CN117467598B - 肝细胞源pcsk9外泌体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物细胞技术领域，具体涉及一种肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法。雌性SD大鼠通过喂食高脂饲料，得到营养肥胖型大鼠；在低氧环境中，营养肥胖型大鼠进行跑台训练，得到低氧训练肥胖大鼠；其中，低氧环境中的氧浓度为13‑14%，跑台训练是先进行适应性跑台训练再进行中等强度跑台训练；分离低氧训练肥胖大鼠的外周血血清，外周血血清分离得到肝细胞源PCSK9外泌体。本发明获得的外泌体可以调控脂肪组织免疫微环境，消除脂肪组织炎症，为进一步脂肪组织代谢类疾病的药物开发或预防措施提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于动物细胞技术领域，具体涉及一种肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法。
背景技术
目前超重和肥胖持续攀升成为全球性问题，肥胖容易导致高血脂症、动脉粥样硬化、高血压病、糖尿病、冠心病等多种疾病，严重威胁人类健康。最新发布的《中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）》显示，成人（≥18岁）的超重率为34.3%、肥胖率为16.4%，超重/肥胖成年人已过半。按照绝对人口数来计算，全国已经有6亿人超重和肥胖，达到全球第一，肥胖目前已成为中国人群健康的重大挑战，目前尚无有效的手段降脂减重。最近研究证实，IL-27可以直接作用到脂肪细胞，进而激活p38 MAPK/PGC-1a信号通路促进产热关键蛋白解偶联蛋白UCP1的表达实现脂肪动员，可见免疫因子对脂肪细胞脂解有重要的作用。
交感神经和免疫细胞在脂肪组织的脂肪代谢中发挥着重要的作用，交感神经元促进脂肪间充质干细胞释放神经营养因子GDNF，后者调控脂肪组织中II型天然免疫细胞（ILC2）释放IL-5、IL-6和Met-Enk促进脂肪细胞能量消耗，形成一个“神经元-免疫细胞”单元，构成脂肪组织良性代谢微环境。但是超重或肥胖人群脂肪组织中神经元数量明显减少，限制了脂肪组织中“神经元-免疫细胞”单元对脂肪细胞脂解的调控，不能有效形成标准、健康的脂肪组织微环境。
如何重构“神经元-免疫细胞”单元，恢复机体脂肪组织良性微环境，是实现肥胖人群健康生活、降脂减重的首要前提和必要条件；然而合理的运动仍然是目前最佳的降脂减重方式。运动不仅仅可以通过Wnt/β-catenin或AMPK信号通路促进脂肪细胞中脂肪动员，还可以诱导脂肪源干细胞向神经元分化，也可以通过血清外泌体促进神经突触的生长和神经重塑，这为形成“神经元-免疫细胞”单元进而促进脂肪细胞脂解奠定了基础。
研究表明，高原低氧训练不仅能够提升肌肉缓冲能力及机体效能，而且能够显著降低体重和体脂，在许多国家已经被用作肥胖类疾病治疗的方案。低氧训练能够改善脂代谢，降低血脂水平，抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸分解和氧化，这是低氧训练明显降重、减脂的机理机制。
PCSK9是由PCSK9基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏产生，调控血浆胆固醇代谢的重要因子，被认定为高胆固醇血症的治疗靶点，它调控靶细胞LDL受体表达水平。PCSK9最初被鉴定为原蛋白转化酶家族成员之一，在肝脏再生和皮质神经元分化方面起重要作用。最近研究发现，在动脉粥样硬化过程中，PCSK9具有潜在的复杂的调控细胞间通信的作用，例如调控细胞外囊泡传递miRNA。
中国专利CN 115710572 A公开一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：1)采用切向流过滤方法浓缩细胞上清液得到浓缩液；2)采用全能核酸酶对浓缩液进行去核酸处理并经重悬得到粗提液；3)对粗提液进行密度梯度离心，收集外泌体层；4)在离心力小于等于50000g的条件下对外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；5)在离心力大于等于100000g的条件下对初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为外泌体。此专利仅是提高了外泌体的质量，并不涉及PCSK9外泌体的制备。
肥胖尤其是过度肥胖以及并发症严重影响人民群众的身体健康，并且给家庭带来严重的经济负担，但是目前尚无好的办法和药物恢复肥胖人群的脂肪组织健康（神经元生长和免疫细胞良性多样性）和促进脂肪降解。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法，科学合理，简单易行，获得的外泌体可以调控脂肪组织免疫微环境，消除脂肪组织炎症，为进一步脂肪组织代谢类疾病的药物开发或预防措施提供帮助。
本发明所述的肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法，包括如下步骤：
（1）营养肥胖型大鼠模型的构建
雌性SD大鼠通过喂食高脂饲料，得到营养肥胖型大鼠；
（2）低氧训练肥胖大鼠模型的构建
在低氧环境中，营养肥胖型大鼠进行跑台训练，得到低氧训练肥胖大鼠；其中，低氧环境中的氧浓度为13-14%，跑台训练是先进行适应性跑台训练再进行中等强度跑台训练；
适应性跑台训练的条件是跑台速度从11m/min递增到 20m/min，训练时间从20min/d递增到60min/d；
中等强度跑台训练的条件是跑台速度为20m/min，训练时间为每天1小时，每周5天；
（3）PCSK9外泌体的获得
分离低氧训练肥胖大鼠的外周血血清，外周血血清分离得到肝细胞源PCSK9外泌体；
步骤（3）中外周血血清分离的方法是外周血血清通过离心分离得到总外泌体，然后采用PCSK9抗体包被的磁珠分离得到肝细胞源PCSK9外泌体。
步骤（1）中所述的营养肥胖型大鼠的体重超过普通饲料喂养大鼠的体重的20-30%，血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）极显著升高（P<0.01），高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）显著降低（P<0.05）。
步骤（2）中所述的低氧环境中的氧浓度优选为13.6%，氧浓度为13.6%是模拟3500米海拔高度的条件。
步骤（2）中所述的适应性跑台训练的时间为1-2周。
步骤（2）中所述的适应性跑台训练的条件如下：
。
步骤（2）中所述的中等强度跑台训练的时间为4-6周，优选为4周。
步骤（2）中所述的中等强度跑台训练在每天17时开始。
步骤（3）中所述的分离低氧训练肥胖大鼠的外周血清的方法是低氧训练肥胖大鼠麻醉后腹主动脉取血，离心，即得；其中，麻醉是采用10%的水合三氯乙醛（剂量按4ml/kg体重计算）进行麻醉。
脂肪组织中脂肪细胞脂解、新神经元分化和重塑均与血清外泌体前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）高表达密切相关，且PCSK9基因仅在低氧和运动共同干预下才在外泌体中高表达，表明低氧训练大鼠组织（器官）之间存在应答，这一应答通过PCSK9外泌体实现脂肪组织中脂肪细胞脂解，促进“交感神经-免疫细胞”单元重构。
本发明制得的肝细胞源PCSK9外泌体可以促进脂肪组织神经元生长、促进脂肪分解代谢及促进免疫细胞种类多样化。
本发明中低氧训练可以上调肥胖大鼠肝源血清外泌体PCSK9蛋白，分别靶向脂肪组织促进神经元生长和脂肪细胞脂解，重构脂肪组织“神经元-免疫细胞”单元。本发明建立了PCSK9外泌体的制备体系，获得的外泌体回输动物体或者人体后，可以实现脂肪降解和减重、避免神经元损伤和免疫失衡的目的。
本发明制得的肝细胞源PCSK9外泌体仅在低氧和运动训练同时存在条件下才能形成，同时受到运动强度、时长、低氧环境等严格限制，外泌体分离自外周血，PCSK9外泌体采用包被PCSK9抗体的磁珠捕获，该PCSK9外泌体可以靶向附睾旁脂肪组织，促进组织神经元生长、脂肪代谢和免疫微环境多样性形成。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明采用低氧环境与运动结合的方式生产外周血外泌体，并分离提取到PCSK9外泌体，该外泌体可以实现脂肪组织中神经元的生长、免疫细胞多样性和脂肪分解代谢。
（2）本发明提供了一种重构脂肪组织“神经元-免疫细胞”微环境的肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法，确定了利用营养型肥胖大鼠生产该外泌体最佳的低氧环境和运动方案。
（3）本发明建立了完整的PCSK9外泌体生产、分离和纯化方案，有利于后期的规模化生产，以及改造后在肥胖人群上的应用，或者进一步研究肥胖动物模型的脂肪代谢。
（4）本发明的PCSK9外泌体靶向脂肪组织，解决了肥胖个体脂肪组织中炎症发生、免疫功能紊乱、神经元缺少等诸多问题，可以用于肥胖相关疾病及其他疾病的防治，并能为类似外泌体的开发提供参考。
附图说明
图1是各组大鼠指标对比图，图中，A：总胆固醇（TC）在各组大鼠血清中含量图；B：甘油三酯（TG）在各组大鼠血清中含量图；C：低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）在各组大鼠血清中含量图；D：高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）在各组大鼠血清中含量图，代表差异显著（p<0.05）；/>代表差异极显著（p<0.01）。
图2是营养肥胖型大鼠训练方案图。
图3是实验干预后各组大鼠指标对比图，图中，A：干预后各组大鼠体重对比图；B：干预后各组大鼠Lee’s指数对比图；C：干预后各组大鼠脂体比对比图，代表差异显著（p<0.05）；/>代表差异极显著（p<0.01）。
图4是大鼠血清PCSK9外泌体蛋白质组学分析图，图中，A：外泌体电镜图；B：外泌体Western blot鉴定图；C：各组大鼠血清外泌体总蛋白含量图，代表差异显著（p<0.05）。
图5是大鼠血清PCSK9外泌体蛋白质组学质谱分析图，图中，A：HE/CE组蛋白质组学质谱分析图；B：HE/H组蛋白质组学质谱分析图；C：HE/C组蛋白质组学质谱分析图；D：H/C组蛋白质组学质谱分析图；E：CE/C组蛋白质组学质谱分析图；箭头标注处代表外泌体蛋白PCSK9的高表达。
图6是PCSK9外泌体的免疫荧光定位图。
图7是大鼠附睾脂肪组织中细胞因子变化图，图中，ns代表无显著差异，代表差异极显著（p<0.001）；/>代表差异极显著（p<0.0001）。
图8是附睾旁脂肪组织中的神经元和免疫细胞的免疫荧光定位图。
图9 是脂肪组织中各细胞变化分析图，图中，A：流式细胞仪分离间充质干细胞、免疫细胞和内皮细胞图；B：A中免疫细胞亚群中各种免疫细胞的变化分析图。
图10是实时定量PCR实验结果图，图中，ns代表无显著差异，代表差异极显著（p<0.01）。
图11是研究PCSK9外泌体来源实验图，图中，A：肝脏组织RNA-seq实验结果的GO分析图；B：在String网站对PCSK9基因表达的转录因子预测图；C：Western blot实验检测肝脏组织中PCSK9和SREBF2蛋白表达情况图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
（1）营养肥胖型大鼠模型的构建
70只3周龄健康雌性SD大鼠，体重57±5g，均购买于武汉华联科生物技术有限公司。实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104；动物合格证号：No.42010200002516；设施使用证号：No.00279229。在适应性喂养3天后，随机选取10只作为普通饲料对照组，其余大鼠喂养高脂饲料构建肥胖大鼠模型（8周）。大鼠饲养在屏蔽级动物房，保持环境清洁、通风，环境温度23±2℃，相对湿度55±2%，昼夜循环时间12小时，期间自由采食、饮水。每周定时测量体重和体长，记录摄食量。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。
8周后选取体重超过普通饲料对照组20-30%的营养肥胖型大鼠作为研究模型组（PC Chandler, et al. Feeding response to melanocortin agonist predictspreference for and obesity from a high-fat diet, Physiol Behav. 2005;85(2):221-30），模型组40只大鼠（肥胖对照组）血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和 低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）指标极显著（P<0.01）升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）显著（P<0.05）降低（图1）。40只大鼠随机分为4组，每组10只：常氧安静组（C）、常氧训练组（CE）、低氧安静组（H）和低氧训练组（HE）。
（2）低氧训练肥胖大鼠模型的构建
干预计划为期4周，安静组大鼠不实施干预，保持笼内正常活动，低氧组大鼠全天生活在氧浓度为13.6%的低氧仓中（模拟海拔 3500 米居住环境）。
训练组大鼠进行跑台训练，跑台训练是先进行适应性跑台训练再进行中等强度跑台训练；
适应性跑台训练的条件如下：
。
中等强度跑台训练的条件是跑台速度为20m/min，训练在每天17时开始，每天1小时，每周5天，共4周。
营养肥胖型大鼠训练方案图见图2。
营养肥胖型大鼠4周实验干预后，常氧训练组和低氧训练组体重、Lee’s指数和脂体比等均有显著下降（p<0.01），见图3，其中低氧训练组的脂体比下降最明显，与常氧训练组形成显著对比（p<0.01），说明运动结合低氧最有利于减重降脂。
在实验干预后，常氧训练组、低氧安静组和低氧训练组大鼠的血脂指标比常氧安静组均有显著变化（p<0.01），表现在血清TC、TG和LDL-C含量下降，而参与胆固醇逆向转运的血清HDL-C含量上升，结果见图1。以上结果说明低氧和运动的干预方式可从不同程度改善大鼠的肥胖，其中低氧结合运动的效果最明显。
（3）外周血血清外泌体分离及PCSK9外泌体纯化
①大鼠用10%的水合三氯乙醛（剂量按4ml/kg体重计算）麻醉，腹主动脉取血，4℃离心2次（第一次，9400rpm 10min；第二次，13200rpm 10min）得到血清，先液氮存放12h，再-80℃冻存。
②取出300μl血清使其在冰上慢慢融化，2000g 4℃离心20min，小心吸取上清，10000g 4℃离心20min，小心吸取上清。
③用5ml 4℃PBS稀释上清，0.2μl滤膜过滤，再120000g 4℃离心2h。
④小心吸取上清（注意备留），管底大约留取500-1000μl沉淀物。
⑤用5ml 4℃PBS重悬沉淀物，120000g4℃离心2h。
⑥小心吸取上清，沉淀物用200μl 4℃PBS重悬或留200μl液体并重悬，得到外泌体悬液，4℃保存（不超过3天）或-80℃冻存。
⑦用包被PCSK9抗体的磁珠与外泌体悬液混合，置于4℃过夜后分离磁珠，洗脱磁珠上的外泌体，即获得PCSK9外泌体。
（4）大鼠血清PCSK9外泌体蛋白质组学分析
鉴于血清外泌体来源比较复杂，本发明分离各组大鼠血清外泌体，送上海吉玛制药技术有限公司进行外泌体蛋白质组学分析，分离的外泌体经电镜和标志物蛋白的western blot检测无误，进行下一步分析，结果显示HE组大鼠血清外泌体总蛋白含量比其他各组降低（图4C），这是因为低氧状态下产能减少导致蛋白翻译效率降低。蛋白质组学质谱分析发现，HE组和CE组间外泌体中有表达差异的蛋白有23种，其中，在HE/CE组中，有8种蛋白表达上调，15种蛋白表达下调，其中外泌体PCSK9表达显著增强；并且在HE/CE组、HE/H组和HE/C组中PCSK9均表达上调，进一步分析证实外泌体中PCSK9只有在低氧和训练两种干预同时存在时才表达（图5）。
（5）PCSK9外泌体靶向脂肪组织细胞
构建营养肥胖型雄性大鼠模型，将PCSK9外泌体经尾静脉注射至新构建的营养肥胖型雄性大鼠体内，24h后断颈处死，解剖分离附睾旁脂肪组织，立即用OCT对组织进行包埋、液氮冷冻、储存于-80℃。因为附睾旁脂肪组织是典型的脂肪类内分泌器官，与全身各脂肪组织中脂肪代谢、细胞因子分泌密切相关，所以为了研究外泌体对雄性大鼠机体脂肪组织代谢的影响，一般将其作为典型代表。
本发明为了了解PCSK9外泌体的靶向性，对脂肪组织冷冻切片中的PCSK9外泌体进行免疫荧光定位分析，细胞核用DAPI染色，PSCK9蛋白一抗是Anti-PCSK9 antibody(ab31762)，用二抗Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 647) (ab150075)进行显色，结果如图6显示，PCSK9外泌体在脂肪组织的脂肪细胞周围富集，说明该外泌体靶向脂肪组织。
（6）大鼠附睾脂肪组织细胞因子变化
将PCSK9外泌体100μg（浓度1μg/μl）经尾静脉注射至营养肥胖型雄性大鼠体内，构建注射PCSK9外泌体组大鼠模型（5只），同时注射100μl PBS缓冲液至另一组营养肥胖型雄性大鼠尾静脉构建肥胖大鼠对照组（5只）。24h后断颈处死，分离附睾旁脂肪组织，剪碎，置于PBS缓冲液放置12h，分别用ELISA实验检测神经元相关因子多巴胺和神经生长营养因子GDNF在肥胖大鼠对照组和注射PCSK9外泌体组间的表达变化，证实两个因子在注射PCSK9外泌体组显著升高；同时检测免疫细胞因子IL-5、IL-13、IL-27和TNF-α，发现IL-13在注射PCSK9外泌体组显著高于肥胖大鼠对照组，而IL-27在注射PCSK9外泌体组显著低于肥胖大鼠对照组，IL-5和TNF-α并无显著差异（图7）。
构建营养肥胖型雄性大鼠模型，随机分为肥胖对照组（5只）、非PCSK9外泌体组（其他外泌体组，5只）和注射PCSK9外泌体组（5只），肥胖对照组大鼠尾静脉注射100μl PBS缓冲液，非PCSK9外泌体组大鼠尾静脉注射100μl不含PCSK9外泌体的其他外泌体，即（3）部分第⑦步中分离纯化PCSK9外泌体后的剩余外泌体，注射PCSK9外泌体组大鼠尾静脉注射100μlPCSK9外泌体，24h后断颈处死，分离附睾旁脂肪组织，立即用OCT对组织进行包埋、液氮冷冻、储存于-80℃。然后制作冷冻切片，对脂肪组织中的神经元（GFAP Marker）和免疫细胞（CD45 Marker）进行免疫荧光分析，结果显示注射PCSK9外泌体组大鼠脂肪组织中的神经元明显增多，免疫细胞总量变少（见图8）。通过以上两个实验可知神经元在生长，脂肪细胞发生脂解和免疫细胞多种类正在恢复。
（7）大鼠附睾脂肪组织免疫细胞变化
将（6）中非PCSK9外泌体组（其他外泌体组，5只）和注射PCSK9外泌体组（5只）肥胖大鼠尾静脉注射24h后断颈处死，分离附睾旁脂肪组织，采用剪碎、消化、细胞筛过滤及离心的方法分离细胞备用。过细胞筛（100μm）后流式细胞仪筛选技术分离间充质干细胞、免疫细胞和内皮细胞（图9A）；免疫细胞进一步亚群分析，结果显示注射PCSK9外泌体组脂肪组织中嗜中性粒细胞减少，活性CD8+ T cell、活性CD4+ T cell、Treg cell、NK cells Resting等等炎症促进免疫细胞减少（图9B）。说明低氧训练改善脂肪组织炎症，调节免疫细胞种类良性平衡。
（8）HE组大鼠肝细胞外泌体形成增强
为了了解低氧运动状态下血清中PCSK9外泌体的主要来源，本发明将（2）中运动干预后的大鼠（HE组和CE组）分离肝脏、骨骼肌、肾脏和皮下脂肪，每种组织取1g置于玻璃匀浆器中，加入2ml PBS缓冲液进行匀浆，待匀浆成单细胞悬液后，取1.5ml细胞悬液置于1.5ml的EP管中，在低温高速离心机中4℃、12000rpm离心1min，收集细胞沉淀加入1ml Trizol溶解细胞，然后按照总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录成cDNA后进行实时定量PCR实验分析各个组织中PCSK9基因表达情况，结果如图10所示，在肝脏细胞中PCSK9基因表达显著上调，说明血清PCSK9外泌体主要来自于肝脏组织。
而后将HE组大鼠肝脏组织送生工生物工程(上海)股份有限公司进行RNA-seq分析，GO分析结果显示，肝脏细胞中外泌体形成相关的6-磷酸甘露糖代谢过程显著提高（mannose-6-phosphate isomerase activity、mannoprotein metabolic process、mannoprotein biosynthetic process）、外泌体分泌（extracellular exosome）显著增强（图11A标记处），高通量RNA-seq结果证实低氧训练环境下，大鼠肝脏组织中外泌体生成和分泌增强，间接说明PCSK9外泌体来自肝脏的可行性。
本发明为进一步了解肝脏组织中PCSK9蛋白及外泌体形成的机制，在String网站对PCSK9基因的相互作用网络进行分析，发现转录因子SREBF2对PCSK9的表达具有直接调控作用（图11B）。
而后对CE组和HE组大鼠肝脏组织中PCSK9和SREBF2蛋白表达情况进行Westernblot分析，结果显示PCSK9和转录因子SREBF2共表达且在低氧运动环境下（HE组）的肝细胞中蛋白上调表达（图11C），实验直接证实了低氧运动诱发肝脏细胞中PCSK9基因加强表达，形成PCSK9外泌体进入大鼠血液，确定了PCSK9外泌体在HE组大鼠机体的来源。
本发明建立了PCSK9外泌体生产体系，并对其蛋白质组分进行研究，探明了其在神经元生长、免疫细胞调控和脂肪分解代谢等方面的功能，该类外泌体回输机体后，可以解决肥胖组织中神经元损伤、免疫紊乱和炎症发生等不良问题，而且还可以促进脂肪组织分解代谢。
Claims (2)
1.一种肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）营养肥胖型大鼠模型的构建
雌性SD大鼠通过喂食高脂饲料，得到营养肥胖型大鼠；
（2）低氧训练肥胖大鼠模型的构建
在低氧环境中，营养肥胖型大鼠进行跑台训练，得到低氧训练肥胖大鼠；其中，低氧环境中的氧浓度为13.6%，跑台训练是先进行适应性跑台训练再进行中等强度跑台训练；
适应性跑台训练的条件是跑台速度从11m/min递增到 20m/min，训练时间从 20min/d递增到60min/d；
中等强度跑台训练的条件是跑台速度为20m/min，训练时间为每天1小时，每周5天；
（3）PCSK9外泌体的获得
分离低氧训练肥胖大鼠的外周血血清，外周血血清分离得到肝细胞源PCSK9外泌体；
步骤（3）中外周血血清分离的方法是外周血血清通过离心分离得到总外泌体，然后采用PCSK9抗体包被的磁珠分离得到肝细胞源PCSK9外泌体；
步骤（2）中适应性跑台训练的条件如下：
；
步骤（2）中中等强度跑台训练的时间为4周；
步骤（2）中中等强度跑台训练在每天17时开始。
2.根据权利要求1所述的肝细胞源PCSK9外泌体的制备方法，其特征在于步骤（3）中分离低氧训练肥胖大鼠的外周血清的方法是低氧训练肥胖大鼠麻醉后腹主动脉取血，离心，即得。
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2023
- 2023-12-28 CN CN202311824894.1A patent/CN117467598B/zh active Active
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