CN112852936A - 一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法及其应用及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种应用免疫组库测序方法分析样本中淋巴细胞或浆细胞的方法：获取样本总mRNA并利用TCR/BCR恒定区特异性引物逆转录获取cDNA分子，以cDNA分子3'端通用序列为上游引物、基于恒定区设计下游引物进行第一次PCR，并在上游引入UMI序列；取第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR反应，获得包含可变区CDR3全长序列及UMI的产物；进行测序，利用UMI校正并构建一致性序列，组装一致性序列获得若干克隆；获取克隆数据并基于鉴定的克隆获取V(D)J组合和CDR3序列，进行淋巴细胞或浆细胞的分析。本发明基于RNA免疫组库测序、分子标记获取校正的序列信息，灵敏度高、操作简单，能获取准确度高的分析结果。

Description

一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方 法及其应用及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法及其应用及其试剂盒。

背景技术

淋巴细胞包括B细胞和T细胞，其是人体内唯一基因组有别于其他体细胞的细胞群。B细胞和T细胞分别介导机体的体液免疫应答和细胞免疫应答，分别通过其对应的表面细胞受体BCR、TCR来识别抗原，进而发挥清除病原体的功能。BCR和TCR都由可变区和恒定区组成，不同细胞的恒定区可相同，但可变区不同，因而具有识别抗原多样性的能力。比如，新型冠状病毒通过呼吸道进入人体肺脏和肺上皮细胞表面受体结合，并借此侵入肺上皮细胞大量繁殖释放新的病毒并感染其他体细胞；肺泡巨噬细胞吞噬细胞碎片和病毒颗粒，病毒在巨噬细胞中被灭活，病毒蛋白被消化成肽链；部分肽链和巨噬细胞表面的HLA(MHC)分子结合，并通过T细胞表面受体TCR识别特定的T细胞；当HLA-肽链-TCR复合体高度亲合时，该T细胞被激活，扩增，形成克隆。当病毒持续存在或二次感染时，该克隆便快速增殖，产生细胞因子和效应T细胞清除病毒，这就是获得性细胞免疫的克隆选择。B细胞可通过自身膜免疫球蛋白(Ig)直接识别病毒表面抗原(如新型冠状病毒的S蛋白)，当Ig分子的可变区与病毒蛋白高度亲和时，该B细胞被激活，扩增，形成克隆，成为记忆细胞。当病毒持续存在或二次感染时，该克隆能快速增殖并分化成浆细胞，产生相应抗体中和病毒，这就是获得性体液免疫的克隆选择。由于病原体往往携带多种抗原，所以可能同时诱导多个T细胞和B细胞的克隆，即多克隆。

与上述状态类似但具有本质性区别的是：淋巴系统(包括浆细胞)肿瘤是一种单克隆淋巴细胞或浆细胞增殖性疾病。由于尚未完全明了的病因(病毒、致癌物、免疫缺陷等)，致使某一淋巴细胞的特定基因产生突变获得生长优势表型，并逃逸了体内免疫监视，可无限制生长形成一个优势克隆，即为单克隆。这些单克隆细胞形成淋巴造血系统恶性疾病包括急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和浆细胞性肿瘤等。这些克隆性恶性细胞存在于正常淋巴细胞包括T细胞、B细胞和浆细胞群中，只有用特定的检测方法才能鉴别出来这些克隆。该发明提供了这样一种检测方法。

所以，对血液或骨髓中淋巴细胞或浆细胞的分析显得至关重要，通过分析是否有优势克隆即单克隆，有助于判断淋巴细胞、浆细胞的克隆性质为反应性表现为良性的多克隆还是增殖性表现为恶性的单克隆，从而有助于及时诊断是否有淋巴系统肿瘤或浆细胞疾病。从而尽早开展治疗，提供个体化治疗的依据，指定有效的治疗方案，提高患者的生存率。同时，随着血液学的不断发展，淋巴系统肿瘤或浆细胞疾病能通过诱导化疗、靶向治疗、骨髓移植治疗等方式得到缓解，但仍会存在复发的状况。MRD是导致复发的首要原因。所述MRD是指治疗后体内仍残留有少量白血病、淋巴瘤或浆细胞骨髓瘤细胞的状态。所以，通过对血液或骨髓中淋巴细胞或浆细胞的分析还有助于实现对MRD的监测，从而及时预测复发情况以及残留量，为判断预后和病情提供依据，并依此制定有效治疗方案。

目前，对淋巴细胞或浆细胞的检测分析有很多方法。如多参数流式细胞术(MFC)以及多重PCR检测BCR和TCR等，但该类方法均存在较大缺陷。如MFC检测不表达或丢失Ig的B细胞肿瘤时即无法实现测定，而多重PCR检测BCR和TCR方法又常常不能保证完全扩增免疫组库各链分子，容易导致假阴性结果。现有技术也提出基于二代测序(NGS)的分析方法，如，通过测定全部T细胞和B细胞受体TCR和BCR基因组以检测克隆性和MRD。但迄今为止，国内外基于NGS的检测方法大都是以DNA-Seq为基础的方法；该类方法同样存在较大缺陷，包括扩增体系复杂不能有效扩增、容易发生偏倚、PCR体系较大成本较高、灵敏度低、模板需求量大等缺陷，仍然不能满足目前对淋巴细胞或浆细胞分析检测的需求。所以，亟需一种分析淋巴细胞或浆细胞的方法，便于高灵敏度的进行淋巴细胞或浆细胞分析并获得准确度高的分析结果，更需应用于淋巴细胞或浆细胞的克隆性分析和微小残留疾病上的方法，以克服现有技术分析方法所存在的缺陷，为诊断疾病、制定有效的治疗方案提供依据。

为此，本发明基于应用专利申请号为201810618023.7的基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法的软件系统设计应用于淋巴细胞或浆细胞分析的方法。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，该方法以mRNA为模板对免疫组库进行NGS建库测序，结合分子标记能获取纠正的、不含内含子的序列信息，偏倚少，有效序列信息含量高，从而便于分析样本淋巴细胞或浆细胞以获取准确度高的分析结果。

本发明采取的技术方案是，一种应用免疫组库测序方法分析样本中淋巴细胞或浆细胞的方法，所述的免疫组库测序方法即为专利申请号为201810618023.7的专利文件的基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法，包括步骤：

S1、获取骨髓或外周血样本细胞总mRNA，利用TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录，获取含有mRNA 5'端全部序列的cDNA分子；

为了方便样本的留存和mRNA的提取，所述骨髓可以为抗凝骨髓，抗凝剂采用EDTA或枸橼酸钠；进一步的，当骨髓或外周血细胞为起始样本时，直接裂解细胞并使用带PolyT的磁珠捕获mRNA；获取mRNA后利用逆转录酶和TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录；且为了获取含有mRNA 5’端全部序列的cDNA分子，采用具有末端转移酶活性的逆转录酶，所述逆转录酶添加若干“C”碱基至cDNA分子的3’端，以便后续延伸模板的形成，从而使得后续获得的cDNA分子含有mRNA 5’端全部序列；

进一步的，步骤S1中使用MMLV RT逆转录酶进行逆转录，并在逆转录至RNA分子5’末端时在产生的cDNA分子3’端加上若干“C”碱基，利用锁核酸修饰的模板转换引物与所加的若干C碱基配对产生延伸模板，从而使后续所得cDNA分子含有mRNA 5'端全部序列；并在产生延伸模板后还使用UDG酶处理以进行碱基错配的修复；进一步的，采用磁珠回收逆转录产物并作为步骤S2的PCR模板。

S2、结合以cDNA分子3'端通用序列的上游引物、基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物进行第一次PCR反应，且所述上游引物中引入UMI序列；所述UMI序列可采用申请号为：201810618023.7的专利文件中的UMI序列，通过UMI序列可实现序列的标记，有助于后续基于UMI进行序列的纠正，从而获取有效的序列信息，提高检测的准确程度。且基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物单引物能实现等效扩增，相比于现有技术中基于DNA的免疫组库测序检测淋巴细胞，检测准确程度高，且偏倚少。

S3、取一部分纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后获得包含TCR/BCR可变区全长序列及UMI序列的产物；进一步的，根据是否带有UMI序列和步骤S3中上下游引物分离获得的产物，保留含有UMI序列和步骤S3中上下游引物的产物序列，去除不带UMI序列和步骤S3中上下游引物的产物序列；

S4、连接测序平台的接头序列于步骤S3获取的产物上，获得最终上机文库分子，进行测序；进一步的，所述测序平台为Illumina测序平台；将上机文库分子按照Illumina高通量测序平台对应试剂盒指示结合试剂盒进行双向常规测序。

S5、对测序原始下机数据处理，根据测序质量值对测试序列进行过滤，过滤测序质量值低的reads，并记过滤后的数据为Clean Data；然后对过滤后的高质量数据进行UMI自身校正，并根据UMI构建一致性序列；

进一步的，步骤S5中数据的UMI自身校正以及构建一致性序列的步骤具体包括：

S51、对UMI进行聚类，校正UMI的自身错误；所述的UMI校正实质即申请号为：201810618023.7的专利文件中的步骤(4)UMI自身校正过程，所述聚类即将序列分成不同的团簇；

S52、在校正过的UMI类群(UMI cluster)里，对UMI相同的序列进行比对，校正序列的碱基错误，构建对应类群的一条一致性序列。所述构建一致性序列的步骤实质采用申请号为：201810618023.7的专利文件中的步骤(6)，所述类群即团簇，通过对同一类群中的序列采用对比软件muscle进行相互之间的序列对比，从而构建出每个类群中的一致性序列。

S6、一对一致性序列组装得到的序列即为一个克隆，对成对的一致性序列进行组装获得一个以上的克隆；组装过程中，对于全长序列，则根据末端重叠区域(overlap)进行拼接；对于非全长序列，采用比对reference(如imgt数据库中参考序列)的方法进行拼接；缺失(gap)区域选择用reference序列进行填充，如根据imgt数据库中的参考序列对缺失部分进行填充，组装得到的序列即为一个clone(克隆)，所述克隆实际即为基因。

S7、对获得的克隆进行比对分析，将相同的clone(克隆)归类为一个clonetype(克隆型)，统计每个克隆型对应的克隆数目；并对鉴定的克隆型注释，鉴定出V(D)J组合和CDR3序列；所述注释采用IMGT数据库对鉴定的clonetype(克隆型)进行注释。

S8、结合步骤S7获取的数据依据需求进行样本中淋巴细胞或浆细胞的序列、表征分析。进一步的，所述序列分析包括依据CDR3序列的基因表达分析以及CDR3对应氨基酸序列分析、CDR3序列多样性分析、核苷酸插入、缺失、突变分析中的一种或多种，所述表征分析包括样本中淋巴细胞或浆细胞克隆性分析(因为浆细胞是B细胞的功能细胞，依据获取的数据同样可以进行针对浆细胞的分析)。即通过步骤S7获取的数据能根据需求实现对淋巴细胞或浆细胞的分析。

现有技术中DNA-Seq为基础的NGS检测中，因每个细胞只能提供两个等位基因序列作为模板，所以为达到预期的检测效果，现有技术往往需要较大用量的DNA模板，才能获得有效量序列信息，对应的，其PCR过程中所需使用的PCR管数也较多。且由于每个细胞只有两个等位基因序列作为模板，所以，对应的检测灵敏度也较低。此外，在DNA-Seq为基础的NGS检测的扩增步骤中，往往存在几十种引物扩增，扩增体系复杂，容易产生相互干扰的状况，使其不能实现有效扩增，影响最终检测结果；且当扩增体系过于复杂、有几十种引物参与扩增时，不仅提高了成本，还可能导致多种引物扩增的效率存在偏倚，不能实现等效扩增，进一步影响检测结果的准确性。而在引物层面，现有技术中多重引物设计是来自于已知参考序列的，所以其不能完全捕捉到人类等位基因全部序列，无法获取较为全面的有效序列信息。更重要的是，gDNA模板中存在内含子，所以每个位点的有效序列信息含量往往是较少的，会进一步导致现有技术检测结果准确性的下降。而其他方法，如多参数流失细胞术检测淋巴细胞，灵敏度较低，且成本较高；PCR TCR/BCR基因重排方法检测淋巴细胞，操作和分析复杂，且结果受引物影响验证，而且缺乏序列信息。

而本发明与上述现有技术方法不同，本发明以mRNA为模板结合分子标记对免疫组库进行NGS建库测序，克服了上述缺陷；因为每个细胞含有多个mRNA拷贝，每个细胞含多个mRNA转录本作为模板，所以本发明分析方法的实施过程中不仅所需的模板用量少，而且具有高灵敏度；且相比于以DNA为基础的免疫组库测序检测淋巴细胞或浆细胞，本发明RNA分子不含内含子，可同时检测CDR全长序列，获取的信息量大。同时，本发明采用恒定区单引物等效扩增，偏倚较少，使得后续获取的序列以及检测结果更加准确。且本发明方法中还包括了分子标记的利用，有助于实现绝对定量(拷贝数)。基于本发明对模板用量较少的需求以及高灵敏度，也有助于实现能检测循环RNA的液体活检技术。更重要的是，本发明结合了现有专利基于分子标记的免疫组库生物信息分析流程，能够基于UMI实现在测序前后的纠正，有效去除扩增错误和测序错误对测序的影响，从而进一步提高淋巴细胞或浆细胞分析的准确性。

进一步的，还结合步骤S7获取的数据进行V(D)J分析、相似性和多样性评估、样本间的相关性分析；所述V(D)J分析对不同V(D)J的使用频率和相互组合进行统计分析，并分析相关CDR3的长度；所述相似性和多样性评估基于样本的Rank abundance变化趋势进行分析，且通过Hill指数评估样本的多样性；所述样本间的相关性分析对包括当前样本的多样本进行分析。

本发明方法除了能利用免疫组库NGS RNA-Seq技术对TCR和BCR CDR1-3指纹区进行测序并用应用申请号为：201810618023.7专利的软件系统分析计算以对T细胞、B细胞或浆细胞克隆进行深入分析外，还能基于获取数据有效评估TCR/BCR互补决定区域(CDR3)的多样性。基于获取的V(D)J组合和CDR3序列还能结合包括V(D)J分析、相似性和多样性评估、样本间的相关性分析的分析过程，以检测V(D)J的基因使用频率、核苷酸的插入与缺失、CDR3区域长度分布、CDR3氨基酸序列、异质性(Diversity)分布曲线等。且在判断存在肿瘤克隆时，还能利用肿瘤克隆CDR3序列以设计个体化PCR引物和探针，为个体化监测提供基础。

进一步的，所述样本为选自慢性淋巴细胞白血病患者、急性淋巴细胞白血病患者、成熟B细胞淋巴瘤患者、成熟T细胞淋巴瘤患者、浆细胞疾病患者、反应性淋巴细胞增生性疾病患者、淋巴细胞肿瘤治疗前或治疗后的患者、骨髓移植后的患者、细胞免疫包括CAR-T治疗后的患者或其他和淋巴细胞或浆细胞相关的疾病(如浆细胞肿瘤)的患者中的一种或多种患者的骨髓样本或外周血样本。

进一步的，所述的一种应用免疫组库测序分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法用于淋巴系统肿瘤或浆细胞肿瘤的克隆性分析。本发明用核酸二代测序方法，通过对全体B细胞和T细胞受体BCR和TCR的转录本核糖核酸(mRNA)指纹区(CDR)进行测定(RNA-Seq)并在B细胞或T细胞整体细胞水平进行比较，从而确定克隆性和克隆的百分比，即实现克隆性的定性和克隆性定量过程，以此判断疾病是良性反应还是恶性肿瘤，有助于指导临床决策、精准诊断，为治疗淋巴系统肿瘤提供重要依据。同理，本发明同样能实现对浆细胞肿瘤的克隆性分析。

进一步的，所述的一种应用免疫组库测序分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法用于微小残留疾病的监测。除了能应用于淋巴系统肿瘤的克隆性分析外，本发明还能应用于肿瘤细胞残留量(MRD)的监测，即通过获取的B细胞和T细胞克隆的分子指纹区的序列(BCR和TCR基因的CDR区域)识别该克隆，从而在核酸序列水平上确定克隆的组成、大小(％)和演化，作为监测淋巴系统包括淋巴细胞肿瘤、浆细胞肿瘤的微小残留疾病(MRD)最可靠最灵敏的方法，为实时评估疾病状态和制定临床治疗方案提供依据。

本发明的另一目的是提供一种试剂盒，包括逆转录酶、逆转录用的TCR/BCR恒定区特异性引物、PCR引物，所述PCR引物包括基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物以及待引入上游通用序列引物中的UMI序列。进一步的，所述试剂盒应用于上述方法中。

进一步的，所述逆转录酶为具有末端转移酶活性的MMLV RT逆转录酶，所述试剂盒还包括UDG酶、Tris-HC、磁珠。更进一步的，所述MMLV RT逆转录酶具有末端转移酶活性；所述Tris-HC为浓度为10mM；所述磁珠用于结合cDNA分子以回收cDNA。

进一步的，在检测免疫细胞克隆性和微小残留疾病中的应用。采用所述试剂盒能实现本发明方法的实施，通过该试剂盒的应用配合测序平台，能对包括T细胞、B细胞或浆细胞的免疫细胞的克隆进行深入分析，可以有效评估TCR/BCR互补决定区域(CDR3)的多样性。如果有优势克隆(单克隆)存在，该方法可以根据指纹序列评估克隆类型、构成以及特定克隆类型的比例、克隆之间的相似程度等。从而实现免疫细胞克隆性的分析，便于预测或诊断淋巴系统疾病，尤其是与克隆表征密切相关的疾病，如其他癌症。同时，通过已有专利系统获得的序列等信息，有助于从核酸序列水平上确定克隆的组成、大小、演化，从而实现对淋巴系统包括淋巴细胞肿瘤、浆细胞肿瘤的微小残留疾病的监测，为实时评估疾病状态和制定临床治疗方案提供依据。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：结合RNA-Seq NGS与现有专利建立了应用于淋巴细胞、浆细胞分析的生信分析方法，通过该方法能够高灵敏度进行淋巴细胞或浆细胞的分析，并获取准确度高的淋巴细胞或浆细胞分析结果。同时，还能基于UMI序列分子标记纠正分析过程中扩增、测序错误，从而提高测序数据的准确度，进而提高淋巴细胞或浆细胞分析的准确性。基于本发明高灵敏度、高准确分析结果以及分析过程获取的克隆信息、V(D)J组合、CDR3序列，本发明方法还能应用于淋巴细胞或浆细胞克隆性分析以及微小疾病残留监测上，基于本发明获取准确度高的分析结果以及序列有助于准确诊断淋巴细胞或浆细胞克隆性，从而及时诊断、治疗淋巴系统肿瘤，提高患者的生存率。基于序列信息则能进一步拟定治疗策略，以获取针对性的有效治疗方案，以提高后续治疗效果。同时，基于本发明获取的序列、克隆等信息能实现准确的预后判断，从而避免预后不准确而导致的复发等状况。更能将本发明应用至微小疾病残留监测上，分析患者淋巴细胞、浆细胞表征或相关基因表达以实现微小疾病残留监测，从而有效及时治疗防止复发。如，基于本法方法获取的数据分析以区别B细胞和T细胞的克隆或克隆状态，从而鉴别B细胞和T细胞是反应性(多克隆，良性)或增殖性(单克隆，恶性)性质，为临床诊断提供重要依据；还可以测定B细胞和T细胞克隆的分子指纹区的序列(BCR和TCR基因的CDR区域)识别该克隆，从而在核酸序列水平上确定克隆的组成、大小(％)和演化，作为监测淋巴系统包括淋巴细胞肿瘤、浆细胞肿瘤的微小残留疾病(MRD)最可靠最灵敏的方法，为实时评估疾病状态和制定临床治疗方案提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例1优势克隆分析结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例

一、样本：

抗凝骨髓或外周血样本(2-8℃，采样后48小时内送达)。抗凝剂可采用EDTA或枸橼酸钠。

具体的，取细胞株和正常人外周血：Jurkat(TCHU123,急性T淋巴细胞白血病)，B-ALL-1(KCB94007YJ,急性B淋巴细胞白血病)。从细胞株细胞提取的mRNA用于TCR和BCR检测的阳性对照。从正常人EDTA抗凝的外周血提取的mRNA用于TCR和BCR检测的阴性对照。

本实施例中，则是取急性T淋巴细胞白血病病人骨髓样本(71192)作为阳性对照，取急性髓细胞白血病缓解期病人骨髓样本(71193)作为阴性对照，以进行克隆性分析。

二、建库：

以骨髓或外周血细胞为起始样本，直接裂解细胞，使用带PolyT的磁珠捕获mRNA，利用莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶(MMLV RT)和TCR/BCR C区特异性引物进行逆转录，一旦逆转录进行到RNA分子的5'末端，MMLV RT的末端转移酶活性发挥并在cDNA分子的3'端加上几个“C”碱基，继而使用锁核酸(LNA)修饰的模板转换引物(TSO)与所加的“C”碱基配对，产生一个延伸模板，从而使所得的cDNA分子可含有mRNA5'端的全部序列，然后使用UDG酶处理，修复碱基错配，使用10mMTris-HC洗涤结合cDNA分子的磁珠3次，回收的磁珠全部作为PCR模板，以基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物、带有一段UMI序列的上游通用引物进行第一次PCR反应；然后取一部分纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后得到TCR/BCR可变区的全长序列及引入的UMI序列，最后连接上Illumina测序平台的接头序列，得到最终上机文库分子。

三、测序：

使用Illumina高通量测序平台(MiSeq or HiSeq)用相应试剂盒对最终上机文库分子进行双向常规测序。

四、采用应用申请号为：201810618023.7专利的软件系统进行生物信息分析：

(1)对测序原始下机数据处理：此步骤过滤测序质量值低的reads，过滤后的数据称为Clean Data；

(2)UMI自身校正和根据UMI构建一致性序列：首先对UMI进行聚类，校正UMI的自身错误，在校正过的UMI cluster里，对UMI相同的序列进行比对，校正序列的碱基错误，构建一条一致性序列；

(3)序列组装：针对成对一致性序列进行组装，对于全长测序，则根据末端overlap进行拼接；对于非全长序列，采用比对reference的方法进行拼接，gap区域选择用reference序列进行填充，组装得到的序列即为一个clone。

(4)Clonal Assignment：对clone进行比对分析，相同的clone归类为一个clonetype，并统计每个clonetype含有的clone数目；

(5)注释：采用IMGT数据库对鉴定的clonetype进行注释，鉴定出V(D)J组合和CDR3序列等；

依据需求进行V(D)J分析、相似性和多样性评估、样本间的相关性分析；其中，V(D)J分析：对不同V(D)J的使用频率和相互组合进行统计分析，并分析相关CDR3的长度；相似性和多样性评估：对样本的Rankabundance变化趋势进行分析，并采用Hill指数的方式去评估样本的多样性；样本间的相关性分析对于多样本分析的情况，采用多方法多角度进行比较分析。

本实施例中，则是基于获取的CDR3序列进行了急性T淋巴细胞白血病骨髓样本、急性髓细胞白血病缓解期样本的优势克隆分析，如图1所示，图1(A)为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)骨髓标本的TCR CDR3RNA-Seq结果，该免疫组库含一个优势克隆(即白血病克隆)，且该优势克隆占整个T细胞群的75％；具体的，该优势克隆在TCR V(D)J基因区域的指纹序列SEQ ID：NO.1为GAAGGGGCTGGTCTTCTCCAGTACCCACCCCTC。具体的，还可将该指纹序列用于后续的MRD监测和个体化PCR设计。图1(B)是急性髓细胞白血病缓解期病人骨髓样本检测结果，可以看出其淋巴细胞中无T细胞优势克隆存在(阴性对照)。即通过本发明方法能够有效实现淋巴系统肿瘤的克隆性分析。

本实施例总体过程即为：接收样本后，首先对样品进行质量检测和信息登录；然后提取总RNA，用添加UMI改良的5′RACE法扩增免疫组库序列，回收目的片段，构建测序文库；并分别用Qubit、Agilent和Q-PCR法对文库的浓度、片段的完整性及插入片段大小、文库有效浓度进行检测和精确定量；用Illumina高通量测序平台(MiSeq)对检测合格的文库进行测序。然后使用拥有专利的软件系统对序列文件进行生物信息分析确定优势克隆及其序列特征，并出具检测报告。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

S1、获取骨髓或外周血样本细胞总mRNA，利用TCR/BCR恒定区特异性引物进行逆转录，获取含有mRNA 5'端全部序列的cDNA分子；

S2、结合以cDNA分子3'端通用序列为上游引物、基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物进行第一次PCR反应，且所述上游引物引入UMI序列；

S3、取纯化后的第一次PCR产物作为模板，并以其两端的通用序列作为上下游引物进行第二次PCR反应，经过两轮PCR后获得包含TCR/BCR可变区CDR3全长序列及UMI序列的产物；

S4、连接测序平台的接头序列于步骤S3获取的产物上，获得最终上机文库分子，进行测序；

S5、根据测序质量值对测试序列进行过滤，进行过滤后数据的UMI自身校正，并根据UMI构建一致性序列；

S6、一对一致性序列组装得到的序列即为一个克隆，对成对的一致性序列进行组装获得一个以上的克隆；

S7、对获得的克隆进行比对分析，将相同的克隆归类为一个克隆型，统计每个克隆型对应的克隆数目；并对鉴定的克隆型注释，鉴定出V(D)J组合和CDR3序列；

S8、结合步骤S7获取的数据进行样本淋巴细胞或浆细胞的序列、表征分析。

2.根据权利要求1所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，步骤S5中数据的UMI自身校正以及构建一致性序列的步骤具体包括：

S51、对UMI进行聚类，校正UMI的自身错误；

S52、在校正过的UMI类群里，对UMI相同的序列进行比对，校正序列的碱基错误，构建一条一致性序列。

3.根据权利要求1所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，步骤S1中使用MMLV RT逆转录酶进行逆转录，并在逆转录至RNA分子5’末端时在产生的cDNA分子3’端加上若干“C”碱基，利用锁核酸修饰的模板转换引物与所加的若干C碱基配对产生延伸模板，使所得cDNA分子含有mRNA 5'端全部序列；并在产生延伸模板后还使用UDG酶处理以进行碱基错配的修复。

4.根据权利要求1所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，还结合步骤S7获取的数据进行V(D)J分析、相似性和多样性评估、样本间的相关性分析；所述V(D)J分析为对不同V(D)J的使用频率和相互组合进行统计分析，并分析相关CDR3的长度；所述相似性和多样性评估为基于样本的Rank abundance变化趋势进行分析，且通过Hill指数评估样本的多样性；所述样本间的相关性分析为对包括当前样本的多样本进行分析。

5.根据权利要求1～4任一项所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法，其特征在于，所述样本为选自慢性淋巴细胞白血病患者、急性淋巴细胞白血病患者、成熟B细胞淋巴瘤患者、成熟T细胞淋巴瘤患者、浆细胞疾病患者、反应性淋巴细胞增生性疾病患者、淋巴细胞肿瘤治疗前或治疗后的患者、骨髓移植后的患者、细胞免疫治疗后的患者或其他和淋巴细胞或浆细胞相关疾病的患者中的一种或多种患者的骨髓样本或外周血样本。

6.根据权利要求1～4任一项所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法用于淋巴系统肿瘤或浆细胞疾病的克隆性分析。

7.根据权利要求1～4任一项所述的一种应用免疫组库测序方法分析样本淋巴细胞或浆细胞的方法用于微小残留疾病的监测。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括逆转录酶、逆转录用的TCR/BCR恒定区特异性引物、PCR引物，所述PCR引物包括基于TCR/BCR恒定区设计的下游引物以及待引入上游通用序列引物中的UMI序列。

9.根据权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为具有末端转移酶活性的MMLV RT逆转录酶，所述试剂盒还包括UDG酶、Tris-HC、磁珠。

10.根据权利要求8～9任一项所述的一种试剂盒，其特征在于，在检测免疫细胞克隆性和微小残留疾病中的应用。

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