JP2014503223A - 免疫多様性の評価方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、診断テストを実施する方法に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞集団の多様性レベルの評価のための診断テストに関する。
一つの診断テストが個々の疾患の確定的な診断をなすことはほとんどない。しかし、正常な状態の存在または不存在を検出するために複数の診断テストが使用され得、これらのテストの結果は患者を選別するのに使用され得、集合的に診断に役立っている。例えば、正常な白血球細胞数は、1マイクロリットルあたり4,500〜10,000個の細胞である。白血球細胞数の増加は特定の疾患を決定づけるものではないが、それは医学的評価を必要とする問題が水面下に存在することを示している可能性がある。女性と男性の赤血球細胞数の正常範囲は一般に異なっており、男性については1マイクロリットルあたり5〜6百万個が正常であり、女性については3.6〜5.6百万個が正常である。血小板数は、それらが150,000〜400,000個の範囲内にある場合に正常である。例えば、炎症の存在下では、赤血球細胞数が減少し得、白血球細胞数が増加し得、そして血小板数も増加し得る。
。
本発明者らは、正常、健康な個体の免疫レパートリーと、症候性および/または非症候性疾患を有する個体の免疫レパートリーとを区別する方法を開発した。この方法は、正常、健康な個体において一般的に見られる免疫細胞の多様性レベルと、1つまたは複数の疾患状態を有する個体において見られる一般的に低い多様性レベルとの間の差異を、正常または異常な免疫状態の存在の診断指標として使用する。本発明の1つの局面において、多様性レベルはD50と称され、D50は免疫系細胞の集団または亜集団における全CDR3のうち少なくとも半分を構成する別個のCDR3の最小割合と定義される。第3相補性決定領域(CDR3)は、そのヌクレオチド配列が各T細胞またはB細胞クローンに特有のものである領域であり、CDR3の数が多いほど多様性レベルが高い。D50は、以下のように説明され得る。細胞の総数における「有意な割合」が50パーセント(50%)の場合、その多様性指数(D50)は、riがi番目に豊富なCDR3の存在量、r1が最も豊富なCDR3の存在量、r2が2番目に豊富なCDR3の存在量等というように順位付けされた優占度構成の、S個の別個のCDR3から構成されるJ個の個々の細胞の免疫レパートリー(CDR3の総数)の多様性の尺度とも定義され得る。Cは、総配列リードの≧50%に達する、別個のCDR3の最小数である。したがってD50は、C/S x 100によって与えられる。
。
ヘパリンナトリウム中に回収された10名の肺癌患者および10名の結腸癌患者および10名の乳癌患者に由来する全血サンプル(40ml)を、Conversant Healthcare Systems(Huntsville, Alabama)から購入した。ヘパリンナトリウム中に回収された8名の正常対照サンプル由来の全血サンプル(40ml)を、ProMedDx(Norton, MA)から購入した。
T細胞の単離は、各々のT細胞サブセットに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた超常磁性ポリスチレンビーズ(MiltenyiBiotec)を用いて行った。全血からFicollプレップによって単核細胞を取得し、そして抗CD14マイクロビーズを用いて単球を除去した。この単球枯渇単核細胞フラクションを、その後、個々のT細胞サブセットのフラクションの供給源として使用した。
RNAの抽出は、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を製造元のプロトコルに従い用いて行った。各標的に対して、www.irepertoire.comで利用可能なプライマーソフトウェアを用いて配列特異的なネステッドプライマーのセット(フォワード・アウト、Fo;フォワード・イン、Fi;リバース・アウト、Ro;およびリバース・イン、Ri)を設計した。共通配列タグ対をすべての内側プライマー(FiおよびRi)に連結した。これらのタグ配列が最初の数サイクルの増幅においてPCR産物に組み込まれることで、共用プライマー対による指数関数的増殖フェーズが実行された。第1増幅ラウンドでは、配列特異的なネステッドプライマーのみを使用した。次いで、このネステッドプライマーをエキソヌクレアーゼ消化によって除去し、そして、共用プライマーならびに新しい酵素およびdNTPの混合物を添加することによって、第1ラウンドのPCR産物を第2増幅ラウンドのテンプレートとして使用した。PCRプライマーによって、同じサンプル由来のアンプリコンに各々個別のバーコードタグを導入した。
異なるサンプル由来のバーコードタグ付アンプリコン産物を一箇所にプールし、2%アガロースゲルにロードした。電気泳動の後、アガロースゲルから抽出された250〜500bp断片に対応するDNAバンドからDNA断片を精製した。DNAは、454 GS FLXシステムを用いてチタニウムキット(SeqWright, Inc.)により配列決定した。
各サンプルの配列を、バーコードタグにしたがって整理した。配列の分類の後、Wang et al.(Wang C, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets. Proc Natl Acad Sci USA 107(4): 1518-1523)により報告されたアプローチと類似の様式で配列分析を行った。簡潔に説明すると、IMGTサーバ(http://www.imgt.org)からダウンロードした生殖系列VおよびJ参照配列を、IRmapプログラムを用いて配列リード上にマップした。参照配列においてCDR3領域を定義する境界を、マッピング情報を通じて配列リードに反映させた。配列リードに内包されるCDR3領域を抽出し、アミノ酸配列に翻訳した。
Claims (8)
- 個体の正常な免疫状態または異常な免疫状態を同定する方法であって、
(a)患者サンプル中の免疫系細胞の集団または亜集団内の免疫系細胞のクロノタイプを定量する工程;
(b)該集団または該亜集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程
を含み、ここで、正常な免疫状態は、細胞の総数における該有意な割合によって表されるクロノタイプの多様性が高いことによって特徴づけられ、異常な免疫状態は、細胞の総数における該有意な割合によって表されるクロノタイプの数が有意に少ないことによって特徴づけられる、方法。 - 前記有意な割合が、約25〜約75から選択されるパーセント値である、請求項1記載の方法。
- 前記有意な割合が50パーセントである、請求項1記載の方法。
- 50パーセントが、C/S x 100によって決定され、式中、Cは、前記細胞集団から単離されたポリヌクレオチドの増幅および配列決定後に得られる総配列リードの50パーセント以上に達する別個のクロノタイプの最小数である、請求項4記載の方法。
- 前記細胞集団が、全T細胞[汎T]、CD8+ T細胞[細胞傷害性T(Tc)]、CD4+ T細胞およびそれらのサブセット[TH1、TH2、TH17、制御性T(Treg)、濾胞性T(TFH)]、ナイーブT(Tn)、活性化T(Ta)、記憶T(Tm)、全B細胞(汎B)、ナイーブB(Bn)、活性化B(Ba)、記憶B(Bm)、形質B細胞および形質芽球B細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 免疫レパートリーの多様性のレベルを評価する方法であって、
(a)標的特異的なネステッドプライマーを含む反応混合物中でヒトまたは動物対象由来の白血球細胞の集団からポリヌクレオチドを増幅して第1アンプリコンセットを生成する工程であって、標的特異的な該ネステッドプライマーの少なくとも一部が、増幅時に、少なくとも1つの共通プライマーに対する結合部位を第1アンプリコンに組み込むためのテンプレートとして機能する追加のヌクレオチドを含む、工程;
(b)第1アンプリコンを含む第1反応混合物の一部を、少なくとも1つの共通プライマーを含む第2反応混合物に移す工程;
(c)少なくとも1つの共通プライマーを用いて第1アンプリコンを増幅し、第2アンプリコンセットを生成する工程;
(d)第2アンプリコンを配列決定して白血球細胞の亜集団におけるV(D)J再構成配列を同定する工程;
(e)同定されたV(D)J再構成配列を使用して免疫系細胞の集団内の細胞の総数および該集団内で同定された各クロノタイプごとの細胞の総数の両方を定量する工程;ならびに
(f)該集団内で計数された細胞の総数において有意な割合を構成するクロノタイプの数を同定する工程
を含み、ここで、正常な状態は、細胞の総数における該有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの多様度が高いことによって特徴づけられ、異常な状態は、細胞の総数における該有意な割合の範囲内に相当するクロノタイプの数が少ないことによって特徴づけられる、方法。 - 前記有意な割合が、約25〜約75のパーセント値である、請求項6記載の方法。
- 前記有意な割合が約50パーセントである、請求項6記載の方法。
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