CN117092352A - 与多发性骨髓瘤诊断与预后相关的rab3b生物标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了RAB3B在作为评估多发性骨髓瘤患者预后风险标记物中的应用。本发明通过RT‑qPCR方法对初诊和缓解MM患者以及健康供者骨髓细胞中的RAB3B表达水平进行了分析，发现该基因在MM患者中的表达水平显著高于正常对照并可能与临床病程相关。随后对该基因的临床意义做了探究，发现该基因的高表达是MM患者低无进展生存(PFS)的独立危险因素。RAB3B在评估多发性骨髓瘤患者预后风险中具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与多发性骨髓瘤诊断与预后相关的RAB3B生物标记物及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是血液系统常见的恶性肿瘤，以克隆性浆细胞异常增殖并分泌大量非功能性免疫球蛋白或其片段为特征，常见的症状包括高钙血症、肾功能损害、贫血、骨病以及继发淀粉样变性等。随着新药不断问世及检测手段的提高，MM的诊断和治疗得以不断改进和完善，但几乎所有患者复发和死亡的结局仍不可避免，目前仍无法治愈。尽管流式细胞术(FCM)、二代测序(NGS)以及影像学检查等可用于评估MRD，但仍缺乏可简便、快速、灵敏检测且特异性的诊断、MRD监测和预后评估的分子靶标。
RAB3蛋白有A、B、C、D四种亚型，均属于RAS癌基因家族成员(Member RAS OncogeneFamily)，RAB3B是其中之一。RAB3在突触小泡中高度富集，是参与哺乳动物细胞胞内囊泡运输和介导囊泡与靶膜融合的GTP酶，其中RAB3B是囊泡运输的中枢调节因子。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何诊断多发性骨髓瘤及评估多发性骨髓瘤患者的预后风险。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的新用途。
本发明提供了检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质在如下(1)-(6)中任一种中的应用：
(1)制备用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品；
(2)制备用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品；
(3)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品；
(4)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存率的产品；
(5)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品；
(6)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品、用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品、用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存率或无进展生存时间的产品和用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品。
本发明提供的用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品、用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品、用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存率或无进展生存时间的产品和用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品均包括检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质。
上述任一所述应用或产品中，所述检测RAB3B基因的物质可为利用现有技术中的方法检测所述RAB3B基因表达水平所需的试剂和/或仪器，如利用高通量测序检测所述RAB3B基因表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用定量PCR检测所述RAB3B基因表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用northern杂交技术检测所述RAB3B基因表达水平所需的试剂和/或仪器。
所述检测RAB3B基因编码的蛋白的物质可为利用现有技术中的方法检测所述蛋白含量所需的试剂和/或仪器，如利用质谱或其相关技术检测所述蛋白含量所需的试剂和/或仪器，或利用免疫杂交技术检测所述蛋白含量所需的试剂和/或仪器，或利用ELISA技术检测所述蛋白含量所需的试剂和/或仪器，或利用蛋白芯片或试纸检测所述蛋白含量所需的试剂和/或仪器。
进一步的，所述检测RAB3B基因的物质为检测RAB3B基因编码的mRNA的表达量的物质。所述检测RAB3B基因编码的mRNA的表达量的物质可包括用于检测所述mRNA的特异性扩增引物和/或探针。在本发明的一个具体实施例中，所述特异性扩增引物由SEQ ID No.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成；所述探针为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。所述探针的5’端可标记有荧光报告基团(如FAM)。所述探针的3’端可标记有荧光猝灭基团(如BHQ)。
再进一步的，所述表达量为RAB3B基因参比内参基因的相对表达量，具体可为RAB3B基因的表达量与内参基因的表达量之比。所述RAB3B基因的表达量和所述内参基因的表达量均可为根据标准曲线和CT值得到的拷贝数。
更进一步的，所述检测RAB3B基因编码的mRNA的表达量的物质还可包括用于检测内参基因mRNA的特异性扩增引物和/或探针。所述内参基因具体可为ABL1基因。检测所述ABL1基因mRNA的特异性扩增引物可为ABL1上游引物(5’-CCGCTGACCATCAATAAGGAA-3’)和ABL1下游引物(5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’)。检测所述ABL1基因mRNA的探针可为5’-FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ-3’。
上述用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品或用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品还可包含数据处理装置A；所述数据处理装置A内设模块；所述模块具有如下功能：根据待测者骨髓单个核细胞中RAB3B的相对表达量诊断待测者是否为多发性骨髓瘤患者：如果待测者骨髓单个核细胞中RAB3B的相对表达量大于健康对照者，则该待测者为或疑似为多发性骨髓瘤患者；否则该待测者不为或疑似不为多发性骨髓瘤患者。
上述用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存率或无进展生存时间的产品还可包含数据处理装置B；所述数据处理装置B内设模块；所述模块具有如下功能：根据多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中RAB3B的相对表达量评估多发性骨髓瘤患者的预后风险或无进展生存率或无进展生存时间：RAB3B低表达组的多发性骨髓瘤患者的预后风险低于或候选低于RAB3B高表达组的多发性骨髓瘤患者；RAB3B低表达组的多发性骨髓瘤患者的无进展生存率高于或候选高于RAB3B高表达组的多发性骨髓瘤患者；RAB3B低表达组的多发性骨髓瘤患者的无进展生存时间长于或候选长于RAB3B高表达组的多发性骨髓瘤患者。
上述用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品还可包含数据处理装置C；所述数据处理装置C内设模块；所述模块具有如下功能：根据多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中RAB3B的相对表达量评估多发性骨髓瘤患者的病程进展：RAB3B低表达组的多发性骨髓瘤患者的复发风险低于或候选低于RAB3B高表达组的多发性骨髓瘤患者。
上述RAB3B高表达组和RAB3B低表达组可按照如下方法判定：以由若干名未采取任何治疗措施的多发性骨髓瘤患者组成的待测群体的离体骨髓为标本，测定每份标本中RAB3B的相对表达量，然后按照所述相对表达量由低到高的顺序将所述待测群体进行排列并进行二等分，将表达量低的1/2所述待测群体作为RAB3B低表达组，将其余1/2所述待测群体作为RAB3B高表达组。
RAB3B蛋白或RAB3B基因作为靶标在如下(1)-(6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)制备用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品；
(2)制备用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品；
(3)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品；
(4)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存率的产品；
(5)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品；
(6)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品。
上述任一所述应用或试剂盒中，所述RAB3B基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述RAB3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
在本发明中，所述预后风险为初诊为多发性骨髓瘤患者预后风险。所述预后风险的高低具体可体现为如下指标中的全部或部分：无进展生存时间、无进展生存率。无进展生存时间越长，则预后风险越低；无进展生存率越高，则预后风险越低。
所述病程进展(复发风险)是指多发性骨髓瘤患者缓解后的复发风险。
上述任一所述应用或试剂盒中，所述筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者包括筛查或辅助筛查初诊多发性骨髓瘤患者和筛查或辅助筛查复发多发性骨髓瘤患者。
上述任一所述应用或试剂盒中，所述多发性骨髓瘤为成人多发性骨髓瘤。
本发明通过RT-qPCR方法对初诊和缓解MM患者以及健康供者骨髓细胞中的RAB3B表达水平进行了分析，发现该基因在MM患者中的表达水平显著高于正常对照并可能与临床病程相关。随后对该基因的临床意义做了探究，发现该基因的高表达是MM患者低无进展生存(PFS)的独立危险因素。RAB3B在多发性骨髓瘤诊断与预后中具有重要价值。
附图说明
图1为RAB3B在初诊和缓解MM患者以及健康供者骨髓细胞中的表达水平。线条代表中位数和四分位数值；****，P＜0.0001；ns.，无统计学意义。
图2为RAB3B诊断初诊MM的ROC曲线图。
图3为RAB3B表达水平与MM临床病程的关系。RAB3B在7例MM患者的初诊、缓解和疾病进展的骨髓细胞标本中的表达水平。
图4为RAB3B表达水平与MM预后无进展生存率的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的RAB3B基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，RAB3B基因编码的RAB3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
实施例1、与多发性骨髓瘤诊断与预后相关的RAB3B标记物及其应用
一、研究对象与方法
1、研究对象
以于2014年1月至2019年3月期间收集自北京大学人民医院血液病研究所的201例初诊为多发性骨髓瘤(NDMM)患者的骨髓标本作为研究对象。201例多发性骨髓瘤包括男性120例，女性81例，中位年龄为60岁，年龄范围为36岁～87岁，对其随访直至疾病进展、死亡、失访或2022年4月。多发性骨髓瘤的诊断标准参考国际骨髓瘤工作组(IMWG)的指南，分期按照Durie-Salmon(D-S)分期体系、国际分期体系(ISS)和修订的国际分期体系(R-ISS)进行。多发性骨髓瘤患者的治疗和疗效评判参照上述指南进行。无进展生存(PFS)定义为从初次治疗开始至第一次发生疾病进展的时间，疾病进展或死亡为事件。
另外，收集NDMM患者随访过程中的骨髓标本共116份，包括40份治疗后达到完全缓解(CR)的骨髓标本、34份治疗后达到非常好的部分缓解(VGPR)的骨髓标本、35份治疗后达到部分缓解(PR)的骨髓标本和7份治疗后出现疾病进展(PD)的骨髓标本。正常对照骨髓标本取自成人健康志愿者，共45份。
本研究方案经过北京大学人民医院伦理委员会批准。所有健康志愿者和患者均签署知情同意书。
2、骨髓单个核细胞提取与RT-qPCR
使用Ficoll淋巴细胞分离液与密度梯度离心法将骨髓标本中的单个核细胞分离出来，提取其中的RNA并将其逆转录为cDNA。使用PCR Master Mix试剂盒配置如下10μL PCR反应体系：5μLUniversal PCR Master Mix；300nM引物；200nM荧光探针；150-500ng cDNA，引物序列和荧光探针序列如表1所示。qPCR利用ABI 7500FAST PCR扩增仪完成，反应条件如下：50℃2min，95℃10min，然后95℃15s，60℃1min进行40个循环。以ABL1为内参，以标准曲线法计算RAB3B与ABL1的拷贝数。系列稀释的表达ABL1的质粒(参见“GabertJ，Beillard E，van der Velden VH，Bi W，Grimwade D，Pallisgaard N，etal.Standardization and quality control studies of“real-time”quantitativereverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcriptsfor residual disease detection in leukemia—a Europe Against Cancerprogram.Leukemia.2003；17：2318-2357”一文中的“ABL1 plasmid”)(106、105、104、103、102、101和100拷贝/μL)和含有RAB3B基因或其片段的重组质粒用来构建标准定量曲线。曲线阈值设置为0.082。通过样本内参基因ABL1及RAB3B基因的扩增曲线及设定的阈值(0.082)得到其ABL1及RAB3B的Ct值，再根据ABL1标准曲线(由于RAB3B与ABL1扩增效率相近，为减少实验误差，均参照ABL1标准曲线计算)，得到样本ABL1及RAB3B的拷贝数，以RAB3B的拷贝数除以ABL1的拷贝数为样本RAB3B表达量，为了与临床常规所发报告的形式一致，结果再乘以百分之百，最终以RAB3B的拷贝数/ABL1的拷贝数×百分数＝样本RAB3B表达量的形式呈现。
表1、RAB3B和ABL1引物和探针序列
3、统计分析
应用SPSS22.0、Graphpad Prism 7进行统计学分析。两组数据差异性的比较，分类变量数据采用卡方检验，连续变量数据采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。受试者工作(receiver operating characteristic，ROC)曲线用来评价诊断指标的特异性和敏感性。约登指数(Youden Index)用于计算诊断的cut-off值。生存分析用Kaplan-Meier进行分析，应用log-rank检验。Cox比例风险回归模型进行多因素分析。应用后退法将P＞0.1的变量逐渐剔除，P＜0.05为具有统计学意义。
二、研究结果
1、RAB3B在多发性骨髓瘤中的表达水平
分析201份初诊多发性骨髓瘤患者的骨髓标本、109份多发性骨髓瘤缓解患者的骨髓标本和45份健康供者对照的骨髓标本的RAB3B表达水平。
结果显示RAB3B在201份初诊NDMM患者骨髓细胞中的表达水平(中位数为17.54％；范围为0～574.38％)显著高于109份缓解标本(中位数为0.29％；范围为0.02～26.85％；P＜0.0001)和45份健康供者对照标本(中位数为0.50％；范围为0.02～1.33％；P＜0.0001)。而在多发性骨髓瘤缓解患者和健康供者之间的表达水平则无显著差异(P＝0.8906)(图1)。
ROC曲线分析显示RAB3B诊断MM的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.9168(95％置信区间0.8738～0.9598；P＜0.0001；图2)，最大约登指数对应的RAB3B表达水平为1.34％。以此为MM的诊断阈值，则RAB3B基因在NDMM中的异常表达率为86.21％。
2、RAB3B表达水平与多发性骨髓瘤的临床病程相关
为了进一步研究RAB3B与成人多发性骨髓瘤临床病程的关系，对7例成人多发性骨髓瘤患者初诊、缓解及疾病进展时的骨髓标本进行RAB3B表达水平的分析。
结果显示缓解时骨髓细胞的RAB3B表达水平均较初诊骨髓细胞显著降低，而复发时骨髓细胞的RAB3B表达水平较缓解骨髓细胞显著升高(图3)。
3、RAB3B的表达水平与多发性骨髓瘤的一般临床特点的关系
根据RAB3B表达水平的中位值按照如下方法将201例初诊为多发性骨髓瘤患者分为RAB3B高表达组和RAB3B低表达组：测定每例患者骨髓标本中RAB3B的相对表达量，然后按照RAB3B的相对表达量由低到高的顺序将待测群体进行排列并进行二等分，将相对表达量低的1/2所述待测群体作为RAB3B低表达组，将其余1/2所述待测群体作为RAB3B高表达组，并分析RAB3B表达水平与多发性骨髓瘤的一般临床特点的关系。
结果显示RAB3B高表达组患者在初诊时更易出现与预后不良相关的高危细胞遗传学标志P53缺失(P＝0.014)(表2)。
表2、RAB3B表达水平与初诊成人多发性骨髓瘤一般临床特点的关系
4、RAB3B的表达水平与多发性骨髓瘤患者预后的关系
对具有预后信息的159例多发性骨髓瘤患者通过Kaplan-Meier法进行生存分析，根据上述步骤3，按照RAB3B的相对表达量将患者分为两组(RAB3B高表达组和RAB3B低表达组)，发现在RAB3B高表达组(N＝85)患者和RAB3B低表达组(N＝74)患者的60个月的无进展生存率(PFS)分别为2.2％和16.5％，RAB3B高表达组患者比RAB3B低表达组患者拥有更短的无进展生存时间(中位14.00vs.28.77月；P＝0.014；图4)。由于影响MM预后的因素较多，为进一步明确RAB3B对预后的影响，将以下2项因素纳入多因素分析：初诊时β2微球蛋白水平(≥vs.＜5.5mg/L)、R-ISS高危染色体标志(是vs.否)，结果显示RAB3B高表达和R-ISS高危细胞遗传学标志均为PFS较差的独立危险因素(表3)。
表3、成人多发性骨髓瘤患者无进展生存率(PFS)的多因素分析
| 结局 | 风险比(95％置信区间) | P值 |
| RAB3B：高表达vs.低表达 | 1.581(1.058-2.362) | 0.025* |
| β2微球蛋白水平：≥5.5mg/L vs.<5.5mg/L | 1.224(0.822-1.823) | 0.319 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质在如下(1)-(6)中任一种中的应用：
(1)制备用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品；
(2)制备用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品；
(3)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品；
(4)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存率的产品；
(5)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品；
(6)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品。
2.用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品，其包括检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质。
3.用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品，其包括检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质。
4.用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险或无进展生存率或无进展生存时间的产品，其包括检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质。
5.用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品，其包括检测RAB3B基因的物质或检测RAB3B基因编码的mRNA的物质或检测RAB3B基因编码的蛋白的物质。
6.根据权利要求1所述的应用或权利要求2-5任一所述的产品，其特征在于：所述检测RAB3B基因编码的mRNA的物质包括检测骨髓单个核细胞中RAB3B基因编码的mRNA的表达量的试剂和/或仪器。
7.根据权利要求6所述的应用或产品，其特征在于：所述检测骨髓单个核细胞中RAB3B基因编码的mRNA的表达量的试剂包括用于检测RAB3B基因编码的mRNA的特异性扩增引物和/或探针。
8.根据权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：所述特异性扩增引物由SEQ IDNo.1所示的单链DNA分子和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成；
所述探针为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
9.RAB3B蛋白或RAB3B基因作为靶标在如下(1)-(6)中任一种中的应用：
(1)制备用于诊断或辅助诊断多发性骨髓瘤的产品；
(2)制备用于筛查或辅助筛查多发性骨髓瘤患者的产品；
(3)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者预后风险的产品；
(4)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存率的产品；
(5)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者无进展生存时间的产品；
(6)制备用于评估或辅助评估多发性骨髓瘤患者病程进展的产品。
10.根据权利要求1所述的应用或权利要求2-5任一所述的产品或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述RAB3B基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述RAB3B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
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