TW202223104A - 利用血中胞外體之蛋白質標記之covid-19重症化預測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種COVID-19患者之重症化預測方法，其利用患者之血液中所含之COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7等RNA之水平。
Description
本發明係關於一種檢測血液中之胞外體所具有之蛋白質而預測SARS-CoV-2感染症之重症化風險之方法等。
嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)感染症(COVID-19)正於全世界蔓延而成為泛流行病(pandemic)。SARS-CoV-2係冠狀病毒屬之病毒，係包含發揮作為遺傳資訊之功能之核酸(RNA)、包圍其之蛋白質殼(capsid)、及具有棘突之脂質雙層膜之殼(envelope)的極小粒子(直徑0.1 nm)。該病毒因飛沫感染或接觸感染而人傳人地擴大感染，飛沫感染係指自感染者之咳嗽/噴嚏/鼻水等飛沫釋放之病毒自口或眼侵入，接觸感染係指用接觸過感染者之飛沫之病毒的手接觸口或鼻。
該感染症經過1～14天之長潛伏期間，變成類似感冒等之發熱/咳嗽等初期症狀。大部分感染者為輕症或無症狀之不顯性。COVID-19之問題係剩餘之一部分患者會產生急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之類之重度呼吸障礙，進而併發心肌炎或血管炎、腦髓膜炎等而陷入生命危機。
當前，各國正積極地實施有無感染SARS-CoV-2之檢查，除了PCR檢查以外，亦進行抗原檢查及抗體檢查。然而，該等檢查方法係判斷病毒之存在本身或者過去曾感染過病毒，存在無法預測感染了病毒之患者重症化的問題。一部分具有基礎疾病、例如循環系統疾病、呼吸系統疾病、糖尿病等基礎疾病之慢性病患者、及孕婦或老年人等，表現出容易重症化之趨勢，但亦出現了健康年輕人之重症化例，從而需要一種更準確之重症化預測方法。
[發明所欲解決之問題]
因此，本發明之目的在於提供一種SARS-CoV-2感染患者之重症化預測方法。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人自藉由PCR檢查判定為SARS-CoV-2陽性且呈現中度症狀之患者採集血液樣本，觀察其後之病情進展度。然後，回溯解析患者之病情之進展度與血液樣本中之胞外體中所含有之蛋白質之關係，結果發現來自患者血液之胞外體所具有之COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之水平成為提示COVID-19患者會重症化或不會重症化之標記。因此，本發明提供一種利用血中胞外體所含有之上述蛋白質的COVID-19患者之重症化預測方法。
本說明書中「COVID-19患者」意指判明了感染SARS-CoV-2之對象或懷疑其感染SARS-CoV-2之對象，無論其有無症狀。例如，COVID-19患者可為在PCR檢查中判定SARS-CoV-2為陽性之患者。SARS-CoV-2係被稱為嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)、或2019新型冠狀病毒(2019-nCoV，2019 novel coronavirus)之冠狀病毒，係全長29.9 kb之正單鏈RNA病毒。首先出現之武漢株(Wuhan-Hu-1)之基因序列公開於GenBank_ID MN908947，但根據Nextstrain之報告，報告稱變異速度為25.9鹼基變異/基因組/年，認為隨機地產生至少9鹼基之變異。因此，本說明書中，「SARS-CoV-2」包括SARS-CoV-2之武漢株及所有自此因變異而產生之衍生株。
本說明書中之標記蛋白質選自：COPB2(COPI Coat Complex Subunit Beta 2，COPI衣被複合次單元β2)(例如，序列編號11)、KRAS(KRAS proto-oncogene，KRAS原癌基因蛋白)(例如，序列編號12)、PRKCB(Protein kinase C beta type，蛋白激酶Cβ型)(例如，序列編號13)、RHOC(Ras homolog family member C，Ras同源家族成員C)(例如，序列編號14)、CD147(Basigin，細胞外基質金屬蛋白酶誘導物(EMMPRIN，extracellular matrix metalloproteinase inducer))(例如，序列編號15)、CAPN2(Calpain-2，鈣蛋白酶-2)(例如，序列編號16)、ECM1(Extracellular matrix protein 1，細胞外基質蛋白1)(例如，序列編號17)、FGG(Fibrinogen gamma chain，纖維蛋白原γ鏈)(例如，序列編號18)、MFAP4(microfibril-associated protein 4，微纖維相關蛋白4)(例如，序列編號19)、ADI1(1,2-二羥基-3-酮基-5-甲基硫代戊烯雙加氧酶(1,2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentene dioxygenase)、APL1、ARD、Fe-ARD、HMFT1638、MTCBP1、Ni-ARD、SIPL、mtnD)、AK1(Adenylate kinase isoenzyme 1，腺苷酸激酶同功酶1)、MGAT1(Alpha-1,3- mannosyl- glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase，α-1,3-甘露糖基-糖蛋白2-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)、CLDN3(Claudin 3，密連蛋白3)、CRP(C-reactive protein，C反應蛋白)、UQCRC2(細胞色素b-c1複合次單元2(Cytochrome b-c1 complex subunit 2)，粒線體(mitochondrial))、FGA(纖維蛋白原α鏈，Fibrinogen alpha chain)、FGB(Fibrinogen beta chain，纖維蛋白原β鏈)、FGL1(Fibrinogen-like protein 1，纖維蛋白原樣蛋白1)、GPX1(Glutathione peroxidase 1，麩胱甘肽過氧化物酶1)、GSK3B(Glycogen synthase kinase 3 beta，肝糖合成酶激酶3β)、LBP(Lipopolysaccharide binding protein，脂多糖結合蛋白)、PDGFC(Platelet Derived Growth Factor C，血小板衍生生長因子C)、RAB13(Ras-related protein Rab-13，Ras相關蛋白Rab13)、RAP1B(Ras-related protein Rap-1b，Ras相關蛋白Rap-1b)、SLC6A4(Sodium-dependent serotonin transporter，鈉依賴性血清素轉運體)、UBA7(Ubiquitin Like Modifier Activating Enzyme 7，類泛素修飾劑激活酶7)、ORM1(血清類黏蛋白1(Orosomucoid 1)，α1-酸糖蛋白1(Alpha-1-acid glycoprotein 1))、RNPEP(Aminopeptidase B，胺肽酶B)、ANGPT1(Angiopoietin 1，血管生成素1)、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX。較佳為選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、及UBA7，更佳為選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4。
本說明書中之標記蛋白質可為上述標記蛋白質之同功型、前體蛋白質、成熟蛋白質、或截斷型，進而可置換或缺失該等之一部分胺基酸、例如1～50個、1～30個、1～20個、1～10個、1～8個、1～5個、1～3個、1～2個、或1個胺基酸，或者可附加或插入該等蛋白質中不含之胺基酸(例如，1～50個、1～30個、1～20個、1～10個、1～8個、1～5個、1～3個、1～2個、或1個胺基酸)。具有與上述標記蛋白質有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或約99%以上之同一性之胺基酸序列的蛋白質亦包括於標記蛋白質中。同一性例如可藉由BLAST等進行判定。除了尤其是如此解釋會矛盾之情形以外，本說明書所記載之標記蛋白質包括該等變異體或變異型。
本說明書中，「血液樣本」包括全血、血漿、血清、全血或者血球之溶血液等血液之分化物或處理物、以及該等之稀釋液或濃縮液，較佳為血清或其稀釋液。
於本說明書中，「重症化」意指在以下WHO 2020年COVID-19病例評分(WHO 2020 scoring for COVID-19 cases)中評分為5以上(住院重症)。
[表1]
| 患者 | 描述詞 | 評分 |
| 未感染 | 無感染之臨床或病毒學證據 | 0 |
| 非臥床 | 無活動限制 | 1 |
| 活動限制 | 2 | |
| 住院輕症 | 無氧氣治療 | 3 |
| 藉由鼻導管或面罩吸氧 | 4 | |
| 住院重症 | 高流量氧氣無創通氣 | 5 |
| 插管及機械通氣 | 6 | |
| 通氣＋額外器官支持(加壓器、RRT、ECMO) | 7 | |
| RRT：腎臟替代治療(renal replacement therapy)，ECMO：體外循環透膜氧合器(extracorporeal membrane oxygenation) |
本說明書中，「胞外體」係指自各種細胞釋出之直徑約20～200 nm或者50～150 nm之細胞外囊泡，亦記載為EV。已知胞外體可具有各種功能，代表性的有細胞間通信、抗原呈現、蛋白質以及mRNA及miRNA等核酸之傳輸。本說明書中之胞外體較佳為於表面具有CD9及CD63。
本說明書中，標記RNA選自miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、let-7c-5p、miR-21-5p、miR-140-3p、及C5orf66-AS2，該等例如可依序具有序列編號1～10所記載之核酸序列，但並不限定於此。
標記RNA存在同功型或變異型之情形時，該同功型或變異型亦包括於本說明書中之標記RNA中。例如，本說明書中之標記RNA中，作為上述標記RNA所知之序列中，可置換或缺失一部分鹼基，例如1～5個、1～3個、1～2個、或1個鹼基，或者可附加或插入上述標記RNA不含之鹼基(例如1～5個、1～3個、1～2個、或者1個鹼基)。又，具有與上述標記RNA有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或者約99%以上之同一性之鹼基序列的RNA亦包括於本說明書中之標記RNA中。同一性例如可藉由BLAST等進行判定。除了尤其是如此解釋會矛盾之情形以外，本說明書所記載之標記RNA包括該等變異體或變異型。
[發明之效果]
藉由本發明之方法等，能夠預測COVID-19患者之預後，因此可用於判斷可否入院，或判斷是否需要監控體制。尤其是對於被預測重症化之患者，藉由更頻繁地進行症狀確認，能夠進行合適之治療或處理。
1.重症化可能性之判定方法
於一形態中，本發明係一種判定COVID-19患者重症化之可能性之方法，包括：測定來自該患者之血液中之胞外體中存在之一種以上之標記蛋白質之水平；及藉由將測定之標記蛋白質之水平與對照RNA水平進行比較而判定上述患者重症化之可能性。上述標記蛋白質係選自以下之蛋白質所組成之群：COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX。
因此，本發明之重症化可能性之判定可包括將來自作為COVID-19患者之受驗者之血液的胞外體中之標記蛋白質水平與對照之標記蛋白質水平進行比較。例如，於測定之蛋白質為COPB2或KRAS之情形時，該蛋白質之水平高於健康正常人之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性低或者維持輕症狀態，或者，不高於(低於或等同於)健康正常人之蛋白質水平時，可判定重症化之可能性高。又，於測定之蛋白質為PRKCB或RHOC之情形時，該蛋白質之水平低於健康正常人或維持輕症狀態之患者之感染判明時之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性高，或者，不低於(高於或等同於)健康正常人或維持輕症狀態之患者之感染判明時之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性低。於測定之蛋白質為CD147、CAPN2、ECM1、及FGG之任一者之情形時，該蛋白質之水平高於健康正常人或維持輕症狀態之患者之感染判明時之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性高，或者，該蛋白質之水平不高於(低於或等同於)健康正常人或維持輕症狀態之患者之感染判明時之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性低。又，於測定之蛋白質為MFAP4之情形時，該蛋白質之水平低於健康正常人之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性低，或者，不低於(高於或等同於)健康正常人之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性高。
為了判定重症化之可能性而測定之標記蛋白質可採用：選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之一種或其以上，較佳可採用選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之一種或其以上。例如，待測定之RNA可採用2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、或者5種或其以上。
於將兩種以上組合加以利用之情形時，較佳為利用以下(a)或(b)之組合：
(a)選自PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS之兩種以上之組合
(b)選自ECM1、CAPN2、FGG、及CD147之兩種以上之組合。
本說明書中，「對照蛋白質水平」意指比較對象中之標記蛋白質水平。此處，「比較對象」意指健康正常人或未曾重症化(維持輕症或無症狀)之COVID-19患者之感染判明時(感染初期)或入院時之血中胞外體之標記蛋白質水平。「對照蛋白質水平」可藉由在測定來自受檢患者之血液的胞外體中之標記蛋白質水平時，同時地測定來自健康正常人之血液的胞外體樣本或來自未重症化(維持輕症或無症狀)之COVID-19患者之感染判明當初或入院時之血液的胞外體樣本而獲得。或者，亦可預先獲取已對此種陰性比較對象測定之標記蛋白質水平相關之資訊，將該水平或考慮該水平而設定之值用作對照蛋白質水平。此種值可為根據已實施之試驗之結果進行ROC解析而設定之臨界值。或者，可預先調整含有如此預先設定之水平之標記蛋白質的樣本作為對照樣本，在測定來自受檢患者之血液的胞外體中之標記蛋白質水平時同時進行測定，藉此獲得對照蛋白質水平。
於本發明之方法包括測定標記蛋白質之方法之情形時，本發明之方法可根據需要，包括從來自受驗患者之血液樣本製備胞外體之步驟。胞外體之製備可利用自受驗者採集之血液，使用任意之公知之方法進行。例如，自血清等樣本回收胞外體可例舉：超離心分離法(例如，Thery C., Curr. Protoc. Cell Biol. (2006) Chapter 3: Unit 3.22.)、聚合物沈澱法、免疫沈澱法、FACS法、超濾法、凝膠過濾法、HPLC法、及利用抗體或凝集素吸附於珠粒等載體之方法。又，亦可使用市售之胞外體單離用套組，回收胞外體。
於採用使用抗體之方法之情形時，可利用胞外體表面之CD9與CD63，使用結合有抗CD9抗體及抗CD63抗體之載體進行單離。胞外體之製備步驟例如可包括：將來自受檢患者之血液樣本與結合有抗CD9抗體及抗CD63抗體之載體進行混合；及回收結合有胞外體之載體。又，於該步驟中，可包括洗淨結合有胞外體之載體之步驟或使胞外體自載體解離之步驟等。
上述回收方法之中，超離心分離法係最通常地用於胞外體之單離的標準之方法。超離心分離法中之離心力例如可為50,000×g以上、100,000×g以上、或者150,000×g以上，且可為300,000×g以下、250,000×g以下、或者200,000×g以下。離心時間無限定，例如可設為30分鐘～120分鐘、60分鐘～90分鐘、或者70分鐘～80分鐘。又，離心分離前可根據需要，藉由進行過濾器過濾及/或更低離心力下之離心分離而去除或減少夾雜物。
可依據公知之方法確認胞外體已被回收或者確認胞外體之物性，例如可藉由電子顯微鏡在視覺上進行確認，或者可使用NTA(Nano Tracking Analysis，奈米示蹤分析)技術測量胞外體之粒徑及粒子數。或者，亦能夠藉由確認可成為胞外體之標記的蛋白質及/或基因之表現而確認胞外體之存在。
蛋白質水平之測定可直接使用製備之胞外體、或者利用SDS或RIPA緩衝液/RIPA裂解緩衝液等界面活性劑破壞膜後進行。使用SDS之情形時，蛋白質會變形，但於使用RIPA緩衝液/RIPA裂解緩衝液之情形時，可製備成未變性之蛋白質樣本。或者，可自製備之胞外體進一步提取蛋白質進行測定。因此，本發明之方法可任意地包括自製備之胞外體提取純化蛋白質。提取蛋白質之情形時，可使用市售之胞外體蛋白質提取套組(COSMO BIO股份有限公司)、ExoMS表面蛋白提取套組(Surface Protein Capture Kit)(System Biosciences)等進行。
蛋白質水平之測定只要為能夠測定蛋白質量之方法，則無特別限制，一般為利用與標記蛋白質特異性結合之物質之方法。作為「與標記蛋白質特異性結合之物質」，可例舉：抗體或其抗原結合性片段、適體、配體/受體或其結合性片段、或者該等與其他物質之融合物。「抗原結合性片段」意指包含抗體之一部分(部分片段)且保持抗體對抗原之作用(免疫反應性/結合性)之蛋白質或肽。作為此種免疫反應性片段，例如可例舉：F(ab')
2、Fab'、Fab、Fab
3、單鏈Fv(以下，稱為「scFv」)、(串聯)雙特異性單鏈Fv(sc(Fv)
2)、單鏈三抗體、奈米抗體、雙價VHH、五價VHH、迷你抗體、(雙鏈)雙功能抗體、串聯雙功能抗體、雙特異性三抗體、雙特異性雙抗體、雙親和性重靶向分子(DART)、三抗體(或三體)、四抗體(或[sc(Fv)
2]
2)、或者(scFv-SA)
4)雙硫鍵Fv(以下，稱為「dsFv」)、緊湊型IgG、重鏈抗體、或者該等之聚合物(參照Nature Biotechnology, 29(1): 5-6 (2011)；Maneesh Jain et al., TRENDS in Biotechnology, 25 (7) (2007): 307-316；及Christoph stein等人，Antibodies(1): 88-123(2012))。本說明書中，抗體及免疫反應性片段可為單特異性、雙特異性(雙重特異性)、三特異性(三重特異性)、及多特異性(多重特異性)之任一者。
典型而言，蛋白質水平之測定係藉由確定與標記蛋白質特異性結合之物質上結合的標記蛋白質之結合水平而進行。測定之「結合水平」可設為該等物質之結合量、結合數、或結合比率、或者表示該等之數值(例如，測定之螢光強度等測定值本身)。於該情形時，可使用作為與標記蛋白質特異性結合之物質而標記化之物質，或者使標記蛋白質標記化而使用。又，通常，同時測定標準樣本，將基於該標準樣本製成標準曲線或校準曲線算出之值、或者以標準樣本水平為指標進行標準化所得之數值確定為結合水平。
因此，例如，本發明之方法可具備以下：
(a)使至少1個與標記蛋白質結合之物質接觸來自患者之血液的胞外體中之蛋白質；
(b)確定上述與標記蛋白質結合之物質上結合的上述胞外體中之標記蛋白質之結合水平；及
(c)根據測定之結合水平，確定該胞外體中之標記蛋白質水平。
於使用抗體或其抗原結合性片段作為與標記蛋白質結合之物質之情形時，結合之測定可基於公知之檢測及/或測定方法。例如，可藉由酵素免疫測定法(EIA法)、簡易EIA法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA法)、放射免疫分析法(RIA法用)、螢光免疫測定法(FIA法)等標記化免疫測定法；西方墨點法等免疫墨點法；金膠體凝集法等免疫層析法；離子交換層析法、親和層析法等層析法；比濁法(TIA法)；散射比濁法(NIA法)；比色法；乳膠凝集法(LIA法)；粒子計數法(CIA法)；化學發光測定法(CLIA法、CLEIA法)；沈澱反應法；表面電漿子共振法(SPR法)；共振鏡偵測器法(RMD法)；比較干涉法等測定結合。
具體而言，使受驗試樣(樣本)接觸固定於固相之本發明之抗體或其抗原結合性片段，洗淨後，添加能夠與標記蛋白質結合之標記化抗體後，藉由洗淨去除未結合抗體，並檢測該抗體之標記或測定標記量(例如，標記之強度)，藉此，可確定標記蛋白質之水平。又，於藉由免疫層析進行之情形時，使樣本接觸未固定之能夠與第一標記蛋白質結合之標記化抗體後，使該混合物接觸在特定部位固定有能夠與第二標記蛋白質結合之抗體或其抗原結合性片段的載體，檢測該部位上之上述標記化抗體或測定標記量(例如，標記之強度)，藉此，可確定標記蛋白質之水平。
作為標記化之方法，例如可例舉：放射性同位素(RI)標記、螢光標記、及酵素標記。作為進行RI標記之情形時之放射性同位素，可例舉：32P、131I、35S、45Ca、3H、14C。又，作為進行螢光標記之情形時之螢光色素，可例舉：DAPI、SYTOX(註冊商標)綠、SYTO(註冊商標)9、TO-PRO(註冊商標)-3、碘化丙啶、Alexa Fluor(註冊商標)350、Alexa Fluor(註冊商標)647、Oregon Green(註冊商標)、Alexa Fluor(註冊商標)405、Alexa Fluor(註冊商標)680、螢光素(FITC)、Alexa Fluor(註冊商標)488、Alexa Fluor(註冊商標)750、Cy(註冊商標)3、Alexa Fluor(註冊商標)532、Pacific Blue(商標)、Pacific Orange(商標)、Alexa Fluor(註冊商標)546、香豆素、四甲基玫瑰紅(TRITC)、Alexa Fluor(註冊商標)555、BODIPY(註冊商標)FL、Texas Red(註冊商標)、Alexa Fluor(註冊商標)568、Pacific Green(商標)、Cy(註冊商標)5、及Alexa Fluor(註冊商標)594。作為酵素標記，可利用生物素(生物素-16-dUTP、生物素-11-dUTP等)、地高辛(DIG：類固醇系天然物)(去氧尿苷5'-三磷酸)、鹼性磷酸酶等。
又，本發明之確定標記蛋白質水平之步驟可利用以下記載之具有與標記蛋白質結合之物質的組合物或裝置。
本說明書中，與蛋白質「特異性結合」意指相較於該物質對具有其他胺基酸序列之蛋白質之親和性，以實質上較高之親和性結合於具有標記蛋白質序列之核酸。此處，「實質上較高之親和性」意指能夠與具有其他胺基酸序列之蛋白質區分地檢測出標記蛋白質之程度的親和性。其他胺基酸序列較佳為與標記蛋白質序列以能區分之程度不同，可為具有50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下之同一性之胺基酸序列。例如，實質上較高之親和性可為與與標記蛋白質之結合量係其他胺基酸序列之結合量之3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上。
本發明之重症化可能性可除了利用上述標記蛋白質以外，亦利用來自該患者之血液中之標記RNA之水平進行判定。因此，上述方法可進而包括測定來自該患者之血液樣本中之一種以上之標記RNA之水平，重症化之可能性係將上述標記蛋白質水平與該標記RNA水平加以組合而判定。具體而言，包括：於測定之標記RNA之水平高於對照之該標記RNA水平時，判定上述患者重症化之可能性高。上述標記RNA係選自由以下之RNA所組成之群：miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、let-7c-5p、miR-21-5p、miR-140-3p、及C5orf66-AS2。
本發明之方法可任意包括自COVID-19患者之血液提取RNA。RNA可使用市售之RNA提取套組(例如，miRNeasy迷你套組、或者QIAzol及miRNeasy迷你套組(均為Qiagen，Hilden，德國))，依據製造者之操作說明進行提取。
為了判定重症化之可能性而測定之標記RNA可採用選自miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、let-7c-5p、miR-21-5p、miR-140-3p、及C5orf66-AS2之一種或其以上，較佳為可採用選自miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、及AL365184.1之一種或其以上。例如，待測定之RNA可設為2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、或者5種或其以上。
於將兩種以上組合利用之情形時，較佳可利用以下之(a)或(b)之組合：
(a)CDKN2B-AS1與AL365184.1之組合
(b)選自miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、及RNU2-29P之兩種以上之組合。
根據本發明者等人之發現，於COVID-19患者之血中之該等RNA水平高於未感染之健康正常人或者高於感染判明後之過程中維持輕症狀態之COVID-19患者之感染判明時之情形時，容易重症化。因此，本發明之重症化可能性之判定可藉由將作為COVID-19患者之受驗者之血液樣本中之標記RNA水平與對照之RNA水平進行比較而進行。來自受驗者之血液樣本中之標記RNA水平高於對照之標記RNA水平之情形時，判定重症化之可能性高。又，來自受驗者之樣本中之標記RNA水平不高於(即，等同於或低於)對照之標記RNA水平之情形時，可判定重症化之可能性低或者維持輕症狀態之可能性高。
本說明書中，「對照之標記RNA水平」意指陰性比較對象中之標記RNA水平。此處，「陰性比較對象」意指健康正常人或未曾重症化(維持輕症或無症狀)之COVID-19患者之感染判明時(感染初期)或入院時之血液樣本中之標記RNA水平。「對照之標記RNA水平」可藉由在測定受檢患者之血液樣本中之標記RNA水平時，對健康正常人之血液樣本或未曾重症化(維持輕症或無症狀)之COVID-19患者之感染判明當初或入院時之血液樣本作為對照同時進行測定而獲得。或者，亦可預先獲取已對此種陰性比較對象測定之標記RNA水平之相關資訊，將該水平或考慮該水平而設定之值用作對照之標記RNA水平。例如，此種值可為根據已實施之試驗之結果進行ROC解析而設定之臨界值。或者，可預先調整含有如此預先設定之水平之標記RNA的樣本作為對照樣本，於測定受檢患者之血液樣本中之標記RNA水平時同時進行測定，藉此獲得對照之標記RNA水平。
RNA水平之測定只要為能夠測定RNA量之方法即可，無特別限制，一般可藉由利用與標記RNA特異性結合之物質之方法進行。於一例中，「與標記RNA特異性結合之物質」可為核酸分子，較佳為具有與標記RNA互補之序列之核酸分子。具有與標記RNA互補之序列之核酸分子可與標記RNA藉由雜交而特異性結合。本說明書中之「核酸」包括DNA、RNA、或者人工地創製之核酸(PNA或鎖核酸(2',4'-BNA)等橋接型核酸)、或者該等之組合。與標記RNA特異性結合之核酸分子可於至少一部分包括人工設計之序列(例如，用以標記化或標籤化之序列等)。
「探針」典型而言係具有與標記RNA序列互補之序列，用於測定與標記RNA序列之結合的核酸分子。探針通常係能夠與標記RNA特異性結合之10～30 mer、10～20 mer等之核酸分子。作為測定標記RNA與探針之結合水平之方法，可例舉：南方雜交、北方雜交、斑點雜交、螢光原位(in situ)雜交(FISH)、微陣列、ASO法等，具體而言，可使用利用GeneChip
TMmiRNA陣列條帶(Thermo Fisher Scientific股份有限公司)或Agilent miRNA微陣列(Agilent Technologies公司)之方法。
RNA水平之測定可藉由測定已結合於標記RNA之與標記RNA特異性結合的物質之結合水平而進行。「結合水平」可設為結合量、結合數、或者結合比率、或者表示該等之數值(例如，測定之螢光強度等測定值本身)。於該情形時，可使用作為與標記RNA特異性結合之物質而標記化之物質，或者將標記RNA標記化而使用。又，一般同時測定標準樣本，基於該標準樣本製作標準曲線或校準曲線，將根據測定樣本之測定值算出之值或者以標準樣本水平為指標而標準化之數值確定為結合水平。
作為標記化之方法，例如可例舉：放射性同位素(RI)標記、螢光標記、及酵素標記。作為進行RI標記之情形時之放射性同位素，可例舉：32P、131I、35S、45Ca、3H、14C。又，作為進行螢光標記之情形時之螢光色素，可例舉：DAPI、SYTOX(註冊商標)綠、SYTO(註冊商標)9、TO-PRO(註冊商標)-3、碘化丙啶、Alexa Fluor(註冊商標)350、Alexa Fluor(註冊商標)647、Oregon Green(註冊商標)、Alexa Fluor(註冊商標)405、Alexa Fluor(註冊商標)680、螢光素(FITC)、Alexa Fluor(註冊商標)488、Alexa Fluor(註冊商標)750、Cy(註冊商標)3、Alexa Fluor(註冊商標)532、Pacific Blue(商標)、Pacific Orange(商標)、Alexa Fluor(註冊商標)546、香豆素、四甲基玫瑰紅(TRITC)、Alexa Fluor(註冊商標)555、BODIPY(註冊商標)FL、Texas Red(註冊商標)、Alexa Fluor(註冊商標)568、Pacific Green(商標)、Cy(註冊商標)5、及Alexa Fluor(註冊商標)594。作為酵素標記，可利用：生物素(生物素-16-dUTP、生物素-11-dUTP等)、地高辛(DIG：類固醇系天然物)(去氧尿苷5'-三磷酸)、鹼性磷酸酶等。
例如，本發明之方法可具備以下之(a)～(c)：
(a)使至少1個與標記RNA之鹼基序列或其一部分結合之核酸分子(探針)接觸患者之血液樣本；
(b)測定與上述探針結合之上述血液樣本中之標記RNA之結合水平；及
(c)根據測定之結合水平確定該血液樣本中之標記RNA水平。
於上述方法中，可代替至少1個與標記RNA之鹼基序列或其一部分結合之核酸分子(探針)，利用本說明書所記載之包含該核酸分子之組合物、套組、或裝置。
或者，RNA水平可使用利用PCR之方法進行測定，例如，可藉由使用與標記RNA特異性結合之核酸(引子)進行qPCR、ARMS(Amplification Refractory Mutation System，擴增阻礙突變系統)、RT-PCR(Reverse transcriptase-PCR，逆轉錄PCR)、或者巢式PCR(Nested PCR)而進行測定。或者，可利用侵入(註冊商標)法。例如，可利用使用適宜之引子與GenoExplorerTM miRNA qRT-PCR 套組(GenoSensor Corporation)之方法。「引子」係通常用於核酸擴增之10～30 mer(較佳為17～25 mer、15～20 mer等)之核酸分子，於其至少一部分具有與(較佳為7 mer以上、8 mer以上、9 mer以上、10 mer以上之)標記RNA之末端序列互補之序列。
因此，RNA水平可藉由以下之步驟進行測定：
(a)以患者之血液樣本為模板，使用能夠與標記RNA特異性結合之核酸分子(引子)，使該患者之血液樣本中之標記RNA之全部或者一部分擴增；
(b)測定經擴增之核酸分子之水平；及
(c)根據經擴增之核酸分子之水平確定該血液樣本中之標記RNA水平。
患者之血液樣本中之標記RNA之全部或一部分之擴增可藉由以該血液樣本為模板進行PCR反應等而實施。經擴增之核酸之水平可藉由點狀墨點雜交法、表面電漿子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(sequence specific Oligonucleotide，序列特異性寡核苷酸雜交)法、PCR-SSP法、AMPFLP(Amplifiable fragment length polymorphism，限制性片段長度多型)法、MVR-PCR法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism，單鏈構象多型)法進行測定。
本說明書中，與RNA「特異性結合」意指相較於該物質對具有其他鹼基序列之核酸之親和性，以實質上較高之親和性結合於具有標記RNA序列之核酸。此處，「實質上較高之親和性」意指能夠與具有其他鹼基序列之核酸區分地檢測出具有標記RNA序列之核酸之程度的親和性。其他鹼基序列較佳為與標記RNA序列以能區分之程度不同，可為具有50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下之同一性之鹼基序列。例如，實質上較高之親和性可為與標記RNA之結合量係與其他鹼基序列之結合量之3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上。
本發明之方法可進而除了上述之標記蛋白質、標記RNA以外，利用年齡、吸菸指數、血中CRP值、及血中ALT值進行。即，可將年齡、吸菸指數、血中CRP值、及/或血中ALT值與上述標記蛋白質水平加以組合而判定重症化之可能性，或者，可將年齡、吸菸指數、血中CRP值、及血中ALT值與上述標記蛋白質水平以及上述標記RNA水平加以組合而判定重症化之可能性。此處，於年齡、吸菸指數、CRP、及ALT之數值均高於健康正常人或者維持輕症之對照之情形時，判定重症化可能性高，或者，數值不高於(低於或等同於)健康正常人或作為輕症者之對照之情形時，判定重症化可能性低。吸菸指數、CRP、及ALT可藉由常法進行判定或測定。
因此，本發明之重症化預測可包括藉由選自以下(a)～(d)之組合而判定重症化：
(a)選自由PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS所組成之群中之兩種以上之因子
(b)選自由吸菸指數、年齡、及MFAP4所組成之群中之兩種以上之因子
(c)選自由CDKN2B-AS1、AL365184.1、ECM1、CAPN2、CRP、FGG、及CD147所組成之群中之兩種以上之因子
(d)選自由ALT、RNU2-29P、SNORD33、miR-122-5p、及AL732437.2所組成之群中之兩種以上之因子。
可藉由統計學分析確定來自受驗者之樣本中之標記水平是否高於或低於比較對象之對照水平。統計學有意性可藉由T-test(T檢定)、F檢定、卡方檢定等統計學方法進行判斷，例如，可藉由比較2個以上之樣本，確定信賴區間及/或p值而確定(Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons, NewYord, 1983)。本發明之信賴區間例如可為90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%或者99.99%。p值例如可為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0002或者0.0001。
本說明書全文中，「水平」意指與數值化之存在量相關之指標，例如包括濃度、量或者可用作其替代之指標(較佳為數值指標)。因此，水平可為螢光強度等之測定值其本身，亦可為換算成濃度之值。又，水平可為絕對之數值(存在量、每單位面積之存在量等)，或者可為與根據需要設定之比較對照相比的相對數值。
本說明書中，判定重症化之可能性之方法可用作：確定或評價重症化之可能性之方法，預測會重症化或不會重症化之方法，確定、判定、或評價不會重症化之可能性之方法，或者提供用以進行該等之資訊之方法。
本說明書之「可能性判定方法」除了如此解釋會矛盾之情形以外，包括監控重症化可能性之變化之方法。因此，本說明書中，「判定可能性」之語句除了尤其是如此解釋會矛盾之情形以外，可解釋為監控重症化可能性之變化。又，進行監控之方法中之可能性判定可連續或斷續地進行。
又，本發明之可能性判定方法可於體內(in vivo)、體外(ex vivo)、或者試管內(in vitro)之任一者進行，較佳為於體內或試管內進行。
可能性判定意指藉此預測患者之狀態之經過或結果，並不意指能以100%之正確性判斷狀態之經過或結果。重症化可能性高意指產生重症化之可能性增大，並不意指以不產生重症化之情形為基準而容易產生。即，可能性之判定結果意指標記RNA上升之患者與不顯示此種特徵之患者相比，更容易產生重症化。
本發明之重症化可能性判定方法可進而包括：對判定重症化之可能性高之COVID-19患者實施重症化預防處理。作為此種重症化預防處理，可例舉：投予疫苗、治療藥、或預防藥，藉由人工呼吸器、ECMO、或IMPELLA等進行治療或處理，及提高患者之症狀監控之頻度(例如，1天1次或其以上、1天2次或其以上、1天3次或其以上等)等。
2.COVID-19重症化標記
於另一形態中，本發明係關於一種COVID-19重症化標記，其係選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種蛋白質。該等之中，較佳為選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、及UBA7之至少一種蛋白質，更佳為選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之至少一種蛋白質。
本說明書中，「標記」意指其於受驗者中之表現或存在水平提示已產生之特定之疾病、狀態或症狀，或者提示將來導致特定之疾病、狀態或症狀之風險之生物體內分子。換言之，標記係用以判斷或預測目前或將來之特定之疾病、狀態或症狀之指標、或作為指標而測定之分子。具體而言，本發明中之標記於為COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、及MFAP4之情形時，係藉由存在水平較低而表示COVID-19重症化之風險較高之分子，本發明中之標記於為CD147、CAPN2、ECM1、及FGG之任一者之情形時，係藉由存在水平較高而表示COVID-19重症化之風險較高之分子。
3.COVID-19重症化預測用組合物或套組
於另一形態中，本發明係關於一種COVID-19重症化預測用組合物，其包含能夠與選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種蛋白質結合之物質。或者，本發明可為一種COVID-19重症化預測用套組，其包含能夠與選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種蛋白質結合之物質。
能夠與標記蛋白質結合之物質可使用上述之「1.重症化可能性之判定方法」中作為「能夠與標記蛋白質結合之物質」所記載之物質。例如，套組可設為包含固定有能夠與標記蛋白質結合之抗體或其結合性片段之固相或半抗原、及能夠與標記化之標記蛋白質結合之抗體或其結合性片段的免疫化學測定套組。或者，本發明之套組可設為包含能夠與標記蛋白質結合之抗體或其結合性片段、及能夠與抗體或其結合性片段結合之物質(例如，抗體或其結合性片段)的免疫化學測定套組。
COVID-19重症化預測用組合物或套組可根據需要包含用以穩定地保存能夠與標記蛋白質結合之物質的緩衝液等。又，本發明之重症化預測用組合物或套組可基於上述公知之檢測及/或測定方法。
COVID-19重症化預測用組合物或套組可為用以確定標記蛋白質與特異性結合於標記蛋白質之物質之結合水平者。於該情形時，該組合物或套組可與用以藉由螢光等檢測與標記蛋白質之結合的系統一起使用。
上述組合物或套組可進而包含1種或其以上、2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、5種或其以上之能夠測定上述標記RNA之物質。
例如，上述組合物或套組可包含以下之組合：
(a)選自能夠測定PRKCB之物質、能夠測定RHOC之物質、能夠測定COPB2之物質、及能夠測定KRAS之物質之兩種以上之組合
(b)選自能夠測定ECM1之物質、能夠測定CAPN2之物質、能夠測定FGG之物質、及能夠測定CD147之物質之兩種以上之組合。
本發明之套組可根據需要包含顯色試劑、反應停止用試劑、標準抗原試劑、檢體預處理用試劑、阻斷試劑等。又，於本發明之套組包含標記化之物質之情形時，可進而包含與該標記反應之受質。進而，本發明之套組可包含紙箱或塑膠盒等儲存套組之構成物之包裝及操作說明書等。套組亦可將所含之不同之構成成分包裝於不同之容器中，可包含於一個套組中，或者，亦可僅於套組中包含能夠與標記蛋白質結合之物質，將其他構成成分與套組分開提供。
4.COVID-19重症化預測用裝置
本說明書中之裝置可包含結合有1種或其以上、2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、或者5種能夠與標記蛋白質結合之物質的陣列、珠粒、晶片、免疫層析板或管柱等。該裝置可為用以藉由測定上述標記蛋白質與特異性結合於標記蛋白質之物質之結合水平而進行者。
本說明書中之裝置可進而為結合有1種或其以上、2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、或者5種能夠與標記RNA結合之物質(探針)的微陣列、珠粒、或者管柱等。該裝置可為用以藉由測定上述標記RNA與特異性結合於標記RNA之物質(探針)之結合水平而進行者。
「微陣列」係指一次定量1個以上之標記之方法中使用之裝置。微陣列可結合有與單一之標記結合之複數種探針或者抗體或其抗原結合性片段。DNA微陣列例如可結合有與標記RNA互補之全長cDNA或者會與標記RNA之一部分雜交的cDNA片段作為探針。
5.標記蛋白質之測定方法
於另一形態中，本發明係關於一種確定來自患者之血液來源的胞外體中所含之蛋白質之水平之方法，該蛋白質選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種，該方法包括：
使來自該患者之血液來源的胞外體中所含之蛋白質接觸上述組合物或上述裝置。
更具體而言，本發明可為一種測定來自患者之血液來源的胞外體中所含之一種以上之標記蛋白質之水平的方法，包括：
使來自該患者之血液來源的胞外體所含之蛋白質接觸上述組合物或上述裝置；
測定上述組合物或上述裝置中之能夠與上述標記蛋白質結合之物質上結合的上述胞外體中之標記蛋白質之結合水平；及
根據測定之結合水平，確定該胞外體中之標記蛋白質水平。
於另一形態中，本發明係關於一種測定來自患者之血液來源的胞外體中所含之一種以上之標記蛋白質之水平、以及來自患者之血液中所含之一種以上之標記RNA之水平的方法，包括：
使來自該患者之血液來源的胞外體中所含之蛋白質接觸上述組合物或上述裝置；以及
使來自該患者之血液中之RNA接觸上述組合物或上述裝置。
更具體而言，本發明可為一種測定來自患者之血液來源的胞外體中所含之一種以上之標記蛋白質之水平、以及來自患者之血液中所含之一種以上之標記RNA之水平的方法，包括：
使來自該患者之血液來源的胞外體中所含之蛋白質接觸具有能夠與標記蛋白質結合之物質的上述組合物或上述裝置；
測定上述組合物或上述裝置中之能夠與上述標記蛋白質結合之物質上結合的上述胞外體中之標記蛋白質之結合水平；及
根據測定之結合水平，確定該胞外體中之標記蛋白質水平；以及
使來自該患者之血液樣本中所含之RNA接觸具有能夠與標記RNA結合之探針的上述組合物或上述裝置；
測定上述組合物或上述裝置中之上述探針上結合的血液中之標記RNA之結合水平；及
根據測定之結合水平，確定該血液中之標記RNA水平。
本說明書全文中，被測定之標記RNA或標記蛋白質、或者組合物或裝置中所含之標記RNA或標記蛋白質可為1種或其以上、2種或其以上、3種或其以上、4種或其以上、或者5種或其以上。於測定2種以上之情形時，重症化可能性可藉由將測定之所有結果加以綜合考慮而判定。例如，於測定之所有標記均顯示重症化可能性高之判定結果之情形時，可判定重症化可能性高於測定之一部分標記顯示重症化可能性高之判定結果之情形。或者，可對各標記進行加權，重視重要度更高之標記RNA之結果判定重症化可能性。例如，在本案實施例之結果中，可將感度及特異度較高之蛋白質(例如，COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147)、P值較低之蛋白質(RHOC、ECM1、FGG、MFAP4)等在判別(descrimination)已重症化之患者方面顯示更有益的蛋白質之重要度設置得較高。
本說明書全文中，本發明之方法使用之或者本發明之組合物、套組及裝置中所含之能夠與標記RNA結合之物質或者能夠與標記蛋白質結合之物質可針對一種標記RNA或者一種標記蛋白質為兩種以上。因此，例如，於本發明之方法中，可使用能夠與同一標記RNA結合之不同之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之探針、或能夠與同一標記RNA結合之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之引子。又，於本發明之方法中，可使用能夠與同一標記蛋白質結合之不同之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之抗體或其抗原結合性片段。又，本發明之組合物、套組及裝置可包含能夠與同一標記RNA結合之不同之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之探針、或能夠與同一標記RNA結合之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之引子。進而，本發明之組合物、套組及裝置可包含能夠與同一標記蛋白質結合之不同之2種或其以上(3種或其以上、4種或其以上等)之抗體或其抗原結合性片段。
再者，本案發明可為以下之發明。
(1)一種冠狀病毒檢查方法，其特徵在於：其係用於預測冠狀病毒感染症(COVID-19)之症狀是否有重症化之可能性的檢查方法，包括：
自受檢者採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之步驟；
自採集之體液回收胞外體之步驟；
自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
解析自胞外體提取之蛋白質，獲取其蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)之步驟；及
基於獲取之上述蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)，預測上述受檢者是否有重症化之可能性之步驟。
(2)如(1)所記載之冠狀病毒檢查方法，其特徵在於：將上述來自胞外體之蛋白質之中，預定之特定種類之蛋白質之任1種或2種以上之組合用作用以預測上述受檢者是否有重症化之可能性之重症化預測標記(生物標記)。
(3)如(1)所記載之冠狀病毒檢查方法，其特徵在於：於預測重症化可能性之步驟中，
預定之特定種類之蛋白質之表現量超過預定之基準值之情形時，預測上述受檢者有重症化之可能性。
(4)如(1)所記載之冠狀病毒檢查方法，其特徵在於：上述蛋白質包含
胞外體之膜上蛋白質、
胞外體所內包之蛋白質
之一者或兩者。
(5)如(1)所記載之冠狀病毒檢查方法，其特徵在於：上述受檢者係
已感染了冠狀病毒(SARS-CoV-2)者、
懷疑感染了冠狀病毒(SARS-CoV-2)者、或者
不知是否感染了冠狀病毒(SARS-CoV-2)者。
(6)一種冠狀病毒檢查系統，其特徵在於：其係用於實施如(1)至(5)中任一項所記載之冠狀病毒檢查方法之系統，具有：
用以自受檢者採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之採液機構；
用以保存作為檢體所採集之血液、鼻水、唾液等體液之保存機構；
用以自採集並保存之體液回收胞外體之胞外體回收機構；
用以自回收之胞外體提取蛋白質之蛋白質提取機構；
用以解析從來自上述胞外體之蛋白質獲得之蛋白質而獲取其蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)的蛋白質解析機構；及
用以基於獲取之上述蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)，預測上述受檢者是否有重症化之可能性的重症化預測機構。
(7)一種冠狀病毒檢查方法，其特徵在於利用：病毒檢查對象者/病毒感染者/患者/醫院/行政等使用者使用之具備通信功能的使用者系統；及
負責病毒檢查之檢查中心使用之具備通信功能的解析判定系統；
使用者系統具有：
用以自受檢者採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之採液機構；
用以保存作為檢體所採集之血液、鼻水、唾液等體液之保存機構；
用以自採集並保存之體液回收胞外體之回收機構；
自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
用以解析回收之胞外體中所含之蛋白質而獲得其蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)的蛋白質解析機構；及
用以經由網際網路而與解析判定系統通信之通信機構；
解析判定系統具有：
用以基於自使用者系統發送之蛋白質資訊，預測上述受檢者是否有重症化之可能性的重症化預測機構；及
用以經由網際網路而與使用者系統通信之通信機構；
上述冠狀病毒檢查方法包括：
(a)使用者系統從自上述受檢者採集之體液回收胞外體之步驟；
(b)使用者系統自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
(d)使用者系統解析自胞外體提取之蛋白質而獲取其蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)的步驟；
(f)使用者系統向解析判定系統經由網際網路發送獲取之上述蛋白質資訊之步驟；
(g)解析判定系統基於自使用者系統接收之蛋白質資訊(有關蛋白質之種類與表現量之資訊)，預測上述受檢者是否有重症化之可能性的步驟；及
(k)解析判定系統向使用者系統經由網際網路發送有關上述步驟(g)之預測結果之資訊的步驟。
(8)一種病毒檢查方法，其特徵在於包括：採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之步驟；
自採集之體液回收胞外體之步驟；
自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
解析自胞外體提取之蛋白質而獲得蛋白質資訊之步驟；
基於自胞外體獲得之蛋白質資訊，解析冠狀病毒(SARS-CoV-2)之型式的步驟；
基於解析出之冠狀病毒之型式，判定有無冠狀病毒感染之步驟；及
於判定感染了冠狀病毒之情形時，以複數個級別判定冠狀病毒感染症(COVID-19)之重症度之步驟。
(9)一種病毒檢查系統，其特徵在於：其係用於實施如(8)所記載之病毒檢查方法之系統，具有：
用以採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之採液機構；
用以保存作為檢體所採集之血液、鼻水、唾液等體液之保存機構；
用以自採集並保存之體液回收胞外體之胞外體回收機構；
用以自回收之胞外體提取蛋白質之蛋白質提取機構；
用以解析回收之胞外體中所含之蛋白質而獲得蛋白質資訊之蛋白質解析機構；
用以基於自胞外體獲得之蛋白質資訊，解析冠狀病毒(SARS-CoV-2)之型式的病毒解析機構；
用以基於解析之冠狀病毒之型式，判定有無感染冠狀病毒之第1判定機構；及
用以於判定感染了冠狀病毒之情形時，以複數個級別判定冠狀病毒感染症(COVID-19)之重症度的第2判定機構。
(10)一種病毒檢查方法，其特徵在於利用：病毒檢查對象者/病毒感染者/患者/醫院/行政等使用者使用之具備通信功能的使用者系統；及
負責病毒檢查之檢查中心使用之具備通信功能之解析判定系統；
使用者系統具有：
用以採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體之採液機構；
用以保存作為檢體所採集之血液、鼻水、唾液等體液之保存機構；
用以自採集並保存之體液回收胞外體之回收機構；
自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
用以解析回收之胞外體中所含之蛋白質而獲得蛋白質資訊之蛋白質解析機構；及
用以經由網際網路而與解析判定系統通信之通信機構；
解析判定系統具有：
用以基於自使用者系統發送之蛋白質資訊，解析冠狀病毒(SARS-CoV-2)之型式的病毒解析機構；
用以基於解析之冠狀病毒之型式，判定有無感染冠狀病毒的第1判定機構；
用以於判定感染了冠狀病毒之情形時，以複數個級別判定冠狀病毒感染症(COVID-19)之重症度的第2判定機構；及
用以經由網際網路而與使用者系統通信之通信機構；
上述病毒檢查方法包括：
(a)使用者系統從自病毒檢查對象者/病毒感染者/患者採集之體液回收胞外體之步驟；
(b)使用者系統自回收之胞外體提取蛋白質之步驟；
(d)使用者系統解析自胞外體提取之蛋白質而獲得蛋白質資訊之步驟；
(f)使用者系統向解析判定系統經由網際網路發送自胞外體獲得之蛋白質資訊之步驟；
(g)解析判定系統基於自使用者系統接收之蛋白質資訊，解析冠狀病毒(SARS-CoV-2)之型式的步驟；
(h)解析判定系統基於解析之冠狀病毒之型式，判定有無感染冠狀病毒之步驟；
(i)於判定感染了冠狀病毒之情形時，以複數個級別判定冠狀病毒感染症(COVID-19)之重症度之步驟；
(j)解析判定系統向使用者系統經由網際網路發送有關上述步驟(h)之判定結果之資訊的步驟；及
(k)解析判定系統向使用者系統經由網際網路發送有關上述步驟(i)之判定結果之資訊的步驟。
(11)一種冠狀病毒之檢查法，其採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體並保存，自該體液提取胞外體所具有之蛋白質，且基於該蛋白質資訊，瞬時地解析冠狀病毒(SARS-CoV-2)之型式，不僅判定有無感染冠狀病毒，亦判定感染會止於輕症或會重症化。
(12)一種用以實施如(11)所記載之冠狀病毒檢查法之裝置，為了不僅判定有無感染冠狀病毒，亦判定感染為輕症或會重症化，包括：檢查裝置，其包含採集血液、鼻水、唾液等體液作為檢體並保存之採液器、及自該體液提取胞外體所具有之蛋白質之測定器；以及基於該蛋白質資訊，瞬時地判別冠狀病毒之型式之解析器的解析裝置。
(13)如(10)所記載之冠狀病毒檢查法，其特徵在於：其係冠狀病毒之在家檢查法，為了不僅判定有無感染冠狀病毒，亦判定感染為輕症或會重症化，基於由患者/醫院/行政等使用者與檢查中心等檢查所之同意而設定之電腦等通信機構，自使用者將檢體資訊電子化而向檢查所發送，且自檢查所將從檢體資訊瞬時地解析所得之結果資訊電子化而向使用者報告。
第一，新型冠狀病毒檢查及解析相關之裝置包括檢查器具及解析器具。
檢查器具係指採液器與測定器。
前者之採液器係將血液等體液作為檢體進行採集且保存者。其根據檢體之種類而不同。任一容器或試劑均可為市售者。
後者之測定器係自作為檢體所採集之體液提取胞外體所具有之蛋白質者。
解析裝置使用基於檢查之結果資訊，依據深度學習(deep learning)而瞬時地判別新型冠狀病毒之型式的系統。
第二，新型冠狀病毒之檢查法利用採液器採集作為檢體之體液，並且保存體液。自該體液利用測定器提取胞外體所具有之蛋白質。又，基於檢查之結果資訊，利用解析器，依據深度學習瞬時地判別新型冠狀病毒之型式。
第三，新型冠狀病毒之在家檢查法(19)如圖2所記載。使用者(14)與檢查所(13)達成如下同意：使用者(14)委託新型冠狀病毒之檢查並支付費用，對此檢查所(14)承諾接下該檢查並交送檢查裝置(8)。在兩者間利用個人電腦、或者智慧手機/電視等通信機構(15)(16)交換該同意。
使用者(14)基於視頻所示之操作說明，對檢體之體液進行採集(4)，且自該體液利用檢查裝置(7)對蛋白質進行提取(5)，進而進行電子化(數位化)，並將檢查資訊進行發送(17)。對此，檢查所(13)利用解析裝置(9)解析檢查資訊，將該結果資訊電子化並向使用者進行報告(18)。
以下，使用實施例對本發明更詳細地進行說明，但其並不限定本發明之範圍。再者，本案說明書全文中引用之文獻係藉由參照而將其全文組入至本案說明書中。
(實施例1)患者群及影響重症化之臨床參數
登錄42名自2020年3月至5月在慈惠會醫科大學醫院接受診斷之SARS-CoV-2陽性之患者(東京慈惠會醫科大學審查委員會批准(編號：32-055(10130)))。將在鼻咽拭子之PCR檢查中判定為SARS-CoV-2 RNA陽性之患者作為COVID-19(SARS-CoV-2感染)患者。患者之重症度係基於表2所示之WHO 2020評分而確定。登錄31名於登錄時點為輕症狀態(mild status)(WHO評分＝3)之COVID-19患者，排除11名重症患者。COVID-19患者全員接受了基於WHO之COVID-19臨床管理臨時指南的標準治療(不含類固醇)。作為健康正常人，以2019年3月至4月為了進行定期體檢而到訪崎玉市大宮城市診所(Omiya City Clinic)的健康正常提供者之中與COVID-19年齡相符之10名(東京大學醫科學研究所機關審查委員會批准(編號：28-19-0907))為對象。
採集對登錄之時點自受驗者獲得之血液在4℃下以3000 rpm進行10分鐘離心分離所得之上清液作為血清樣本，在-80℃下保存。回溯討論獲得之血清樣本中之各標記與登錄後之臨床經過之相關。經過登錄後起根據疾病之進展程度將31名COVID-19患者分為以下之2群(圖1)，結果組1(輕症者)為22名、組2(重症者)為9名。
組1(輕症者)：維持輕症狀態(WHO評分≦4)之患者
組2(重症者)：進展成重症狀態(WHO評分≧5)之患者
組2之患者之中2名因COVID-19併發症而死亡。將單個患者之背景及樣本採集後之症狀之進展示於表3。又，將臨床參數之統計值示於表4。於健康正常人與COVID-19患者之間，年齡、性別、BMI、吸菸指數、血清尿素氮(BUN)、肌酸酐(Cr)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、高血壓史、糖尿病、異常血脂症、及冠狀動脈性心臟病方面未見不同(P＞0.05)。另一方面，白血球細胞(WBC)數、C反應蛋白(CRP)值確認到有意義之不同(P＜0.05)。又，於組1與組2之COVID-19患者之間，性別、BMI、WBC數、BUN、Cr、肌酸酐激酶(CK)、D-二聚物、纖維蛋白原、高血壓史、糖尿病、異常血脂症、及冠狀動脈性心臟病方面未見不同(P＞0.05)。另一方面，於年齡、吸菸指數、CRP值、及ALT值方面確認到有意義之不同(P＜0.05)。因此，顯示年齡、吸菸指數、CRP值、及ALT值4個參數與重症化相關。
[表2]
| 患者 | 描述詞 | 評分 |
| 未感染 | 無感染之臨床或病毒學證據 | 0 |
| 非臥床 | 無活動限制 | 1 |
| 活動限制 | 2 | |
| 住院輕症 | 無氧氣治療 | 3 |
| 藉由鼻導管或面罩吸氧 | 4 | |
| 住院重症 | 高流量氧氣無創通氣 | 5 |
| 插管及機械通氣 | 6 | |
| 通氣＋額外器官支持(加壓器、RRT、ECMO) | 7 | |
| RRT：腎臟替代治療(renal replacement therapy)，ECMO：體外循環透膜氧合器(extracorporeal membrane oxygenation) |
[表3]
(表中，性別欄之M表示男性，F表示女性)；*「嚴重事件開始前之時間(天)」表示獲得許可進行採樣之日起之天數。
| 患者 | WHO 評分 | WHO分類 | 臨床評估 | 年齡 | 性別 | 嚴重事件開始前之時間(天)* | 住院時長 | 結果 | |
| 健康提供者 | HD-1 | 0 | 未感染 | 健康 | 38 | M | - | - | - |
| HD-2 | 0 | 未感染 | 健康 | 34 | M | - | - | - | |
| HD-3 | 0 | 未感染 | 健康 | 25 | F | - | - | - | |
| HD-4 | 0 | 未感染 | 健康 | 40 | M | - | - | - | |
| HD-5 | 0 | 未感染 | 健康 | 71 | M | - | - | - | |
| HD-6 | 0 | 未感染 | 健康 | 55 | M | - | - | - | |
| HD-7 | 0 | 未感染 | 健康 | 62 | M | - | - | - | |
| HD-8 | 0 | 未感染 | 健康 | 47 | M | - | - | - | |
| HD-9 | 0 | 未感染 | 健康 | 59 | M | - | - | - | |
| HD-10 | 0 | 未感染 | 健康 | 34 | F | - | - | - | |
| 組1 COVID-19 | 1 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 34 | M | - | 15 | 出院 |
| 2 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 31 | M | - | 14 | 出院 | |
| 3 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 48 | M | - | 10 | 出院 | |
| 4 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 43 | M | - | 13 | 出院 | |
| 5 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 52 | M | - | 21 | 出院 | |
| 6 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 54 | M | - | 26 | 出院 | |
| 7 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 87 | M | - | 28 | 出院 | |
| 8 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 55 | F | - | 25 | 出院 | |
| 9 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 25 | F | - | 11 | 出院 | |
| 10 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 27 | F | - | 23 | 出院 | |
| 11 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 42 | F | - | 15 | 出院 | |
| 12 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 45 | M | - | 12 | 出院 | |
| 13 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 70 | M | - | 47 | 出院 | |
| 14 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 44 | M | - | 54 | 出院 | |
| 15 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 44 | M | - | 9 | 出院 | |
| 16 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 56 | M | - | 15 | 出院 | |
| 17 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 31 | F | - | 12 | 出院 | |
| 18 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 54 | M | - | 18 | 出院 | |
| 19 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 41 | F | - | 21 | 出院 | |
| 20 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 35 | M | - | 0 | 出院 | |
| 21 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 36 | F | - | 0 | 出院 | |
| 22 | 3→3 | 輕症→輕症 | 輕症→輕症 | 42 | M | - | 7 | 出院 | |
| 組2 COVID-19 | 23 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 61 | M | 5 | 93 | 出院 |
| 24 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 80 | M | 4 | 23 | 死亡 | |
| 25 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 64 | M | 3 | 138 | 仍然住院 | |
| 26 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 72 | M | 9 | 44 | 出院 | |
| 27 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 73 | M | 7 | 29 | 出院 | |
| 28 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 73 | M | 7 | 125 | 仍然住院 | |
| 29 | 3→7 | 輕症→重症 | 輕症→危重 | 51 | M | 10 | 43 | 死亡 | |
| 30 | 3→6 | 輕症→重症 | 輕症→重症 | 58 | M | 5 | 31 | 出院 | |
| 31 | 3→5 | 輕症→重症 | 輕症→重症 | 57 | M | 7 | 16 | 出院 |
[表4]
| 表2.COVID-19患者與健康提供者之特徵差異 | ||||||
| 未感染 | COVID-19 | P值 | ||||
| 組1 | 組2 | |||||
| (n＝10) | (n＝22) | (n＝9) | (未感染比已感染) | (組1比組2) | ||
| 年齡(歲) | 46.5 ± 14.8 | 45.3 ± 14.3 | 65.4 ± 9.5 | 0.42 | 0.001 | |
| 性別 | 男 | 8 (80%) | 15 (68.2%) | 9 (100%) | 1.00 | 0.08 |
| 女 | 2 (20%) | 7 (31.8%) | 0 (0%) | |||
| BMI(kg/m 2) | 22.8 ±4.4 | 23.0 ± 3.0 (n＝20) | 22.4 ± 3.2 | 0.95 | 0.63 | |
| 吸菸指數 | 176 ±237 | 60 ± 140 | 427 ± 670 | 0.94 | 0.02 | |
| WBC數(10 3/μL) | 6.7 ± 2.9 | 4.6 ± 1.5 | 5.2 ± 3.2 | 0.03 | 0.46 | |
| CRP(mg/dL) | 0.12 ± 0.12 | 2.50 ± 2.41 | 6.07 ± 5.11 | 0.01 | 0.01 | |
| BUN(mg/dL) | 13.7 ± 4.5 | 17.0 ± 16.6 | 22.6 ± 14.6 | 0.35 | 0.39 | |
| Cr(mg/dL) | 0.84 ± 0.13 | 1.72 ± 3.22 | 1.88 ± 2.4 | 0.33 | 0.90 | |
| ALT(IU/L) | 22.5 ± 8.5 | 21.4 ± 15.2 | 42.6 ± 33.2 | 0.51 | 0.02 | |
| CK(IU/L) | NA | 69.5 ± 44.1 | 71.8 ± 50.8 | NA | 0.90 | |
| D-二聚體(μg/mL) | NA | 1.8 ± 2.0 (n＝12) | 1.1 ± 0.4 | NA | 0.28 | |
| Fbg(mg/dL) | NA | 389.0 ± 84.2 (n＝7) | 480.4 ± 172.2 | NA | 0.22 | |
| 高血壓 | 2 (20.0%) | 6 (27.3%) | 3 (33.3%) | 0.70 | 1.00 | |
| 糖尿病 | 0 (0%) | 5 (22.7%) | 3 (33.3%) | 0.17 | 0.66 | |
| 異常血脂症 | 0 (0%) | 4(18.2%) | 3 (33.3%) | 0.16 | 0.38 | |
| 冠狀動脈心臟病 | 0 (0%) | 2 (9.1%) | 0 (0%) | 1.00 | 1.00 | |
| 連續變數表示為平均值±SD，並藉由學生t檢定進行檢測。 類別變數表示為n (%)，並藉由費雪精準檢定進行檢測。 |
(實施例2)胞外體(EV)中之蛋白質測定
(1)胞外體(EV)之單離
對結合於Dynabeads M-280 Tosylactivate(Thermo Fisher Scientific Inc，Waltham，MA，USA)之抗CD9抗體及抗CD63抗體(HU Group Research Institute，Tokyo)利用螯合物基之PEVIA(註冊商標)試劑(HU Group Research Institute)進行處理後，於旋轉器上在4℃下培養18小時。利用PBS將珠粒洗淨3次，進而於4℃下保存直至分析。
(2)肽之製備
所獲得之胞外體(EV)係使用S-Trap微自旋管柱(AMR Inc，東京，日本)，將製造商之指示稍加變更進行處理。具體而言，將胞外體懸浮於pH值7.5的50 μL之包含5%SDS(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，大阪，日本)之50 mM TEAB緩衝液(Honeywell Inc，夏洛特，北卡羅來納，美國)中。去除珠粒後，利用MicroBCA
TM蛋白質分析套組(Thermo Fisher Scientific Inc)測定來自EV之蛋白質之量。為了進行消化效率之品質管理，將質量分析用之13.8 ng Pierce
TM消化指示劑(Thermo Fisher Scientific Inc)追加至溶解樣本。
(3)利用LC-MS之蛋白質體分析
自EV蛋白質獲得之肽係利用包含0.1%甲酸(FA)(Fisher Chemical，Thermo Fisher Scientific Inc)之10 μl水進行重構。肽之定量化係使用Pierce
TM定量螢光肽測定(Quantitative Fluorometric Peptide Assay)(Thermo Fisher Scientific Inc)進行。肽之蛋白質體分析係使用搭載有UltiMate 3000奈米LC系統(Thermo Fisher Scientific Inc.)之Q Exactive(Thermo Fisher Scientific Inc.)執行。使用Dreamspray介面(AMR Inc)將肽樣本(1 μg)注入至在連接於具備nano Zero & Captive Spray Insert(75 μm×25 cm，Ion Opticks Pty Ltd)之C18逆相AuroraUHPLC發射管柱之腔室內加熱至40℃的Acclaim PepMap 1000捕集管柱(75 μm×2 cm，nanoViperC183 μm，100 Å、Thermo Fisher Scientific Inc)。奈米泵之流量設定為302分鐘之梯度、250 nL/min，流動相設為A(水中0.1%FA，Fisher Chemical，Thermo Fisher Scientific Inc.)及B(乙腈中0.1%FA，Fisher Chemical，Thermo Fisher Scientific Inc.)。層析梯度係設計成從0～8分鐘之2%B起線性地增加，8～272分鐘設為2%B至35%B，272～282分鐘設為35%B至70%B，282～283分鐘設為70%B至95%B，洗淨設為8分鐘及平衡化設為10分鐘。資料依存性之獲取係以陽離子模式執行。質量分析參數及Proteome Discoverer 2.2.0.388軟體(Thermo Fisher Scientific Inc)之參數係依據以前之報告(Ayako Kurimoto等人，Enhanced recovery of CD9-positive extracellular vesicles from human specimens by chelating reagent，doi： https://doi.org/10.1101/2020.06.17.155861)所記載之方法進行。
(實施例3)血清miRNA測定
使用QIAzol及miRNeasy迷你套組(Qiagen，Hilden，德國)，依據製造者之操作說明，自實施例1中採集之血清樣本之等分試樣(200 μL)提取總RNA。使用QIAseq miRNA建庫套組(Library Kit)(Qiagen)製備庫。調整之庫係使用Bioanalyzer 2100或TapeStation 4200系統(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國)進行品質管理。使用庫品質管理套組(Library Quantification Kit)(Takara，滋賀，日本)對庫池進行定量，利用NovaSeq6000定序平台(sequencing platform)(Illumina Inc，San Diego，CA，美國)確定序列。使用CLC Genomics Workbench v20.0.1對確定之序列進行預處理，且對照miRBasev22.1及Ensembl 非編碼DNA資料庫 第100版進行註釋。
(實施例4)統計學處理
使用類別變數之費雪精準檢定與不對應連續變數之學生t檢定，比較2組間之臨床資料。為了自EV蛋白質與exRNA之中特定出生物標記候選，首先使用單因子變異數分析(ANOVA)，選擇在3個受驗者組(未感染、COVID-19組1、及組2)間以P＜0.05之不同水平存在之候選。主成分分析(PCA)係使用Partek Genomics Suite 7.0(Partek，聖路易斯，密蘇里州，美國)，針對選擇之候選執行。其次，基於使用捨一交叉驗證之線性判別分析，選擇組1與組2之識別力優異之候選，之後，進行使用R版本3.6.3(R Foundation for Statistics Computing，http://www.R-project.org)、compute.es套裝版本0.2-2、散列套裝版本2.2.6.1、MASS套裝版本7.3-51.5、mutoss套裝版本0.1-12、及pROC套裝版本1.16.2之ROC分析。各候選之最佳之臨界值係基於感度與特異度之合計之最大點(約登指數)設定。預測感度、特異度、及精度係使用各候選所對應之臨界值進行計算。使用對數等級檢定之卡本-麥爾分析與Cox回歸分析係使用IBM SPSS Statistics 25(IBM Japan，東京，日本)執行。相關點圖係使用R版本3.6.3及corrplot套裝版本0.84生成，無監督階層聚類分析係使用Partek Genomics Suite7.0執行。所有分析之統計學有意性之界限定義為0.05之雙側P值。
(結果)
(1)COVID-19患者及未感染對照之血清樣本中之來自EV之蛋白質體分佈之LC-MS分析
在臨床現場，基於液態生檢之EV之分析作為提供各種疾病之診斷及預後之生物標記的潛在方法正受到關注。但由於無用以自患者分離EV之標準化方法，故該戰略尚未被廣泛使用。對最佳之EV之製備法進行了各種研究，結果藉由基於以EV之表面標記蛋白質為靶標之免疫沈澱(IP)的方法，能夠實現迅速且特異性之分離。具體而言，於螯合試劑之存在下，使用IP回收來自血清樣本之CD9+或CD63+陽性EV，藉此提高產量與純度，並且適於藉由LC-MS之其後之EV蛋白質體分析(圖2)。
自41種血清樣本進行LC-MS分析，排除在所有樣本中均不存在之蛋白質，結果特定出1676種蛋白質。該等1676種蛋白質之中，723種蛋白質在3組間以不同之水平存在(P＜0.05；單因子變異數分析)。為了在3個患者群組間比較該等723種來自EV之蛋白質之表現模式，使用基於主成分分析(PCA)映射之無監督多變量統計。PCA係使用LC-MS資料之所有之項目出現頻度(term frequency)對第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)進行描點，顯示3組間之分離趨勢(圖8)。第一個PC1占分散之28.1%，第2個PC2占分散之14.5%，因此顯示能夠藉由兩個主成分以54.5%之貢獻率將3組間分離的趨勢。
該觀察結果顯示：COVID-19患者之血清之EV蛋白質體分佈與未感染受檢者(健康正常人)相去甚遠。可藉由PCA評分點圖發現組1與組2之間有明顯之EV蛋白質體學之不同，但有略微重複或分散。為了進一步特定出來自組1與組2之患者的源自EV之蛋白質之不同，基於選擇之各蛋白質之費雪線性判別分析，計算顯示該等間之識別性能之穩健性(robustness)的交叉檢定評分(Urabe F等人，Clin Cancer Res. 2019；25(10)：3016-25.)。自候選蛋白質將交叉檢定評分超過0.75之91種蛋白質製成列表(表5～表7)。
[表5]
| 用以區分輕症與重症COVID-19患者之EV蛋白質 | |||||
| 基因名稱 | 交叉驗證評分 | 感度 | 特異度 | 精度 | AUC |
| COPB2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| KRAS | 0.90 | 1.00 | 0.82 | 0.87 | 0.93 |
| PRKCB | 0.90 | 0.89 | 0.95 | 0.94 | 0.93 |
| RHOC | 0.90 | 0.78 | 1.00 | 0.94 | 0.96 |
| CD147 | 0.87 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.73 |
| CAPN2 | 0.87 | 0.89 | 0.77 | 0.81 | 0.84 |
| ECM1 | 0.87 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.82 |
| FGG | 0.87 | 0.67 | 1.00 | 0.90 | 0.87 |
| MFAP4 | 0.87 | 0.56 | 1.00 | 0.87 | 0.75 |
| ADI1 | 0.84 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.88 |
| AK1 | 0.84 | 0.89 | 0.91 | 0.90 | 0.95 |
| MGATI | 0.84 | 1.00 | 0.77 | 0.84 | 0.91 |
| CLDN3 | 0.84 | 0.89 | 0.82 | 0.84 | 0.86 |
| CRP | 0.84 | 0.78 | 0.77 | 0.77 | 0.82 |
| UQCRC2 | 0.84 | 0.78 | 0.82 | 0.81 | 0.77 |
| FGA | 0.84 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.88 |
| FGB | 0.84 | 0.67 | 1.00 | 0.90 | 0.84 |
| FGL1 | 0.84 | 0.78 | 0.82 | 0.81 | 0.85 |
| GPX1 | 0.84 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.81 |
| GSK3B | 0.84 | 0.44 | 1.00 | 0.84 | 0.73 |
| LBP | 0.84 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.82 |
| PDGFC | 0.84 | 0.89 | 0.77 | 0.81 | 0.86 |
| RAB13 | 0.84 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.85 |
| RAP1B | 0.84 | 0.67 | 1.00 | 0.90 | 0.91 |
| SLC6A4 | 0.84 | 0.89 | 0.82 | 0.84 | 0.90 |
| UBA7 | 0.84 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.83 |
| ORM1 | 0.81 | 0.89 | 0.59 | 0.68 | 0.80 |
| RNPEP | 0.81 | 0.56 | 0.95 | 0.84 | 0.68 |
| ANGPT1 | 0.81 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.88 |
| APOB | 0.81 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.79 |
[表6]
| 基因名稱 | 交叉驗證評分 | 感度 | 特異度 | 精度 | AUC |
| BHMT | 0.81 | 0.44 | 1.00 | 0.84 | 0.74 |
| CPN1 | 0.81 | 0.89 | 0.68 | 0.74 | 0.84 |
| GNAZ | 0.81 | 1.00 | 0.95 | 0.97 | 0.99 |
| ICAM2 | 0.81 | 1.00 | 0.59 | 0.71 | 0.83 |
| SELL | 0.81 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.74 |
| MAN1A1 | 0.81 | 0.78 | 0.82 | 0.81 | 0.85 |
| SERPINA5 | 0.81 | 0.89 | 0.82 | 0.84 | 0.81 |
| PACSIN2 | 0.81 | 0.89 | 0.86 | 0.87 | 0.90 |
| NCF1B | 0.81 | 0.89 | 0.55 | 0.65 | 0.73 |
| TMEM59 | 0.81 | 0.44 | 0.95 | 0.81 | 0.59 |
| YWHAB | 0.77 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.85 |
| ABAT | 0.77 | 0.33 | 1.00 | 0.81 | 0.52 |
| ADH1B | 0.77 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.79 |
| ASL | 0.77 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.80 |
| ASS1 | 0.77 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.79 |
| CDH2 | 0.77 | 0.56 | 0.95 | 0.84 | 0.69 |
| CAB39 | 0.77 | 0.89 | 0.91 | 0.90 | 0.94 |
| CPS1 | 0.77 | 0.67 | 0.82 | 0.77 | 0.74 |
| CD226 | 0.77 | 0.67 | 1.00 | 0.90 | 0.87 |
| COL6A3 | 0.77 | 0.67 | 0.86 | 0.81 | 0.82 |
| CUL4A | 0.77 | 0.78 | 0.64 | 0.68 | 0.75 |
| DSC1 | 0.77 | 0.44 | 0.95 | 0.81 | 0.58 |
| ENTPD5 | 0.77 | 1.00 | 0.64 | 0.74 | 0.86 |
| EIF4A1 | 0.77 | 0.67 | 0.86 | 0.81 | 0.80 |
| FN1 | 0.77 | 0.89 | 0.68 | 0.74 | 0.81 |
| PGC | 0.77 | 0.89 | 0.68 | 0.74 | 0.78 |
| RHEB | 0.77 | 1.00 | 0.59 | 0.71 | 0.84 |
| GNAI2 | 0.77 | 0.89 | 0.59 | 0.68 | 0.79 |
| GNB1 | 0.77 | 0.78 | 0.77 | 0.77 | 0.83 |
| GNA13 | 0.77 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.86 |
| ITGA2B | 0.77 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.86 |
| ITGB1 | 0.77 | 1.00 | 0.59 | 0.71 | 0.84 |
[表7]
| 基因名稱 | 交叉驗證評分 | 感度 | 特異度 | 精度 | AUC |
| ITGB1 | 0.77 | 1.00 | 0.59 | 0.71 | 0.84 |
| ILK | 0.77 | 0.89 | 0.77 | 0.81 | 0.84 |
| F11R | 0.77 | 1.00 | 0.50 | 0.65 | 0.82 |
| LTA4H | 0.77 | 0.56 | 0.91 | 0.81 | 0.67 |
| LIMS1 | 0.77 | 0.89 | 0.77 | 0.81 | 0.83 |
| NAV2 | 0.77 | 0.56 | 0.86 | 0.77 | 0.73 |
| FAM129B | 0.77 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.84 |
| NNMT | 0.77 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.69 |
| NID1 | 0.77 | 0.89 | 0.55 | 0.65 | 0.76 |
| PPIA | 0.77 | 0.78 | 0.77 | 0.77 | 0.86 |
| PLA1A | 0.77 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.80 |
| PPBP | 0.77 | 0.67 | 0.77 | 0.74 | 0.69 |
| PECAM1 | 0.77 | 1.00 | 0.55 | 0.68 | 0.82 |
| GP1BB | 0.77 | 0.67 | 0.86 | 0.81 | 0.81 |
| PCSK9 | 0.77 | 1.00 | 0.82 | 0.87 | 0.91 |
| MENT | 0.77 | 0.44 | 0.95 | 0.81 | 0.71 |
| SERPINA10 | 0.77 | 0.67 | 0.82 | 0.77 | 0.74 |
| F2RL3 | 0.77 | 0.89 | 0.86 | 0.87 | 0.91 |
| LOX | 0.77 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.81 |
| SFTPB | 0.77 | 0.67 | 0.77 | 0.74 | 0.78 |
| RAB5B | 0.77 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.84 |
| RALB | 0.77 | 0.89 | 0.68 | 0.74 | 0.82 |
| REEP6 | 0.77 | 0.78 | 0.68 | 0.71 | 0.71 |
| RETN | 0.77 | 0.67 | 0.73 | 0.71 | 0.69 |
| AGXT | 0.77 | 0.22 | 1.00 | 0.77 | 0.48 |
| CCT2 | 0.77 | 0.89 | 0.64 | 0.71 | 0.81 |
| THBD | 0.77 | 0.56 | 0.91 | 0.81 | 0.74 |
| ISG15 | 0.77 | 0.33 | 1.00 | 0.81 | 0.67 |
| ZYX | 0.77 | 1.00 | 0.55 | 0.68 | 0.82 |
進而，將3個患者組間交叉檢定評分超過0.85之前9個蛋白質於各組之存在量示於圖4。該等蛋白質之中，4個蛋白質：COPI衣被複合次單元β2(COPB2)、KRAS原癌基因蛋白(KRAS)、蛋白激酶Cβ(PRKCB)、及ras同源家族成員C(RHOC)於組1中多於組2或未感染對照(P趨勢＞0.05)。進而，CD147、鈣蛋白酶2(CAPN2)、細胞外基質蛋白1(ECM1)、纖維蛋白原γ鏈(FGG)於組2中有意義地多於未感染對照或組1(P趨勢＜0.05)。僅微纖維相關蛋白4(MFAP4)於組1中量少於未感染對照或組2(P趨勢＞0.05)。
(2)針對COVID-19重症度之9個EV蛋白質之預測值
將組1與組2組合，執行ROC分析，對9個預測標記之集合進行感度、特異性、及AUC之穩健性測試(圖5)。組1中存在量亢進之COPB2、KRAS、PRKCM、及RHOC這4個標記之AUC值分別為1.00(95%CI：1.00-1.00)、0.93(95%CI：0.85-1.00)、0.93(95%CI：0.83-1.00)、及0.96(95%CI：0.89-1.00)。CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4這其他5個標記之AUC值分別為0.73(95%CI：0.48-0.98)、0.84(95%CI：0.67-1.00)、0.82(95%CI：0.60-1.00)、0.87(95%CI：0.73-1.00)、及0.75(95%CI：0.52-0.97)。
根據該結果，提示：患者入院時檢查之該一系列之標記能夠將輕度與重度發病COVID-19之患者間以有意義之程度分離。為了依據約登指數特定出9個標記蛋白質之最佳臨界值，生成追加之ROC曲線。
為了進一步分析，使用臨界值，將COVID-19患者分成低組與高組，比較重度之COVID-19相關事件之發病。對9個蛋白質分別製作表示至重度之事件開始前之時間的卡本-麥爾曲線(圖6)。組1中可見存在量之增加之蛋白質COPB2、KRAS、PRKCM、及RHOC之量較少的組之非重症化期間(無進展期間)有意義地短於該等蛋白質之量較多之組(分別為P＝9.8×10
-10；P＝1.0×10
-5；P＝5.1×10
-7；P＝4.2×10
-8)。相反地，組2中存在量增加之蛋白質CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之量較多的組之非重症化期間(無進展期間)有意義地短於該等蛋白質之量較少之組(P＝7.0×10
-5；P＝0.00060；P＝2.2×10
-5；P＝1.9×10
-7；P＝2.0×10
-6)。該等結果顯示：該一系列之標記有助於預測患者經歷重度之COVID-19相關事件之可能性。
(3)來自COVID-19患者及未感染對照之血清樣本中之ExRNA分佈之NGS測定
循環之exRNA有可能發揮作為眾多疾病之生物標記之功能。ExRNA由藉由併入至EV、或者與脂質或蛋白質之結合而免遭分解之多種RNA亞群構成。血液樣本中之ExRNA分佈為動態，包括mRNA、miRNA、piRNA、及lncRNA(Murillo OD等人，Cell.(2019)177(2)：463-77 e15.)。本實施例中，使用下一代定序(NGS)，分析患者之血清樣本中存在之exRNA(圖7)。
自41種血清樣本藉由NGS分析鑑定出408種轉錄產物。其中，排除於所有樣本中讀取未達50之轉錄產物。該等exRNA之中，43種轉錄產物於3個組間差異性地表現(P＜0.05；單因子變異數分析)。為了特定出3個組間之該等43種轉錄產物之表現模式，基於PCA映射執行無監督多變量統計。根據基於NGS資料之PCA點圖，從而明確了將3個組間分離之趨勢(圖8)。該分離可藉由占分散之28.1%的第一主成分(PS1，first principal components)所說明。第二主成分(PS2，second principal components)占分散之14.5%。該等觀察結果顯示：COVID-19患者之血清exRNA分佈與未感染提供者之血清exRNA分佈相去甚遠。進而，可藉由PCA點圖而檢測出組1與組2間之exRNA分佈之明顯不同，但有一些重複或分散性。
為了區分組1與組2，基於費雪線性判別分析計算所選各轉錄產物之交叉驗證評分。自候選轉錄產物選擇交差檢定評分超過0.75之14種轉錄產物(表8)。
[表8]
| 轉錄本 | 交叉驗證評分 | 感度 | 特異度 | 精度 | AUC |
| miR-122-5p | 0.84 | 0.56 | 1.00 | 0.87 | 0.81 |
| SNORD33 | 0.84 | 1.00 | 0.73 | 0.81 | 0.89 |
| AL732437.2 | 0.84 | 0.89 | 0.68 | 0.74 | 0.80 |
| RNU2-29P | 0.81 | 0.44 | 1.00 | 0.84 | 0.70 |
| CDKN2B-AS1 | 0.81 | 0.67 | 0.95 | 0.87 | 0.86 |
| AL365184.1 | 0.81 | 0.78 | 0.86 | 0.84 | 0.87 |
| AL365184.1 | 0.81 | 0.78 | 0.91 | 0.87 | 0.90 |
| AL365184.1 | 0.81 | 0.67 | 0.91 | 0.84 | 0.87 |
| AL365184.1 | 0.81 | 0.78 | 0.91 | 0.87 | 0.90 |
| AL365184.1 | 0.81 | 1.00 | 0.73 | 0.81 | 0.92 |
| let-7c-5p | 0.77 | 0.44 | 0.95 | 0.81 | 0.75 |
| miR-21-5p | 0.77 | 0.56 | 0.91 | 0.81 | 0.71 |
| miR-140-3p | 0.77 | 0.89 | 0.77 | 0.81 | 0.89 |
| C5orf66-AS2 | 0.77 | 0.78 | 0.91 | 0.87 | 0.89 |
(4)為了預測疾病之重症度值而選擇之標記間之相關
其次，使用單變量Cox回歸分析，計算exRNA標記與EV蛋白質標記之風險比(HR)。尤其是低COBP2之HR無法進行使用最佳臨界值之統計學計算，提示EVCOPB2在2組標記中具有最高之預測值。高年齡(HR28.1；95%CI3.4-231.9；P＝0.0019)、高CRP(HR8.4；95%CI1-67.5；P＝0.045)、低PRKCB(HR32.1；95%CI3.9-261.9；P＝0.0012)、低RHOC(HR23.6；95%CI4.7-118；P＝0.00012)、高CD147(HR10.7；95%CI2.5-45.1；P＝0.0013)、高CAPN2(HR15.5；95%CI1.9-125.9；P＝0.010)、高ECM1(HR11.6；95%CI2.8-48.4；P＝0.00079)、高FGG(HR21.4；95%CI4.2-110.4；P＝0.00025)、高MFAP4(HR12.7；95%CI3.3-48.6；P＝0.00022)、高miR-122-5p(HR10.5；95%CI2.7-40.4；P＝0.00063)、高AL732437.2(HR9.9；95%CI1.2-79.9；P＝0.031)、高RNU2-29P(HR10.4；95%CI2.6-40.8；P＝0.00081)、高CDKN2B-AS1(HR14.4；95%CI3.4-61.3；P＝0.00031)、及高AL365184.1(HR14.2；95%CI1.8-114.4；P＝0.013)於統計上有意義(表9)。
[表9]
| 臨界 | HR | (95%CI) | P值 | |
| 年齡高 | 56.5 | 28.1 | (3.4-231.9) | 0.0019 |
| 吸菸指數高 | 87.5 | 3.1 | (0.8-11.6) | 0.092 |
| CRP高 | 2.3 | 8.4 | (1-67.5) | 0.045 |
| ALT高 | 21.5 | 3.8 | (0.8-18.5) | 0.095 |
| COPB2低 | 1.6×10 8 | NA | - | - |
| KRAS低 | 4.8×10 7 | 189.8 | (0.4-9.0×10 4) | 0.095 |
| PRKCB低 | 6.3×10 7 | 32.1 | (3.9-261.9) | 0.0012 |
| RHOC低 | 1.4×10 7 | 23.6 | (4.7-118) | 0.00012 |
| CD147高 | 6.1×10 8 | 10.7 | (2.5-45.1) | 0.0013 |
| CAPN2高 | 7.2×10 5 | 15.5 | (1.9-125.9) | 0.010 |
| ECM1高 | 2.3×10 8 | 11.6 | (2.8-48.4) | 0.00079 |
| FGG高 | 1.4×10 10 | 21.4 | (4.2-110.4) | 0.00025 |
| MFAP4高 | 4.6×10 8 | 12.7 | (3.3-48.6) | 0.00022 |
| miR-122-5p高 | 1.0×10 5 | 10.5 | (2.7-40.4) | 0.00063 |
| SNORD33高 | 406.6 | 104.1 | (0.4-2.7×10 4) | 0.10 |
| AL732437.2高 | 8.8 | 9.9 | (1.2-79.9) | 0.031 |
| RNU2-29P高 | 124.1 | 10.4 | (2.6-40.8) | 0.00081 |
| CDKN2B-AS1高 | 6.2 | 14.4 | (3.4-61.3) | 0.00031 |
| AL365184.1高 | 2.9 | 14.2 | (1.8-114.4) | 0.013 |
| HR：風險比(hazard ratio)；CI：信賴區間(confidence interval)；NA：不適用(not applicable) |
為了調查選擇之標記間之潛在關係，基於標記水平計算斯皮爾曼之相關係數。為了將19個標記之相關係數視覺化，製作相關點圖(圖9)。藉此，發現了該等所屬之組內共用較強之正相關的標記之4個階層式叢集。各標記似乎對應明確地定義之4個叢集(即，叢集1、2、3、及4)之某一者。尤其是叢集1(PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS)與其他叢集有負相關關係，叢集2、3、及4相互有實質上較強之正相關關係。
叢集1之4個EV蛋白質均係組1顯示有意義地高於組2之COVID-19患者之存在量。MFAP4之水平與吸菸或年齡不存在有意義之相關關係。另一方面，叢集3包括ECM1、CDKN2B.AS1、AL365184.1、CAPN2、CRP、FGG、及CD147。1個exRNA(叢集3之CDKN2B.AS1)與和細胞外基質形成相關之4種蛋白質(叢集2之MFPA4與叢集3之ECM1、CAPN2、CD147)之水平與在凝固方面發揮重要功能之FGG之水平相關(P＜0.05)(圖4)。叢集3之標記之水平與和血管內皮功能障礙及凝固相關之年齡(Donato AJ等人，Circ Res.2018；123(7)：825-48.)相關。資料之大部分啟示，叢集2及3示出凝固相關標記之組。叢集4之成分ALT、RNU2-29P、SNORD33、miR-122-5p、及AL732437.2有可能至少部分地反映與肝障礙相關之現象。主要與肝功能障礙相關之代表性轉胺酶ALT之水平與該等3個exRNA種類之水平相關(P＜0.05)。
根據上述結果表明：患者之血清中之EV蛋白質與exRNA之分佈明確地反映了針對SARS-CoV-2感染與疾病之進展的特定宿主反應。
13:檢查所
14:使用者
15:中央電子計算機
16:單個電子計算機
17:資訊之發送
18:資訊之報告
19:新型冠狀病毒之在家檢查法
圖1表示實施例中之群組之患者募集流程圖。
圖2表示基於來自31名輕度COVID-19患者及10名未感染之健康對照血清樣本之CD9＋/CD63＋EV進行蛋白質體之LC-MS鑑定的工作流程。31名輕度COVID-19患者經過樣本採集後起分為組1(輕症：n＝22)與組2(重症：n＝9)。
圖3係來自3個受檢對象群之723種蛋白質之PCA圖。
圖4係表示3個受檢者組間之COPB2、KRAS、PRKCM、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之相關關係的圖表。P值係針對基於皮爾森相關分析之趨勢。誤差槓表示平均±SEM。縱軸表示蛋白質量，橫軸表示患者群(未感染、組1(輕症)、組2(重症))。
圖5係對9種EV蛋白質進行ROC解析所得之圖表。數值表示評價之AUC值(95%CI)。
圖6表示基於對數等級檢定之9種EV蛋白質之卡本-麥爾曲線。縱軸表示症狀未進展之患者之比率，橫軸之時間(天)表示登錄日起之經過天數。使用最合適之臨界值，定義高組與低組。
圖7表示利用NGS確定來自31名輕度COVID-19患者及10名未感染之健康對照之血清樣本的exRNA分佈之工作流程。31名輕度COVID-19患者經過樣本採集後起分為組1(輕症：n＝22)與組2(重症：n＝9)。
圖8係針對3個受檢對象群之43種轉錄本之PCA圖。
圖9中顏色表示皮爾森相關係數。上部之三角形部分中，正相關用紫色表示，負相關用棕色表示。圓之顏色深度及橢圓化與相關係數成比例。下部之三角顯示實際之相關值，粉色之高光表示P＜0.05。叢集1(PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS)包括與抗病毒應答相關之EV蛋白質之組。叢集2(吸菸、年齡、及MFPA4)及叢集3(CM1、CDKN2B.AS1、AL365184.1、CAPN2、CRP、FGG、及CD147)包括凝固相關標記之組。叢集4(ALT、RNU2-29P、SNORD33、miR-122-5p、及AL732437.2)包括與肝障礙相關之exRNA之組。
圖10係表示COVID-19之重症化預測之流程之流程圖。
圖11係COVID-19在家診療法之圖。
<![CDATA[<110> 日商國際宇宙醫療股份有限公司(International Space Medical Co., Ltd)]]>
宮戶 光(Miyato, Mitsuru)
落谷 孝広(Ochiya, Takahiro)
<![CDATA[<120> 利用胞外體中之蛋白質之COVID-19重症化預測方法]]>
<![CDATA[<130> K2452ANP0002]]>
<![CDATA[<150> JP 2020-168107]]>
<![CDATA[<151> 2020-10-02]]>
<![CDATA[<160> 36 ]]>
<![CDATA[<170> PatentIn第3.5版]]>
<![CDATA[<210> 1]]>
<![CDATA[<211> 22]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 1]]>
uggaguguga caaugguguu ug 22
<![CDATA[<210> 2]]>
<![CDATA[<211> 85]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 2]]>
gcggccggug augagaacuu cucccacuca cauucgaguu ucccgaccau gagaugacuc 60
cacaugcacu accaucugag gccac 85
<![CDATA[<210> 3]]>
<![CDATA[<211> 2357]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 3]]>
gcacucagua cucauggcug aucaagggaa gugagcucau cucaccuuga cucacagcga 60
ugacagguuc aagccccugc augugggccc guuccucaga ggauguuugc aaugggggug 120
gggguugcca uggugaugcc cagucaacag aauggagaaa agagaaauuu gguuugaaau 180
gaaauuugag ucuugagaga gggcugauau gaaggagaau caaacaagcc acaugggagc 240
aucugaaggc cuggagauaa gggccuguug cauggcugug aaaauuuggc cuuuaaaaua 300
acuaggcaug ggccagaaau cacagccggc ggcugcgacc acccaaggca ggagauccag 360
cgggggacua uggagcucag uggagcugcg gccugggaga agcccaccca agagaaccau 420
guaacuagaa accaucacau ucggcuucgu gugagggaga agcagguguu ucauugcacg 480
caguuacuga gaucuggggu uguuuguuau ugcagcaagg acccacccua acacacgagg 540
uguuauaugc auuuuacaga uugccaagau gguacagaca gcagaagugg caaaacaaca 600
cuuaaacuca aaccugccca acuucaaagu ccacgcccuu cccugggcuu cagacugccg 660
ucuuugaugc uaucuuucau ugagauguug uuugcauuaa augggggauc uugcggcaca 720
cgguggaccu ugcccagcac ccacucuucc uagggccagc cuuacucugu ggggucagcc 780
uuugaccguc ugggccauga agguggcuga ugaggccccu ucgacagcca aguuggggca 840
caaucuccuc cggauguugu uauuccuuca cagucucauc gcaggcgggg aggaagucag 900
agggcugauu uagaggacag agauacaaac agagugagca gaggauguuu ggcugcaguu 960
gcuccagagu uucaagggag aaaacacaag cauugcugag cggccauuag gggcuugcac 1020
gcucagcugg gcacaugucc acaccgaggc aucacgugcg gucugagcug agcucucauc 1080
ucuggguuuc aggacuuuca gcacaguccu ggcccuucac guuuagucug ggugaucagg 1140
gauguaaacc agcaauugca agguggugaa gcaccaccgu ggaagggcac cagccgggcc 1200
cuggggucac agaagugccc caggaagugu ggccguuaag ccuggugaga ggagagcgag 1260
ccgggaggac ggugagagac aggcaugacg gggcggugag ugugacugcu gcugagcaug 1320
ucugagacgg caggcaguca ccaaaggcuu guaagcagag gcaacacccu gacuuguggu 1380
uuggagagau cauggugacu gccgugcagg gacggaaugg aggcugcucc agugacucug 1440
gccgugggca guggugggcg ggugagggga cagaggaaag uggauggagu ugcugccccc 1500
acaacccugc ugagaaagug cccacgggac cuggcggggu gugagucaca cuugggcugc 1560
ucugccuggc ucugcaccua uuucgugagc uggaagggac agccugagcc ccgucccuug 1620
gauggacauc aaugcaggag uaagggucug ucucugaagc ucucugagca acggaaggga 1680
aggugcccac ugggcucaau gcagagauau uggggcugau guggcaggag gggugggugu 1740
gcaggcccgg cggggaagga gacuuccaaa cagacgggcu gccccacggg gaaucuggcu 1800
ggggccaguc auucucagag ucaaaccauc uucauucaac uccgaggcug ccccaggcca 1860
guagcguccu uccugagagc gcuuccugcg agauuuauga ggcaggggcc aggccuggau 1920
cguagaaagc uagagaaugc cuuggcugcc cagggaaguc uggaauuucu uccaaaccaa 1980
gcuuccagac gucccucugg acuccucugu cugagaaugg gcacuuuaaa ggcccaggag 2040
agaacuccca ugacaccguu uuccaaccuc ccaucucccc uccccggcag cuccccauuu 2100
ccggcaucuc ggcuuggcag gaccccucca ggaccucacu ccucugagac gcacugcaga 2160
ccucacaggu gacagcagcg uuuugcugac ucagaggcaa cuaccacgau gacccuccag 2220
cccgugucca gaccuggggc agcgacuugg acagggggcu gcagaagugg gucugugagg 2280
gggaccugac ggggggcugc agaagugggu cugugaggcg gaccuggggg ggcagcccug 2340
gggugggcuc acugggg 2357
<![CDATA[<210> 4]]>
<![CDATA[<211> 189]]>
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caguuuuaug cagaacaucu gauuagcagg aucaaacggu caacauuaag cauauguaua 60
uuauuuucaa ccaucucccu gcuccaaaaa uccacuuaau auauuguccu gggauagagg 120
aaguaccaga uauuaaacug auaaaagcag auucuacacu ugaucuuagc caaaagaccu 180
agaagggau 189
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agcuacaucc gucaccugac acggcccuac caggaacagc cgcgcucccg cggauucugg 60
ugcugcucgc guccccgcuc cccuauuccc cuuauuuuau uccuggcucc ccucgucgaa 120
agucuuccau ucuucaaacu agauuauuua aaaaugaaaa aggaagaaag gaaagcgagg 180
ucaucucauu gcucuauccg ccaaucagga ggcugaaugu caguuuugaa cuaaaagccg 240
cuccgcuccu cuucuagauu uggaaaacaa gcgaaauuaa acuaaaccgc ugcacgccuc 300
ugacgcgaca ucuggacacg gcgcggcgcu ggcgcugccg gagcugucga cccggccugg 360
cgccggacua ggacuauuug ccacgacauu ucaaaggauu ccaagagaga auauuggugu 420
ccaugcugug augauuccuc agcuccucuc aucugaucuc cguccuggcc cccaugacuu 480
ucuuuguggu aguuagggug ugguaugugc cacugaggcc cacaccuauu gcugcaauuu 540
auagcacuga ucugucauca auaccacuug cugucuugga ugugaagaug auuuuuccug 600
cagggauucc cucuacaaaa uuaaaaacac ugggcaugug gaaauaauau ucaugcuuua 660
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cuaguguagu gaauagaaaa gacaauuuaa agcgugaaua uuauuuccuc augcccagug 780
uuuuuaauuu uguacugguc uguggcuugu uagaaaccag gcugcacagc agaagguggg 840
cagcagauau ugagaaacca cagaaagaga gaaguuaaau aauuuuccug ucaaagacca 900
caucaaugau gaagccagaa uuugagcuca uguacuuaac cacuggacua ccugccugcc 960
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cacuguuagg ugugcuggaa uccuuucccg agucaguacu gcuuucuaga agaaaaccgg 1200
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gauggaggcu uuuuauuuug ccacaaaacc acuggugacg uugccugugg ccaccuugga 2220
gaagacacug gaggccuggg acauggagac ugcuuuucug cagaaaccac aucccuugga 2280
guaaugagcu acaccuaccu caauuauuca gugcaguaca acacuccaga cagggucuca 2340
cucugucacc caggcuggag uguauuggca ugauuacagc ucacugcaac cuugaacucc 2400
caggcucaaa ccugagcagc ugggacuaca gaugcaccac caugcauggu accagagaua 2460
uaauaaugag aaacagacau gcucccuccc cucauugagg uuacagcuua guguggagac 2520
acacagaugc cuaacgcacu augguaugga aggugcuaug gacacagugc ucaaauccau 2580
gaucuacaua gguggagaac uucaguagag gaaguggcag gaauuuggga augaggagca 2640
cagugauuaa acuggggcca uucauaugag aguuuaagaa cucagaccag ugacuuagau 2700
uggcuucucu cacauggcaa gaaacauugc ugcuagcacu ucccgaguuc uacguucuac 2760
aacauccacc acuggaucuu aacauagacg uaagaucaaa ugcaauagca ugucaaacaa 2820
uguguaacuc caguuauaca aacauuacug uaucucauug gggauacgaa gcucuacaca 2880
cuugaagaug gugaaggaau auaaaaaucu augucucaca guccagacuu ggaguacaag 2940
uaauaagaag aauaaaacuu aaucccuuaa guagauucac cauaaguuag cucagagcaa 3000
uuccagugca aguauggucu gugauccagu aguaucuuac agacagcaag uugaacauug 3060
ugggaugcau gagcuauuga ggccuuugca gcuuucugcu acauggaggc uagggccaga 3120
gucaagauuu augcuuugca gcacacuggu cagcuguuuu ugcaaaucag auuaaaugau 3180
uuuuaaauga ggcugagagc augggagaua cuaaugugug uuuccuugug agcuacugca 3240
uaaguuagga aauugaaaua cagaaagaug aaaagugauu ugcccaagca uauagaucaa 3300
agcuguggca gaaccaggac uggaaccuau aucucucuac uaaugguuuu uuuaaaaaaa 3360
uaaccuuguu ucaaaaauau uaaaaaguca caagaaaggu aaacaugugg auaaacaaaa 3420
ugaagaaaau aaaaauuauc caguaauaac auauuggcau augucuuucu gguauauuuu 3480
ccuguguugu caucauuauc aucuccauca ucauuauauc caucauuauc aucaucauca 3540
ucaucaucau caucauuauc aucaccauag ugaacaugua augcuuaccu agugccagau 3600
gcugucuagg cauuuuacau guguuacugg uaacucaugu aauccucaua acaaccuuau 3660
aaggugguug cuauuauccc cauguuacau augaagagac agaagcauaa agaaguugca 3720
ccgcugguaa uuggcuggga uuugaacuua agcagucuaa ccuuagagua augauuuuaa 3780
caacuaugcu auauacauac aaauuuacaa aauaaaacug ggcucagaca auaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaa 3857
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<![CDATA[<213> 智人]]>
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ggguggggcc agauaggaga acaaaagcag gcugcccgag cuagcagugg caacaugcuc 60
aggucucuua ccacgcugug gaagcuuugu ucuuucgcuc uuugcaauga auccugcugc 120
ugcucacucu uuggguccac acugccuuua ugagcuguaa cacucacugu gaagguccgc 180
agcuucccuc cugagccagc gagaccagga acccaccaga aggaagaaac ucagaacaca 240
ucccaacauc agaaggaaca aacuccagac gcgccaccuu aagagcugua acacucaccg 300
cgagggucug cggcuucauu cuucaaaguc cauucuaagu uguucuguca gugaaacucu 360
guuuaaaaca uggcuuguau gaaguuguca ggaaucggcu cugacacuug gaugauucuu 420
cagcuggcua uaaaauucua aaaucagagu aaccguguau ugacuuccaa cauuccacau 480
uuccaaaggu guuuccugug aucucuggga uccugauccg caccacucaa cuuuggccuc 540
cuaaacuuca uccuugaccc caccccagga ccucuugacc agaauuuauc cagcacucca 600
gcacggcuug cacguuaucu ggaguaaaga gaccuucugg gauuucauca gccuccuguc 660
caucaagagu ucuuccaguu uuugacugac ugaauuuuca gugaacugug ugucuaacug 720
aagcuuugag agagagagag agagaaagaa ggaaaaaaag aaaagguuuu acuucacuug 780
aacuuguuaa aaaggaagag acacagaucc agcauaguag aaggagaaag aaagcagaca 840
acaguuugga auggaggcau ugagacggaa gaguccauug gagauggaau guacacacaa 900
aaauaacaau uuagguccuu ugcucaugca acaucuuguu cuaauguccu cugcuccagg 960
ucacaacauu gagcuacaaa gugugugcag ugacuccagu cugcauucau gcuacaagau 1020
gauccguuua guaagacuga gcaaggcuug uuaaccucuu ggacgugaga gauuuccccu 1080
gagaaaauau auaaaacaag agaaaagaaa gaaaaucaag uacgaucacu gaaaaccugc 1140
uuaguaguag caacuauuua cuguagcuga uuuuugugca aggucaacac ugaacccuuu 1200
aaguccaucu uaguucaaac cucaugacca accugccuuc cccccucccu cccuccacug 1260
acacgucaaa caaaacuauc cucccucccu ccacccuccu accccuccca aauccuuccu 1320
ccccacugca aacagacuga ugguuucaca gcacagauua gcaaaucaua aaacauaucc 1380
auaaaugcuc caucaaggcu uagcaaugaa gcaacaccua gguucccaac ugauuauaaa 1440
cauguuacaa caaaucuuag uaagcugcuc ugaaagauaa ugugagugca uucuuguuca 1500
auggcugaaa uuaaugucac auuuauaaau aucuagaaau guagaggaua cgauuuaauu 1560
aaauaaaaug caguuuuuga gggugugauu caugaaacuc aagauugagu cuguucccua 1620
ucuuacauaa uaauggauaa aaaggugcca auuauauauc ugaagauaaa agucuacuug 1680
uucccuguu 1689
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ugagguagua gguuguaugg uu 22
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<![CDATA[<211> 22]]>
<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 8]]>
uagcuuauca gacugauguu ga 22
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<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
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uaccacaggg uagaaccacg g 21
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<![CDATA[<212> RNA]]>
<![CDATA[<213> 智人]]>
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cggaggaggg gagaggagag gaaaguggga ggagaggcug cacucuaaac agcccucuug 60
ccugagcaau cugacgcaga ggcacaugag gaaucagcac ggaaccaucg acccacaggg 120
uuaaucccaa ugucaauacc ugcuagaugu cagggauccc cugggcugcu ggcgagccau 180
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cagugucagu ccauauuuac ugagugccga cugcccggga cccugugcca gagcugcgcc 2040
ccaaccccau ccaucccgag cuucaugaua auaacauuau ucuuuccaac uuugggcuga 2100
ucaggguuua uaagggcucc cacuucacuu uuuaccaaaa gaaaauaucu uuccuuugca 2160
aaaaaaaaaa aaaaa 2175
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<![CDATA[<213> 智人]]>
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Met Pro Leu Arg Leu Asp Ile Lys Arg Lys Leu Thr Ala Arg Ser Asp
1 5 10 15
Arg Val Lys Ser Val Asp Leu His Pro Thr Glu Pro Trp Met Leu Ala
20 25 30
Ser Leu Tyr Asn Gly Ser Val Cys Val Trp Asn His Glu Thr Gln Thr
35 40 45
Leu Val Lys Thr Phe Glu Val Cys Asp Leu Pro Val Arg Ala Ala Lys
50 55 60
Phe Val Ala Arg Lys Asn Trp Val Val Thr Gly Ala Asp Asp Met Gln
65 70 75 80
Ile Arg Val Phe Asn Tyr Asn Thr Leu Glu Arg Val His Met Phe Glu
85 90 95
Ala His Ser Asp Tyr Ile Arg Cys Ile Ala Val His Pro Thr Gln Pro
100 105 110
Phe Ile Leu Thr Ser Ser Asp Asp Met Leu Ile Lys Leu Trp Asp Trp
115 120 125
Asp Lys Lys Trp Ser Cys Ser Gln Val Phe Glu Gly His Thr His Tyr
130 135 140
Val Met Gln Ile Val Ile Asn Pro Lys Asp Asn Asn Gln Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Gln Leu Gly Ser Ser Ser
165 170 175
Pro Asn Phe Thr Leu Glu Gly His Glu Lys Gly Val Asn Cys Ile Asp
180 185 190
Tyr Tyr Ser Gly Gly Asp Lys Pro Tyr Leu Ile Ser Gly Ala Asp Asp
195 200 205
Arg Leu Val Lys Ile Trp Asp Tyr Gln Asn Lys Thr Cys Val Gln Thr
210 215 220
Leu Glu Gly His Ala Gln Asn Val Ser Cys Ala Ser Phe His Pro Glu
225 230 235 240
Leu Pro Ile Ile Ile Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Val Arg Ile Trp
245 250 255
His Ser Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Met Glu
260 265 270
Arg Val Trp Cys Val Ala Ser Leu Arg Gly Ser Asn Asn Val Ala Leu
275 280 285
Gly Tyr Asp Glu Gly Ser Ile Ile Val Lys Leu Gly Arg Glu Glu Pro
290 295 300
Ala Met Ser Met Asp Ala Asn Gly Lys Ile Ile Trp Ala Lys His Ser
305 310 315 320
Glu Val Gln Gln Ala Asn Leu Lys Ala Met Gly Asp Ala Glu Ile Lys
325 330 335
Asp Gly Glu Arg Leu Pro Leu Ala Val Lys Asp Met Gly Ser Cys Glu
340 345 350
Ile Tyr Pro Gln Thr Ile Gln His Asn Pro Asn Gly Arg Phe Val Val
355 360 365
Val Cys Gly Asp Gly Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Ala Met Ala Leu Arg
370 375 380
Asn Lys Ser Phe Gly Ser Ala Gln Glu Phe Ala Trp Ala His Asp Ser
385 390 395 400
Ser Glu Tyr Ala Ile Arg Glu Ser Asn Ser Ile Val Lys Ile Phe Lys
405 410 415
Asn Phe Lys Glu Lys Lys Ser Phe Lys Pro Asp Phe Gly Ala Glu Ser
420 425 430
Ile Tyr Gly Gly Phe Leu Leu Gly Val Arg Ser Val Asn Gly Leu Ala
435 440 445
Phe Tyr Asp Trp Asp Asn Thr Glu Leu Ile Arg Arg Ile Glu Ile Gln
450 455 460
Pro Lys His Ile Phe Trp Ser Asp Ser Gly Glu Leu Val Cys Ile Ala
465 470 475 480
Thr Glu Glu Ser Phe Phe Ile Leu Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Val Leu
485 490 495
Ala Ala Gln Glu Thr His Glu Gly Val Thr Glu Asp Gly Ile Glu Asp
500 505 510
Ala Phe Glu Val Leu Gly Glu Ile Gln Glu Ile Val Lys Thr Gly Leu
515 520 525
Trp Val Gly Asp Cys Phe Ile Tyr Thr Ser Ser Val Asn Arg Leu Asn
530 535 540
Tyr Tyr Val Gly Gly Glu Ile Val Thr Ile Ala His Leu Asp Arg Thr
545 550 555 560
Met Tyr Leu Leu Gly Tyr Ile Pro Lys Asp Asn Arg Leu Tyr Leu Gly
565 570 575
Asp Lys Glu Leu Asn Ile Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Val Ser Val Leu
580 585 590
Glu Tyr Gln Thr Ala Val Met Arg Arg Asp Phe Ser Met Ala Asp Lys
595 600 605
Val Leu Pro Thr Ile Pro Lys Glu Gln Arg Thr Arg Val Ala His Phe
610 615 620
Leu Glu Lys Gln Gly Phe Lys Gln Gln Ala Leu Thr Val Ser Thr Asp
625 630 635 640
Pro Glu His Arg Phe Glu Leu Ala Leu Gln Leu Gly Glu Leu Lys Ile
645 650 655
Ala Tyr Gln Leu Ala Val Glu Ala Glu Ser Glu Gln Lys Trp Lys Gln
660 665 670
Leu Ala Glu Leu Ala Ile Ser Lys Cys Gln Phe Gly Leu Ala Gln Glu
675 680 685
Cys Leu His His Ala Gln Asp Tyr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr
690 695 700
Ala Ser Gly Asn Ala Asn Met Val Asn Lys Leu Ala Glu Gly Ala Glu
705 710 715 720
Arg Asp Gly Lys Asn Asn Val Ala Phe Met Ser Tyr Phe Leu Gln Gly
725 730 735
Lys Val Asp Ala Cys Leu Glu Leu Leu Ile Arg Thr Gly Arg Leu Pro
740 745 750
Glu Ala Ala Phe Leu Ala Arg Thr Tyr Leu Pro Ser Gln Val Ser Arg
755 760 765
Val Val Lys Leu Trp Arg Glu Asn Leu Ser Lys Val Asn Gln Lys Ala
770 775 780
Ala Glu Ser Leu Ala Asp Pro Thr Glu Tyr Glu Asn Leu Phe Pro Gly
785 790 795 800
Leu Lys Glu Ala Phe Val Val Glu Glu Trp Val Lys Glu Thr His Ala
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Asp Leu Trp Pro Ala Lys Gln Tyr Pro Leu Val Thr Pro Asn Glu Glu
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Arg Asn Val Met Glu Glu Gly Lys Asp Phe Gln Pro Ser Arg Ser Thr
835 840 845
Ala Gln Gln Glu Leu Asp Gly Lys Pro Ala Ser Pro Thr Pro Val Ile
850 855 860
Val Ala Ser His Thr Ala Asn Lys Glu Glu Lys Ser Leu Leu Glu Leu
865 870 875 880
Glu Val Asp Leu Asp Asn Leu Glu Leu Glu Asp Ile Asp Thr Thr Asp
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Ile Asn Leu Asp Glu Asp Ile Leu Asp Asp
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Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
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Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
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Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
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Met Ala Asp Pro Ala Ala Gly Pro Pro Pro Ser Glu Gly Glu Glu Ser
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Thr Val Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
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Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65 70 75 80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Ala Ser Asp
85 90 95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Ser Ser Pro
100 105 110
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
115 120 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Met Met Asn Val His Lys Arg Cys Val
130 135 140
Met Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Thr Asp His Thr Glu Arg Arg Gly
145 150 155 160
Arg Ile Tyr Ile Gln Ala His Ile Asp Arg Asp Val Leu Ile Val Leu
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Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Val Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
180 185 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Ser Glu Ser
195 200 205
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Glu Thr Phe Arg Phe Gln Leu Lys Glu Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
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Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Leu Thr Ser Arg Asn Asp Phe Met
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Gly Ser Leu Ser Phe Gly Ile Ser Glu Leu Gln Lys Ala Ser Val Asp
260 265 270
Gly Trp Phe Lys Leu Leu Ser Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Phe Asn Val
275 280 285
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Phe Glu Arg Ala Lys Ile Ser Gln Gly Thr Lys Val Pro Glu Glu Lys
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Met Lys Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser
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Phe Gly Lys Val Met Leu Ser Glu Arg Lys Gly Thr Asp Glu Leu Tyr
355 360 365
Ala Val Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val
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Pro Phe Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Met Asp Arg Leu
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Tyr Phe Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile
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595 600 605
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Ala Gly Leu Gln Val Arg Lys Asn Lys Arg Arg Arg Gly Cys Pro Ile
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Leu
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Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
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Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys
35 40 45
Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys Cys
50 55 60
Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn Gln Asp
65 70 75 80
Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu Tyr Gln
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Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met Glu Ile
100 105 110
Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn
115 120 125
Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Val Leu Lys Arg Lys
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Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu Val Asp Ile Asp Ile Lys
165 170 175
Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val
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Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln Leu Glu Gln Val Ile
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210 215 220
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Ala Trp Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Val Pro Leu
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Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp
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Leu Leu Pro Ser Ser Ser Lys Glu Pro Val Phe Arg Leu Ser Val Ala
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Leu Asn Thr Phe Tyr Pro Lys Phe Asn Asp Lys Leu Ala Glu Gly Phe
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Pro Leu Pro Leu Leu Lys Arg Val Gln Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Gln
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Ile His Lys Asp Phe Leu Phe Leu Gly Ala Asn Val Gln Tyr Met Arg
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Val
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<![CDATA[<213> 智人]]>
<![CDATA[<400> 32]]>
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<![CDATA[<400> 35]]>
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Arg Ser Lys Gly Leu Gln Asp Leu Gly Gly Ile Ser Trp Gln Leu Ala
245 250 255
Leu Cys Ile Met Leu Ile Phe Thr Val Ile Tyr Phe Ser Ile Trp Lys
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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Ala Gly Pro Ser Leu Leu Phe Ile Thr Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Asn
405 410 415
Met Pro Ala Ser Thr Phe Phe Ala Ile Ile Phe Phe Leu Met Leu Ile
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Thr Leu Gly Leu Asp Ser Thr Phe Ala Gly Leu Glu Gly Val Ile Thr
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Ala Val Leu Asp Glu Phe Pro His Val Trp Ala Lys Arg Arg Glu Arg
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Phe Val Leu Ala Val Val Ile Thr Cys Phe Phe Gly Ser Leu Val Thr
465 470 475 480
Leu Thr Phe Gly Gly Ala Tyr Val Val Lys Leu Leu Glu Glu Tyr Ala
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Thr Gly Pro Ala Val Leu Thr Val Ala Leu Ile Glu Ala Val Ala Val
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Ser Trp Phe Tyr Gly Ile Thr Gln Phe Cys Arg Asp Val Lys Glu Met
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Leu Gly Phe Ser Pro Gly Trp Phe Trp Arg Ile Cys Trp Val Ala Ile
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Ile Arg Leu Asn Ala Val
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Arg Gln Leu Tyr Val Leu Gly Ser Pro Ala Met Gln Arg Ile Gln Gly
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Ala Arg Val Leu Val Ser Gly Leu Gln Gly Leu Gly Ala Glu Val Ala
35 40 45
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Glu Leu Ser Cys Glu Gly Asp Asp Glu Asp Thr Ala Phe Pro Pro Leu
995 1000 1005
His Tyr Glu Leu
1010
Claims (19)
- 一種判定COVID-19患者重症化之可能性之方法，其藉由 測定來自該患者之血液中之胞外體中存在之一種以上之標記蛋白質之水平，及 將測定之標記蛋白質之水平與對照RNA水平進行比較，從而判定上述患者重症化之可能性， 此處，上述標記蛋白質係選自以下之群之一種以上之蛋白質：COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX。
- 如請求項1之方法，其中上述標記蛋白質係選自以下之群之一種以上之蛋白質：COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4， 此處，於測定之蛋白質為COPB2或KRAS之情形時，該蛋白質之水平高於健康正常人之蛋白質水平時，判定上述患者不重症化之可能性高； 於測定之蛋白質為PRKCB或RHOC之情形時，該蛋白質之水平低於健康正常人或輕症化之患者之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性高； 於測定之蛋白質為CD147、CAPN2、ECM1、及FGG之任一者之情形時，該蛋白質之水平高於健康正常人或輕症化之患者之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性高；且 於測定之蛋白質為MFAP4之情形時，該蛋白質之水平低於健康正常人之蛋白質水平時，判定上述患者重症化之可能性低。
- 如請求項1或2之方法，其中對照蛋白質水平為自健康正常人或未曾重症化之COVID-19患者在感染初期所獲得之血液樣本中之該標記RNA之水平。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其將兩種以上組合使用。
- 如請求項4之方法，其中上述兩種以上之組合為以下（a）或（b）之組合， （a）選自PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS之兩種以上之組合 （b）選自ECM1、CAPN2、FGG、及CD147之兩種以上之組合。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其進而包括測定來自該患者之血液中之一種以上之標記RNA水平， 重症化之可能性係將上述標記蛋白質水平與該標記RNA水平組合而判定， 此處，上述標記RNA係選自以下之群之一種以上之RNA：miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、AL365184.1、let-7c-5p、miR-21-5p、miR-140-3p、及C5orf66-AS2，且 此處，於測得之RNA之水平高於對照RNA水平時，顯示上述患者重症化之可能性高。
- 如請求項6之方法，其中上述標記RNA選自由以下之RNA所組成之群：miR-122-5p、SNORD33、AL732437.2、RNU2-29P、CDKN2B-AS1、及AL365184.1。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其進而包括確定或測定選自該患者之年齡、吸菸指數、血中CRP值、及血中ALT值之一種以上，重症化之可能性係將年齡、吸菸指數、血中CRP值、及/或血中ALT值與上述標記蛋白質水平組合，或與上述標記蛋白質水平及上述標記RNA水平組合而判定， 此處，於年齡、吸菸指數CRP、及ALT之數值均高於作為健康正常人或輕症者之對照之情形時，判定重症化可能性高。
- 如請求項8之方法，其包括藉由選自以下（a）～（d）之組合而判定重症化， （a）選自由PRKCB、RHOC、COPB2、及KRAS所組成之群中之兩種以上之因子 （b）選自由吸菸指數、年齡、及MFAP4所組成之群中之兩種以上之因子 （c）選自由CDKN2B-AS1、AL365184.1、ECM1、CAPN2、CRP、FGG、及CD147所組成之群中之兩種以上之因子 （d）選自由ALT、RNU2-29P、SNORD33、miR-122-5p、及AL732437.2所組成之群中之兩種以上之因子。
- 如請求項1至9中任一項之方法，其進而包括對判定為重症化可能性高之患者進而進行針對重症化之管理或治療。
- 一種COVID-19重症化標記，其係選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種蛋白質。
- 如請求項11之標記，其係選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之至少一種蛋白質。
- 一種COVID-19重症化預測用組合物，其包含一種以上能夠與選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種蛋白質結合之物質。
- 如請求項13之組合物，其包含一種以上能夠與選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、及MFAP4之至少一種蛋白質結合之物質。
- 如請求項14之組合物，其包含兩種以上能夠與上述蛋白質結合之物質。
- 如請求項15之組合物，其包含以下（a）或（b）之組合： （a）選自能夠與PRKCB結合之物質、能夠與RHOC結合之物質、能夠與COPB2結合之物質、及能夠與KRAS結合之物質的兩種以上之組合 （b）選自能夠與ECM1結合之物質、能夠與CAPN2結合之物質、能夠與FGG結合之物質、及能夠與CD147結合之物質的兩種以上之組合。
- 如請求項13至16中任一項之組合物，其中上述物質為抗體或其抗原結合性片段。
- 一種COVID-19重症化預測用套組或COVID-19重症化預測用裝置，其包含如請求項13至17中任一項之組合物。
- 一種測定來自患者之血液來源之胞外體中之蛋白質之水平之方法，該蛋白質選自COPB2、KRAS、PRKCB、RHOC、CD147、CAPN2、ECM1、FGG、MFAP4、ADI1、AK1、MGAT1、CLDN3、CRP、UQCRC2、FGA、FGB、FGL1、GPX1、GSK3B、LBP、PDGFC、RAB13、RAP1B、SLC6A4、UBA7、ORM1、RNPEP、ANGPT1、APOB、B4GALT1、BHMT、CPN1、GNAZ、ICAM2、SELL、MAN1A1、SERPINA5、PACSIN2、NCF1B、TMEM59、YWHAB、ABAT、ADH1B、ASL、ASS1、CDH2、CAB39、CPS1、CD226、COL6A3、CUL4A、DSC1、ENTPD5、EIF4A1、FN1、PGC、RHEB、GNAI2、GNB1、GNA13、ITGA2B、ITGB1、ILK、F11R、LTA4H、LIMS1、NAV2、FAM129B、NNMT、NID1、PPIA、PLA1A、PPBP、PECAM1、GP1BB、PCSK9、MENT、SERPINA10、F2RL3、LOX、SFTPB、RAB5B、RALB、REEP6、RETN、AGXT、CCT2、THBD、ISG15、及ZYX之至少一種，該方法包括： 使來自該患者之血液樣本與如請求項13至18中任一項之組合物接觸。
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