CN103374628B - 先天性心脏病相关基因fam71a及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了先天性心脏病相关基因FAM71A及其应用。具体地，本发明提供了一种检测先天性心脏病易感性的方法，它包括检测个体的FAM71A基因、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患先天性心脏病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，尤其是产前诊断试剂盒。

Description

先天性心脏病相关基因FAM71A及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及先天性心脏病相关基因FAM71A(英文：family with sequence similarity 71，member A，简称FAM71A)的单核苷酸变异(single nucleotide variation，SNV)及其与先天性心脏病的相关性。本发明还涉及检测这些SNV的方法和试剂盒。

背景技术

先天性心脏病(Congenital Heart Defeats，CHD)是胎儿期心脏及大血管发育异常引起的先天畸形，是最为常见的先天畸形之一。由于病情严重，合并症多，治疗复杂，也是导致新生儿死亡最常见的缺陷之一。CHD在胎儿中的发病率高达50‰。我国1岁以下婴儿和1-5岁幼儿的死因分析结果表示，先天性心脏病的死亡率在城市和农村地区均居前两位。大多数CHD的病因十分复杂，现有病因学证据十分有限。而CHD早发现、早治疗，可显著提高儿童的生存率和生活质量。建立新生儿CHD的有效筛查、随诊机制，可以使越来越多的CHD得以及时发现，尽早得到专业防治。因此，探索先天性心脏病的致病根源以及发病机制，及早诊断并有效干预治疗，同时针对性开展药物研发，对于优生优育，提高国民综合素质具有重大意义。

目前普遍认为，由遗传因素和环境因素共同导致，并具有遗传异质性。研究表明，除了外界因素如酒精、维甲酸、抗痉挛药以及母体疾病会导致CHD的发生，遗传因素也发挥了相当大的作用[McBride，K.L.and V.Garg，Impact of Mendelian inheritance incardiovascular disease.Ann N Y Acad Sci.2010.1214：p.122-37；Jenkins，K.J.，etal.，Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects：currentknowledge：a scientific statement from the American Heart Association Councilon Cardiovascular Disease in the Young：endorsed by the American Academy ofPediatrics.Circulation，2007.115(23)：p.2995-3014.]。导致CHD的遗传因素包括染色体畸变、单基因突变以及拷贝数变异等[Richards，A.A.andV.Garg，Genetics of congenitalheart disease.Curr Cardiol Rev，2010.6(2)：p.91-7.]。过去的几十年中，随着分子遗传学技术的发展以及家系样本的运用，多个可能导致CHD或者其他综合症并发CHD的基因已经被发现，如NKX2-5，GATA4，PTPN11，JAG1以及TBX5等[Schott，J.J.，et al.，Congenitalheart disease caused by mutations in the transcription factor NKX2-5.Science，1998.281(5373)：p.108-111；Garg，V.，et al.，GATA4 mutations cause humancongenital heart defects and reveal an ineraction with TBX5.Nature，2003.424(6947)：p.443-7；Tartaglia，M.，et al.，Mutations in PTPN11，encoding the proteintyrosine phosphatase SHP-2，cause Noonan syndrome.Nature Genetics，2001.29(4)：p.465-468；Li，L.H.，et al.，Alagille syndrome is caused by mutations in humanJagged1，which encodes a ligand for Notch1.Nature Genetics，1997.16(3)：p.243-251；Oda，T.，et al.，Mutations in the human Jagged1 gene are responsible forAlagille syndrome.Nature Genetics，1997.16(3)：p.235-42.；Basson，C.T.，et al.，Mutations in human TBX5cause limb and cardiac malformation in Holt-Oramsyndrome(vol l5，pg30，1997).Nature Genetics，1997.15(4)：p.411-411.]。这些遗传因子在导致CHD中都呈现出单基因遗传模式[Wessels，M.W.and P.J.Willems，Geneticfactors in non-syndromic congenital heart malformations.Clinical Genetics，2010.78(2)：p.103-23.]。

虽然已有40多个基因被证实可能与CHD发病有关，但散发病例以及非综合症病例的病因依旧不明朗。例如一个CHD致病明星基因NKX2-5，在家族性先天性心脏病病人中(ASD，VSD，TOF等)，已有40多个高外显率的突变被报道，而在散发病人，仅发现了6个低外显率突变[Garg，V.，et al.，GATA4 mutations cause human congenital heart defectsand reveal an interaction with TBX5.Nature，2003.424(6947)：p.443-7.]。这种强烈对比表明，由于胎儿心脏发育是一个复杂而又精密的过程，此间数千个分子协同作用且任何一个变异均可能导致心脏发育异常，所以散发病例中，CHD的发生可能是多个遗传因素导致的。因此，寻找CHD治病基因的难点可能存在于如何采用高效的手段对于散发CHD人群进行全基因组扫描。

越来越多的证据表明，罕见突变往往是一些常见疾病的元凶[Cirulli，E.T.andD.B.Goldstein，Uncovering the roles of rare variants in common disease throughwhole-genome sequencing.Nature Reviews Genetics，2010.11(6)：p.415-425.]。此外，大约98％人类基因组由重复序列、基因间序列和非编码序列组成。全基因组测序，基因组变异丰富、分析复杂，真正突变往往淹没在大量变异和序列匹配错误中，并且成本依然很高。因此，基因组测序寻找致病基因突变集中于基因编码区效率更高。事实上，对遗传性疾病和一些散发的疾病而言，已经发现的疾病基因突变多集中于编码区。因此，目前阶段外显子测序是寻找遗传性疾病致病基因更为有效的方法。

先天性心脏病作为一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找其相关基因进而阐明先天性心脏病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。

虽然已有许多关于各种基因变异与先天性心脏病的研究，但没有证实FAM71A基因与先天性心脏病相关性的报道，更没有证实FAM71A基因的SNV与先天性心脏病相关性的报道。

综上所述，为了尽早诊断先天性心脏病，本领域迫切需要寻找先天性心脏病易感基因，并开发检测先天性心脏病的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)先天性心脏病的方法及检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种FAM71A基因或其单核苷酸变异在制备检测先天性心脏病的试剂或试剂盒中的用途，其中所述的单核苷酸变异SNV是：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)FAM71A基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的特异性引物具有SEQ ID NO：3-12中所示的序列，更佳地为SEQ ID NO.：5和6构成的引物对。

在另一优选例中，所述的试剂盒是产前诊断试剂盒。

在本发明的第二方面，提供了一种检测先天性心脏病的试剂盒，它包括特异性扩增FAM71A基因或转录本的引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，它还含有选自下组的试剂：

(a)与所述SNV位点的结合的探针；

(b)识别所述SNV位点的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物是序列为SEQ ID NO：3-12的引物，更佳地为SEQ ID NO.：5和6构成的引物对。

在本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品是否存在FAM71A的单核苷酸变异的方法，包括步骤：

(a)用FAM71A基因特异性引物扩增样品的FAM71A基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物是序列为SEQ ID NO：3-12的引物，更佳地为SEQ ID NO.：5和6构成的引物对。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp，且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第四方面，提供了一种对个体的先天性心脏病易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

(i)检测该个体的FAM71A基因、转录本和/或蛋白，并与正常的FAM71A基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患先天性心脏病的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，在步骤(i)中检测FAM71A的基因或转录本，并与正常FAM71A核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的个体是人。

在本发明的第五方面，提供了一种试剂在制备检测检测先天性心脏病的试剂盒的用途，其中所述试剂选自下组：

(a)FAM71A基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片；或

(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒是产前诊断试剂盒。

在本发明第六方面，提供了一种人FAM71A基因的用途，它被用于制备检测先天性心脏病的试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括特异性扩增FAM71A基因或转录本的引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，还含有选自下组的试剂：

(a)与所述SNV位点的结合的探针；

(b)识别所述SNV位点的限制性内切酶。

在本发明的第七方面，提供了一种分离的FAM71A核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示，并且具有一个或多个选自下组的突变：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第八方面，提供了一种分离的FAM71A氨基酸序列，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示，并且具有一个或多个选自下组的突变：

Arg90X、Pro91Thr、Leu122Pro、Ala358Thr、Lys448Glu、Ser508Pro；

其中，X表示终止，且氨基酸位置编号基于SEQ ID NO：2。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了FAM71A在217个散发先天性心脏病病人中突变分析。

图2显示了FAM71A在心脏和细胞系中表达。

图3显示了FAM71A在细胞亚结构中的定位。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNV进行了测定和分析。首次发现和证明了FAM71A的基因组序列与先天性心脏病密切相关，因此可作为辅助性检测先天性心脏病(或其易感性)的特异性SNV。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过全基因组外显子测序技术在66个先天性心脏病患者样本(样本采自河北省三甲医院)组成的4个混合样本中发现该该基因5个位点发生功能性变异，通过Sequenom Mas s Array platform验证后，采用Sanger测序和二代测序相结合的手段，在217个散发病人样本中共发现6个杂合点突变，并且在800个正常人样本中均未发现上述变异，显著性为P＝8.932e^-5，这充分证明FAM71A是一种先天性心脏病的致病基因。本发明为先天性心脏病的辅助分子诊断、分子分型、产前诊断、药物靶点选择和临床治疗提供了依据。

FAM71A基因

FAM71A(family with sequence similarity 71，member A)位于人第1号染色体，其序列是已知的。其详细序列和一些相关信息可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。

FAM71A的基因组序列全长共2.3kb，共1个外显子。编码蛋白由594个氨基酸组成，目前为止关于该基因研究较少。

为了方便起见，在SEQ ID NO：1给出FAM71A中与本发明SNV相关的核苷酸序列，其中起始密码子从第1位atg开始。FAM71A的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示。

本发明人通过全外显子组测序技术、Sanger测序技术和Sequenom质谱分析技术发现了一种先天性心脏病致病基因FAM71A，并揭示和证实了多种与先天性心脏病易感性关联性非常高的SNV。

具体而言，本发明揭示了该基因在217个CHD散发病人中共6个位点发生杂合错意突变，并且在800个正常人中均未发现。如下表1所示：

表1：FAM71A在217个散发先天性心脏病病人中突变分析

注：

ASD＝房间隔缺损

DORV＝右室双出口

PDA＝动脉导管未闭

PS＝肺动脉狭窄

TOF＝法洛氏四联症

VSD＝室间隔缺损

VSD&ASD＝室间隔缺损同时房间隔缺损

VSD&PH＝室间隔缺损同时肺动脉高压

FAM71A基因的应用

基于本发明的新发现，FAM71A基因、蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：用于辅助性诊断先天性心脏病，或用于筛选促进FAM71A蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。

另一方面，本发明还包括对人FAM71A DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人FAM71A基因产物或片段。较佳地，指那些能与人FAM71A基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人FAM71A蛋白的分子，也包括那些并不影响人FAM71A蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人FAM71A基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人FAM71A蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人FAM71A蛋白功能的抗体以及不影响人FAM71A蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人FAM71A基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人FAM71A基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产

抗人FAM71A蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人FAM71A蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗FAM71A抗体是不识别正常FAM71A但识别突变FAM71A的抗体，或者识别正常FAM71A但不识别突变FAM71A的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的先天性心脏病易感性检测。

利用本发明FAM71A蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与FAM71A蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还涉及定量和定位检测人FAM71A蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在FAM71A蛋白的方法是利用FAM71A蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与FAM71A蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在FAM71A蛋白。

FAM71A蛋白的多聚核苷酸可用于FAM71A蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，FAM71A蛋白的多聚核苷酸可用于检测FAM71A蛋白的表达与否或在疾病状态下FAM71A蛋白的异常表达。如FAM71A DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断FAM71A蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用FAM71A蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测FAM71A蛋白的转录产物。

检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。FAM71A蛋白突变的形式包括与正常野生型FAM71A DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNV的方法，是通过用FAM71A基因特异性引物扩增样品的FAM71A基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在表1所示的单核苷酸变异。例如，可通过测序或特异性探针进行检测。

应理解，在本发明首次揭示了FAM71A基因的SNV与先天性心脏病的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNV位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在本发明所揭示的SNV或突变。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNV的对应位置。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第318位。

本发明的主要优点在于：

首次揭示了一种新的先天性心脏病的致病基因FAM71A。由于本发明基因突变与先天性心脏病具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期辅助性诊断先天性心脏病，而且可以未雨绸缪地在产前进行诊断，指导优生优育，从而提高胎儿存活率，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。此外，本发明的有利于阐述CHD的发病机制，对于疾病的研究以及CHD药物研发提供依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

1.1样本准备

217个先天性心脏病人血样均采自河北省三甲医院。所有病人都经过资深心脏科医生诊断，临床表型均通过标准超声心电图以及其他测试确定。充分了解并收集患者临床信息以及家族病史。217人中有3人患有唐氏综合症，其他214人均未患有任何综合症。大多数患者接受过心导管手术。

所有患者或其监护人充分知情并同意采集其血样进行遗传学研究，本研究也通过了中科院上海生命科学研究院健康科学研究所伦理委员会批准。

作为对照的样本(500例)采自临床确定不患有先天性心脏病的正常人，知情并且同意采用其血样进行遗传学研究。

采用QIAamp DNA Blood小抽试剂盒抽提血样基因组DNA，NanoDrop测浓度。

217例先天性心脏病样本，分有多种亚型，其中最常见的是VSD、PDA、TOF、ASD四种亚型，部分患者同时患有两种或者两种以上亚型。

从上述样本中选择了20个VSD病人、19个PDA病人、9个TOF病人以及18个ASD病人的基因组DNA分别混合成4个库。且每个库中每个病人DNA量控制相等。选取标准是1、DNA样本质量比较高2、对应患者只表现其中一种亚型临床性征。

其中，与FAM71A基因相关的病人样本信息如下(仅列出该基因发生突变的病人样本)。

表2：病人样本信息

病人编号	性别	诊断结果	染色体组型	CNVs检测	混合样本的外显子组测序
						97	M	TOF	正常	/	/
118	M	ASD	正常	/	Pool4
						132	F	VSD	正常	/	Pool1
182	M	ASD	正常	/	/
						188	F	VSD	正常	/	/
195	M	VSD，PH	正常	/	/

2、全基因组外显子测序

采用NimbleGen 2.1M human exome array捕获基因组DNA样本外显子区，每个样本中180,000个外显子被富集。随后这些富集的DNA样本被随机打断，在片段两端分别连接上接头制备杂交文库。文库经纯化后经过LM-PCR的线性扩增与Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即用Illumina GenomeAnalyzer II测序。

测序结果平均片段大小为75bp。外显子组测序数据如下：

表3：4个混合样本外显子测序结果

外显子捕获数据	Pool1	Pool2	Pool3	Pool4
					混合样本数	20	19	9	18
全长(bp)	6667566876	6816327380	6552956536	6358639428
					原始读序数	82214918	84305890	80384124	78573962
定位到基因组中的序列	80680618	81931344	79376178	77724534
					可定位到基因上的序列百分比(％)	98.13	97.18	98.75	98.92
定位到靶区域的读序数量	47545038	51944774	54103261	54873136
					定位到靶区域的读序比例(％)	57.83	61.61	67.31	69.84
靶区域的平均深度	87.36	95.88	100.08	100.25
					靶区域的覆盖率(％)	99.73	99.73	99.69	99.6

3、碱基定位和变异分析

通过全基因组外显子测序，本发明人总共获得了26G的碱基对，其中98.3％的碱基可以定位到参考基因组上，平均测序深度为95.9。通过MAQ(version 0.7.1)将测序获得碱基定位到数据库的参考序列上(UCSC hg18)。针对样本数为20，19，18，9的混合样，使用的MAQ参数分别为-N40，38，36，18。过滤掉dbSNP132中的位点以获得新的变异。

基于NCBI和UCSC数据库，使用SeattleSeqAnnotation对新发变异进行注释，最终获得的变异数据如下表所示：

表4：外显子测序变异结果分析

注：1.候选SNV指数据分析过程后共获得的SNV；

2.验证的SNV指用sanger或者质谱的办法验证为阳性的SNV；

4、使用sequenom进行测序结果验证和基因型鉴定

利用MassArray Assay Design 3.1设计PCR引物以及延伸引物。Sequenom验证失败的位点采用Sanger测序法验证。多重PCR实验，SAP反应以及iPLEX反应采用iPLEX试剂盒，Sequenom过程根据常规操作手册进行，每个反应加入基因组DNA的量为5-10ng。延伸产物利用MassArrayNanodi spenser滴加到SpectroCHIP II-G384芯片上，随后芯片装载到MassArray Analyzer分析仪获取光谱。光谱数据分析软件用市售的MassArrayTyper 4.0。

最终确定FAM71A基因在VSD病人组成的混合样本1中有1个位点发生nonsense无义突变(导致蛋白被截断)因为该蛋白较小，且无义突变所导致的蛋白被截断会在很大程度上改变蛋白的结构和功能，故挑选作为先天性心脏病重点候选基因进一步分析。

5、Sanger测序分析FAM71A在217个样本中的突变情况，

采用普通Sanger测序法，PCR引物如下：

PCR采用TouchDown法，程序如下：

扩增产物用ExoSAP-IT(USB)进行纯化，BigDye Terminator(ABI)测序反应，程序如下：

产物用乙醇沉淀法纯化，随后ABI 3730Genetic Analyzer进行测序分析。测序结果Chromas打开分析。发现新变异随后重新PCR、测序以过滤假阳性。

6、统计学分析

针对CHD散发病人中发现的6个突变位点，本发明人在800个正常人中进行筛查(400个未发表外显子测序数据，400个Sequenom数据)均未发现上述突变，以排除单核苷酸多态性(SNP，Singer Nucleotide Polymorphism)的可能性。CHD患者和正常人之间差异性分析采用双尾t检验分析(R统计软件)。

7、RT-PCT分析FAM71A表达谱

提取人心脏组织RNA后用RNase-free的RQ1Dnase((Promega)消化以排除DNA污染，反转采用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)，引物如下：

8.结果

6个突变位点见表1。在217个CHD散发病人中共5个位点发生杂合错意突变和1个位点发生杂合无义突变(见图1)，并且在800个正常人中均未发现。统计学分析具有显著性(P＝8.932e^-5)。

值得注意的是，大多数突变均集中在房间隔缺损和室间隔缺损(VSD，ASD)，这提示FAM71A突变可能导致心脏隔膜缺损。

RT-PCR结果表明，FAM71A在心脏组织和一些细胞系中均有表达(见图2)

实施例2

先天性心脏病易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO：1中表1中所示的突变与先天性心脏病疾病密切相关。因此，可基于这些突变设计FAM71A基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患先天性心脏病的对象、已知患先天性心脏病病人和经检测无先天性心脏病的正常人。

抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将先天性心脏病检测试剂盒中的PCR引物稀释到2μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRIS^TM 377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Chromas软件进行序列的判读和SNV确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出表1中所示的突变。

检测结果：

对于FAM71A存在表1中所示的突变的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患有先天性心脏病情况。检测结果表明，含突变的检测对象的先天性心脏病易感性比例明显高于正常人群(高出至少2倍)。

这表明通过检测FAM71A的突变，可进行先天性心脏病的辅助性检测和/或早期诊断。

实施例3

先天性心脏病易感性辅助性检测

制备一试剂盒(300人次)，它含有：

重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了180个人的样本(检测前不知道是否有先天性心脏病症状)进行检测。其中，部分样本是血液样本(制备方法同实施例1)，部分样本是羊水穿刺样本。

羊水样本的制备：利用羊水穿刺手术，采集羊水获得羊水细胞来进行候选基因基因突变分析。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从所述羊水中提取DNA。

将先天性心脏病检测试剂盒中的PCR引物稀释到2μmol/μl，以所提取的各样本的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Chromas软件进行序列的判读和SNV确认。

结果检测出3名对象在本发明的SEQ ID NO：1的第200-400位存在表1中所示的SNV(纯合)，进一步通过常规方法确认，其中有2个样本来自患有先天性心脏病的对象。

实施例4

FAM71A及其突变体的准备

用下表中所示的引物，以常规方法抽提的基因组DNA为模板，用常规PCR方法扩增获得FAM71A野生型以及其截短型突变体的扩增产物，N端接上Myc标签后重组到pTriEX-HisMyc载体(购自上海吉然生物科技有限公司)上，获得表达载体。

载体构建过程如下所述，以pTriEX-HisMyc+FAM71A-WT为例：

1、使用HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen，Cat.203205)从正常人基因组DNA中扩增FAM71A的编码区。

反应结束后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查是否为目的条带。用AxyPrep^TMPCR Cleanup Kit(Axygen，Cat.AP-PCR-50)纯化PCR产物。

对扩增产物进行EcoRI/BamHI酶切，与同样双酶切后的pTriEX-HisMyc vector连接。用连接产物转化常规的大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自Tiangen公司)。用常规方法抽提质粒，质粒DNA送去测序检测其是否存在突变，其余的置于-20度冰箱保存。

用常规方法进行免疫荧光检测细胞定位。

结果：

为了研究Arg90X这个变异对FAM71A造成的影响，本实施例构建了FAM71A的野生型表达载体(pTriEX-HisMyc+FAM71A-WT)以及FAM71A截短体的表达载体(pTriEX-HIsMyc+FAM71A-truncate)。将这两种载体转染进常规的293T细胞，看它们在细胞亚结构中的定位情况。

免疫荧光实验的结果显示，野生型的FAM71A是入核表达的，而其截短体却不能进核，只能在细胞质中表达，这说明Arg90X这个变异彻底改变了FAM71A在细胞亚结构中的定位。(图3)

应用

本发明方法特别适用于产前诊断。羊水穿刺可用于获取胎儿基因组DNA，用于胎儿疾病预测。由于胎儿基因组DNA有一半来自父本，一半来自母本，因此胎儿父母任一方(或家族中其他成员)患有先天性心脏病，则有必要进行产前诊断。尤其是当胎儿父母任一方(或家族中其他成员)证明携带FAM71A的突变时，那么通过羊水穿刺检测胎儿是否有FAM71A的突变可以预测胎儿患先天性心脏病的几率大小，从而有助于优生优育。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种突变FAM71A基因在制备检测先天性心脏病易感性的试剂或试剂盒中的用途，其中所述的突变FAM71A基因存在单核苷酸变异SNV，所述单核苷酸变异SNV选自下组：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1；

所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)FAM71A基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述SNV位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述SNV位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO:3-12中所示的序列。

5.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的引物为SEQ ID NO.:5和6构成的引物对。

6.一种检测先天性心脏病易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增FAM71A基因或转录本的引物，并且所述的引物扩增出的扩增产物的长度为100-2000bp，并且所述扩增产物含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1；

所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测；

并且所述的试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与所述SNV位点结合的探针；

(b)识别所述SNV位点的限制性内切酶。

7.一种试剂在制备检测检测先天性心脏病易感性的试剂盒中的用途，其中所述试剂选自下组：

(a)用于检测FAM71A基因的一种或多种所述SNV位点的特异性探针；

(b)用于检测FAM71A基因的一种或多种所述SNV位点的芯片；或

(c)用于检测FAM71A基因的一种或多种所述SNV位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体；

其中所述的SNV位点选自下组：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1；

所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。

8.一种基于人FAM71A基因单核苷酸变异SNV制备检测先天性心脏病易感性的试剂或试剂盒的方法；

其中，所述单核苷酸变异SNV选自下组：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1；

所述检测为散发先天性心脏病的辅助性检测。

9.一种分离的FAM71A核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，并且具有一个选自下组的突变：

第268位C→T；

第271位C→A；

第365位T→C；

第1072位G→A；

第1342位A→G；

第1522位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

10.一种分离的FAM71A氨基酸序列，其特征在于，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，并且具有一个选自下组的突变：

Arg90X、Pro91Thr、Leu122Pro、Ala358Thr、Lys448Glu、Ser508Pro；

其中，X表示终止，且氨基酸位置编号基于SEQ ID NO:2。