CN117551753A - 一种自身免疫性肝炎生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自身免疫性肝炎生物标志物。所述生物标志物为TRBV2、TRBV11‑2蛋白，RNA或cDNA。本发明通过对TRBV2和TRBV11‑2的表达水平以及凝胶电泳中条带灰度值定量分析，可以在AIH和NC组之间实现较好的诊断性能。这个方法有助于将AIH与健康对照群体很好的区分开来，并为AIH的诊断提供一种潜在的辅助手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种自身免疫性肝炎生物标志物。
背景技术
自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病，其临床特征为不同程度的血清转氨酶和免疫球蛋白水平升高、循环自身抗体阳性；组织学特征为以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的界面性肝炎，严重病例可快速进展为肝硬化和肝衰竭。AIH在世界范围内均有发生，2019年4月的一篇系统综述显示，AIH在全球的发病率为17.44/100,000，目前在世界范围内，其发病率成上升趋势。尽管AIH存在循环自身抗体和肝脏浆细胞浸润，但由于B细胞活化是依赖于T细胞的事件，因此AIH被认为是与T细胞相关的疾病。T细胞在AIH的发病机制中起着关键的致病作用，这也与HLA II类多态性所带来的疾病易感性相吻合。AIH的免疫病理发生概念依赖于自身反应性CD4+和CD8+T细胞，在环境触发因素破坏自身耐受性后诱导出现。AIH的炎症性肝脏浸润主要由α/βT细胞组成，CD4+T细胞比CD8+T细胞频率高两倍。人们认为AIH中的免疫应答是由尚未确定的自身抗原肽段呈递给未定向的初始CD4+辅助T(Th0)淋巴细胞的T细胞受体(TCR)所引发的。因此，CD4+T细胞的TCR在AIH的发病机制中起着重要作用。在免疫反应过程中，抗原呈递导致特异性与病原体相关的TCR的T细胞的激活和扩增。克隆扩增的T细胞携带独特的TCR重排。一旦病原体被清除，一部分具有特异性TCR的T细胞作为长寿命记忆细胞保留下来。这些独特的DNA重排具有作为稳定生物标志物的潜力，记录个体的功能性T细胞记忆和免疫历史。
AIH的主要挑战在于其难以诊断，需要依赖复杂的生化和免疫学标志物。肝组织活检被认为是AIH诊断的金标准，但它存在一定的风险，突显了寻找新的非侵入性诊断标志物的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自身免疫性肝炎生物标志物。
一种自身免疫性肝炎生物标志物，所述生物标志物为TRBV2、TRBV11-2蛋白，RNA或cDNA。
所述生物标志物在自身免疫性肝炎患者中的表达量升高。
TRBV2和/或TRBV11-2在制备检测自身免疫性肝炎的试剂中的应用，所述试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测TRBV2和/或TRBV11-2基因表达水平的试剂。
所述试剂包含特异性扩增TRBV2和/或TRBV11-2基因或其cDNA的引物；或特异性识别TRBV2和/或TRBV11-2基因或其cDNA的探针；或特异性结合TRBV2和/或TRBV11-2蛋白的抗体。
一种产品，包括制剂、芯片或试剂盒，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测TRBV2和/或TRBV11-2基因表达水平的试剂。
本发明的有益效果：本发明通过对TRBV2和TRBV11-2的表达水平以及凝胶电泳中条带灰度值定量分析，可以在AIH和NC组之间实现较好的诊断性能。这个方法有助于将AIH与健康对照群体很好的区分开来，并为AIH的诊断提供一种潜在的辅助手段。
附图说明
图1为AIH组和NC组样本之间的TCR克隆多样性参数统计分析。
图2为自身免疫性肝炎(AIH)和正常对照组(NC)外周血中T细胞受体克隆型(TCRclonotypes)和框架(frame)的比较；(A-B)两组之间TCR克隆型的比较；(C-D)两组之间TCR框架的比较；使用学生t检验进行统计显著性测试，其中ns表示无显著差异(P>0.05)，*表示具有统计学上显著差异(P<0.05)，**表示具有高度统计学上显著差异(P<0.01)，***表示具有极其显著差异(P<0.001)。
图3为TCRβ链中TRBV和TRBJ基因使用的差异分析；每个自身免疫性肝炎(AIH)和正常对照组(NC)的TRBV(A)和TRBJ(B)基因频率的堆叠柱状图。
图4为自身免疫性肝炎(AIH)与正常对照组(NC)的Vβ-Jβ配对分析。(A)：显示AIH组和NC组之间所有757个Vβ-Jβ配对利用率的聚类热图。(B)：显示来自29个显著差异的Vβ-Jβ配对的AIH和NC的聚类热图；桑基图显示AIH(C)和NC组(D)中出现多次的特定Vβ-Jβ配对。
图5为自身免疫性肝炎(AIH)和正常对照组(NC)的RT-PCR电泳凝胶图像；使用TRBV2(A)和TRBV11-2(B)的简并引物扩增AIH和NC的cDNA，然后将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化。
图6为TRBV2氨基酸分析；(A)自身免疫性肝炎(AIH)和正常对照组(NC)中TRBV2CDR3氨基酸使用频率；(B)AIH和NC中TRBV2 CDR3氨基酸长度分布模式；(C)AIH和NC的TRBV2CDR3氨基酸保守序列的MOTIF图谱；(G)AIH和NC之间TRBV2 CDR3氨基酸差异的MOTIF图谱。
图7为ROC曲线显示自身免疫性肝炎(AIH)和正常对照组(NC)的分类性能；(A)使用TRBV2、TRBV11-2、TRBV2带强度和TRBV11-2带强度的ROC曲线，其中标注了曲线下面积(AUC)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
1.材料与方法
病人特征：在2020年至2023年期间，从首都医科大学附属北京佑安医院收集了18名自身免疫性肝炎(AIH)患者的外周血样本。作为对照组，发明人还采集了10名健康个体(NC)的外周血样本，这些健康个体没有任何血液学异常，用于进行高通量测序，旨在分析AIH患者的T细胞受体(TCR)库和TCR亚型富集情况。为了验证高通量测序的结果，发明人又从45名AIH患者和45名NC对照组捐赠者中再次采集了血样。AIH的纳入标准遵循了2008年的简化诊断指南(19)，AIH诊断得分≥6。本研究已获得首都医科大学附属北京友安医院伦理委员会的批准，并且所有患者样本均在该医院收集。
RNA提取及多重PCR技术：收集18名AIH和10名NC的外周血单个核细胞(PBMCs)，使用CD4+微珠(CD4微珠套装)分离CD4+T细胞。随后，通过流式细胞术检验分离细胞的纯度(使用来自eBioscience,San Diego,CA,USA的CD4 FITC抗体)。接着，利用QIAGEN公司的/>Mini提取试剂盒按照制造商的说明，从每个患者组的CD4+T细胞中提取RNA。在TCR的位于CDR3区两端的V、J基因保守区域设计PCR引物，通过多重PCR扩增得到互补决定区CDR3区域，扩增产物用于后续高通量测序建库。将收集好的RNA反转录得到cDNA，再进行多重PCR(MPCR)。
Lllumina NGS and data analysis：NGS采用免疫SEQ平台(AdaptiveBiotechnologies,Seattle,WA,USA)进行。采用IMGT中注释的TCRVβ(TRBV)和TCRJβ(TRBJ)基因的特异性PCR引物从cDNA中扩增TRB的抗原互补决定区3(CDR3)，使用Illumina HisSeq平台进行深度测序。每个样品平均产出1628.23Mb数据。测序的原始数据包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，在去除这部分reads后，平均每个样本得到1605.88Mb数据。每个样品具有较高的Q20和Q30，这反映测序数据具有较好的测序质量。使用比对软件MiXCR将clean reads比对到TCR参考基因序列，对成功比对的序列，经过组装后得到每种clone序列，质量值较低的序列需要经过进一步的校正。最终，将clone序列完全一致的序列聚类到一起。chao1即chao estimate，是假设数据量完全饱和的情况下，预测的克隆多样性；Shannon Wiener Index，inverse Simpson Index为多样性指数，其中ShannonWiener Index为香农-威纳多样性指数，范围是0～13.82(假设克隆类型数量最大为一百万)，指数越大，表明克隆多样性越高；inverse Simpson Index为辛普森多样性指数(倒数)，范围是0～1000000(假设克隆类型数量最大为一百万)，指数越大，说明克隆多样性越高。每个独特的互补决定区3(CDR3)核苷酸序列被定义为一个克隆。使用GLIPH(通过副表位热点对淋巴细胞相互作用进行分组)算法对具有高可能性的抗原特异性的TRBV序列进行聚类。簇显示为来源于各自簇所组成的单个互补决定区3(CDR3)氨基酸序列的共有序列。CDR3氨基酸的平均频率被认为是“簇大小”，用于绘图。
引物设计：2003年，IMGT数据库中共包含55个TCR-Vβ链序列。发明人从IMGT数据库下载了TRBV2的三个等位基因和TRBV11-2的三个等位基因，以及三个常数区域(C domain)的亚型的碱基序列。为了确定最高相似性的区域，发明人使用DNAMAN 9.0序列分析软件(Lynnon,加拿大魁北克)进行了比较。根据分析结果，设计了三个引物。其中一个用于TRBV2的设计引物如下：
TRBV2正向引物：5'-CTTGGGGCAGAAAGTCGAGTTTCTGG-3'；
TRBV11-2正向引物：5'-GGGACAGGGCCCAAAGCTTCTGATTC-3'；
反向引物：3'-GCACCTCCTTCCCATTCACCCACCAG-5'；
该反向引物跨越了C1和C2等位基因，在TCR-Vβ链的C区域内。
所有引物均使用DNAMAN 9.0进行设计，并由擎科生物(中国北京)合成。
RT-PCR和一代测序：收集45名AIH和45名NC的外周血单个核细胞(PBMCs)，使用CD4+微珠(CD4微珠套装)分离CD4+T细胞。随后，通过流式细胞术检验分离细胞的纯度(使用来自eBioscience,San Diego,CA,USA的CD4 FITC抗体)。接着，利用QIAGEN公司的/>Mini提取试剂盒按照制造商的说明，从每个患者组的CD4+T细胞中提取RNA。采用HiScript IIOne-Step RT-PCR试剂盒通过一步法将提取的RNA合成cDNA，然后进行PCR扩增。在Thermo PCR仪上进行PCR。进行一轮PCR以从中扩增cDNA。每个20ul的PCR反应液包含1ul的模版RNA、10ul的2×one step Mix、1ul的one step Enzyme Mix、0.8ul的GeneSpecific Primer Forward和0.8ul的Gene Specific Primer Reverse。
PCR条件是：50℃30分钟一个循环，94℃30秒一个循环，然后是94℃30秒，55℃30sec，72℃30sec共循环40个周期，72℃5min一个循环，最后在4℃下延长10分钟。PCR产物(20ul)在2％琼脂凝胶上进行。对电泳后得到的条带采用Image J软件进行条带强度计算，同时将条带切下进行一代测序。测序出来的TCR CDR3碱基序列经过IMGT/V-QUEST工具进行TCRV-J分析。
所有分析和数据绘制均使用R Studio(1.1.456版)和GraphPad Prism(Version9.5.0)、SPSS(Version 26)和DANMAN(Version 8.0)软件包进行操作。使用非参数检验(Mann-Whiney Wilcoxon检验)比较两组之间的差异。使用t检验比较平均值，P<0.05被认为是显著的2.结果
患者特征：发明人的研究分为训练队列和验证队列。训练队列包括20名AIH患者和20名健康参与者。验证队列包括45名AIH患者和45名健康参与者。发明人收集了训练队列中两组人群的临床特征指标，并且在性别和年龄方面两组患者之间没有显著差异(P>0.05)。
Table 1.Clinical characteristics of study subjects for training Queue
AIH组和NC组之间的TCR克隆多样性比较：为了更深入地了解AIH患者的TCR免疫组库，发明人对18名AIH患者和10名年龄和性别相匹配的NC的外周CD4+T细胞进行了下一代测序(NGS)免疫测序。TCR的测序深度约为每个样本50,000个读数。
通过全面比较AIH组和NC组的与克隆多样性相关的免疫参数(图1A-F)，研究结果显示，相较于NC组，AIH组内的克隆多样性显著降低(P<0.05)。发明人推测，与AIH相关的TCR克隆可能在AIH组中发生扩增。这种现象导致AIH患者的T细胞免疫系统相对失衡。
图1(A-F)对AIH组和NC组样本之间的TCR克隆多样性参数进行了整体统计分析。具体而言，比较了AIH患者(n＝18)和NC组(n＝10)之间的clone、chaoE、extrapolatediversity、resampled diversity、Shannon-Wiener Index和inverse Simpson Index。每个箱线图代表一个组，每个箱线图包含五个统计值(即最大值、上四分位数、中位数、下四分位数和最小值，从上到下)。使用Student's t检验进行了统计显著性测试，其中ns表示无显著差异(P>0.05)，*表示统计学上显著差异(P<0.05)，**表示高度显著差异(P<0.01)，***表示极显著差异(P<0.001)。
AIH和NC基因组的比较分析：在比较AIH和NC时，发明人重点关注clone typenumber,clone type number with stop codons(图2A-B)，以及out-of-frame和frame/out-of-frame(图2C-D)。相比于NC，发明人观察到AIH中的克隆类型数量和帧外克隆减少。发明人假设这种减少是由于AIH患者循环自身抗体引起免疫系统持续激活，导致T细胞克隆类型的多样性降低，并增加了特定克隆的计数。
AIH和NC中TCRV和J基因的频率分布：为验证上述假设，发明人对AIH和NC队列中每个样本中的前20个V基因和所有J基因进行了分组比较(图3A-B)。结果使用堆叠柱状图进行可视化。发明人观察到TRBV2、TRBV11-2和TRBV28在每个AIH患者中的频率显著高于NC组。TRBV7-2仅在一个AIH患者中显示出显著增加，而TRBJ2-1和TRBJ2-3在所有AIH患者中均显示出显著增加的频率。这些结果表明，在AIH患者中，由于循环的自身抗体引起的持续免疫活化导致特定与疾病相关的TRBV T细胞克隆的扩增。
T细胞在使用TRBV-J基因方面呈现出与AIH特异性的偏倚：为了确定与AIH相关的免疫特征，发明人分析了AIH患者和NC组中循环T细胞中重新排列的TRBV-J基因的配对情况。共获得757个注释的Vβ-Jβ配对，并比较了AIH组和NC组之间Vβ-Jβ组合的频率。大多数Vβ-Jβ基因配对频率在AIH组和NC组之间存在显著差异(图4A)，显示出与AIH疾病相关的一种显著的T细胞偏倚。聚类热图描述出29个在AIH组和NC组之间存在显著差异的Vβ-Jβ基因配对(图4B)。在AIH组中，最常使用的V-J配对是TRBV2-J2-1，而在NC组中，最常见的V-J配对是TRBV29-1-J1-1。
通过绘制AIH组(图4C)和NC组(图4D)的TRBV-TRBJ配对桑基图，发明人观察到AIH组和NC组之间V-J配对的不同流动模式。在AIH组中，TRBV2与TRBJ2-1和TRBJ2-5的配对频率更高，TRBV11-2与TRBJ2-1的配对频率也更高。而在NC组中，TRBV29与TRBJ1-1、TRBJ1-2、TRBJ2-5和TRBJ2-7的配对频率更高。此外，发明人观察到与NC组相比，AIH组的TCR库更丰富于特定亚型，而NC组展示了更均匀的TCR亚型分布。这些发现表明在AIH患者中某些特定的TCR亚型有过度表达，这为AIH的诊断和治疗提供了宝贵的线索和潜在的治疗靶点。
RT-PCR和cDNA测序：根据上述结果，我们选择了AIH组中富集的TRBV2和TRBV11-2进行RT-PCR和一代测序验证。验证队列包括45例AIH患者和45例NC组患者。两组之间在性别和年龄方面没有显著差异(P>0.05)。
首先，发明人采集外周血单个核细胞，随后分离CD4+T细胞。利用RT-PCR技术从AIH组和NC组的样本中扩增TRBV2和TRBV11-2的cDNA片段。随后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和一代测序。对于每个样本，进行多次测序以确保结果的准确性和可靠性。
将从每个患者一代测序得出的TCR CDR3核苷酸序列与IMGT数据库进行比对。测序结果显示，TRBV2和TRBV11-2的表达在AIH组和NC组之间存在显著差异。AIH组中TRBV2的检出率为84.44％(38/45)，而在NC组中为22.22％(10/45)(图5A)。AIH组中TRBV11-2的检出率为82.22％(37/45)，而在NC组中为11.11％(5/45)(图5B)。与NC组相比，AIH组的TRBV2和TRBV11-2的检出率较高(P<0.001)。
Table 2.Demographics and band intensity for validation Queue
此外，使用Image J软件检测了两组患者中TRBV2和TRBV11-2的条带灰度值。与NC组相比，AIH组中的TRBV2和TRBV11-2的条带灰度值显著增加(表2，P<0.001)。
TRBV2 CDR3的氨基酸序列深入分析：由于CDR3的氨基酸具有疏水性质，其组成可能会影响免疫反应。为了探究这种关系，发明人根据IMGT网站提供的亲水性、疏水性和中性氨基酸分类，分析了TCR CDR3氨基酸的性质。由于TRBV11-2亚型在NC组中的表达水平较低，因此对两组之间CDR3氨基酸差异的分析主要集中在TRBV2上。发明人研究了两组TRBV2CDR3区域中不同氨基酸的频率(图6A)。有趣的是，与NC组相比，AIH患者TRBV2 CDR3序列中亮氨酸的出现率显著增高。发明人推测，亮氨酸的疏水性质可能在AIH相关免疫反应的致病机制中发挥作用。
基于高通量测序的结果，研究了TRBV2 CDR3氨基酸长度。TRBV2 CDR3长度在AIH和NC组中都以14个氨基酸为主(图6B)，这表明这些个体的免疫应答中存在TRBV2共同的使用模式，表示可能有选择性优势或共享抗原的特异性。
这些结果为不同患者群体的TCR库组成提供了见解。了解TCR CDR3长度的分布可以增进发明人对免疫系统变异的认识。
进一步分析了TRBV2 CDR3的保守氨基酸序列(图6C)，由14个氨基酸组成。发明人发现不同组有独特的氨基酸序列。在AIH组中，TRBV2 CDR3的保守序列为CASSEGGGDDDYYF，而在NC组中为CASSEGGGDHDHFF(图6D)。AIH和NC TCR CDR3氨基酸差异分析的结构图(图6E)显示，在AIH患者中，酪氨酸在位置13上富集，而在位置12和13的组氨酸和苯丙氨酸相对于NC组而言则减少。这表明在AIH患者中，携带TRBV2的T细胞可能识别不同的表位(自身抗原)。
两组中TRBV2、TRBV11-2及TRBV2的条带灰度值和TRBV11-2条带灰度值的表达及诊断价值：根据TRBV2和TRBV11-2的表达水平以及凝胶电泳中的带强度，发明人分别构建了AIH组和NC组的受试者工作特征(ROC)曲线(图7)；基于TRBV2分析，通过TRBV2带强度，AIH组与NC组区分的曲线下面积(AUC)为78.61％(95％ CI:0.69-0.88)，基于TRBV2带强度分析识别的曲线下面积为79.05％(95％ CI:0.66-0.92)。利用TRBV11-2，AIH组与NC组之间的区分能力，其AUC为86.54％(95％ CI:0.79-0.95)，TRBV11-2带强度为100％(95％ CI:1-1)。利用TRBV11-2的条带灰度值进行分析，可以很好的区分AIH和NC。
这些结果表明，通过对TRBV2和TRBV11-2的表达水平以及凝胶电泳中条带灰度值定量分析，可以在AIH和NC组之间实现较好的诊断性能。这个方法有助于将AIH与健康对照群体很好的区分开来，并为AIH的诊断提供一种潜在的辅助手段。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种自身免疫性肝炎生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为TRBV2、TRBV11-2蛋白，RNA或cDNA。
2.根据权利要求1所述自身免疫性肝炎生物标志物，其特征在于，所述生物标志物在自身免疫性肝炎患者中的表达量升高。
3.TRBV2和/或TRBV11-2在制备检测自身免疫性肝炎的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测TRBV2和/或TRBV11-2基因表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述TRBV2和/或TRBV11-2在制备检测自身免疫性肝炎的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包含特异性扩增TRBV2和/或TRBV11-2基因或其cDNA的引物；或特异性识别TRBV2和/或TRBV11-2基因或其cDNA的探针；或特异性结合TRBV2和/或TRBV11-2蛋白的抗体。
5.一种产品，其特征在于，包括制剂、芯片或试剂盒，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测TRBV2和/或TRBV11-2基因表达水平的试剂。
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