CN110246539B - 一种免疫力水平评估的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评估受试者免疫力水平的方法和装置，包括从受试者样本中分离淋巴细胞，提取淋巴细胞的RNA并进行逆转录，利用特异性引物获得BCR和/或TCR可变区多核苷酸，对所述多核苷酸进行测序获得序列信息，计算BCR和/或TCR可变区序列的D50值，从而判断受试者的免疫力水平。
Description
技术领域
本发明涉及免疫力检测领域，具体涉及一种通过免疫图谱分析评估免疫力水平的方法。
背景技术
目前市场上用来分析免疫功能的主要方法有：1)免疫五项，检测血液中免疫球蛋白和补体的含量；2)血常规，利用细胞计数的方法分析外周血中白细胞的数量，白细胞数目的增高表明体内存在炎症反应；3)淋巴细胞亚群分析，利用流式细胞分析以及PCR技术分析外周血中白细胞各个亚群的数目和相对比例。
免疫五项检测
通过单向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)、免疫固定电泳、免疫比浊法等方法，检测血液中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3和C4的含量。免疫球蛋白和补体是体液免疫的主要效应成分，在某些疾病(如感染、自身免疫疾病、免疫缺陷病等)情况下，这些指标的浓度相对参考值将出现升高或降低，从而具有评估免疫力、诊断疾病的临床价值。然而免疫五项检测针对体液免疫，不能很好评估细胞免疫。在评估体液免疫时，只能检测IgG、IgA、IgM和补体C3、C4的总体水平，不能在分子序列层次上进行深度分析。
血常规检测
免疫细胞即白细胞，主要分为淋巴细胞和巨噬细胞，是免疫系统的基本组成单位。血常规检测是通过显微镜观测对外周血中的白细胞进行分类和计数。白细胞总数高于参考值上限称白细胞增多，低于参考值下限为白细胞减少。其增多和减少主要受中性粒细胞数量的影响，淋巴细胞等数量的改变也会引起白细胞总数的变化。从生理性变化到恶性肿瘤都有可能引起白细胞总数异常，医生可结合血常规检测侧结果进行临床诊断。血常规检测只能大致判断细胞免疫整体水平的状况，无法分辨针对具体疾病的免疫，也无法在基因水平判断免疫细胞的分类和多样性。
淋巴细胞亚群分析
通过流式细胞分析或PCR技术，对外周血中免疫细胞的相对计数、绝对计数及其变化进行监控，分析疾病状态下的免疫状况(如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等)，以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。最常检测的亚群包括T细胞(CD3)、B细胞(CD19)、NK细胞(CD16+56)、辅助性T细胞(CD3+CD4+)和抑制性T细胞(CD3+CD8+)等。淋巴细胞亚群分析针对一些特定疾病具有较好检测效果，例如流行病学统计结果显示，HLA-B27基因型阳性的人患数个遗传性免疫疾病的机率，比一般人要高很多，以强直性脊柱炎为例，约为87倍。因此检测时选用CD3/HLA-B27双标记抗体，圈定T淋巴细胞亚群，再分析其细胞表面是否表现HLA-B27组织抗原，可以有效帮助临床鉴别诊断强直性脊柱炎等血清阴性骨关节疾病。然而淋巴细胞亚群种类繁多，如进行全面分析，则需要采集的外周血量、费用及时间均难以接受。只进行少数几种淋巴细胞亚群分析，则难以获取全面的免疫系统状况。
目前，现有的免疫检测方法，普遍存在只能针对免疫系统的某一方面，且只能进行较粗略的评估，缺乏全面性、灵敏度和精准性。
无论体液免疫还是细胞免疫，根本上免疫能力来自于相关的免疫细胞。B和T淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。其中，B细胞在早期发育过程中表达细胞表面抗原受体BCR/抗体，在抗原和辅助因子刺激后表达成抗体分泌到细胞外；T细胞表达细胞表面抗原受体TCR。在B或T淋巴细胞早期发育过程中，由基因重组产生的BCR/抗体和TCR的多样性是建立正常免疫功能的基础。
BCR/抗体和TCR的分子结构分为恒定区和可变区，其多样性来自可变区序列的变化。BCR/抗体和TCR可变区序列的多样性来自于免疫细胞形成过程中发生的V(D)J基因重组：基因组中含有多个variable(V)、diversity(D)和joining(J)基因，这些基因在造血干细胞的染色体上是彼此分割的。当造血干细胞分化为免疫细胞的过程中，随机选取的V、D、J基因被连接在一起，形成了BCR/抗体和TCR的可变区。BCR/抗体和TCR的可变区序列中，又以互补性决定区(complementarity determining region，CDR)最为关键，因为它决定了BCR/抗体和TCR所能结合的抗原类型，其中第三个互补决定区(CDR3)是序列变化最显著，也是在抗原决定过程中权重最高的区域，因此CDR3的多样性就代表了BCR/TCR的多样性。
正常情况下，每个B或者T细胞只表达一种BCR/抗体或者TCR。但是，在年龄增长、身体状况恶化或罹患疾病等情况下，BCR/抗体和TCR的多样性可能被破坏。随着二代测序技术的发展，为基于分子水平检测基因变化提供了可能。目前急需一种在分子基因水平检测评估免疫系统的方法。
发明内容
本发明针对现有免疫检测方法的不足，基于高通量测序技术和目标区域特异性扩增技术，实现了使用很少量外周血样本，在基因分子水平，对免疫系统整体的水平进行全面、精确且量化的评估，提供一种免疫系统水平评估的方法和装置。
本发明所提供的方法，使用从受试者静脉血中分离淋巴细胞，提取mRNA逆转录生成cDNA，特异性扩增TCR和/或BCR可变区进行建库测序，从测序数据中获得受试者的免疫力水平。克服了现有技术只能针对免疫系统的某一方面，且只能进行比较粗略的评估的特点，缺乏全面性、灵敏度和精准性的问题。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
根据本发明第一方面，本发明提供了一种评估受试者免疫力水平的方法，包括：从受试者血液样本中分离淋巴细胞，获得淋巴细胞的RNA并进行逆转录；利用特异性引物扩增BCR和/或TCR可变区多核苷酸，对可变区多核苷酸进行测序获得序列信息；计算BCR和/或TCR可变区序列的D50值，根据D50确定受试者的免疫力水平。
根据本发明的实施例，以上所述的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述方法用于非诊断目的。以上评估免疫力水平的方法可以用于科研，例如科学研究免疫细胞治疗的动物或人体试验时，需要追踪体内免疫细胞的种类、数量、多样性等。
在本发明的一些实施例中，扩增BCR可变区的特异性引物为SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:31，包括BCR特异性逆转录引物和BCR特异性扩增引物，其中，BCR特异性逆转录引物为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3；BCR特异性扩增引物为SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:21。
在本发明的一些实施例中，扩增TCR可变区的特异性引物为SEQ ID NO:32-SEQ IDNO:81，包括TCR特异性逆转录引物和TCR特异性扩增引物，其中，TCR特异性逆转录引物为SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:35；TCR特异性扩增引物为SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:81。
在本发明的一些实施例中，所述可变区界定采用BCR和/或TCR互补决定区3(CDR3)，其中可变区序列有分为功能性可变区和非功能性可变区。
在本发明的一些实施例中，根据D50确定受试者的免疫力水平，所述D50是通过下列步骤确定的：
测序所得BCR和/或TCR可变区多核苷酸序列信息，比对确定功能性基因可变区序列总数N，比对到功能性基因的不同序列的类型数为C，每一种序列的拷贝数为N1、N2……NC，并按拷贝数从多到少排序(N1≥N2≥……NC-1≥NC)，拷贝数最多且占据可变区序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值为D50。
其中，
当D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险；
当0.05≤D50<0.10，免疫力较差，处于亚健康状态；
当0.10≤D50<0.15，免疫力正常；
当0.15≤D50，免疫力优秀。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种评估受试者免疫力水平的装置，测序单元，所述测序单元用于对受试者淋巴细胞的BCR和/或TCR可变区多核苷酸进行序列测定，以便获得测序数据；D50确定单元，所述测序单元与D50计算单元连接，基于所述测序数据，确定所述D50。判定单元，所述判定单元与D50确定单元连接，根据D50值判定受试者的免疫力水平。
附图说明
图1、淋巴细胞RNA电泳图
图2、BCR扩增产物电泳图
图3、TCR扩增产物电泳图
图4、受试者健康状况直接影响TCR多样性(D50)图
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明基于高通量测序技术和目标区域特异性扩增技术，从受试者外周血分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录获得cDNA，利用特异性引物扩增BCR和/或TCR可变区域，获得其序列信息，评估受试者免疫力水平。实现了使用很少量外周血样本，在基因分子水平，对免疫系统整体的水平进行全面、精确且量化的评估。
在本发明的至少一些实施方式，提供了一种评估受试者免疫力水平的方法，包括以下步骤：
步骤一：淋巴细胞分离、BCR和/或TCR可变区域序列的获得
利用常规方法从受试者静脉血分离淋巴细胞，提取淋巴细胞的mRNA并进行逆转录。采用特异性引物扩增BCR和/或TCR可变区域，建库测序。
步骤二：评估受试者免疫力水平
根据测序所得的BCR和/或TCR可变区序列信息，计算D50，用作评估BCR/TCR序列多样性的指标。
其中，功能性可变区CDR3序列的总数记为N，功能性可变区CDR3序列的不同序列的类型数为C，每一种序列的拷贝数为N1、N2……NC，并按拷贝数从多到少排序(N1≥N2≥……NC-1≥NC)，拷贝数最多且占据功能性可变区CDR3序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值为D50。
免疫力水平的判断标准如下：
(1)D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险；
(2)0.05≤D50<0.10，免疫力较差，处于亚健康状态；
(3)0.10≤D50<0.15，免疫力正常；
(4)0.15≤D50，免疫力优秀。
以下结合对具体样本依据本发明的方法进行目标区域单体型的确定、基因型的确定、单体型或基因型确定后的用途进行详细的描述及结果展示。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明中所使用的“第一”、“第二”、“第三”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
实施例1免疫图谱分析及免疫水平评估方法的建立
一、淋巴细胞分离和mRNA的提取
1、淋巴细胞分离
取6个受试者静脉血10ml，置于紫盖EDTA抗凝管中，用人淋巴细胞分离液(天津灏阳，货号LTS1077)分离淋巴细胞，具体操作步骤如下：
(1)将采集的新鲜血液10ml加入50ml离心管中，加入生理盐水定容到25ml，轻轻吹打混匀。
(2)在新的50ml离心管中，加入25ml的淋巴细胞分离液(等量)，然后用移液管吸取血样轻轻的沿壁加于分离液液面之上，500g，20℃，离心30min，升速为2，降速为1(Thermol公司低速离心机)。
(3)离心后，用10ml移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到新的50ml离心管中，加入生理盐水定容到50ml，轻轻上下颠倒混匀，300g，20℃离心8min，弃上清。
(4)再次清洗细胞，先将管底细胞弹散，之后再加入生理盐水定容到20ml，轻轻上下颠倒混匀，400g，20℃离心5min，弃上清。
(5)向50ml离心管中加入2ml PBS轻轻吹打均匀混悬细胞，获得分离的淋巴细胞。
(6)细胞计数：取100μl混悬液，加900μl PBS稀释10倍，混匀后进行细胞计数(可根据细胞量自行调整稀释倍数)，细胞计数公式为：细胞数密度＝4大格细胞总数×稀释倍数×104/4＝细胞数/ml
2、淋巴细胞基因组mRNA的提取及检测
按照Trizol试剂(Ambion，货号15596026)说明书操作，一般取5×106～1×107个细胞，细胞量一定要严格计数，细胞不宜过多，会导致RNA酶抑制不彻底，导致RNA降解。具体操作步骤如下：
(1)取分离的5×106个淋巴细胞的混悬液，400g，4℃，离心5min，弃上清。
(2)轻弹离心管底部，松散细胞沉淀物。向淋巴细胞中加入1mL Trizol试剂，用枪吹打混匀，看不到沉淀，室温静止5min，使细胞充分裂解。
(3)加入200μl氯仿，手动剧烈摇晃15s后，室温静置5min。
(4)4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，转移至另一离心管，约450μl。
(5)加入500μl异丙醇混匀，室温静置10min。
(6)4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
(7)加入1ml 75％乙醇，温和震荡EP管，使RNA沉淀整片悬浮。
(8)4℃，7500g离心5min，弃上清，室温放置5-8min，挥发酒精，不能过于干燥。
(9)用30μl DEPC/无酶水溶解RNA沉淀，少量分装后，做好标记，-80℃冰箱保存。
(10)取2μl RNA，用微量紫外分光光度计检测浓度和OD值，取2μl RNA电泳检测条带，使用2％的凝胶，DL2000Marker，同时立刻进行反转录实验。
检测结果为RNA总量＞5μg，体积＞20μl，OD260/280:1.8以上，同时2％琼脂糖电泳检测，出现三条带，为28sRNA、18sRNA、5sRNA，其中28S为18S条带亮度的1～2倍，5S条带最浅(见图1)。
3、逆转录及PCR扩增
3.1 BCR基因特异性扩增
1)逆转录反应
使用同科公司试剂盒(TonkBioTM First chain cDNA synthesis kit)进行逆转录反应，
反应体系和反应条件如下：
其中BRTmix引物的名称和序列如下表所示，引物浓度1：1:1混合，总浓度为20uM。
| BRTmix | 序列5’-3’ | 序号 |
| hIgM-RT | AGGAAGTCCTGTGCGAGGCA | SEQ ID NO:1 |
| hIgG-RT | CGGGGAAGTAGTCCTTGACC | SEQ ID NO:2 |
| hIgA-RT | CGCTCCAGGTCACACTGAGT | SEQ ID NO:3 |
2)第一轮PCR：
对cDNA的BCR基因进行特异性扩增反应，其中所用的PCR酶为同科公司Taq酶(货号TK01015)，反应体系及条件如下表所示：
| 逆转录产物 | 2ul |
| VHmix引物(20um) | 0.5ul |
| JHmix(10uM) | 1ul |
| 10×Buffer | 2ul |
| Mgcl<sub>2</sub> | 1.6ul |
| dNTP(10um) | 0.8ul |
| Taq酶 | 1.2ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.9ul |
| total | 20ul |
PCR程序：
其中，VHmix引物为5’端多重PCR引物，引物名称和序列见下表，按1：1混合，总浓度为20uM。
JHmix引物为3’端多重PCR引物，引物名称和序列见下表所示，按1：1混合，总浓度为10uM，其中小写字母部分是与第二轮3’端引物barcode的保护序列配对
| JHmix | 序列5’-3’ | 编号 |
| JH145 | tctcacCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT | SEQ ID NO:18 |
| JH2 | tctcacCTGAGGAGACAGTGACCAGGGT | SEQ ID NO:19 |
| JH3 | tctcacCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG | SEQ ID NO:20 |
| JH6 | tctcacCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC | SEQ ID NO:21 |
不进行电泳检测，接着进行第二轮扩增。
3)第二轮PCR:
使用同科公司Taq酶(货号TK01015)进行第二轮PCR反应，反应体系和反应条件如下：
| 第一轮PCR产物 | 2ul |
| VHmix引物(20um) | 1ul |
| JHxBCX(20uM) | 1ul |
| 10×Buffer | 2ul |
| Mgcl<sub>2</sub> | 1.6ul |
| dNTP(10um) | 0.8ul |
| 酶 | 1.2ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.4ul |
| total | 20ul |
PCR程序：
其中VHmix引物为5’端多重PCR引物，即第一轮PCR中的VHmix。
JHxBCX为3’端引物，引物名称和序列如下表所示，包含含有10个不同barcode的引物序列，引物序列包括barcode序列(下划线部分)、barcode保护识别序列(小写字母部分)和特异性扩增序列，一个样品选用一种JHxBCX引物，对应唯一一个barcode，以此根据barcode序列区分不同的样本,6个样本的3’端引物分别选自下表中引物SEQ ID NO:22-27，。
| JHxBCX | 序列5’-3’ | 序号 |
| JHxBC1 | gag<u>ATCACGTT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:22 |
| JHxBC2 | gag<u>CGATGTTT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:23 |
| JHxBC3 | gag<u>TTAGGCAT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:24 |
| JHxBC4 | gag<u>TGACCACTt</u>ctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:25 |
| JHxBC5 | gag<u>ACAGTGGT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:26 |
| JHxBC6 | gag<u>GCCAATGT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:27 |
| JHxBC7 | gag<u>CAGATCTG</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:28 |
| JHxBC8 | gag<u>ACTTGATG</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:29 |
| JHxBC9 | gag<u>GATCAGCG</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:30 |
| JHxBC10 | gag<u>TAGCTTGT</u>tctcacCTGAGGAGACGGTGACC | SEQ ID NO:31 |
4)电泳检测扩增效果，目的条带在400多bp处，见图2。
5)磁珠纯化：一个样本做1～2管第二轮PCR翻译后即可纯化。在PCR产物中加入等体积的DNA片段分选纯化磁珠(百迈格生物货号BMSX)，使用30ul水洗脱。使用微量分光光度计检测纯化后产物浓度。
6)等浓度混合6个不同barcode样本，建库测序及后续分析。
3.2 TCR扩增
1)RT-PCR反应(逆转录及第一轮PCR)
使用QIAGEN onestep RT-PCR试剂盒(货号210212)对提取的RNA立刻进行反转录，之后在同一体系内连续进行第一轮扩增。
| RNA | 1ug |
| TRTmix引物(20uM) | 0.625ul |
| Vβmix引物(20um) | 0.625ul |
| 5×onestep RT-PCR Buffer | 5ul |
| RNase inhibitor | 0.25ul |
| dNTP(10um) | 1ul |
| 酶 | 1ul |
| Add RNase-free H<sub>2</sub>O to | 25ul |
RT-PCR程序：
TRTmix为逆转录引物，也作为PCR反应3’端引物，名称和序列如下表所示，按1：1：1混合，总浓度为20uM。
| TRTmix | 序列5’-3’ | 编号 |
| hTCRb-RT1 | tgggagat | SEQ ID NO:32 |
| hTCRb-RT2 | cttttggg | SEQ ID NO:33 |
| hTCRb-RT3 | ccagtgtg | SEQ ID NO:34 |
| hTCRb-RT4 | ctctgcttctgatggctcaaacacagc | SEQ ID NO:35 |
其中Vβmix引物为5’端多重PCR引物，引物名称和序列如下表所示，按1：1混合，总浓度为20uM。
TRTmix为逆转录引物，也作为PCR反应3’端引物，名称和序列如下表所示，按1：1：1混合，总浓度为20uM。
2)第二轮PCR：
使用同科公司Taq酶(货号TK01015)对TCR区域进行特异性扩增，反应体系和条件如下表所示：
| RT-PCR产物 | 4ul |
| Vβmix引物(20um) | 0.5ul |
| hTCRCbBCX引物(20uM) | 0.5ul |
| 10×Buffer | 2ul |
| Mgcl<sub>2</sub> | 1.6ul |
| dNTP(10um) | 0.8ul |
| 酶 | 1.2ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 9.4ul |
| total | 20ul |
PCR程序：
其中Vβmix5’端多重引物，与RT-PCR相同反应的Vβmix相同，浓度也为20uM。
3’端hTCRCbBCX引物(20uM)选自下表中的一种引物，下表中的引物含有不同的barcocde序列，一个样品选用一种hTCRCbBCX引物，一个样对应唯一一个barcode(大写字母)，在本实施例中6个样本的3’端引物分别为SEQ ID NO:72-SEQ ID NO:77。
| hTCRCbBCX | 序列5’-3’ | 编号 |
| hTCRCbBC1 | gagTTACTCGCgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:72 |
| hTCRCbBC2 | gagTCGTTAGCgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:73 |
| hTCRCbBC3 | gagTACCGAGCgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:74 |
| hTCRCbBC4 | gagTGTTCTCCgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:75 |
| hTCRCbBC5 | gagTTCGCACCgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:76 |
| hTCRCbBC6 | gagTTGCGTACgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:77 |
| hTCRCbBC7 | gagTCTACGACgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:78 |
| hTCRCbBC8 | gagTGACAGACgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:79 |
| hTCRCbBC9 | gagTAGAACACgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:80 |
| hTCRCbBC10 | gagTCATCCTAgcacagcgacctcgggtgggaac | SEQ ID NO:81 |
3)电泳检测
电泳检测扩增效果，目的条带在350bp左右，见图3。
4)磁珠纯化：
一个样本做1～2管第二轮PCR后即可纯化。在PCR产物中加入1.4倍体积DNA片段分选纯化磁珠(百迈格生物货号BMSX)，使用30ul水洗脱。使用微量分光光度计检测纯化后产物浓度。
5)等浓度混合6个不同barcode样本(最多10个，对应10种hTCRCbBCX引物)，建库测序及后续分析。
4、建库、测序及数据分析获得免疫图谱
4.1建库及高通量测序
1)建库：
严格按照操作手册操作，加上测序接头及定量工作。
根据试剂盒说明书进行建库，包括Ion Plus Fragment Library Kit(货号4471252)、Ion Xpress Barcode Adaptors 1-16Kit(货号4471250)、Agencourt AMPure XP(货号A63881)，仪器包括PCR仪、Qubit定量仪及核酸定量试剂。
2)模板制备及上机测序
Ion chef-自动化模板制备仪，安装好试剂及耗材即可自动进行实验，完成文库加上ISP磁珠、富集、loading芯片工作。
Ion S5-测序仪，完成测序工作及初步数据处理。
使用试剂包括Ion 520/530 ExT-Chef-4rxns&4 Init NEW-For 600bp(货号A30670)、Ion 530 Chip Kit(货号A27764)。
4.2数据分析获得免疫图谱
高通量测序完成后，使用FQ文件进行数据分析，序列进行Igblast，从中抓取出需用于D50计算的功能性的不同种类的CDR3氨基酸序列，同时统计对应的数量，数量按从高到低排序，保存文件名为受试者编号_productive_CDR3_count.csv。具体如下：
(1)使用网上免费平台分析，链接https://usegalaxy.org/。原数据FQ文件进行reverse反向处理。
(2)合并正反向数据后分barcode，得到单个样本FQ文件。
(3)单个样本FQ文件进行FastQC质检，下载结果。
(4)对单个样本FQ文件再次进行reverse反向处理。
(5)反向处理的FQ文件进行格式转换，得到Fasta文件。
(6)单个样本Fasta文件进行VDJ数据比对(推荐使用免费平台Igblast比对，链接https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，得到比对文件。
(7)比对文件抓取功能性序列的比对数据，单独保存，文件名productive。
(8)再从功能性序列的比对数据中进一步抓取不同种类的CDR3氨基酸序列，同时统计对应的数量，数量按从高到低排序，单独保存，文件名为productive_CDR3_count
(9)productive_CDR3_count文件进行D50计算，具体计算方式如下：
5、评估受试者免疫力水平
测序所得的BCR/TCR可变区序列信息，其中所有功能性基因可变区CDR3序列的总数记为N，不同序列(克隆)的CDR3类型数记为C，每一种克隆的拷贝数被记为N1、N2……NC并按拷贝数从多到少排序(N1≥N2≥……NC-1≥NC)，拷贝数最多且占据功能性CDR3序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值被定义为D50，用作评估BCR/TCR序列多样性的指标。
6个受试者的数据分析及D50计算结果如下：
TCR测序数据进行处理，QC结果见下表：
D50相关数据统计见下表：
3、根据D50数据，对受试者的免疫水平、健康状况进行评估，我们定义通过免疫图谱分析评估受试者免疫力水平的标准为：
1)D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险；
2)0.05≤D50<0.10，免疫力较差，处于亚健康状态；
3)0.10≤D50<0.15，免疫力正常；
4)0.15≤D50，免疫力优秀。
实施例2本发明方法对大量受试者免疫水平评估
根据实施例1中描述的方法对124个受试者进行免疫图谱检测分析，所有的受试者对应的D50值如下表：
其中健康人：
白血病人：
癌症病人：
| 编号 | D<sub>50</sub> | 病例 |
| 24ny | 0.04 | 肝癌 |
| 1ny | 0.049 | 肺癌 |
| 2ny | 0.021 | 肺癌 |
| 3ny | 0.0196 | 肺癌 |
| 4ny | 0.006 | 肺癌 |
| 5ny | 0.021 | 肺癌 |
| 7ny | 0.001 | 肺癌 |
| 9ny | 0.042 | 肺癌 |
| 12-1ny | 0.004 | 肠癌 |
| 13-1ny | 0.093 | 胃癌 |
| 65-1 | 0.011 | 乳腺癌 |
理想情况下，每一种CDR3克隆只有一个功能性拷贝，D50＝0.5；当受试者免疫力下降，或罹患肿瘤、免疫缺陷等疾病时，D50数值会急剧下降。来自75位健康受试者及20位肿瘤患者的免疫图谱分析表明，大多数健康受试者的D50>0.05，而绝大多数罹患肿瘤受试者的D50<0.05。健康人群与白血病患者的D50存在显著差异(p＝0.0014),健康人群与癌症患者的D50存在显著差异(p＝0.00007),而白血病患者与癌症患者的D50没有显著差异(p＝0.498)。因此，受试者健康状况与免疫多样性(D50)具有显著正相关性。
根据D50数值大小对受试者进行分类，再对照受试者健康状况进行分析，D50>0.05时，95％受试者是健康人，而D50<0.05时，60％受试者是肿瘤患者。建议D50<0.05的健康受试者进行深入体检后，有2人查出癌变早期，预期在2-3年内可能发展为白血病。因此，受试者免疫多样性(D50)可以用于判断其健康状况。
因此，我们定义通过免疫图谱分析评估受试者免疫力水平的标准为：
1)D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险；
2)0.05≤D50<0.10，免疫力较差，处于亚健康状态；
3)0.10≤D50<0.15，免疫力正常；
4)0.15≤D50，免疫力优秀。
据此标准，2.2.5中所述6位受试者，可以看出1号受试者的D50>0.15，免疫力优秀，2、3号受试者的D50在0.10-0.15之间，免疫力正常，4、5、6号受试者D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险。免疫图谱分析结果与受试者健康状况对照，4、5、6号受试者都是肿瘤患者，符合得出的规律。
综上所述，可以确定了标志CDR3多样性的指标D50作为评估受试者免疫水平的指标。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 成都益安博生物技术有限公司
<120> 一种免疫力水平评估的方法及装置
<130> 2019110005
<160> 81
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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aggaagtcct gtgcgaggca 20
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cggggaagta gtccttgacc 20
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cgctccaggt cacactgagt 20
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caggtgcagc tggtgcagtc tgggg 25
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caggttcagc tggtgcagtc tggag 25
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tctcacctga ggagacggtg accagggt 28
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tctcacctga agagacggtg accattgtcc cttg 34
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gagatcacgt ttctcacctg aggagacggt gacc 34
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gagcgatgtt ttctcacctg aggagacggt gacc 34
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gagttaggca ttctcacctg aggagacggt gacc 34
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gagtgaccac ttctcacctg aggagacggt gacc 34
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gagcagatct gtctcacctg aggagacggt gacc 34
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gagtagcttg ttctcacctg aggagacggt gacc 34
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ccagtgtg 8
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ggtgctgtcg tctctcaaca tccgag 26
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catgccaaag tcacacagac tccagga 27
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gacacagctg tttcccagac tccaaaatac 30
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cccagacacc aaaatacctg gtcacagc 28
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cacctggtca tgggaatgac aaataagaag tc 32
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gctgctggag tcatccagtc ccc 23
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gattctggag tcacacaaac cccaaagcac 30
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acacacctga tcaaaacgag aggacagca 29
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ggtgaagaag tcgcccagac tccaaaac 28
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gacaccaagg tcacccagag acctag 26
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cccaggcaca aagtgacaga gatgggacaa 30
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ccccggcacg aggtgacaga gatgggacaa 30
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gaagctggag ttactcagtt ccccagc 27
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gaacctgaag tcacccagac tcccagc 27
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gaagctggag tggttcagtc tcccag 26
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ccccagacac aagatcacaa agaggggac 29
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ctcccaggta caaagtcaca aagaggggac 30
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cccctaggta caaagtcgca aagagaggac 30
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ccctgagaca caaggtagca aagaagggaa a 31
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cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa a 31
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gagttactcg cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagtaccgag cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagtgttctc cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagttcgcac cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagttgcgta cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagtctacga cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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gagtgacaga cgcacagcga cctcgggtgg gaac 34
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<400> 81
gagtcatcct agcacagcga cctcgggtgg gaac 34
Claims (4)
1.一种评估受试者免疫力水平的装置，其特征在于，包括以下：
测序单元，所述测序单元用于对受试者淋巴细胞的BCR和/或TCR可变区多核苷酸进行序列测定，以便获得测序数据；
D50确定单元，所述测序单元与D50确定单元连接，基于所述测序数据，确定BCR和/或TCR可变区序列的D50值；
判定单元，所述判定单元与D50确定单元连接，根据D50值判定受试者的免疫力水平:
D50<0.05，免疫力低下，可能已经罹患严重疾病或具有很高患病风险；
0.05≤D50<0.10，免疫力较差，处于亚健康状态；
0.10≤D50<0.15，免疫力正常；
0.15≤D50，免疫力优秀；
所述BCR可变区由特异性引物NO:1-SEQ ID NO:31扩增得到，所述引物包括BCR特异性逆转录引物和BCR特异性扩增引物，其中，BCR特异性逆转录引物为SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:3；BCR特异性扩增引物为SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:31；
所述TCR可变区由特异性引物为NO:32-SEQ ID NO:81扩增得到，所述引物包括TCR特异性逆转录引物和TCR特异性扩增引物，其中，TCR特异性逆转录引物为SEQ ID NO:32-SEQ IDNO:35；TCR特异性扩增引物为SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:81。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的D50的计算方法如下：测序所得BCR和/或TCR可变区多核苷酸序列信息，比对确定功能性基因可变区序列总数为N，比对到功能性基因的不同序列的类型数为C，每一种序列的拷贝数为N1、N2……NC，并按拷贝数从多到少排序，拷贝数最多且占据功能性可变区序列总数50％的克隆类型数记为H，H与C的比值为D50。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述的可变区界定采用BCR和/或TCR互补决定区3(CDR3)。
4.根据权利要求1所述装置，其特征在于，所述受试者淋巴细胞从外周血样中获得。
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