CN115807056A - 一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 - Google Patents
一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115807056A CN115807056A CN202211511742.1A CN202211511742A CN115807056A CN 115807056 A CN115807056 A CN 115807056A CN 202211511742 A CN202211511742 A CN 202211511742A CN 115807056 A CN115807056 A CN 115807056A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- template
- sequence
- amplification
- pool
- tcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 115
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 50
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 31
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 6
- 101001079285 Homo sapiens Immunoglobulin heavy joining 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100028078 Immunoglobulin heavy joining 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 101001037141 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-21 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001037144 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-9 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100040217 Immunoglobulin heavy variable 3-21 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100040234 Immunoglobulin heavy variable 3-9 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 claims description 4
- 101000998952 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001037145 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 2-5 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001037151 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 2-70 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001037140 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-23 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000839684 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-31 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000839781 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-59 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000989062 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 5-51 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000989060 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 6-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036886 Immunoglobulin heavy variable 1-3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040235 Immunoglobulin heavy variable 2-5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040233 Immunoglobulin heavy variable 2-70 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040220 Immunoglobulin heavy variable 3-23 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028310 Immunoglobulin heavy variable 4-31 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028405 Immunoglobulin heavy variable 4-59 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029414 Immunoglobulin heavy variable 5-51 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100029416 Immunoglobulin heavy variable 6-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 29
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 28
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000989065 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 7-4-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029420 Immunoglobulin heavy variable 7-4-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Abstract
本发明公开了一种BCR或TCR重排序列模板池及其应用。本发明设计分析多重引物组的扩增偏好性的方法，能够大规模地验证多重扩增体系对每种重排序列的检出能力及检测均一性，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，从而锁定需要进行优化的引物对，有利于精准快速地构建均一性较高的多重扩增重排检测体系，成本低，可操作性强；同时，设计特定组成的重排序列模板池，能够有效应用于分析多重引物组的扩增偏好性，适用范围广，并依托高通量DNA合成技术构建模板池，可以同时合成大量的DNA分子，成本低，并且所有的DNA分子能够以寡核苷酸序列池的形式存在，无需人工逐个混合，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种BCR或TCR重排序列模板池及其应用。
背景技术
免疫组库(immune repertoire,IR)是指在某一时间点某个体的循环系统内所有功能多样性T细胞和B细胞的总和。免疫组库多样性反映B细胞及T细胞的多态性和克隆化程度，从而反映免疫细胞的功能和免疫应答状态。这种多样性主要来源于免疫细胞识别相应靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子的多样性，也就是B细胞受体(BCR)及T细胞受体(TCR)的多样性。
编码BCR/TCR的基因在胚系阶段以分隔的，数量众多的基因片段的形式存在。在B/T细胞的分化发育过程中，这些基因片段会发生重排和组合，无功能的胚系基因片段连接成一个完整的、有转录活性的Ig/TCR功能基因，从而产生数量巨大、能识别特异性抗原的BCR/TCR。
以BCR为例，完整的BCR是由两条相同BCR重链和两条相同BCR轻链形成的异源四聚体，由可变域(Variable domain)和恒定域(Constant domain)组成。其中重链BCR为IGH基因编码，其可变域由IGH基因V(Variable)片段、D(Diversity)片段及J(Joining)片段三部分基因片段组成，轻链BCR由IgK或IgL基因编码，其可变域缺少D片段，由V片段及J片段组成。每条链的可变域均含有3个高变区，又称互补决定区(complementary determinateregion,CDR)，分别为CDR1，CDR2和CDR3，其中CDR3由V-D-J或V-J之间连接区编码，因此CDR3变化程度最大，正常机体中，淋巴细胞在未受任何刺激的情况下，其基因重排是随机的，每种B/T细胞具有独特的V-(D)-J重排序列，因而能够表达不同的CDR3序列，细胞呈现为多家族和多克隆性，极大地丰富了免疫细胞的多样性。通常情况下，BCR多样性可达1011～1012种，TCR则更加多样，可达1015～1018种，以保证机体能够识别任何抗原。
在血液肿瘤疾病中，免疫细胞往往会呈现出单克隆性，即某一种肿瘤细胞大量增殖。因此，可以通过鉴定某种特殊的V-D-J重排来判断肿瘤细胞的主克隆形式，并通过跟踪这种重排形式来评估肿瘤细胞的残留情况，即微小残留病(minimal residual disease，MRD)。研究表明，MRD与血液肿瘤的复发密切相关，并且MRD检测灵敏度与预测复发的准确性相关。通常认为，通过NGS检测BCR/TCR重排的方式监测微小残留病的灵敏度可达10-6水平。
极高的灵敏度要求决定了对重排检测体系的要求也非常高，首先是对肿瘤细胞主克隆形式的判断。目前常规的方法是采用多重扩增子测序，首先将所有的V-(D)-J的重排形式扩增出来，然后上机进行高通量测序，通过分析相应的V-(D)-J重排的读序(reads)数目，鉴定主要的肿瘤细胞克隆。其中对主克隆序列的鉴定决定了后续监测的有效性，此时应避免多重引物的非特异扩增或偏好性扩增干扰最终的reads数目，从而影响主克隆序列判断的准确性。另一方面，在后续MRD的监测中，需要对低至百万分之一的肿瘤细胞进行精准检测。这就要求重排检测体系需要对每一种重排都能达到10-6灵敏度。但由于V-(D)-J重排的多样性，很难对每一种重排序列都进行相应的灵敏度验证，这就存在一种风险，即对于某种主克隆序列，后续的MRD监测阴性可能是由于重排检测体系对这种序列扩增较差而出现的假阴性结果。因此，重排检测体系的引物扩增均一性对于MRD检测至关重要。同样地，由于V-(D)-J重排具有非常多种可能性，需要有一种方法能够对多种多样的重排序列的检测能力进行相应的验证，即需要一种模板池来分析多重扩增的偏好性情况并进行相应的优化，以使最终的扩增体系达到较好的均一性。
综上所述，提供一种模板池及基因重排检测的多重引物组的扩增偏好性分析及校正方法，可高效地对多重引物组进行扩增偏好性分析及校正，对于基因重排检测检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足和实际需求，本发明提供一种BCR或TCR重排序列模板池及其应用。本发明可以任意定制模板池序列，以囊括多种多样的V-(D)-J重排形式，并设计分析多重引物组的扩增偏好性的方法，从而大规模地验证多重扩增体系对每种重排序列的检出能力及检测均一性，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，从而锁定需要进行优化的引物对，有利于精准快速地构建均一性较高的多重扩增重排检测体系，成本低，可操作性强。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种分析多重引物组的扩增偏好性的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测多重引物组与模板池、管家基因及管家基因引物混合进行PCR扩增，得到测序文库1；用与模板池中模板的5’端及3’端分别互补的通用引物与模板池及管家基因混合进行PCR扩增，得到测序文库2；
(2)对测序文库1进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到测序文库1中每种模板的相对丰度；
对测序文库2进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到测序文库2中每种模板的相对丰度；
(3)计算测序文库1中模板的相对丰度与测序文库2中同一模板的相对丰度的比值，即为该模板的引物的扩增偏好系数，将扩增偏好系数<0.5或>2的引物判定为具有扩增偏好性的引物；
所述模板池中模板的结构从5’端到3’端依次包括5’端通用引物结合序列、BCR或TCR的V片段序列、酶切位点、BCR或TCR的D片段序列、条码序列、酶切位点、BCR或TCR的J片段序列和3’端通用引物结合序列。
本发明中，设计分析多重引物组的扩增偏好性的方法，基于BCR/TCR重排序列模板池，利用管家基因DNA片段作为内参，通过比较特异性多重扩增产物与通用引物扩增产物的序列相对丰度，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，实现快速高效分析分析多重引物组的扩增偏好性，成本低，可操作性强。
优选地，所述模板池中模板的长度为150bp～300bp，且每条模板长度相同；
优选地，所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列为适配测序仪的接头部分序列。
优选地，所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列的长度各自独立地为30～40bp，包括但不限于31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、38bp或39bp。
优选地，所述V片段序列包括公共数据库中V片段至少100bp参考序列，并一直延伸到3’末端，且含有特异性引物的结合位点。
优选地，所述酶切位点为限制性内切酶识别序列，且不在模板序列的其他位置中出现。
优选地，所述限制性内切酶选自BamHI、EcoRI、HindIII或SalI。
优选地，所述条码序列为识别每条模板的标签序列，其长度为6～15bp，包括但不限于7bp、8bp、9bp、10bp、11bp、12bp、13bp或14bp。
优选地，所述D片段序列为空序列或公共数据库中D片段的全部参考序列。
优选地，所述J片段序列包括公共数据库中J片段的全部参考序列。
优选地，模板池中V片段序列、D片段序列及J片段序列的种类包括公共数据库中的所有功能性片段。
优选地，所述公共数据库选自IMGT数据库、UCSC数据库或NCBI数据库中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述管家基因包括GAPDH或ACTB。
优选地，所述管家基因的长度与所述模板池中模板的长度相同。
优选地，所述管家基因两端还含有所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列。
优选地，所述管家基因的的拷贝数经数字PCR定量。
优选地，所述测序包括二代高通量双端测序。
优选地，所述读序数目的获取方法包括：将得到的测序数据与数据库中参考的IGH/K/L的V序列及J序列或TCRA/B/D/G的V序列及J序列分别进行比对，得到支持每种模板池中V-J重排的读序数目(reads)；进一步地，测序reads先根据重复区(overlap)进行合并，然后再进行序列比对分析；进一步地，测序数据同时与管家基因片段进行比对，得到管家基因的读序数目(reads)。
第二方面，本发明提供一种BCR或TCR重排序列模板池，所述模板池用于第一方面所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法；
优选地，所述模板池中模板的结构从5’端到3’端依次包括5’端通用引物结合序列、BCR或TCR的V片段序列、酶切位点、BCR或TCR的D片段序列、条码序列、酶切位点、BCR或TCR的J片段序列和3’端通用引物结合序列，结构示意图如图1所示。
优选地，所述5’端通用引物结合序列的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地，所述V片段序列选自IGHV1-3、IGHV1-46、IGHV2-5、IGHV2-70、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-9、IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV5-51、IGHV6-1和IGHV7-4-1中任意一种。
优选地，所述J片段序列选自IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5和IGHJ6中任意一种。
优选地，所述酶切位点为GGATCC。
优选地，所述3’端通用引物结合序列的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述条码序列的长度为10bp。
优选地，所述V片段序列和J片段序列两两组合，共构成72种模板序列，包括SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.74所示的序列。
SEQ ID NO.1：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。
SEQ ID NO.2：5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3’。
本发明中，设计特定组成的BCR或TCR重排序列模板池，能够有效应用于分析多重引物组的扩增偏好性，适用范围广。
优选地，所述BCR或TCR重排序列模板池通过高通量DNA合成技术制备得到。
本发明中依托高通量DNA合成技术构建模板池，由于其具有高通量的特性，可以同时合成大量的DNA分子，同时高通量合成的成本较低，并且所有的DNA分子能够以寡核苷酸序列池(oligo pool)的形式存在，无需人工逐个混合，操作简便。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的BCR或TCR重排序列模板池的相对定量方法，所述相对定量方法包括以下步骤：
(1’)用与待测模板池中模板的5’端及3’端分别互补的通用引物与待测模板池混合进行PCR扩增，得到双链模板池；
(2’)在所述双链模板池中加入管家基因，使用所述通用引物进行PCR扩增，得到测序文库；
(3’)对所述测序文库进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到每种模板的相对丰度。
优选地，所述待测模板池的投入量大于10ng。
优选地，所述管家基因包括GAPDH或ACTB。
优选地，所述双链模板池的投入总量为0.01ng～1ng，包括但不限于0.02ng、0.03ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng或0.9ng。
优选地，所述管家基因的投入量为5000～10000拷贝，包括但不限于5500拷贝、6000拷贝、7000拷贝、8000拷贝、9000拷贝、9500拷贝、9600拷贝、9800拷贝或9900拷贝。
优选地，步骤(1’)所述PCR扩增的循环数为12～14循环。
优选地，所述管家基因两端还含有所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列。
优选地，所述读序数目的获取方法包括：将得到的测序数据与数据库中参考的IGH/K/L的V序列及J序列或TCRA/B/D/G的V序列及J序列分别进行比对，得到支持每种模板池中V-J重排的读序数目(reads)；进一步地，测序reads先根据重复区(overlap)进行合并，然后再进行序列比对分析；进一步地，测序数据同时与管家基因片段进行比对，得到管家基因的读序数目(reads)。
第四方面，本发明提供一种校正多重引物组的扩增偏好性的方法，所述方法包括：
采用第一方面所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法分析多重引物组的扩增偏好性，调整具有扩增偏好性的引物进行浓度或更换引物序列，使所有的引物的扩增系数为0.5～2。
本发明中，通过比较特异性多重扩增产物与通用引物扩增产物的序列相对丰度，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，从而锁定需要进行优化的引物对，有利于精准快速地构建均一性较高的多重扩增重排检测体系。
第五方面，本发明提供第一方面所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法、第二方面所述的BCR或TCR重排序列模板池、第三方面所述的相对定量方法或第四方面所述的校正多重引物组的扩增偏好性的方法在以非疾病诊断为目的的Ig/TCR基因重排检测中的应用。
第六方面，本发明提供一种多重扩增Ig/TCR基因重排的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的BCR或TCR重排序列模板池。
第七方面，本发明提供第六方面所述的多重扩增Ig/TCR基因重排的试剂盒，所述试剂盒还包括重排扩增特异性引物组、一轮扩增试剂、二轮扩增试剂及通用扩增引物。
优选地，所述一轮扩增试剂包括多重扩增酶及扩增缓冲液。
优选地，所述二轮扩增试剂包括热启动扩增酶及扩增缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂。
优选地，所述核酸纯化试剂包括磁珠和/或清洗液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计分析多重引物组的扩增偏好性的方法能够大规模地验证多重扩增体系对每种重排序列的检出能力及检测均一性，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，从而锁定需要进行优化的引物对，有利于精准快速地构建均一性较高的多重扩增重排检测体系，成本低，可操作性强；
(2)本发明设计特定组成的BCR/TCR重排序列模板池，能够有效应用于分析多重引物组的扩增偏好性，适用范围广，并依托高通量DNA合成技术构建模板池，由于其具有高通量的特性，可以同时合成大量的DNA分子，同时高通量合成的成本较低，并且所有的DNA分子能够以寡核苷酸序列池(oligo pool)的形式存在，无需人工逐个混合，操作简便。
附图说明
图1为本发明模板池序列结构示意图；
图2为模板池序列扩增偏好性系数分布图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例按照图1所示结构设计了72条IGH模板序列，其中5’通用引物结合序列为：5‘-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；3’通用引物结合序列为：5‘-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3’；酶切位点为GGATCC；Barcode为10bp标签序列，V序列包括IGHV1-3、IGHV1-46、IGHV2-5、IGHV2-70、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-9、IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV5-51、IGHV6-1及IGHV7-4-1共12种，J序列包括IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6共6种，其中V-J序列两两组合，共构成72种重排模板池序列，分别如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.74所示。
实施例2
本实施例将实施例1中设计的模板池序列交由专业的DNA合成公司进行单链合成，将合成的单链DNA分子池(干粉形式)进行模板池构建，步骤如下：
1单链DNA模板序列分子池干粉溶解
1.1将合成的干粉快速离心，加入20μL TE buffer(10mM Tris-Cl pH 8.0,1mMEDTA)，涡旋振荡混匀，反复3次，静置1分钟；
1.2利用Qubit单链DNA(ssDNA)定量试剂对1.1中的DNA单链分子池浓度进行定量，原液可保存于-20℃；
1.3取45μL nuclease-free water(invitrogene公司，货号10977-015)加入低吸附离心管中，加入1.2步骤所得原液5μL，涡旋振荡混匀，反复3次，静置1分钟，得到工作液，标记为ss-oligos；
1.4利用Qubit单链DNA(ssDNA)定量试剂对1.3中的DNA单链分子池工作液进行定量，记录浓度为5.2ng/μL，工作液可保存于-20℃；
2二链合成
2.1按照下表冰上融化KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPA公司，货号KK2602)试剂及正、反向通用引物，并按表1配制PCR反应液，涡旋振荡混匀，瞬时离心；
其中正向通用引物序列为：aatgatacggcgaccaccgagatctacacatatgcgctcgtcggcagcgtc；反向通用引物序列为：caagcagaagacggcatacgagatctgatcgtgtctcgtgggctcgg；
表1
| 组份 | 终浓度 | 50μL反应体系 |
| KAPA HiFi PCR Master Mix,2× | 1× | 25μL |
| 正向通用引物 | 250nM | 1.25μL |
| 反向通用引物 | 250nM | 1.25μL |
| 合成模板池 | 5.2ng/μL | 1.92μL |
| nuclease-freewater | / | 20.58μL |
| 总体积 | 50μL |
2.2将上述反应液放至PCR仪中，按照表2所示PCR程序进行二链合成得到双链DNA模板池；
表2
3双链DNA模板池纯化
3.1提前将AMPure XP beads(BECKMAN COULTER，货号A63882)从4℃冰箱拿出，放至25℃平衡30min；
3.2振荡AMPure XP beads至其充分重悬，取90μLAMPure XP beads加入上述PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，25℃孵育5min；
3.3将离心管放至磁力架上静置3min，待溶液澄清后移弃上清液，保留磁珠；
3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；
3.5重复上述步骤一次；
3.6将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置5min至磁珠干燥完全；
3.7向每个样本中加入32μL nuclease-free water，涡旋混匀，短暂离心，25℃孵育5min；
3.8将离心管放在磁力架上2min，待溶液澄清；
3.9小心吸取30μL上清至一新的1.5mL EP管中，丢弃磁珠；所得上清即为双链DNA模板池；
3.10利用Qubit双链DNA(dsDNA)定量试剂对3.9中的双链DNA模板池进行定量，记录浓度为1.8ng/μL，工作液可保存于-20℃；
3.11取3.10步骤中DNA双链模板池产物5μL，加入255μL无核酸水稀释至0.1ng/μL，混匀3次并离心静置，标记为dsOligos。
实施例3
本实施例利用实施例1及实施例2中所述模板池进行IGH重排特异性引物组扩增偏好性分析.
1.1模板池通用引物扩增文库数据分析
1.1.1实施例2中所述双链DNA模板池已经为可直接上机的测序文库，在该文库中加入合成好的、带有双端接头序列的0.001ng管家基因片段，上机进行2×150bp双端测序；其中管家基因片段序列为：tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggagctggggaatgggactgaggctcccacctttctcatccaagactggctcctccctgccggggctgcgtgcaaccctggggttgggggttctggggactggctttcccataatttcctttcaaggtggggagggaggtagaggggtgatgtggggagtacgctgcagggcctcactcct tttgcagaccacagtccatgccatcactgtctcttatacacatctccgagcccacgagac；
1.1.2将得到的双端测序读序(reads)先根据重复区(overlap)进行合并，然后与数据库中参考的IGH的V序列及J序列分别进行比对，得到模板池中支持每种V-J重排的reads数目；
1.1.3将上述测序数据同时与管家基因片段进行比对，得到管家基因的reads数目；
1.1.4每种模板池序列的相对丰度＝模板池序列支持reads数/管家基因reads数，实施例2中所述模板池序列的相对丰度分析结果如下表3所示；
表3
1.2模板池特异性多重引物组扩增
1.2.1按照表4冰上融化并配制多重扩增反应液，涡旋振荡混匀，瞬时离心；
表4
| 试剂 | 体积(μL) |
| 多重扩增缓冲液 | 25 |
| Taq聚合酶 | 0.25 |
| IGH特异性多重引物组(100μM) | 2.66 |
| GAPDH引物(10μM) | 3 |
| dsOligos | 1 |
| GAPDH片段 | 1 |
| Nuclease-free water | 17.09 |
| 总体积 | 50 |
1.2.2振荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，按照表5运行PCR程序；
表5
1.3PCR产物纯化
1.3.1提前将AMPure XP beads从4℃冰箱拿出，放至25℃平衡30min；
1.3.2振荡AMPure XP beads至其充分重悬，取60μL(1.2x)AMPure XP beads加入上述PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀，25℃孵育5min；
1.3.3将离心管放至磁力架上静置3min，待溶液澄清后移弃上清液，保留磁珠；
1.3.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；
1.3.5重复上述步骤一次；
1.3.6将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置5min至磁珠干燥完全；
1.3.7向每个样本中加入25μL nuclease-free water，涡旋混匀，短暂离心，25℃孵育5min；
1.3.8将离心管放在磁力架上3min，待溶液澄清；
1.3.9小心吸取22μL上清至一新的1.5mL EP管中，丢弃磁珠。
1.4模板池特异性多重引物扩增产物文库构建
1.4.1对上步中的纯化PCR产物进行第二轮PCR引入测序接头序列和文库标签Index，按表6配置反应体系采用Agilent 2100生物分析仪或4200对纯化后的DNA进行检测；
表6
1.4.2振荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪，运行表7程序；
表7
1.5文库纯化
1.5.1提前将AMPure XPbeads从4℃冰箱拿出，放至25℃平衡30min；
1.5.2振荡AMPure XPbeads至其充分重悬，取60μL(1.2×)的AMPure XPbeads加入上述PCR管中，然后使用移液器温和反复吹打10次，使其充分混匀。25℃孵育5min；
1.5.3将离心管放至磁力架上静置3min，待溶液澄清后移弃上清，保留磁珠；
1.5.4保持离心管在磁力架上，在反应管中加入200μL新配制的80％的乙醇，静置30s后吸弃上清，保留磁珠；
1.5.5重复上述步骤一次；
1.5.6将离心管中残留的乙醇尽可能去除，放置在磁力架上静置5min至磁珠干燥完全；
1.5.7向每个样本中加入30μLnuclease-free water，涡旋混匀，短暂离心，25℃孵育2min；
1.5.8将离心管放在磁力架上3min，待溶液澄清；
1.5.9小心吸取28μL上清至一新的1.5mLEP管中，丢弃磁珠。
1.6模板池特异性引物组扩增文库数据分析
1.6.1将上述文库上机进行2×150bp双端测序；
1.6.2将得到的双端测序读序(reads)先根据重复区(overlap)进行合并，然后与数据库中参考的IGH的V序列及J序列分别进行比对，得到模板池中支持每种V-J重排的reads数目；
1.6.3将上述测序数据同时与管家基因片段进行比对，得到管家基因的reads数目；
1.6.4每种模板池序列的相对丰度＝模板池序列支持reads数/管家基因reads数，扩增偏好系数＝模板池特异性引物扩增产物序列相对丰度/模板池通用引物扩增产物序列相对丰度，实施例2中所述特异性引物组1扩增出的模板池序列的相对丰度分析结果(MPCR-1)及扩增偏好系数(Bias-factor1)如下表8所示；
表8
实施例4
本实施例根据实施例3结果优化扩增偏好性。
1.1将扩增偏好系数<0.5或>2的模板判定为具有明显扩增偏好性的重排序列，包括IGHV1-46*01&IGHJ1、IGHV1-46*01&IGHJ2、IGHV1-46*01&IGHJ4为扩增较差的序列，IGHV3-21*06&IGHJ6及IGHV3-9*01&IGHJ1为明显有扩增偏好的序列；
1.2进一步分析该五种序列相应的扩增引物对分别为MEDX-IGHV1/IGHJ-B、MEDX-IGHV1/IGHJ-AC、MEDX-IGHV1/IGHJ-AC、MEDX-IGHV3-1/IGHJ-AC、MEDX-IGHV3-1/IGHJ-AC。其中对扩增较差的序列IGHV1-46*01&IGHJ1、IGHV1-46*01&IGHJ2及IGHV1-46*01&IGHJ4，相应增加对应的引物MEDX-IGHV1、IGHJ-B在多重引物组中的浓度；对具有明显扩增偏好的序列IGHV3-21*06&IGHJ6及IGHV3-9*01&IGHJ1，相应降低对应的引物IGHV3-1在多重引物组中的浓度，通过多次引物浓度配比测试，挑选扩增均一性较好的引物浓度条件，对调整引物浓度无效的序列，可采用重新设计相对应的引物序列进行均一性校正。
1.3经数轮优化后，最终的多重扩增特异性引物组2扩增出的模板池序列的相对丰度分析结果(MPCR-2)及扩增偏好系数(Bias-factor2)如下表9所示；
9表
对上表数据分析可知，所有的模板池序列扩增偏好系数均在0.5-2.0之间，达到了较好的均一性，以柱状图表示为图2。
综上所述，本发明设计分析多重引物组的扩增偏好性的方法，能够大规模地验证多重扩增体系对每种重排序列的检出能力及检测均一性，鉴定扩增较差或有明显扩增偏好的序列，从而锁定需要进行优化的引物对，有利于精准快速地构建均一性较高的多重扩增重排检测体系，成本低，可操作性强；同时，设计特定组成的BCR/TCR重排序列模板池，能够有效应用于分析多重引物组的扩增偏好性，适用范围广，并依托高通量DNA合成技术构建模板池，可以同时合成大量的DNA分子，成本低，并且所有的DNA分子能够以寡核苷酸序列池(oligo pool)的形式存在，无需人工逐个混合，操作简便。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种分析多重引物组的扩增偏好性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测多重引物组与模板池、管家基因及管家基因引物混合进行PCR扩增，得到测序文库1；用与模板池中模板的5’端及3’端分别互补的通用引物与模板池及管家基因混合进行PCR扩增，得到测序文库2；
(2)对测序文库1进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到测序文库1中每种模板的相对丰度；
对测序文库2进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到测序文库2中每种模板的相对丰度；
(3)计算测序文库1中模板的相对丰度与测序文库2中同一模板的相对丰度的比值，即为该模板的引物的扩增偏好系数，将扩增偏好系数<0.5或>2的引物判定为具有扩增偏好性的引物；
所述模板池中模板的结构从5’端到3’端依次包括5’端通用引物结合序列、BCR或TCR的V片段序列、酶切位点、BCR或TCR的D片段序列、条码序列、酶切位点、BCR或TCR的J片段序列和3’端通用引物结合序列。
2.根据权利要求1所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法，其特征在于，所述模板池中模板的长度为150bp～300bp，且每条模板长度相同；
优选地，所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列为适配测序仪的接头部分序列；
优选地，所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列的长度各自独立地为30～40bp；
优选地，所述V片段序列包括公共数据库中V片段至少100bp参考序列，并一直延伸到3’末端，且含有特异性引物的结合位点；
优选地，所述酶切位点为限制性内切酶识别序列，且不在模板序列的其他位置中出现；
优选地，所述限制性内切酶选自BamHI、EcoRI、HindIII或SalI；
优选地，所述条码序列为识别每条模板的标签序列，其长度为6～15bp；
优选地，所述D片段序列为空序列或公共数据库中D片段的全部参考序列；
优选地，所述J片段序列包括公共数据库中J片段的全部参考序列；
优选地，模板池中V片段序列、D片段序列及J片段序列的种类包括公共数据库中的所有功能性片段；
所述公共数据库选自IMGT数据库、UCSC数据库或NCBI数据库中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法，其特征在于，所述管家基因包括GAPDH或ACTB；
优选地，所述管家基因的长度与所述模板池中模板的长度相同；
优选地，所述管家基因两端还含有所述5’端通用引物结合序列和3’端通用引物结合序列。
4.一种BCR或TCR重排序列模板池，其特征在于，所述模板池用于权利要求1-3任一项所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法；
优选地，所述模板池中模板的结构从5’端到3’端依次包括5’端通用引物结合序列、BCR或TCR的V片段序列、酶切位点、BCR或TCR的D片段序列、条码序列、酶切位点、BCR或TCR的J片段序列和3’端通用引物结合序列；
优选地，所述5’端通用引物结合序列的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
优选地，所述V片段序列选自IGHV1-3、IGHV1-46、IGHV2-5、IGHV2-70、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-9、IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV5-51、IGHV6-1和IGHV7-4-1中任意一种；
优选地，所述J片段序列选自IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5和IGHJ6中任意一种；
优选地，所述酶切位点为GGATCC；
优选地，所述3’端通用引物结合序列的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
优选地，所述条码序列的长度为10bp。
5.一种权利要求4所述的BCR或TCR重排序列模板池的相对定量方法，其特征在于，所述相对定量方法包括以下步骤：
(1’)用与待测模板池中模板的5’端及3’端分别互补的通用引物与待测模板池混合进行PCR扩增，得到双链模板池；
(2’)在所述双链模板池中加入管家基因，使用所述通用引物进行PCR扩增，得到测序文库；
(3’)对所述测序文库进行测序，基于测序数据计算模板池中每种模板的读序数目以及管家基因的读序数目，将模板池中每种模板的读序数目分别除以管家基因的读序数目，得到每种模板的相对丰度。
6.根据权利要求5所述的的相对定量方法，其特征在于，所述待测模板池的投入量大于10ng；
优选地，所述管家基因包括GAPDH或ACTB；
优选地，所述双链模板池的投入总量为0.01ng～1ng；
优选地，所述管家基因的投入量为5000～10000拷贝。
7.一种校正多重引物组的扩增偏好性的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求1-3任一项所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法分析多重引物组的扩增偏好性，调整具有扩增偏好性的引物进行浓度或更换引物序列，使所有的引物的扩增系数为0.5～2。
8.权利要求1所述的分析多重引物组的扩增偏好性的方法、权利要求4所述的BCR或TCR重排序列模板池、权利要求5所述的相对定量方法或权利要求7所述的校正多重引物组的扩增偏好性的方法在以非疾病诊断为目的的Ig/TCR基因重排检测中的应用。
9.一种多重扩增Ig/TCR基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的BCR或TCR重排序列模板池。
10.根据权利要求9所述的多重扩增Ig/TCR基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括重排扩增特异性引物组、一轮扩增试剂、二轮扩增试剂及通用扩增引物；
优选地，所述一轮扩增试剂包括多重扩增酶及扩增缓冲液；
优选地，所述二轮扩增试剂包括热启动扩增酶及扩增缓冲液；
优选地，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂；
优选地，所述核酸纯化试剂包括磁珠和/或清洗液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211511742.1A CN115807056B (zh) | 2022-11-29 | 2022-11-29 | 一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211511742.1A CN115807056B (zh) | 2022-11-29 | 2022-11-29 | 一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115807056A true CN115807056A (zh) | 2023-03-17 |
| CN115807056B CN115807056B (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=85484437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211511742.1A Active CN115807056B (zh) | 2022-11-29 | 2022-11-29 | 一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115807056B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115976221A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-04-18 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710454A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-09 | 南方科技大学 | Tcr或bcr高通量测序的方法及利用标签序列矫正多重pcr引物偏差的方法 |
| US20200199650A1 (en) * | 2017-05-18 | 2020-06-25 | Geneplus－Beijing | Analysis system for peripheral blood-based non-invasive detection of lesion immune repertoire diversity and uses of system |
| EP4001432A1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-25 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Algorithmic method for efficient indexing of genetic sequences using associative arrays |
-
2022
- 2022-11-29 CN CN202211511742.1A patent/CN115807056B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710454A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-09 | 南方科技大学 | Tcr或bcr高通量测序的方法及利用标签序列矫正多重pcr引物偏差的方法 |
| US20200199650A1 (en) * | 2017-05-18 | 2020-06-25 | Geneplus－Beijing | Analysis system for peripheral blood-based non-invasive detection of lesion immune repertoire diversity and uses of system |
| EP4001432A1 (en) * | 2020-11-13 | 2022-05-25 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Algorithmic method for efficient indexing of genetic sequences using associative arrays |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115976221A (zh) * | 2023-03-21 | 2023-04-18 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用 |
| CN115976221B (zh) * | 2023-03-21 | 2023-05-23 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115807056B (zh) | 2023-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107586832B (zh) | 用于测量和校准多重pcr反应中的扩增偏倚的组合物和方法 | |
| CN106048009B (zh) | 一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用 | |
| CN111808854B (zh) | 带有分子条码的平衡接头及快速构建转录组文库的方法 | |
| CN111363783B (zh) | 一种基于特有识别序列的t细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法 | |
| CN110129415B (zh) | 一种ngs建库分子接头及其制备方法和用途 | |
| JP2017528138A (ja) | 小胞性リンカー、ならびに核酸ライブラリ構築およびシーケンシングにおけるその使用 | |
| CN108004304B (zh) | 一种检测淋巴细胞相关基因重排的克隆性的方法 | |
| CN109486923B (zh) | 多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法 | |
| CN106939344B (zh) | 用于二代测序的接头 | |
| CN107038349B (zh) | 确定重排前v/j基因序列的方法和装置 | |
| CN113005121A (zh) | 接头元件、试剂盒及其相关应用 | |
| CN110603327A (zh) | Pcr引物对及其应用 | |
| CN115807056A (zh) | 一种bcr或tcr重排序列模板池及其应用 | |
| CN114657254B (zh) | 用于bcr/tcr基因重排检测的试剂盒和装置 | |
| CN111748637A (zh) | 一种用于亲缘关系分析鉴定的snp分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒及方法 | |
| CN105087560B (zh) | 一种基于高通量测序构建猪bcr重链文库的多重pcr引物和方法 | |
| Langlois de Septenville et al. | Immunoglobulin gene mutational status assessment by next generation sequencing in chronic lymphocytic leukemia | |
| CN112094914B (zh) | 一种联合检测急性髓细胞白血病的试剂盒 | |
| CN111501106A (zh) | 外泌体rna的高通量测序文库的构建方法及装置、用途 | |
| CN103789414A (zh) | 17个x染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒 | |
| CN116064818A (zh) | 检测igh基因重排及超突变的引物组、方法和系统 | |
| CN112266963B (zh) | 一种联合检测慢性粒细胞白血病检测试剂盒 | |
| CN112795654A (zh) | 用于生物体融合基因检测与融合丰度定量的方法及试剂盒 | |
| CN110600082B (zh) | 用于hla分型的核酸捕获探针及其设计方法 | |
| CN113234808A (zh) | 高通量测序检测人源dna的igh免疫组库的引物组和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |