CN101684488B - 微小rna及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于强直性脊柱炎诊断的寡聚核苷酸，包括逆转录引物、探针、正向引物和反向引物，以及所述寡聚核苷酸用于微小RNA表达量检测的用途。寡聚核苷酸包括用于检测下述微小RNA：hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a的探针和引物。本发明进一步提供了包含上述寡聚核苷酸的试剂盒及检测方法，对强直性脊柱炎患者的微小RNA进行杂交检测，能检测出患者样本中上述微小RNA的表达量高于正常人，可作为强直性脊柱炎的诊断试剂。
Description
技术领域
本发明涉及一组微小核酸的用途，尤其是涉及hsa-miR-17-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a作为生物标记物的应用，属于生物医学材料技术领域。
背景技术
近几年来，从植物、线虫到人的细胞中广泛存在一种非编码的单链RNA小分子(microRNA—miRNA)，它们能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非翻译端特定区域相互作用，抑制蛋白质的合成。1993年Lee等采用经典克隆方法在线虫中首次克隆了lin-4基因，通过点突变的方法证实小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蝇中发现了let-7基因的存在，于是推测这类小分子可能是一类进化上保守，在生命过程中起重要作用的调节分子。随后人们在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中己发现了一千多个miRNA基因。小RNA的研究给我们带来重要的启迪是基因组非组蛋白编码区蕴含着重要的生命功能活动信息。现有研究表明生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些非蛋白编码小RNA的调控；而除miRNA，siRNA以外的小RNA我们更是知之甚少。长期以来，有关基因的研究重点都在蛋白编码基因上，而小RNA的发现和研究对揭示基因的表达调控机制，让我们更为深入的了解生命之奥秘无疑具有重大的科学价值。
据统计，miRNA在人类基因组中约占1％的数量，在不同的时空发育阶段表达量存在显著差异。Bartel等(Ambros V，Bartel B，Bartel DP，Burge CB，Carrington JC，Chen X，Dreyfuss q Eddy SR，Crriffiths-Jones S，MarshallM，Matzke M，Ruvkunq Tuschl T.)提出，由于miRNA与靶miRNA互补程度不同，起着切割或微弱抑制作用。由于其作用靶点的多寡，miRNA表达量亦不同，通过基因芯片技术，可以同时检测所有miRNA时空表达的状况。在此基础上，寻找miRNA靶基因，揭示其作用机制是目前研究的重点，也是后基因组时代需要解决的问题之一。全部miRNA基因功能的揭示可能会给人们对生命现象的理解带来一场深刻的革命。
目前的研究已经发现多种miRNA与疾病的发生有关。如MiR-15a在白血病细胞中有调控作用(MiR-15a and miR-16-1 cluster functions in human leukemia.Calin GA，Cimmino A，Fabbri M，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008，1；105(13)：5166-71.)。有研究表明，MiR-15a通过靶向BCL2诱导凋亡(miR-15and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2.Cimmino A，Calin GA，FabbriM，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2005，27；102(39)：13944-9.)。MiR-342在多发性骨髓瘤骨髓微环境调控中起重要作用(An integrative genomicapproach reveals coordinated expression of intronic miR-335，miR-342，andmiR-561 with deregulated host genes in multiple myeloma.Ronchetti D，Lionetti M，Mosca L，et al.BMC Med Genomics.2008，13；1(1)：37.)，在结肠癌中可通过宿主基因的表观遗传学改变被沉默(Epigenetic silencing of theintronic microRNA hsa-miR-342 and its host gene EVL in colorectal cancer.Grady WM，Parkin RK，Mitchell PS，et al.Oncogene.2008，19；27(27)：3880-8.)。其他如let-7a，miR-98，miR-17-5p也在各种肿瘤中被广泛研究。MiR-17-5p被研究的较广泛较多，可通过与其他miRNA相互作用发挥作用。MiR-17-5p通过抑制AIB1 mRNA的翻译调控乳腺癌细胞增殖(Mir-17-5pregulates breast cancer cell proliferation by inhibiting translation ofAIB1 mRNA.Hossain A，Kuo MT，Saunders GF.Mol Cell Biol.2006；26(21)：8191-201.)。MiR-17-5p拮抗剂可以通过上调p21和BIM抑制难治性神经母细胞瘤的生长(Antagomir-17-5p abolishes the growth oftherapy-resistant neuroblastoma through p21 and BIM.Fontana L，Fiori ME，Albini S，et al.PLoS ONE.2008 May 21；3(5)：e2236.)。Mir-29a在艾滋病中靶向重要的基因nef基因，在延缓疾病进展中起重要作用(Targets for humanencoded microRNAs in HIV genes.Hariharan M，Scaria V，Pillai B，et al.Biochem Biophys Res Commun.2005，2；337(4)：1214-8.)。在散发的早老性痴呆患者中，miR-29a的缺失与BACE1/β分泌酶的表达增加相关(Loss of microRNAcluster miR-29a/b-1in sporadic Alzheimer’s disease correlates withincreased BACE1/beta-secretase expression.Related Articles，Hébert SS，HorréK，
L et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008，29；105(17)：6415-20.)。
强直性脊柱炎由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重点累及脊柱，最终导致脊 柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎(Ankglosing Spondytitis)，简称AS。强直性脊柱炎是一种严重威胁人类健康的疾病，本病在不同人种、不同地区发病率不尽相同，平均患病率约占人口的0.1％。本病多发于16-25岁人群，男女性别比例约为10：1。目前，强直性脊柱炎的诊断仍沿用1966年纽约标准，或1984年修订的纽约标准，条件如下：
纽约标准(1966年)：有X片证实的双侧或单侧骶髂关节炎(按前述0—IV级分级)，并分别附加以下临床表现的1条或2条，即，①腰椎在前屈、侧屈和后伸的三个方向运动均受限；②腰背痛史或现有症状；③胸廓扩展范围小于2.5cm。根据以上几点，诊断肯定的AS要求有：X线片证实的III—IV级双侧骶髂关节炎，并附加上述临床表现中的至少一条；或者X线证实的III—IV级单侧骶髂关节炎或II级双侧骶髂关节炎，并分别附加上述临床表现的1条或2条。
修订的纽约标准(1984年)：①下腰背痛的病程至少持续3个月，疼痛随活动改善，但休息不减轻；②腰椎在前后和侧屈方向活动受限；③胸廓扩展范围小于同年龄和性别的正常值；④双侧骶髂关节炎II—IV级，或单侧骶髂关节炎III—IV级。如果患者具备④并分别附加①—③条中的任何1条可确诊为AS。
从上述两种标准可见，它们均缺乏对患者诊断的敏感性及重复性。并且，目前没有对AS进行诊断的定量标准。
为克服上述缺点，本领域仍需要提供一种新的可以作为强直性脊柱炎的生物学标志物及其检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组新的作为强直性脊柱炎的生物标志物并提供可用于该组生物标志物表达量定量检测的寡聚核苷酸，以及所述寡聚核苷酸的用途。
本发明经过广泛而深入的研究，发现并分离了新的可作为强直性脊柱炎标志物的微小核酸：hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a。上述微小核酸在正常人的血液样本中不表达或表达量很低，而在强直性脊柱炎患者的血液样本中表达量很高，并且在患者服药后表达量有所下降。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a微小核酸，它包含：具有SEQ ID NO：1～4所示的多核苷酸序列、或其保守性变异核酸序列、或其片段。
在本发明的第二方面，提供了用于检测上述微小核酸的寡聚核苷酸，包括逆转录引物、探针和正向引物及反向引物，优选的，所述寡聚核苷酸的序列如SeqID No 5～36所示。本发明中所述的一组寡聚核苷酸，是指用于检测一种微小核酸的逆转录引物、探针和正向引物、反向引物。
本发明的第三方面提供了上述寡聚核苷酸的用途，既可以用于检测样本中微小核酸hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a的表达量，又可以用于筛选调节所述微小核酸表达的调控因子，如药物筛选，还可用于制备强直性脊柱炎诊断试剂。本发明中所述调控因子是指任何能够影响所述微小核酸表达的分子，包括有机分子、无机分子、大分子化合物和小分子化合物、生物分子如siRNA或microRNA类似物等。在使用上述寡聚核苷酸制备检测或诊断试剂时，既可以仅使用其中的任意一组用于检测一种微小核酸，也可以使用其中的至少两组寡聚核苷酸的组合，可以是检测一种微小核酸的寡聚核苷酸的组合，也可以是检测不同的微小核酸的寡聚核苷酸的组合。
本发明的第四方面提供了应用上述寡聚核苷酸检测所述微小核酸的方法，包括提取人组织样本中的总RNA，加入逆转录引物反转录成cDNA后，以cDNA为模板向反应体系中加入探针和正向引物、反向引物、DNA聚合酶及四种脱氧核糖核苷酸底物、反应缓冲液等，通过反应产物的荧光强度，反映微小核酸的原始表达量。所述探针可在5’端连接荧光报告基团，荧光报告基团可以为Sybr Green、lux、FAM、HEX、CY3，VIC、TET、JOE，相应的在探针的3’端连接对应的荧光淬灭基团，例如当荧光报告基团为6-羧基-荧光素(简称FAM)时，其3’端连接的对应的荧光淬灭基团为4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(简称DABCYL)。优选的人的组织样本为血液样本。
在上述技术方案的基础上，本发明进一步提供了检测微小核酸表达的试剂盒，所述试剂盒包含上述寡聚核苷酸的一组或多组，优选地还包含如下组分：
逆转录酶及其反应缓冲液
四种脱氧核糖核苷酸底物
DNA聚合酶
荧光定量PCR反应缓冲液
人工合成的snRNA—U6的内参及正常人对照品
试剂盒使用说明书。
更进一步的，本发明还提供了一种诊断强直性脊柱炎的方法，包括下列步骤：
从待诊断患者取得生物样本；
检测生物样本中hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a中一个或多个微小核酸的表达水平，比较生物样本中的微小核酸表达量与正常对照样本中的相同微小核酸的表达量，其中出现一种或多种微小核酸增量表达的生物样本的供体患有强直性脊柱炎。优选的，所述生物样本为供试者的血液。
本发明还提供了治疗强直性脊柱炎药物筛选的方法，所述方法为用药前后检测hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a中至少一种微小核酸的表达量。
另外，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如，与本发明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
本发明的有益效果：
1.提供了可以作为强直性脊柱炎的诊断标志物；
2.提供了定量检测强直性脊柱炎标志物表达的寡聚核苷酸；
3.提供了定量检测强直性脊柱炎标志物表达的试剂盒。
本发明的技术方案为强直性脊柱炎的检测提供定量的标准，克服了以往疾病诊断中主要依靠医生个人的主观判断，而且简便易操作，取样方便，对于强直性脊柱炎的准确诊断具有重要意义。
附图说明
图1基因芯片分析microRNA表达谱检测结果
图2内参基因U6在不同生物样本中的扩增曲线图，左图是正常人，右图是AS患者，CU值基本相同。
图3hsa-miR-17-5p在不同生物样本中的扩增曲线图，左图是正常人，右图是AS患者，与内参相比，正常人ΔCU大于患者，因此该miRNA在患者中相对于正常组表达较高。
图4hsa-miR-27a在不同生物样本中的扩增曲线图，左图是正常人，右图是AS患者，与内参相比，正常人ΔCU大于患者，因此该miRNA在患者中相对于正 常组表达较高。
图5hsa-miR-29a在不同生物样本中的扩增曲线图，左边图是正常人，右图是AS患者，与内参相比，正常人ΔCU大于患者，因此该miRNA在患者中相对于正常组表达较高。
图6hsa-miR-126-3p在不同生物样本中的扩增曲线图，左图是正常人，右图是AS患者，与内参相比，正常人ΔCU大于患者，因此该miRNA在患者中相对于正常组表达较高。
具体实施方式
下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1总RNA的制备
A：分离外周血单个核细胞(PBMC)
(1).用抗凝管(内含抗凝液0.2ml)收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积(1:1)稀释血液。
(2).取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
(3).将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液叠于分层液上，保持两者界面清晰。(稀释血液与分层液体积比例约为2:1)。
(4).18-20℃，水平离心机以2000rpm离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆(内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层(薄)。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
(5).用毛细血管(或1ml注射器)轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。
(6).加入5ml的不含Ca2+和Mg2+的Hank’s液或RPMI1640(请注明来源)洗涤2次，混匀，依次以1500rpm离心10min、1000rpm离心10min，吸弃上清。
(7).末次离心后，弃上清，所得沉淀为外周血单个核细胞。
B：细胞总RNA抽提
(1).往离心管中加入500μl Ezol。
(2).称取适量的组织样品(10～20mg左右)于2ml离心管中，匀浆。
(3).匀浆后补加500μl Ezol，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min。
(4).加入200μl RNA专用的三氯甲烷，剧烈上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成乳白色状。
(5).室温放置5min，12000rpm/min离心15min。
(6).小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，避免吸动中层蛋白相和下层有机相。
(7).往上清中加入500μl预冷的RNA专用的异丙醇，室温放置5min。10000rpm/min离心10min。
(8).小心弃尽上清，加入1ml RNA专用的75％的乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min离心10min。
(9).小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，每管加入20μl DEPC水溶解，混匀。
实施例2基因芯片分析microRNA表达谱(基因芯片购自Invitrogen)
(1).外周血单个核细胞，总RNA和miRNA的提取
抽取活动期AS患者治疗前10个标本，Enbrel治疗12周后AS患者10个标本，健康对照者10个标本静脉血4ml，用实施例1所述方法提取PBMC。用TRIzolReagent(Life Technologies，Inc.)提取总RNA，然后用mirVana microRNAIsolation Kit(Ambion，Inc.)分离其中的miRNA，保存于-20℃。
(2).miRNA芯片标记与纯化
将2--5μg的microRNA真空干燥，干燥完毕后，用4μl Nuclease-freeWater重悬microRNA样品；用mirVana TM microRNA Labeling Kit(AmbionInc.)以Monoreactive Cy3 dye/Monoreactive Cy5 dye(Amersham PharmaciaBiotech，Ltd)作荧光标记，QIAgene PCR Purification kit(QIAGEN，Inc.)；标记后进行下一步的纯化。
(3).miRNA芯片的制备与杂交
microRNA探针文库包括1152个探针，包括重复点样的331个人类来源的microRNA分子、236个小鼠来源的microRNA分子、189个大鼠来源的microRNA分子、以及142个预测的microRNA分子；其他为各种阴性对照和外参照分子。
(4).芯片图像采集与数据分析
随后进行数据分析和处理。对于microRNA分子表达变化的显著性，判断标准是将校正后的两个样品间杂交信号强度的比值(Ratio)大于2或小于0.5。聚类分析的数据来源为校正后的各样品的平均杂交信号值的对数数值，聚类分析的计算方法为最小方差法(Ward’s minimum variance)。结果见附图1。
实施例3cDNA的制备(总RNA逆转录)：
将实施例1抽提得到的总RNA进行逆转录，制备cDNA模板(逆转录引物序列如表1所示)。
A：逆转录反应体系：
| 试剂名称(buffer和酶均为 promega公司) | 用量/管 |
| 5×Reverse Transcription buffer (缓冲液) | 4ul |
| RT Primer Mix(1uM)(引物混合液) | 1.25ul |
| dNTP(10mM)(四种脱氧核糖核苷酸 混合液) | 0.75ul |
| RNA(模板) | 2ul |
| RTase(200U/ul)(逆转录酶) | 0.5ul |
| DEPC H20 | to 20ul |
B：逆转录反应条件：
反应条件为：16℃ 30min；42℃ 30min；85℃ 10min。
实施例4荧光定量PCR检测
A：cDNA模板的稀释：
将实施例2逆转录后得到的cDNA稀释3倍，例如：往20μl的体系中加入40μl RNase/DNase free ddH20，混匀。
B：荧光定量PCR体系(PCR反应引物及探针序列如表1、2、3所示)：
| 试剂名称 | 用量/管 |
| 2×PCR Master Mix | 10ul |
| F Primer(20uM)(正向引物) | 0.2ul |
| R Primer(20uM)(反向引物) | 0.2ul |
| Taqman probe(20uM)(探针) | 0.1ul |
C：荧光定量PCR反应条件：
(i)95℃ 3min；
(ii)95℃ 15s；
(iii)55℃ 30s；
(iv)72℃ 30s；
第ii至第iv步共40个循环。
根据hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a的序列，设计检测所需的逆转录引物、探针、正向引物和反向引物，实验中分别选取两组进行荧光实时定量PCR实验。
表1 各微小RNA对应的第一组引物及探针序列
(RT primer：逆转录引物；F primer：正向引物；R primer：反向引物；Probe：探针)
表2 各微小RNA对应的第二组引物及探针序列
(RT primer：逆转录引物；F primer：正向引物；R primer：反向引物；Probe：探针)
FAM为6-羧基-荧光素，DABCYL为4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸。
实施例5 不同类型生物样本中四种微小核酸的表达量检测
将所取得的生物样本按照来源分为患者用药前(简称A组)、患者用药后(简称B组)及正常人对照组(简称C组)三组，每组30个生物样本。经过荧光实时定量PCR实验，结果如图3～图6及表3～4所示：A组与C组比较，四种微小核酸的表达量均有大幅度的升高，因此这四种微小核酸均可作为强直性脊柱炎的生物标志物。而B组中，四种微小核酸的表达量与A组相比均有不同程度的降低，提示患者经治疗后四种微小核酸的表达量降低，进一步表明四种微小核酸为强直性脊柱炎的生物标志物。
表3 不同类型生物样本中四种微小核酸的表达量(使用表1所示的引物和 探针)
| miRNA名称 | A患者(用药前) | B患者(用药后) | C正常人对照 |
| Hsa-miR-17-5p | 70.73 | -6.06 | 1.00 |
| Hsa-miR-126-3p | 145.67 | -2.36 | 1.00 |
| Hsa-miR-27a | 201.49 | -1.76 | 1.00 |
| Hsa-miR-29a | 1776.45 | -5.86 | 1.00 |
(设定C组的表达量为1，其他为C组表达量的倍数，数字都是相对于正常组的表达倍数)
表4 不同类型生物样本中四种微小核酸的表达量(使用表2所示的引物和探针)
| miRNA名称 | A患者(用药前) | B患者(用药后) | C正常人对照 |
| Hsa-miR-17-5p | 73.26 | -5.92 | 1.00 |
| Hsa-miR-126-3p | 132.38 | -3.07 | 1.00 |
| Hsa-miR-27a | 192.86 | -2.86 | 1.00 |
| Hsa-miR-29a | 1547.62 | -6.03 | 1.00 |
(设定C组的表达量为1，其他为C组表达量的倍数，数字都是相对于正常组的表达倍数)
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表
<110>苏州吉玛基因药物科技有限公司
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Claims (8)
1.用于检测样品中微小核酸hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a的表达的寡聚核苷酸用于制备强直性脊柱炎诊断试剂的用途，其中，hsa-miR-17-5P如Seq ID No：1所述，hsa-miR-126-3P如Seq ID No：4所述，hsa-miR-27-a如Seq ID No：2所述，hsa-miR-29-a如Seq ID No：3所述。
2.一组用于检测样品中微小核酸hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a或hsa-miR-29-a的表达的寡聚核苷酸，其包括逆转录引物、探针、正向引物和反向引物，并用于通过荧光实时定量PCR法检测hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a或hsa-miR-29-a的表达，其中，hsa-miR-17-5P如Seq ID No：1所述，hsa-miR-126-3P如SeqID No：4所述，hsa-miR-27-a如Seq ID No：2所述，hsa-miR-29-a如Seq ID No：3所述，
其中，所述寡聚核苷酸如下所述：
其中RT-Primer为逆转录引物，Probe为探针，F-Primer为正向引物，R-Primer为反向引物。
3.如权利要求2所述的寡聚核苷酸,其特征在于，所述探针5’端连接荧光报告基团，3’端连接对应的荧光淬灭基团。
4.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其特征在于，所述探针5’端连接的荧光报告基团为6-羧基-荧光素，3’端连接的对应的荧光淬灭基团为4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸。
5.权利要求2～4任一项所述的寡聚核苷酸用于制备微小核酸hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a或hsa-miR-29-a表达量的检测试剂的用途。
6.权利要求2～4任一项所述的寡聚核苷酸用于制备强直性脊柱炎诊断试剂的用途。
7.一种用于强直性脊柱炎的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2～4中任一项所述的寡聚核苷酸中的一组或多组。
8.如权利要求7所述的检测强直性脊柱炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有:
逆转录酶及其反应缓冲液
四种脱氧核糖核苷酸底物
DNA聚合酶
荧光定量PCR反应缓冲液
人工合成的snRNA－U6的内参及正常人对照品
试剂盒使用说明书。
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