CN103710454A - Tcr或bcr高通量测序的方法及利用标签序列矫正多重pcr引物偏差的方法 - Google Patents

Tcr或bcr高通量测序的方法及利用标签序列矫正多重pcr引物偏差的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种对TCR或BCR进行高通量测序的方法，该方法根据TCR或BCR的V区基因特征设计上游引物，根据TCR或BCR的C区或J区基因特征设计下游引物，结合多重PCR技术和高通量测序，获得TCR或BCR的序列，从而分析TCR或BCR的重排信息；采用本发明提供的2个循环的多重PCR技术，相比现有多重PCR的25～30个循环，能大大降低引物扩增偏好引入的测序误差；此外，本发明还提供了一种利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，进一步降低引物扩增偏好引入的测序误差以及高通量测序固有的测序错误。

Description

TCR或BCR高通量测序的方法及利用标签序列矫正多重PCR引物偏差的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种TCR或BCR高通量测序的方法以及一种利用标签序列矫正多重PCR引物偏差的方法。 
背景技术
T或B淋巴细胞发育成熟过程中，通过V（D）J基因组合、连接多样性，以及体细胞高频突变、基因转换和类别转换等途径形成数量庞大且种类多样的TCR或BCR受体库，免疫细胞群中TCR的多样性多达1016，BCR的多样性多达1014，传统的方法比如SSCP技术、GeneScan技术、荧光定量溶解曲线技术等，常存在覆盖率范围窄的缺点，不能满足数量繁多、种类多样的的检测。 
高通量测序可以满足庞大的序列测序要求。但是，使用Roche454测序平台和Illumina的solexa或Genome Analyzer测序平台等高通量测序技术进行测序时，一般需要进行测序前样本的文库构建，由于TCR或BCR的多样性，引物的扩增偏好性以及模板丰度的差异等因素，建库时引物设计显得尤为重要；此外，现有技术建库时，常在引物的5’端连接标签序列来追踪特异的目标序列，但是标签序列使得引物序列延长，提高了引物的复杂性，多对引物同时使用时，采用普通的PCR无法满足高通量测序建库的要求，还可能会引起PCR引物的扩增误差。 
因此，有必要提供一种TCR或BCR高通量测序的方法以及构建高通量测序文库时矫正PCR引物扩增偏差的方法以及降低高通量测序固有的测序错误。 
发明内容
鉴于此，本发明第一方面提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，该方法根据TCR或BCR的V区基因特征设计了上游引物，根据TCR或BCR的C区或J区基因特征设计了下游引物，再采用2个 循环的多重PCR技术进行扩增，并结合高通量测序，能快速、便捷的获得较准确的TCR或BCR的序列，能更全面地反映TCR或BCR的种类，且降低了现有技术中高通量测序误差。本发明第二方面提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体全长基因进行高通量测序的方法。本发明第三方面提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体CDR3区基因进行高通量测序的方法。本发明第四方面提供了一种利用DNA标签序列以及高通量测序对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行定量分析的方法。本发明第五方面提供了一种利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，该方法能降低测序文库构建过程中由于引物序列对模板的扩增偏好引入的误差以及降低高通量测序固有的测序错误。 
第一方面，本发明提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，包括M种上游引物和至少一种下游引物，所述M种上游引物的设计方法为：根据T淋巴细胞受体TCR或B淋巴细胞受体BCR的可变区V区基因序列的特征，分别设计M种与所述TCR或BCR的V区基因家族上游序列互补的上游引物，其中，所述M为自然数；所述至少一种下游引物的设计方法为：根据TCR或BCR的恒定区C区的基因序列的特征，设计至少一种与TCR或BCR的C区基因序列互补的下游引物，或根据TCR或BCR的连接区J区的基因序列的特征，设计至少一种与TCR或BCR的J区基因序列互补的下游引物。 
优选地，所述上游引物和下游引物分别与所述待测TCR全长或TCR的CDR3区基因两条链的3’末端互补。 
优选地，所述上游引物和下游引物分别与所述待测BCR全长或BCR的CDR3区基因两条链的3’末端互补。 
优选地，所述设计M种上游引物的过程中，为根据BCR的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6和VH7家族的leader区基因序列的特征分别设计至少一条上游引物，分别得到全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物。 
进一步优选地，所述全长-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7所示，所述全长-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:8所示，所 述全长-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:14所示，所述全长-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示，所述全长-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示，所述全长-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:21所示，所述全长-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:22所示。 
优选地，所述设计M种上游引物的过程中，为根据BCR的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6和VH7家族的CDR3区上游的保守区FR3基因序列的特征分别设计至少一条上游引物，分别得到CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物。 
进一步优选地，所述CDR3-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:33所示，所述CDR3-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:34所示，所述CDR3-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:35所示，所述CDR3-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:36所示，所述CDR3-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:37所示，所述CDR3-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:38所示，所述CDR3-VH7的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:39所示。 
优选地，所述设计至少一种下游引物的过程中，为根据BCR膜表面免疫球蛋白mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD的C区基因序列的特征分别设计至少一种下游引物，分别得到mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD下游引物。 
进一步优选地，所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。 
本发明通过在TCR或BCR的可变区(variable)基因设置上游引物序列，在TCR或BCR的连接区（joining）J基因或恒定区（constant）C基因设置下游引物序列，通过多重PCR扩增出目的链的PCR产物构建高通量测序文库。本发明采用2个循环的多重PCR技术，相比采用25～30个循环，本发明提供的方 法能充分发挥标签序列的功能，降低PCR引物扩增偏好引入的测序误差。 
采用本发明带标签序列的引物构建高通量测序文库时，2个循环的多重PCR尤为关键，因为进行了2个循环的扩增后，每个DNA分子已经带上独特的标签，若再进行扩增，会使得带该标签的DNA分子更换新的标签，从而无法追踪该DNA分子在样品中的初始情况；因此，设计带标签的多对引物进行多重PCR时，采用2次循环，若采用25～30个循环的多重PCR，将导致极高比例的扩增错误。 
需要指明的是，本发明提供的多重PCR引物不带标签时，也可以采用25～30个循环的多重PCR构建高通量测序文库。 
编码B淋巴细胞受体的基因位于不同的染色体上，其中，C基因片段编码BCR重链和轻链的恒定区（C区）；轻链V基因和J基因编码轻链可变区（V区）；重链V、J基因片段和D基因片段编码重链可变区（V区）。B淋巴细胞发育成熟过程中，通过V（D）J基因组合、连接多样性，以及体细胞高频突变、基因转换和类别转换等途径形成数量庞大且种类多样的BCR受体库。 
当在可变区(variable)基因的leader区设置上游引物序列时，可扩增BCR全长，当在可变区(variable)基因的CDR3区上游（即FR3区）设置上游引物序列时，可扩增BCR的CDR3区。本发明对BCR的V基因7大类家族ORF（分别为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4）的同源性进行了分析，并在V基因的leader区设计了22条BCR上游引物，在CDR3区上游设计了12条BCR上游引物。 
本发明的提供的全长上游引物序列（全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物）和下游引物序列（mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD下游引物）配对，可覆盖BCR轻重链V区的CDR1、CDR2和CDR3三个高变区，三者均参与对抗原的识别，共同决定BCR的抗原特异性；本发明的提供的CDR3上游引物序列（CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物）和下游引物序列（mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD下游引物）配对，可对BCR的CDR3高变区进行测序，该区是最重要的、研究最多BCR可变区。 
本发明提供的BCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的BCR序列，有利于BCR序列的多态性程度分析及BCR序列的长度多态性分布分析。 
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。 
优选地，本发明提供的标签序列可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都加上了一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组合，且所述标签序列互不相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时（本发明实施例中表示为8N标签序列），可以获得109个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是七个时，可以获得108个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是六个时，可以获得107个不同的标签序列组合，所述标签序列的碱基个数是八个，或者七个，或者六个。 
优选地，本发明提供的标签序列可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都加上了一个标签序列。 
由于二代测序存在固有的测序错误（sequencing errors），因此有一些碱基会被读错，对序列的判断有影响。本发明采用的带标签的多重PCR引物能降低高通量测序误差，甚至能检测出单个碱基突变。因为当带有标签序列的引物进行多个循环的PCR扩增后，每个序列都带上了不同于其它序列的标签序列，通过计算标签序列的个数就可以知道每种DNA片段在起始DNA混合物中的拷贝数，做到定量分析；此外，每个序列被PCR扩增，经过测序后，即可获得每个DNA序列的多个测序结果，通过分析每个DNA序列的多个测序结果，确定正确的碱基序列，因此可以降低高通量测序的仪器、测序方法本身的系统误差，从而提高测序的准确性。 
优选地，所述通过分析每个DNA序列的多个测序结果，确定正确的碱基序列的步骤，包括：将所述DNA测序结果按照标签序列进行分类整理，获得属于同一个DNA序列的所有的DNA测序结果；比较所述属于同一个DNA序列的所有的DNA测序结果，并统计所述所有的DNA测序结果中每个位置出现相同 碱基的频次；判断所述每个位置出现相同碱基的频次是否达到预定的阈值；若达到预定的阈值，则确定所述属于同一个DNA序列的所述位置的碱基，按照所述方法，即可确定所述属于同一个DNA序列的所有位置的碱基。 
优选地，统计所述所有的DNA测序结果中每个位置出现相同碱基的频次后，每个位点碱基是根据该位点出现的频率最高者的碱基而确定的。 
若待测样品为RNA序列，基于同样的原理，可以确定属于同一个RNA序列的所有位置的碱基。 
特别要说明的是，本发明第三方面提供的检测B淋巴细胞受体的方法以人的BCR为样本，其仅为本发明优选的实施例，除此以外，还可以根据需要选用鼠、斑马鱼等为样本进行引物序列设计。 
优选地，所述T淋巴细胞受体（TCR）或B淋巴细胞受体（BCR）待测RNA序列为采用RNA试剂盒提取人外周血单个核细胞的获得的总RNA的序列。 
第二方面，本发明提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，包括如下步骤： 
取待测样品； 
采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR全长； 
将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，获得检测结果。 
优选地，所述多重PCR反应为2个循环的多重PCR反应。 
优选地，所述全长-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7所示，所述全长-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:8所示，所述全长-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:14所示，所述全长-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示，所述全长-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示，所述全长-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:21所示，所述全长-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:22所示。 
优选地，所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。 
当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通实验室采用的体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR。 
第三方面，本发明提供了一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，包括如下步骤： 
取待测样品； 
采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR CDR3区； 
将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，获得检测结果。 
优选地，所述多重PCR反应为2个循环的多重PCR反应。 
优选地，所述CDR3-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:33所示，所述CDR3-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:34所示，所述CDR3-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:35所示，所述CDR3-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:36所示，所述CDR3-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:37所示，所述CDR3-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:38所示，所述CDR3-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:39所示。 
优选地，所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。 
当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通实验室 采用的体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR。 
本发明第四方面提供了一种利用DNA标签序列以及高通量测序对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行定量分析的方法，包括： 
（1）提供或者制备M对TCR或BCR多重PCR引物 
所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同； 
（2）取待测DNA样品，采用步骤（1）所述M对TCR或BCR多重PCR引物进行2个循环的多重PCR，使得每条待测DNA序列带上标签序列；或 
取待测RNA样品，采用步骤（1）所述M对TCR或BCR多重PCR引物的上游引物和下游引物分别进行逆转录反应和cDNA第二链的合成反应，得到带上标签序列的DNA序列，其中，所述上游引物和下游引物为M条上游或下游引物的混合引物； 
（3）取步骤（2）得到的产物进行高通量测序； 
（4）生物信息学分析，对TCR或BCR进行定量分析，方法如下： 
带相同标签的DNA来源于同一条DNA模板，计算同一条DNA所带标签的种类，记为R，R即为该DNA在待测样品中的条数；即可得该DNA在待测样品中的初始含量。 
第五方面，本发明提供了一种利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏性的方法，包括以下步骤： 
（1）提供或制备M对TCR或BCR多重PCR引物 
所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同； 
（2）制备多重PCR的模板 
提供或制备N种已知序列的TCR或BCR DNA片段，等摩尔比混合后作为多重PCR模板，其中，N大于M； 
（3）多重PCR 
取步骤（2）制备的多重PCR模板，与步骤（1）提供的多重PCR引物进行多重PCR，得到的PCR产物进行高通量测序； 
（4）生物信息学分析，矫正多重PCR的引物偏性，方法如下： 
（4a）带相同标签的DNA来源于同一条DNA模板，计算出该DNA模板经过多重PCR后测序得到的条数，记为Q，其中，第N种DNA模板经过多重PCR后测序得到的条数为Qn； 
（4b）任一选取2种以上的DNA模板的Qn，如果Qn都相同，则说明对该序列进行多重PCR的引物在扩增时没有偏性；反之，则有偏性，并判断出现偏性的具体引物对。 
优选地，所述步骤（1）中，所述M对TCR或BCR多重PCR引物为CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7上游引物以及mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物随机组合配对而成，其中，所述CDR3-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:33所示，所述CDR3-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:34所示，所述CDR3-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:35所示，所述CDR3-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:36所示，所述CDR3-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:37所示，所述CDR3-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:38所示，所述CDR3-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:39所示，所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。 
优选地，所述步骤（2）中，所述N种已知序列的TCR或BCR DNA片段的制备方法为： 
采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR全长； 
再将PCR产物通过TA克隆后插入质粒载体，将所得质粒载体进行测序并筛选阳性克隆，得到高通量基因测序的对照文库； 
将所得对照文库进行序列分析并和IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对，再将所得对照文库按V、D和J区基因进行归类，得到N种质粒克隆，所述N种质粒克隆包含了N种已知序列的TCR或BCR DNA片段，即得N种已知序列的TCR或BCR DNA片段。 
本发明提供的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法以及一种利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法的有益效果为：（1）本发明提供的对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法能获得丰富的TCR或BCR重排信息；本发明提供的全长BCR多重PCR引物以及BCR的CDR3多重PCR可分别用于构建BCR全长高通量测序文库以及BCR的CDR3区高通量测序文库；（2）本发明提供的2个循环的多重PCR技术结合本发明的带标签的多重PCR引物能获得误差更小的高通量测序信息；（3）本发明提供的对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法对每一个待测TCR或BCR序列加上DNA标签序列，可以在高通量测序中实现TCR或BCR序列的定量分析并进一步减少高通量测序误差；（4）本发明提供的利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，该方法能进一步降低高通量测序文库构建过程中由于引物序列对模板的扩增偏好引入的误差。 
附图说明
图1为本发明实施例6多重PCR所得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图； 
图2～图3为本发明实施例5所得序列的VDJ重组信息进行分析的结果图； 
图4为本发明实施例5所得序列经过8N标签筛除重复计数的拷贝数后的分析结果。 
具体实施方式
实施例1 
本发明实施例1提供了一种B淋巴细胞受体（BCR）RNA样品的制备方法，包括如下步骤： 
（1）收集健康人的新鲜外周血样本各10毫升（ml）； 
（2）采用密度梯度离心原理（Ficoll密度为1.077，PBMC平均密度为1.072），并通过反复离心洗涤，获得相对较纯的PBMC，步骤如下： 
a.将步骤（1）所得血液用PBS或0.09%NaCl分别按1:1稀释； 
b.向15ml离心管中加入所得稀释血液0.5倍体积的淋巴细胞分离液； 
c.将步骤a所得稀释血液缓慢加入步骤b所得的淋巴细胞分离液的表面，保持分离液和血液分层，然后用swing angle离心机离心，转速600g，在下离心20min-25min，离心机加速/减速设置为4(缓慢升降速)； 
d.轻柔收集淋巴细胞带，置于新的15ml离心管（每人/1支），并加PBS至5ml，操作时尽量避免吸到分离液及过多的血浆，然后在室温下，以2500rpm，离心5min，离心机加速/减速设置为9，弃上清； 
e.再向15ml离心管中加入5ml PBS，混匀使细胞重悬，然后在室温下，以1800rpm，离心5min，离心机加速/减速设置为9，弃部分上清，保留1ml上清，然后混匀使细胞重悬，将细胞重悬液转移至1.5ml EP管； 
f.采用Qiagen Rneasy mini kit提取步骤e所得细胞的总RNA，并用Nanodrop2000（Thermo）测定RNA的浓度及纯度，然后保存总RNA。 
实施例2 
本发明实施例2提供了一种采用BCR全长引物进行2个循环的多重PCR，构建BCR全长高通量测序文库，进行高通量测序的方法，包括如下步骤： 
（1）将实施例1所得总RNA反转录成cDNA，方法如下： 
（1.1）冰上配置如下体系： 
Figure BDA0000450946350000121
该体系中的BCR全长下游引物为mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD下游引物（分别如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:27所示）加上测序接头后混合而成，具体为在即如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:27所示的引物的5’端分别接上illumina测序公司的下游引物接头序列后等摩尔混合，所述illumina测序公司的下游引物接头序列如SEQ ID NO:42所示（具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书），总RNA为实施例1所制备的总RNA，配置含有RNA的反应体系时所采用的水皆为无RNA酶的去离子水； 
然后将该体系置于65℃下5min，再置于冰上； 
（1.2）冰上配置如下体系： 
Figure BDA0000450946350000122
随后将该体系置于42℃下60min，然后72℃下5min，最后4℃保存所得cDNA； 
（2）合成cDNA第二链，方法如下： 
以步骤（1）所得cDNA为模板（为混合物，其中含有cDNA，还有步骤（1）反应后剩余的BCR全长下游引物），取BCR全长上游引物，再采用QIAGEN公司Multiplex PCR试剂盒，配置下述多重PCR体系： 
Figure BDA0000450946350000123
Figure BDA0000450946350000131
该体系中的BCR全长上游引物为全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物（分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示）加上测序接头后混合而成，具体为在这些引物的5’端分别接上illumina测序公司的上游引物接头序列后等摩尔混合，所述illumina测序公司的上游引物接头序列如SEQ ID NO:41所示（具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书），再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR： 
Figure BDA0000450946350000132
72℃7min，PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，挑选片段长度约为500bp的BCR片段，割胶回收，得到纯化后的BCR片段，胶回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室操作进行； 
（3）二代测序文库构建 
（3.1）采用Agencourt AMPure XP（Beckman coulter）试剂盒对步骤（3）所得PCR产物进行磁珠提纯，去除引物等杂质，步骤如下： 
a、将PCR产物转置1.5mlEP管，在其按1：1的比例加入磁珠液，所述磁珠液已经在室温平衡30min；b、混匀，稍微离心后，静置2min；c、将试管置于磁力架上，磁性分离静置3min；d、小心吸去磁珠另一边的清液，用70%乙醇小心清洗2次，吹打10次，注意不要将磁珠冲下，吸去乙醇；e、50度恒温锅加热2-3min，烤至半湿状态，待磁珠上面出现2-3条龟裂时取出；f、用DEPC水溶解磁珠，混匀后稍离心，静置5min后，置于磁力架上，吸附磁珠，转移出DNA溶液，得到纯化后的PCR产物； 
（3.2）PCR反应在DNA两端加上illumina测序用的接头 
参照illumina高通量测序文库构建步骤，配置下述体系： 
Figure BDA0000450946350000133
将所配置的体系按下述程序进行PCR反应： 
Figure BDA0000450946350000142
72℃7min，PCR结束后，4℃保存，电泳检测PCR产物； 
（3.3）采用QIAquick Gel Extraction试剂盒纯化步骤（4.2）所得的PCR产物，按说明书操作，最后洗涤步骤先用25ul EB洗涤一次，然后换个新EP管，再加25ul EB，充分洗脱结合在膜上的DNA，得到纯化后的DNA，Nanodrop2000测试DNA浓度，并送公司进行高通量测序（采用Illumina hiseq2000测序）。 
实施例3 
本发明实施例3提供了一种采用BCR的CDR3引物进行2个循环的多重PCR，构建BCR的CDR3区高通量测序文库，进行高通量测序的方法，该方法只需将实施例2中的全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物置换为CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物（如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:39所示），其他操作和实验条件不变。 
实施例4 
本发明实施例4提供了一种采用带标签的BCR全长引物进行2个循环的多重PCR，构建BCR全长高通量测序文库，进行高通量测序的方法，该方法只需将实施例2中的BCR全长引物置换为带标签的BCR全长引物，其他操作和实 验条件不变，其中，所述带标签的BCR全长引物为在实施例2中所述接有illumina测序公司接头序列的BCR全长引物的中间接上8个碱基的核苷酸序列（即8N标签序列，如SEQ ID NO:40所示），引物的具体结构为：接头序列+标签序列+BCR全长引物，其中，上游引物为SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:40和BCR全长上游引物依次连接；下游引物为ID NO:41、SEQ ID NO:40和BCR全长下游引物依次连接（即上游引物为SEQ ID NO：41、8个随机碱基（8N标签序列）和BCR全长上游引物依次连接；下游引物为SEQ ID NO：42、8个随机碱基（8N标签序列）和BCR全长下游引物依次连接）。 
实施例5 
本发明实施例5提供了一种采用带标签的BCR CDR3引物进行2个循环的多重PCR，构建BCR的CDR3区高通量测序文库，进行高通量测序的方法，该方法只需将实施例4中的全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物置换为CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物（如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:39所示），其他操作和实验条件不变； 
为充分说明本发明的有效效果，本实施例采用设计的程序对所得序列的VDJ重组信息进行分析，结果如图2、图3所示，图2为未采用8N标签进行筛除，直接分析所有所得序列的结果；图3为先根据8N标签的种类，将属于同一条DNA模板扩增的所有序列折合为1条序列（具体方法见实施例7），作为该DNA的测序结果，筛除其他多余的序列，然后再进行VDJ重组信息分析的结果。该图仅显示部分分析结果。图2和图3中的坐标轴分别代表V、D、J的种类，其中，D区为7类，J区为6类，V区为IGHV1、IGHV1-58、IGHV2、IGHV3、IGHV3-20、IGHV3-30、IGHV3-38、IGHV3-49、IGHV3-63、IGHV3-71、IGHV4、IGHV4-4、IGHV5、IGHV7，其中，V2、V5和V7分别为1种，V1和V4为2种，V3为7种。图中的点（V，D，J）的体积代表特定VDJ组合的序列的拷贝数。 
由图2和图3可知，经过8N标签筛除步骤后，相对图2，图3中相应的点 的体积变小，即筛除重复计数的拷贝数，使结果能够反映样品中真实的拷贝数。 
为充分说明本发明的有效效果，本实施例还对图2和图3的分析所得结果中拷贝数排前50的克隆进行对比分析，结果如图4所示。图4中，横坐标表示标号为1～50的克隆，纵坐标表示克隆对应的拷贝数；每组柱子中，前面的柱子是未经8N标签矫正的克隆拷贝数，后面的柱子是经8N标签矫正后的克隆拷贝数。由图4可知，测序所得序列经过8N标签筛选后，能明显去掉重复计数的拷贝，使分析结果更加接近原始样品中待测模板的拷贝数。 
此外，本实施例还对特定VDJ组合计算信息熵（entropy），结果如下表1所示： 
  筛除前 根据8N标签筛除后
TRBV Entropy 4.3995 4.4244
TRBD Entropy 4.339 4.354
TRBJ Entropy 1.65 1.65
VDJ Rearrangement Entropy 8.355 8.456
Unique Clone Entropy 13.3167 13.356
Unique Clone Number 54077 43767
表1.所得克隆的VDJ组合信息 
结果显示本实施例得到43,767种克隆，每种克隆之间存在至少一个碱基的差异，即采用本发明提供的方法可以获得多样、丰富的BCR重排信息。 
对本实施例高通量测序的所得的部分序列输入IMGT数据库进行分析，得到CDR3序列，所述CDR3序列分别如下SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:72所示： 
43:gttagaggtc ccgtggggct cgtccgggca ggggttgact ac，44:gcgagagtca ttgggggagc accacccgca，45:gcggtggggg gggacacacc tatggtcact tactcc，46:gcaaacttaa tggaagcagt cgggttggtc，47:gcgatttatc gtgacatatt acgttcgggg gagtcacctc tc，48:gcgagaggtc ccatagggct cgtccgggta ggacctgact at，49:gcgagagtta ggcataccaa cagcgcatgg tggttcgacc cc，50:gtgaggggcg gggcagtacc cgcggacgtc，51:gcgagagtca ttgggggagc accacccgga，52:gtgaaaggga acactccgtt ttgggagtta ggggacgtc，53:gcactgtatt gtactactat cagttgctct  cggggctca，54:gccagaggag gagctcgtcc gggagacttc，55:gccagaggta gtgacaggag tggttattac tctccctac，56:gcgaattcct atttttggag ggttgactac，57:gcgagaggtc ccattgggct cgtccgggca ggggttgact ac，58:gcgagagact ccgactgggc ctttgactat，59:gcactatatt gcactgctat cagttgctct cgggggtca，60:gcggtttatc gtgacgtatt acgttcgggg gagtcacctc tc，61:gcgacatccc cctatgtcta ttcttcgggg ttccat，62:gcgagaggta gtgacagtgc tggttattac tctccctac，63:gtacacgaat atcggtggga gaccattgac tat，64:gcgaggccag tttgtgctga tggtaactgc tctccgggga at，65:gtaagagacc cggattggag tgggagcctc gaacttgact ac，66:acgagagagc cagcatacca ctttgactat，67:gggagagagc cgcgtagaac cagcgagggc gtc gcgagaggtc，68:ccatagggct cgtccgggta gggattgact ac，69:gcgaaagaca gttacgattt ttccgccttt gactac，70:gcgaaaggtg gggacggtgc tcacgctgac tacttcgact ac，71:gcgagagatc tcaactggaa ctttgactac，72:attgcctcgg atttgtatgg cagcagaccc acgggggcct at，其中的43～72分别代表SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:72。 
实施例6 
本发明实施例6提供了一种采用BCR全长引物进行多个循环的多重PCR，构建BCR全长高通量测序文库，进行高通量测序的方法，包括如下步骤： 
（1）将实施例1所得总RNA反转录成cDNA，方法如下： 
（1.1）将如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示的22种上游引物混合配置成混合引物，该混合引物总浓度为10umol/L，取2.0ul该混合引物与4ug实施例1所得总RNA混合，并加入无RNA酶的去离子水配置成12.0ul的反应体系，然后在65℃下5min使反向引物序列与模版结合，后置将体系于冰上，该步骤如下所示：反应体系为： 
Figure BDA0000450946350000171
体系中的上游引物为本步骤配置的上游引物的混合引物；反应条件： 
65℃下水浴5min，再置于冰上； 
（1.2）分别取4.0ul的Thermo逆转录缓冲液（5X）、1.0ul的Thermo逆转录酶、1.0ul的RNA抑制剂、2.0ul的dNTP（10mM）与步骤（1.1）置于冰上的体系混合，然后按42℃下60min、72℃下5min，最后4℃保温的程序设置仪器，进行逆转录反应，得到一链cDNA，该步骤如下所示：反应体系为： 
Figure BDA0000450946350000181
反应条件：42℃下60min，然后72℃下5min，最后4℃保存所得cDNA； 
（2）多重PCR反应合成cDNA第二链，并进行扩增 
将如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:27所示的5种下游引物混合配置成混合引物，该混合引物总浓度为10uM，再采用QIAGEN公司Multiplex PCR试剂盒，配置下述多重PCR体系： 
Figure BDA0000450946350000182
该体系中DNA模板为步骤（1）所得cDNA，其中含有步骤（1.1）体系中的上游引物，下游引物为本步骤配置的下游引物的混合引物，然后按照下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，并进行多重PCR（35个循环）： 
Figure BDA0000450946350000183
Figure BDA0000450946350000191
72℃7min，然后4℃保存 
得到的PCR产物，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。如图1所示，扩增片段大约400～500bp。 
再参照实施例2的步骤（3）～步骤（4）、结合illumina的说明书构建高通量测序文库并送公司进行高通量测序（采用Illumina hiseq2000测序）。 
实施例7 
本发明实施例7提供了一种采用标签序列矫正高通量测序误差以及对待测序列进行定量分析的方法，包括如下步骤： 
将实施例5的高通量测序结果进行分析，挑选出上游引物的标签序列和下游引物的标签序列分别相同的BCR序列，如下表2所示： 
Figure BDA0000450946350000192
表2.DNA序列的高通量测序结果分析 
带下划线的斜体碱基为标签序列，把前后8N的标签序列归到一组，所述8N为ATCG四种碱基随机排列所示的具有8个脱氧核糖核苷酸的标签序列，比如：ATCGATCG、ATGGATCG等，因为这些序列都是从原始的一条RNA扩增PCR出来的。上游引物和下游引物只显示接头序列，中间的BCR seq为高通量测序所得一系列结果，可知二代测序有测序错误（sequencing errors），因此有一些碱基会被读错，错读的碱基如粗体加下划线所标示的碱基所示。 
根据该位点出现的频率最高者的碱基而确定该位点的碱基，可知该BCR的序列应该为： 
TTTTGTAT\GCTCAGCGGGAA....AGTCTGTGCATTTGA...GGTGAGTTCCAG\CCAATAAG。 
因为采用2个循环的多重PCR，每条DNA序列仅带有一种标签序列测序后所得的具有相同标签序列的DNA来源于同一条模板DNA，因此，采用本发明提供的方法可以减少高通量测序误差，甚至能检测出单个碱基突变。 
此外，因为采用2个循环的多重PCR，所以每条测序后的DNA所带的标签序列的种类可以真实的反应其在样品中的初始数目，因此，还可以根据同一条BCR序列所带标签种类的多少确定该序列在待测样品中的初始数目，进行定量分析，因为每条DNA或RNA序列都带上了不同的标签序列。 
实施例8 
本发明实施例8提供了一种矫正多重PCR引物扩增误差的方法，包括： 
（1）制备多重PCR模板 
（1a）构建质粒文库 
采用Invitrogen公司TOPO克隆试剂盒将实施例6步骤（2）胶回收纯化后的BCR片段与TA克隆的质粒载体连接；然后取2-3μl连接产物，加入至100μl JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰中静置30分钟后，再在42℃水浴加热60秒钟，然后迅速置于冰上1-2分钟；往转化产物中加入890μlLB培养基（amp-），37℃、175rpm振荡培养60分钟，然后将培养液以4000rmp离心1min，弃上清若干，剩下的菌液混匀后取3/4的量在含有X-Gal(10ul)、IPTG(100ng20ul)、Amp的L-琼脂平板培养基上涂布，待菌液完全被培养基吸收后，37度倒置培养12-16h，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落； 
挑取每个平板上所有单个白色菌落，加到600ul LB培养液（Amp+），恒温孵育箱225rpm37度震荡培养2-5h，然后取2.5ul菌液做PCR（25ul体系）； 
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认载体中插入片段的长度大小，测序后选取阳性克隆组成BCR质粒文库； 
（1b）挑选28种质粒混合制备多重PCR模板 
在（1a）所得BCR质粒文库中挑选出28种BCR质粒，挑选方法为：根据BCR的C区、V、D和J区的特征，所得克隆与IMGT数据库中的序列进行生物信息学分析并分类，本发明还将属于同一V家族的，但C基因不一样，或者 是中间的CDR3序列不一样的序列进行进一步的分类。 
该28种BCR质粒的分布如下表3： 
质粒种类 VH1 VH3 VH4 VH7
种类数 18 6 3 1
表328种质粒分布 
将该28种BCR质粒等摩尔混合后，作为多重PCR模板，每种质粒的添加数量是已知的，即每条DNA的数量是已知的； 
（2）设置多重PCR引物 
多重PCR引物为实施例5中加8N标签序列和测序公司接头序列后的多重PCR引物（下文仍然以序列表中没有加8N标签序列和测序公司接头序列的编号表示）； 
（3）多重PCR 
取步骤（1）制备的多重PCR模板，分别与多重PCR引物进行多重PCR，得到的PCR产物分别进行高通量测序； 
（4）将高通量测序结果进行生物信息学分析，包括如下步骤： 
（4.1）以VH1中的4种待测DNA模板为例，记为VH1-18-2（如SEQ ID NO:74所示，作为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO：25所示引物的扩增模板，记为第1对引物）、VH1-2-1（如SEQ ID NO:75所示，作为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO：24所示引物的扩增模板，记为第2对引物）、VH7（如SEQ ID NO:100所示，作为SEQ ID NO:39和SEQ ID NO：24所示引物的扩增模板，记为第3对引物）和VH3-1（如SEQ ID NO:91所示，作为SEQ ID NO:35和SEQ ID NO：25所示引物的扩增模板，记为第4对引物），分析VH1-18-2、VH1-2-1、VH7以及VH3-1的多重PCR引物的扩增误差，如下表4所示，为VH1-18-2、VH1-2-1、VH7、VH3-1多重PCR扩增结果： 
模板 VH1-18-2 VH1-2-1 VH7 VH3-1 比例
高通量测序产物条数 10条 4条 8条 5条 10:4:8:5
[0177] 
模板的初始条数 1条 1条 1条 1条 1:1:1:1
表4多重PCR扩增结果 
由表4可知，采用多重PCR引物进行2个循环的多重PCR时存在扩增误差；此外，采用本实施例提供的方法可以对其他所有引物对进行扩增误差的分析并矫正。若以第4对引物作为参照，则第1对引物和第3对引物扩增数偏高，第2对引物扩增书偏低，且第1对和第3对引物在多重PCR中的扩增误差更大。 
本实施例步骤（1b）所述28种质粒的中的插入片段的序列分别如下表5中SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:100所示，所述SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:100经过NCBI序列比对后，同源性最高的、对应的序列在genebank中的登录号如下表5所示（在表5中，query表示本发明提供的序列的比对位点，sbjct表示genebank中的已知序列与本发明提供的序列相匹配的位点，identities表示本发明提供的序列与genebank数据库中的相对应的序列的相同碱基的比例，本发明不直接提供SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:100的序列，而是以表5的形式间接地反映SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:100的序列）： 
SEQ ID NO Genebank ID query sbjct Identities
73 gb|EU099190.1 61-486 4-416 386/428(90%)
74 gb|HM995876.1 27-455 1-431 408/435(94%)
75 AF062271.1|AF062271 1-422 1-419 391/422(93%)
76 HM152519.1 1-386 8-393 353/389(91%)
77 gb|HM152519.1 1-460 8-451 409/460(89%)
78 gb|BC009851.2 1-433 1-421 371/434(85%)
79 gb|S77600.1 1-460 1-454 421/462(91%)
80 gb|HM995558.1 32-442 4-412 390/414(94%)
81 gb|L29121.1|HUMIGHZE 4-438 51-503 424/453(94%)
82 gb|M18516.1|HUMIGHVAN 1-408 14-421 365/408(89%)
83 emb|Z47272.1 1-464 17-483 440/469(94%)
84 gb|L29121.1|HUMIGHZE 1-446 52-503 421/458(92%)
[0182] 
85 gb|L29121.1|HUMIGHZE 1-446 52-503 416/458(91%)
86 emb|Z47272.1 1-467 17-483 445/469(95%)
87 emb|Z80837.1 1-404 17-414 355/404(88%)
88 emb|Z47272.1 1-454 16-483 430/468(92%)
89 gb|L29121.1|HUMIGHZE 1-449 52-503 428/454(94%)
90 gb|AF062161.1|AF062161 1-426 17-436 382/428(89%)
91 gb|M24236.1|HUMIGVSM 1-369 34-412 348/380(92%)
92 gb|HM995896.1 11-439 1-434 387/437(89%)
93 gb|AY452138.1 1-453 19-467 421/457(92%)
94 gb|AY452138.1 1-379 19-409 343/391(88%)
95 gb|AF067420.1|AF067420 1-411 102-524 274/306(90%)
96 gb|AF067420.1|AF067420 1-428 102-524 387/434(89%)
97 gb|AY671164.1 3-484 2-483 462/485(95%)
98 gb|AY671158.1 1-475 3-483 452/483(94%)
99 gb|AY671184.1 2-481 3-476 458/481(95%)
100 emb|X59906.1 4-410 74-480 355/410(87%)
表5SEQ ID NO:73～SEQ ID NO:100序列比对结果。 
Figure IDA0000450946420000011
Figure IDA0000450946420000021
Figure IDA0000450946420000031
Figure IDA0000450946420000041
Figure IDA0000450946420000061
Figure IDA0000450946420000071
Figure IDA0000450946420000081
Figure IDA0000450946420000091
Figure IDA0000450946420000101

Claims (14)

1.一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，包括M种上游引物和至少一种下游引物，所述M种上游引物的设计方法为：根据T淋巴细胞受体TCR或B淋巴细胞受体BCR的可变区V区基因序列的特征，分别设计M种与所述TCR或BCR的V区基因家族上游序列互补的上游引物，其中，所述M为自然数；所述至少一种下游引物的设计方法为：根据TCR或BCR的恒定区C区的基因序列的特征，设计至少一种与TCR或BCR的C区基因序列互补的下游引物，或根据TCR或BCR的连接区J区的基因序列的特征，设计至少一种与TCR或BCR的J区基因序列互补的下游引物。
2.如权利要求1所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述设计M种上游引物的过程中，为根据BCR的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6和VH7家族的leader区基因序列的特征分别设计至少一条上游引物，分别得到全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物。
3.如权利要求2所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，
所述全长-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7所示，
所述全长-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:8所示，
所述全长-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:14所示，
所述全长-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:18所示，
所述全长-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示，
所述全长-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:21所示，
所述全长-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:22所示。
4.如权利要求1所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述设计M种上游引物的过程中，为根据BCR的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6和VH7家族的CDR3区上游的保守区FR3基因序列的特征分别设计至少一条上游引物，分别得到CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物。
5.如权利要求4所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，
所述CDR3-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:33所示，
所述CDR3-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:34所示，
所述CDR3-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:35所示，
所述CDR3-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:36所示，
所述CDR3-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:37所示，
所述CDR3-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:38所示，
所述CDR3-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:39所示。
6.如权利要求1所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述设计至少一种下游引物的过程中，为根据BCR膜表面免疫球蛋白mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD的C区基因序列的特征分别设计至少一种下游引物，分别得到mIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD下游引物。
7.如权利要求6所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。
8.如权利要求1所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
9.一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取待测样品；
（2）采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR全长；或
采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR CDR3区；
（3）将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，获得检测结果。
10.如权利要求9所述的一种对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，所述多重PCR反应为2个循环的多重PCR反应。
11.一种利用DNA标签序列以及高通量测序对T淋巴细胞受体或B淋巴细胞受体进行定量分析的方法，其特征在于，包括：
（1）提供或者制备M对TCR或BCR多重PCR引物
所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同；
（2）取待测DNA样品，采用步骤（1）所述M对TCR或BCR多重PCR引物进行2个循环的多重PCR，使得每条待测DNA序列带上标签序列；或
取待测RNA样品，采用步骤（1）所述M对TCR或BCR多重PCR引物的上游引物和下游引物分别进行逆转录反应和cDNA第二链的合成反应，得到带上标签序列的DNA序列，其中，所述上游引物和下游引物为M条上游或下游引物的混合引物；
（3）取步骤（2）得到的产物进行高通量测序；
（4）生物信息学分析，对TCR或BCR进行定量分析，方法如下：
带相同标签的DNA来源于同一条DNA模板，计算同一条DNA所带标签的种类，记为R，R即为该DNA在待测样品中的条数；即可得该DNA在待测样品中的初始含量。
12.一种利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提供或制备M对TCR或BCR多重PCR引物
所述多重PCR引物的下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同；
（2）制备多重PCR的模板
提供或制备N种已知序列的TCR或BCR DNA片段，等摩尔比混合后作为多重PCR模板，其中，N大于M；
（3）多重PCR
取步骤（2）制备的多重PCR模板，与步骤（1）提供的多重PCR引物进行多重PCR，得到的PCR产物进行高通量测序；
（4）生物信息学分析，矫正多重PCR的引物偏性，方法如下：
（4a）带相同标签的DNA来源于同一条DNA模板，计算出该DNA模板经过多重PCR后测序得到的条数，记为Q，其中，第N种DNA模板经过多重PCR后测序得到的条数为Qn；
（4b）任一选取2种以上的DNA模板的Qn，如果Qn都相同，则说明对该序列进行多重PCR的引物在扩增时没有偏性；反之，则有偏性，并判断出现偏性的具体引物对。
13.如权利要求11所述的利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述
M对TCR或BCR多重PCR引物为CDR3-VH1、CDR3-VH2、CDR3-VH3、CDR3-VH4、CDR3-VH5、CDR3-VH6和CDR3-VH7上游引物以及mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物随机组合配对而成，其中，
所述CDR3-VH1的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:28～SEQ ID NO:33所示，
所述CDR3-VH2的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:34所示，
所述CDR3-VH3的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:35所示，
所述CDR3-VH4的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:36所示，
所述CDR3-VH5的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:37所示，
所述CDR3-VH6的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:38所示，
所述CDR3-VH7的上游引物的碱基序列SEQ ID NO:39所示，
所述mIgG的下游引物的序列如SEQ ID NO:23所示，所述mIgA的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:24所示，所述mIgM的下游引物的碱基序列如SEQID NO:25所示，所述mIgE的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:26所示，所述mIgD下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:27所示。
14.如权利要求11所述的利用DNA标签序列矫正多重PCR的引物偏差的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述N种已知序列的TCR或BCR DNA片段的制备方法为：
采用mIgG、mIgA、mIgM、mIgE及mIgD下游引物与所述全长-VH1、全长-VH2、全长-VH3、全长-VH4、全长-VH5、全长-VH6和全长-VH7的上游引物随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增BCR全长；
再将PCR产物通过TA克隆后插入质粒载体，将所得质粒载体进行测序并筛选阳性克隆，得到高通量基因测序的对照文库；
将所得对照文库进行序列分析并和IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对，再将所得对照文库按V、D和J区基因进行归类，得到N种质粒克隆，所述N种质粒克隆包含了N种已知序列的TCR或BCR DNA片段，即得N种已知序列的TCR或BCR DNA片段。
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