4）对不同的细胞系设置不同的拷贝数水平，依据定值拷贝数结果取对应量的细胞系基因组DNA与稳定剂混合，并用稀释液稀释至相应拷贝数浓度，获得所述内掺参考物。

本发明中，设计了针对不同的免疫球蛋白链的内掺参考物制备方法，以进行对目标克隆序列的定量分析，能够稳定得到读序（reads）数目和数字PCR定量的拷贝数之间的皮尔逊（Pearson）相关系数>0.99，从而规范化校准目标克隆序列的拷贝数，实现对肿瘤细胞克隆的定量。该方法毋须针对每种重排序列逐一单独开发定量方法，对不同的免疫球蛋白链重排及不同的目标克隆序列具有普适性，可操作性强，重复性好；同时，和常规内参基因校准相比，不受PCR引物和PCR扩增效率的影响，稳定性好，能够实现对低水平肿瘤细胞克隆的高灵敏度、高准确度的定量。

优选地，所述目标重排链包括IgH、Igκ、Igλ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述细胞系组合中包含至少三种同一类免疫球蛋白链的重排序列。

优选地，所述细胞系为淋系血液肿瘤标准细胞系。

优选地，用于BCR重排定量的细胞系选自MEC-1、REH、IM-9、SUP-B15、SUP-B8、U266B1、TOM-1或MN-60中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，用于TCR重排定量的细胞系选自Jurkat、MOLT-4、MOLT-13、MOLT-16、SUP-T1、SUP-T3、HUT78或HUT102中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤（2）还包括对所述各细胞系基因组DNA进行稀释的步骤；

优选地，所述稀释的终浓度为5~15 ng/µL，包括但不限于6 ng/µL、7 ng/µL、8 ng/µL、9 ng/µL、10 ng/µL、12 ng/µL、13 ng/µL或14 ng/µL。

优选地，所述不同的细胞系的拷贝数水平各自独立地为10~1000拷贝，包括但不限于11拷贝、12拷贝、13拷贝、14拷贝、15拷贝、16拷贝、17拷贝、18拷贝、19拷贝、30拷贝、50拷贝、100拷贝、300拷贝、400拷贝、500拷贝、800拷贝、900拷贝、950拷贝、960拷贝、970拷贝、980拷贝、990拷贝、995拷贝、998拷贝或999拷贝。

优选地，所述拷贝数水平设置三个梯度，第一梯度拷贝数水平为10~30拷贝，第二梯度拷贝数水平为80~120拷贝，第三梯度拷贝数水平为600~1000拷贝；

优选地，所述拷贝数浓度为目标拷贝数水平除以2 µL。

优选地，所述稳定剂包括鲑鱼精DNA。

优选地，所述稳定剂的终浓度为40~60 ng/µL，包括但不限于41 ng/µL、42 ng/µL、45 ng/µL、50 ng/µL、55 ng/µL、56 ng/µL、57 ng/µL、58 ng/µL或59 ng/µL。

优选地，所述稀释液包括TE缓冲液。

优选地，步骤（4）后还包括对所述内掺参考物中目标重排链序列进行定值拷贝数的步骤。

优选地，所述进行定值拷贝数的方法包括数字PCR。

第二方面，本发明提供一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物，所述内掺参考物由第一方面所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供第二方面所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物在BCR或TCR重排定量检测中的应用。

第四方面，本发明提供一种BCR或TCR重排定量检测试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物。

优选地，所述试剂盒还包括重排扩增特异性引物组、一轮扩增试剂、二轮扩增试剂和通用扩增引物。

优选地，所述一轮扩增试剂包括多重扩增酶及扩增缓冲液。

优选地，所述二轮扩增试剂包括热启动扩增酶及扩增缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂。

优选地，所述核酸纯化试剂包括磁珠和/或清洗液。

第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的定量检测肿瘤细胞克隆的方法，所述方法包括以下步骤：

（1’）采用第二方面所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物，其包含的目标重排链序列种类为n种，对应的拷贝数分别为C₁、C₂、……、C_n-1和C_n，其中n为正整数；

（2’）将所述内掺参考物掺入X ng待测样本DNA中，用BCR或TCR特异性重排扩增引物进行扩增，构建文库，并进行双端测序；

（3’）将得到的双端测序读序先根据重复区进行合并，然后与公共数据库中参考的IgH的V序列及J序列分别进行比对，得到测序数据中支持的、样本中的目标克隆V-D-J或V-J重排序列的读序数目为R；其中所述公共数据库选自IMGT数据库、UCSC数据库或NCBI数据库中任意一种或至少两种的组合；

（4’）将得到的双端测序读序分别比对至内掺参考物包含的不同重排链的V片段序列及J片段序列，得到支持内掺参考物中每种重排的读序数目分别为Y₁、Y₂……、Y_n-1和Y_n；

（5’）计算目标肿瘤细胞克隆的重排序列的拷贝数N，N=R/(Y₁+Y₂+……+Y_n)×(C₁+C₂+……+C_n)；

计算目标肿瘤细胞微小残留病灶MRD水平M，M=N/(X/6.53×1000)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明设计针对不同的免疫球蛋白链的内掺参考物制备方法，来进行对目标克隆序列的定量分析，能够稳定得到读序数目和数字PCR定量的拷贝数之间的皮尔逊相关系数>0.99，从而规范化校准目标克隆序列的拷贝数，实现对肿瘤细胞克隆的定量；

（2）本发明的内掺参考物对不同的免疫球蛋白链重排及不同的目标克隆序列具有普适性，可操作性强，重复性好；同时，和常规内参基因校准相比，不受PCR引物和PCR扩增效率的影响，稳定性好，能够实现对低水平肿瘤细胞克隆的高灵敏度、高准确度的定量。

附图说明

图1为本发明定量内掺参考物制备流程图；

图2为本发明定量内掺参考物中包含的MEC-1重排序列数字PCR拷贝数定量一维散点图；

图3为本发明定量内掺参考物中包含的MEC-1重排序列数字PCR拷贝数定量的二维散点图；

图4为本发明定量内掺参考物中包含的REH重排序列数字PCR拷贝数定量一维散点图；

图5为为本发明定量内掺参考物中包含的REH重排序列数字PCR拷贝数定量二维散点图；

图6为本发明定量内掺参考物中包含的IM-9重排序列数字PCR拷贝数定量一维散点图；

图7为本发明定量内掺参考物中包含的IM-9重排序列数字PCR拷贝数定量二维散点图；

图8为本发明实施例4中对SUPB15重排序列数字PCR拷贝数定量一维散点图；

图9为本发明实施例4中对SUPB15重排序列数字PCR拷贝数定量二维散点图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。

本发明的用于BCR/TCR重排定量检测的内掺参考物及其制备方法可根据需求构建或筛选具有目标重排链的细胞系组合，具体流程图如图1所示。

实施例1

本实施例选择MEC-1，REH及IM-9三种细胞系制备BCR重链IgH重排定量内掺参考物。其中MEC-1细胞系购自南京科佰生物科技有限公司（货号CBP60514P），REH细胞系购自ATCC（货号CRL-8286），IM-9细胞系购自ATCC（货号CCL-159）。

1. 细胞系基因组DNA提取。

按照试剂盒的说明书进行（迈杰转化医学研究（苏州）有限公司，货号N067A01）。对提取的基因组DNA进行Nanodrop™ Lite 分光光度计及Qubit ® 3.0 荧光定量仪质检，测得MEC-1，REH及IM-9三种细胞系基因组DNA的Qubit浓度分别为29.7 ng/µL、37.7 ng/µL、18.2 ng/µL，-20℃保存。

2. 配制100 µL细胞系基因组DNA工作液（10 ng/uL）。

分别取33.67 µL、26.53 µL、54.95 µL步骤1中MEC-1、REH、IM-9三种细胞系基因组DNA溶液，再分别加入66.33 µL、73.47 µL、45.05 µL TE缓冲液，混匀，即为工作液。分别取各工作液进行Qubit定量，每种重复测量5次，取中间3次检测值求均值，测得MEC-1、REH、IM-9三种工作液浓度分别为10.02 ng/µL、9.98 ng/µL及10.05 ng/µL。

3. 对步骤2中三种细胞系基因组DNA工作液分别进行数字PCR确定拷贝数。

分别依据细胞系重排序列设计引物探针，利用数字PCR对工作液进行拷贝数定值，其中数字PCR试剂购自新羿制造科技（北京）有限公司，数字PCR仪为新弈制造科技（北京）有限公司的数字PCR系统生物芯片分析仪Chip Reader R1，操作依据仪器说明书进行，反应条件为95℃，10 min，(94℃ 30s，60℃ 60s) 40个循环，12℃，保持。最终测定MEC-1工作液对应的克隆重排序列为1409.5拷贝/µL，REH工作液对应的克隆重排序列为1369.8拷贝/µL，IM-9工作液对应的克隆重排序列为497.1拷贝/µL。

4. 定量内掺参考物制备。

最终设置定量内掺参考物每次用量为2 µL，其中每2 µL定量内掺参考物包含MEC-1目标拷贝数800，REH目标拷贝数100，IM-9目标拷贝数20，即定量内掺参考物的三种克隆重排序列拷贝数浓度为400拷贝/µL、50拷贝/µL及10拷贝/µL。本次共配制200反应数的定量内掺参考物，分别取MEC-1工作液113.52 µL、REH工作液14.60 µL及IM-9工作液8.05 µL进行混合，加入100 µL鲑鱼精DNA（终浓度为200 ng/µL），再加入TE缓冲液163.83 µL补400 µL体积，在涡旋混合仪上点触混匀，短暂离心，置于-20℃备用。

5. 定量内掺参考物重排序列拷贝数定值。

再次使用探针法数字PCR对混好后的内掺参考物进行拷贝数测定，测得最终制备的定量内掺参考物中每2 µL包含的MEC-1重排序列拷贝数为798.3，REH重排序列拷贝数为102，IM-9重排序列拷贝数为18.6，对应的结果图分别见图2~图7。所有的数字PCR体系中，均选择FAM荧光标记相应的重排序列探针。以图2和图3为例说明，图2为一维散点图，展示了重排探针携带的FAM荧光增幅的分布情况，其中基线荧光增幅在560-880之间，阳性液滴（即带有MEC-1重排的液滴）荧光增幅在2800左右，表明该数字PCR反应有效；图3为二维散点图，图中上方FAM荧光增幅较高的数据点群体表示携带MEC-1重排的阳性事件，下方FAM荧光增幅在基线水平的数据点群体表示不具有MEC-1重排的事件，数字PCR仪自动依据泊松分布假设计算出对应样本中所包含的MEC-1重排拷贝数为798.3拷贝。

实施例2

本实施例利用7例血液肿瘤临床样本及1例人工掺比细胞系样本，将实施例1中制备的内掺参考物同步加入重排扩增体系中，进行IgH重排特异性多重引物组扩增，每例样本分别取500 ng基因组DNA投入量。其中人工掺比细胞系样本制备过程为取5 ng细胞系SUPB15基因组DNA（浓度稀释至2 ng/µL，取2.5 µL），加入495 ng健康供者基因组DNA（浓度206.3 ng/µL，取2.40 µL）中混合而成，并同时对该混合样本中SUPB15重排序列进行数字PCR定量，用于验证定量内掺参考物的定量效果。

1. 按照下表1冰上融化并配制多重扩增反应液，其中样本DNA及无核酸酶水分别对应的体积见表2，涡旋振荡混匀，瞬时离心；

表1

表2

2. 振荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，按照表3运行PCR程序；

表3

3. PCR产物纯化

3.1提前将AMPure XP 磁珠从4℃冰箱拿出，放至25℃平衡30 min；

3.2振荡AMPure XP 磁珠至其充分重悬，取60 μL AMPure XP 磁珠加入上述PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，25℃孵育5 min；

3.3将离心管放至磁力架上静置3 min，待溶液澄清后移弃上清液，保留磁珠；

3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200 μL新配制的80%的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

3.5重复上述步骤一次；

3.6将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置5 min至磁珠干燥完全；

3.7向每个样本中加入25 μL无核酸酶水，涡旋混匀，短暂离心，25℃孵育5 min；

3.8将离心管放在磁力架上3 min，待溶液澄清；

3.9小心吸取22 μL上清至一新的1.5 mL 离心管中，丢弃磁珠。

实施例3

本实施例将实施例2中扩增产物进行高通量测序文库构建。

1. 对实施例2中的纯化PCR产物进行第二轮PCR引入测序接头序列和文库标签Index，按表4配制反应体系；

表4

2. 将步骤1中反应体系振荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，运行表5程序；

表5

3. 文库纯化

3.1提前将AMPure XP 磁珠从4℃冰箱拿出，放至25℃平衡30 min；

3.2振荡AMPure XP 磁珠至其充分重悬，取60 μL的AMPure XP 磁珠加入上述PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，25℃孵育5 min；

3.3将离心管放至磁力架上静置3 min，待溶液澄清后移弃上清，保留磁珠；

3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200 μL新配制的80%的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；

3.5重复上述步骤一次；

3.6将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置5 min至磁珠干燥完全；

3.7向每个样本中加入30 μL无核酸酶水，涡旋混匀，短暂离心，25℃孵育2 min；

3.8将离心管放在磁力架上3 min，待溶液澄清；

3.9小心吸取28 μL上清至一新的1.5 mL 离心管中，丢弃磁珠。

实施例4

本实施例对实施例3中文库进行上机测序，对测序数据进行分析，并对8例样本中目标克隆序列进行相对定量。

1. 将实施例3中文库上机进行2×150 bp双端测序，每例样本测序量为2 Gb；

2. 将得到的双端测序读序先根据重复区（overlap）进行合并，然后与数据库中参考的IgH的V序列及J序列分别进行比对，得到定量内掺参考物支持的读序数目，利用EXCEL软件中皮尔逊公式分别分析每例样本中内掺参考物对应的细胞系重排序列支持的读序数目与数字PCR实测的拷贝数之间的皮尔逊相关系数，结果如表6所示；

表6

由表6数据分析可知，本发明制备的定量内掺参考物包含的重排序列对应的支持读序数与数字PCR定标的拷贝数之间皮尔逊相关系数均大于0.99，具有很高的相关性，表明本发明制备的内掺参考物原始投入的拷贝数与最终测序所得的对应读序有很好的相关性，即该内掺参考物可以作为目标重排序列拷贝数归一化的参考物质。

3. 按步骤2中同样的生物信息分析方法得到测序数据中支持每例临床样本中主克隆V-D-J重排序列的读序数目，结果如表7所示；

表7

4. 对每例临床样本中的目标克隆重排序列进行相对定量，并计算MRD水平，以IGHVDJ-样品1为例，以内掺参考物为基准归一化计算目标肿瘤细胞克隆的重排序列的拷贝数为437547/(721959+174935+19652)×(798.3+102+18.6)=439，计算目标肿瘤细胞微小残留病灶MRD水平为439/(500/6.53×1000)= 5.73E-03。其它样本以此类推，8例样本的重排MRD水平计算结果如表8所示；

表8

以表8中IGHVDJ-SUPB15样本为例，由实施例2中描述可知SUPB15重排序列的理论投入拷贝数为765拷贝，其中理论投入拷贝数的计算方法为：以每个细胞的单倍体DNA含量为6.53 pg估计，5 ng投入了5/6.53×1000=765拷贝。同时对IGHVDJ-SUPB15样本利用数字PCR对SUPB15重排序列进行拷贝数定量散点图如图8及图9所示，其中图8一维散点图中显示基线荧光增幅在610-910之间，阳性液滴（即带有SUPB15重排的液滴）荧光增幅在2800左右，表明该数字PCR反应有效；图9二维散点图中，图中上方FAM荧光增幅较高的数据点群体表示携带SUPB15重排的阳性事件，下方FAM荧光增幅在基线水平的数据点群体表示不具有SUPB15重排的事件，数字PCR仪自动依据泊松分布假设计算出对应样本中所包含的SUPB15重排拷贝数为762拷贝。此外，由上述计算公式利用内掺参考物归一化计算得到的SUPB15重排拷贝数为939191/(929597+213001+4530)×(798.3+102+18.6)=752拷贝。三种方法计算出的拷贝数对应的MRD水平分别为1）按理论拷贝数计算MRD水平765/(500/6.53×1000)=9.99E-03；2）按数字PCR实际定量拷贝数计算MRD水平762/(500/6.53×1000)=9.95E-03；3）按本发明内掺参考物归一化拷贝数计算MRD水平752/(500/6.53×1000)=9.83E-03；三种方法计算出的拷贝数及对应的MRD水平非常接近，CV值为0.87%，表明本发明内掺参考物可作为目标重排序列拷贝数归一化的参考物质，实现对目标重排序列的准确定量。

综上所述，本发明设计的适用于下一代高通量测序法的BCR或TCR重排定量内掺参考物，能够对目标克隆序列进行准确定量，并且对于不同类的免疫球蛋白链具有应用普适性，适合各类基于高通量测序技术的BCR或TCR重排分析方法，成本低，可操作性强，适用范围广，具有较好的应用性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）构建或筛选具有目标重排链的细胞系组合，所述细胞系组合中包含至少三种同一类免疫球蛋白链的重排序列，所述细胞系为淋系血液肿瘤标准细胞系；

（2）分别提取所述细胞系组合中各细胞系基因组DNA；

（3）对所述细胞系组合中各细胞系中的目标重排链序列进行定值拷贝数；

（4）对不同的细胞系设置不同的拷贝数水平，依据定值拷贝数结果取对应量的细胞系基因组DNA与稳定剂混合，并用稀释液稀释至相应拷贝数浓度，获得所述内掺参考物。

2.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述目标重排链包括IgH、Igκ、Igλ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ中任意一种或至少两种的组合；

用于BCR重排定量的细胞系选自MEC-1、REH、IM-9、SUP-B15、SUP-B8、U266B1、TOM-1或MN-60中的任意一种或至少两种的组合；

用于TCR重排定量的细胞系选自Jurkat、MOLT-4、MOLT-13、MOLT-16、SUP-T1、SUP-T3、HUT78或HUT102中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，步骤（2）还包括对所述各细胞系基因组DNA进行稀释的步骤；

所述稀释的终浓度为5~15 ng/µL。

4.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述不同的细胞系的拷贝数水平各自独立地为10~1000拷贝；

所述拷贝数水平设置三个梯度，第一梯度拷贝数水平为10~30拷贝，第二梯度拷贝数水平为80~120拷贝，第三梯度拷贝数水平为600~1000拷贝；

所述拷贝数浓度为目标拷贝数水平除以2 µL。

5.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括鲑鱼精DNA；

所述稳定剂的终浓度为40~60 ng/µL；

所述稀释液包括TE缓冲液；

步骤（4）后还包括对所述内掺参考物中目标重排链序列进行定值拷贝数的步骤。

6.根据权利要求1所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法，其特征在于，所述进行定值拷贝数的方法包括数字PCR。

7.一种用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物，其特征在于，所述内掺参考物由权利要求1-6任一项所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物的制备方法制备得到。

8.权利要求7所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物在BCR或TCR重排定量检测中的应用。

9.一种BCR或TCR重排定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物；

所述试剂盒还包括重排扩增特异性引物组、一轮扩增试剂、二轮扩增试剂和通用扩增引物；

所述一轮扩增试剂包括多重扩增酶及扩增缓冲液；

所述二轮扩增试剂包括热启动扩增酶及扩增缓冲液；

所述试剂盒还包括核酸纯化试剂；

所述核酸纯化试剂包括磁珠和/或清洗液。

10.一种以非疾病诊断为目的的定量检测肿瘤细胞克隆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1’）采用权利要求7所述的用于BCR或TCR重排定量检测的内掺参考物，其包含的目标重排链序列种类为n种，对应的拷贝数分别为C₁、C₂、……、C_n-1和C_n，其中n为正整数；

（2’）将所述内掺参考物掺入X ng待测样本DNA中，用BCR或TCR特异性重排扩增引物进行扩增，构建文库，并进行双端测序；

（3’）将得到的双端测序读序先根据重复区进行合并，然后与公共数据库中参考的IgH的V序列及J序列分别进行比对，得到测序数据中支持的、样本中的目标克隆V-D-J或V-J重排序列的读序数目为R；其中所述公共数据库选自IMGT数据库、UCSC数据库或NCBI数据库中任意一种或至少两种的组合；

（4’）将得到的双端测序读序分别比对至内掺参考物包含的不同重排链的V片段序列及J片段序列，得到支持内掺参考物中每种重排的读序数目分别为Y₁、Y₂……、Y_n-1和Y_n；

（5’）计算目标肿瘤细胞克隆的重排序列的拷贝数N，N=R/(Y₁+Y₂+……+Y_n)×(C₁+C₂+……+C_n)；

计算目标肿瘤细胞微小残留病灶MRD水平M，M=N/(X/6.53×1000)。

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