KR102593421B1 - 다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응 - Google Patents

다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응 Download PDF

Info

Publication number
KR102593421B1
KR102593421B1 KR1020197029634A KR20197029634A KR102593421B1 KR 102593421 B1 KR102593421 B1 KR 102593421B1 KR 1020197029634 A KR1020197029634 A KR 1020197029634A KR 20197029634 A KR20197029634 A KR 20197029634A KR 102593421 B1 KR102593421 B1 KR 102593421B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
primer
strand
reverse
mix
dna
Prior art date
Application number
KR1020197029634A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190127804A (ko
Inventor
웬징 판
미란다 바이른-스틸레
지아오홍 호우
브리타니 브라운
지안 한
Original Assignee
아이리퍼트와, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이리퍼트와, 인크. filed Critical 아이리퍼트와, 인크.
Publication of KR20190127804A publication Critical patent/KR20190127804A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102593421B1 publication Critical patent/KR102593421B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/15—Modifications characterised by incorporating a consensus or conserved sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 개시내용은 프라이머-이량체 형성과 연관된 문제를 회피하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본원에서 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응(dam-PCR)으로 지칭된다. 본원에 개시된 방법은 일반적으로 RNA 샘플로부터 DNA, 예를 들어, cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사시키는 단계로서, DNA의 각각의 제1 가닥은 역방향 공통 프라이머 결합 부위를 도입하는 것인 단계; DNA의 각각의 제1 가닥을 선택하는 단계; DNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 DNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하는 단계로서, DNA의 각각의 제2 가닥은 정방향 공통 프라이머 결합 부위를 도입하는 것인 단계; cDNA의 각각의 제2 가닥을 선택하는 단계; 및 공통 프라이머를 사용하여 DNA 가닥을 증폭시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 본 방법은 gDNA 주형을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 증폭 이전의 DNA 가닥 선택 및 비사용 프라이머의 제거에 기인하여 프라이머-이량체 형성을 회피하고, 종래 다중 PCR 방법과 비교하여 감도 및 효율을 더욱 크게 증가시킬 수 있다.

Description

다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 3월 9일 출원된 미국 출원 제62/469,309호(발명의 명칭: "다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응")에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본원에서 참조로 포함된다.
관련 분야
중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 통해 DNA 증폭이 분자 진단 검사를 비롯한 다양한 용도로 사용될 수 있었다. 다중 PCR 방법은 샘플 내의 다중 핵산을 증폭시켜 다중 표적 서열을 검출 및 확인할 수 있도록 하기 위해 개발되었다. 다중 PCR의 경우, 상이한 표적 서열에 특이적으로 결합하여 상기 서열을 증폭시킬 수 있는 다중 프라이머가 선택되어야 한다. 그러나, 다중 프라이머 사용은 프라이머 세트, 온도 조건, 및 상이한 프라이머에 대해 요구될 수 있는 상이한 조건을 충족시키는 효소의 최적화가 필요하기 때문에, 종래 다중 PCR 방법하에서는 문제가 되는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 종래 다중 PCR 방법을 위한 양립성 프라이머 세트를 찾기 위해서는 상당한 계획 및 검사가 필요할 수 있다.
다중 PCR과 연관된 도전과제는, 대개는 다중 프라이머가 사용될 때에 발생하는 프라이머-이량체 형성에 의해 악화된다. 프라이머-이량체 형성은, 일부 표적 서열을 매우 효율적으로 증폭하는 반면, 나머지 다른 것은 매우 비효율적으로 증폭하거나, 또는 전혀 증폭하지 못하게 되는 결과를 초래할 수 있다. 또한, 이러한 고르지 못한 증폭 잠재성은 종점 정량 분석을 정확하게 수행하는 것을 어렵게 하여 불가능하게 만들고, 어떤 프라이머가 특정 다중 PCR 검정법에서 적합하게 조합될 수 있는지 결정하기 위해 상당한 프라이머 최적화를 필요로 한다. 프라이머-이량체 문제는 심지어 공통 프라이머를 사용하여 추가 증폭시키기 이전에 초기 PCR 사이클링 동안 표적을 농축시키기 위해 유전자 특이적 프라이머가 사용되는 방법에서도 조차 계속될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 현 패러다임은 다중 PCR의 이상적인 성능을 달성하기 위해서는 프라이머의 선택이 최적화되어야 한다는 것이다[예컨대, 문헌 [Canzar, et al. Bioinformatics, 2016, 1-3 ("Canzar")]].
그러므로, 과중하고, 비용이 많이 드는 프라이머 최적화를 필요로 하지 않으면서, 프라이머-이량체 형성의 부정적 효과를 회피함과 동시에, 다중 프라이머를 사용하여 다중 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
한 실시양태에서, 본 개시내용은 역방향 프라이머 믹스를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사시켜 제1 가닥 cDNA를 형성하는 단계로서, 역방향 프라이머 믹스는 역방향 공통 프라이머 결합 부위를 cDNA의 각각의 제1 가닥 내로 도입하도록 구성된 적어도 하나의 역방향 프라이머를 함유하는 것인 단계; 각각의 제1 가닥 cDNA를 선택하는 단계; 정방향 프라이머 믹스를 사용하여 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 cDNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하여 적어도 하나의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 형성하는 단계로서, 정방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 함유하고, 각각의 정방향 프라이머는 cDNA의 특정 제1 가닥에 결합하고, 정방향 공통 프라이머 결합 부위를 cDNA의 각각의 제2 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 단계; cDNA의 각각의 제2 가닥을 선택하는 단계; 각각의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 선택하는 단계; 적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 cDNA 가닥을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 cDNA 가닥을 선택하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 증폭된 cDNA 가닥을, 적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 역방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하고, 적어도 하나의 역방향 프라이머는 식별 마커로서 각각의 제1 cDNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 정방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 포함하고, 적어도 하나의 정방향 프라이머는 식별 마커로서 각각의 제2 cDNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 자기 비드를 사용하여 cDNA 가닥을 프라이머 믹스로부터 분리시키는 것을 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 칼럼 정제에 의해 cDNA 가닥을 프라이머 믹스로부터 분리시키는 것을 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 프라이머 믹스의 효소적 절단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 가닥 cDNA는 제1 가닥 cDNA:RNA 복합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 피험체로부터의 질환 인자(disease agent)를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계로서, 질환 인자는 표적 서열에 의해 특징지어지는 것인 단계; 샘플 중의 핵산에 대해 본 단락에서 기술된 방법을 수행하는 단계; 증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및 질환 인자로부터 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 피험체에서 질환의 존재를 진단하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 피험체로부터의 백혈구 샘플로부터의 핵산에 대해 본 단락에서 기술된 방법을 수행하는 단계; 증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및 T 세포 수용체, 항체, 및 MHC 재배열을 나타내는 하나 이상의 DNA 서열을 확인 및 정량화하여 피험체의 면역 상태 프로파일을 생성하는 단계를 포함하는, 피험체에 대한 면역 상태 프로파일을 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, mRNA는 단일 세포로부터 수득된 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 프라이머 믹스를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 게놈 DNA로부터 DNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 합성하여 제1 가닥:DNA 복합체를 형성하는 단계로서, 제1 프라이머 믹스는 적어도 하나의 제1 프라이머를 함유하고, 각각의 제1 프라이머는 특정 표적 서열에 결합하고, 제1 공통 프라이머 결합 부위를 DNA의 각각의 제1 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 단계; 각각의 제1 가닥:DNA 복합체를 선택하는 단계; 제2 프라이머 믹스를 사용하여 DNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 DNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하여 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 형성하는 단계로서, 제2 프라이머 믹스는, 각각의 제2 프라이머가 DNA의 특정 제1 가닥에 결합하고, 제2 공통 프라이머 결합 부위를 DNA의 각각의 제2 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 적어도 하나의 제2 프라이머를 함유하는 것인 단계; 각각의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 선택하는 단계; DNA 가닥을, 적어도 하나의 제1 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 제1 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 제2 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 제2 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 및 증폭된 DNA 가닥을 선택하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 게놈 DNA는 단일 세포로부터 수득된 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 피험체로부터의 질환 인자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계로서, 질환 인자는 표적 서열에 의해 특징지어지는 것인 단계; 샘플로부터 핵산을 단리시키는 단계; 단리된 핵산에 대해 본 단락에서 기술된 방법을 수행하는 단계; 증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및 질환 인자로부터 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 피험체에서 질환의 존재를 진단하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 피험체로부터의 백혈구 샘플로부터의 핵산에 대해 본 단락에서 기술된 방법을 수행하는 단계; 증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및 T 세포 수용체, 항체, 및 MHC 재배열을 나타내는 하나 이상의 DNA 서열을 확인 및 정량화하여 피험체의 면역 상태 프로파일을 생성하는 단계를 포함하는, 피험체에 대한 면역 상태 프로파일을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 방법의 특정 실시양태에서: 제1 프라이머 믹스는 역방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 역방향 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이고; 제2 프라이머 믹스는 정방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제2 프라이머는 정방향 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머는 정방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 공통 프라이머 결합 부위이다. 본 방법의 특정 실시양태에서: 제1 프라이머 믹스는 정방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 정방향 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머는 정방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 공통 프라이머 결합 부위이고; 제2 프라이머 믹스는 역방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제2 프라이머는 역방향 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이다. 본 방법의 특정 실시양태에서: 제1 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 정방향 또는 역방향 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이고; 제2 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 프라이머 믹스의 정방향 또는 역방향 프라이머는 제1 프라이머 믹스 중에 포함되지 않고, 각각의 제2 공통 프라이머는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 증폭된 DNA 가닥을, 적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 제1 프라이머 믹스는 식별 마커로서 각각의 제1 DNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 제2 프라이머 믹스는 식별 마커로서 각각의 제2 DNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 자기 비드를 사용하여 DNA 가닥을 프라이머 믹스로부터 분리시키는 것을 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 칼럼 정제에 의해 DNA 가닥을 프라이머 믹스로부터 분리시키는 것을 포함한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 각 선택은 프라이머 믹스의 효소적 절단을 포함한다.
본 개시내용은 하기 도면을 참조하였을 때 더욱 잘 이해될 수 있다. 도면의 구성 요소는 반드시 서로에 대해 상대적으로 축척될 필요는 없지만, 그 대신 개시내용의 원리를 명확하게 도시할 때 강조가 이루어진다. 추가로, 유사한 번호들은 여러 도면에 걸쳐 상응하는 부분을 나타낸다.
도 1a-1c는 RNA 주형을 사용하는 dam-PCR 방법의 예시적인 실시양태의 단계를 도시한 것이다. 도 1a는 역전사에 의한 단일 사이클 제1 가닥 cDNA 합성, 비사용 역방향 프라이머 믹스 제거, 및 제1 가닥 cDNA 선택으로 이루어진 단계를 도시한 것이다. 도 1b는 단일 사이클 제2 가닥 DNA 합성(제2 가닥 태깅(tagging)), 비사용 정방향 프라이머 믹스 제거, 및 제1 가닥:제2 가닥 DNA 이중체 선택으로 이루어진 단계를 도시한 것이다. 도 1c는 공통 프라이머를 이용하여 표적을 증폭시키는 단계, 및 선택 및 증폭을 반복하는 임의적 단계를 도시한 것이다.
도 2a-2c는 게놈 DNA("gDNA": genomic DNA) 주형을 사용하는 dam-PCR 방법의 예시적인 실시양태의 단계를 도시한 것이다. 도 2a는 제1 프라이머 믹스를 이용한 제1 가닥 DNA 합성(제1 가닥 태깅), 비사용 제1 프라이머 믹스 제거, 및 제1 가닥:DNA 이중체 선택으로 이루어진 단계를 도시한 것이다. 도 2b는 제2 가닥 DNA 합성 및 비사용 제2 프라이머 믹스 제거로 이루어진 단계를 도시한 것이다. 도 2c는 공통 프라이머를 이용하여 표적을 증폭시키는 단계, 및 선택 및 증폭을 반복하는 임의적 단계를 도시한 것이다.
도 3a 및 3b는 프라이머-이량체 형성이 결과에 미치는 효과를 도시한 것이다. 도 3a는 단일 세포 상에서 arm-PCR을 이용한 프라이머-이량체 형성의 출현 및 프라이머-이량체 형성에 기인한 1차 생성물 밴드의 상응하는 감소를 보여주는 겔이이다. 겔 상의 비율(%)은 심지어 최종의 라이브러리 세정 이후에도 잔류 프라이머-이량체 생성물을 서열분석할 때 폐기된 서열분석 리드의 비율(%)을 나타낸 것이고, 이는 각 세포의 데이터에 대한 차세대 서열분석 데이터를 분석함으로써 수득하였다. 각각의 개별 레인은 알파 및 베타 TCR 유전자좌 및 추가의 표현형 마커를 커버하는 arm-PCR 다중 믹스를 이용한 증폭 후의 독특한 단일 세포를 나타낸다. 도 3b는 PCR 동안 정방향 및 역방향 프라이머, 둘 모두를 포함하는 믹스의 프라이머 쌍 사이의 프라이머-이량체 형성 잠재능 및 프라이머-이량체 형성의 결과로서 폐기된 리드(이는 샘플에 대해 의도된 리드의 31% 정도로 높은 비율을 차지할 수 있다)를 나타낸 표이다.
도 4a 및 4b는 1개 정도로 적은 염기쌍 오버랩을 가지는 프라이머-이량체 형성을 도시한 것이다. 도 4a는 주형의 부재하에 RT-단일 세포 프로토콜(scRT), 비RT 단일 세포 프로토콜(scPCR), 및 iR-10-10 프로토콜(iR1010)을 포함하는 수개의 사이클링 조건하에서 arm-PCR을 수행하여 얻은 의도한 프라이머-이량체 형성을 보여주는 겔이다. 레인 1-3은, 사용된 프로토콜에도 불구하고, 프라이머 iTRAV_2와 iTRAC 사이에 형성된, 단일 뉴클레오티드 오버랩의 프라이머-이량체 형성을 나타낸다. 레인 4-6은 사용된 프로토콜에도 불구하고 형성된, 프라이머 iTRAV_2와 IL-17F-Ri-09 사이의 4개의 뉴클레오티드 오버랩의 프라이머-이량체 형성을 나타낸다. 레인 6-9는 사용된 프로토콜에도 불구하고 형성된, 프라이머 iTRAV_2와 BCL6Ri_MD_11 사이의 6개의 뉴클레오티드 오버랩의 프라이머-이량체 형성을 나타낸다. 레인 10-12는 사용된 프로토콜에도 불구하고 형성된, 프라이머 iTRAV_40과 BCL6Ri_MD_11 사이의 6개의 뉴클레오티드 오버랩의 프라이머-이량체 형성을 나타낸다. 도 4b는 특정 프라이머-이량체에서 특이적 중복 염기쌍을 도시한 것이다. 도 3a 및 3b에서 제시된 arm-PCR을 통해 증폭된 단일 세포의 결과에서의 프라이머-이량체 생성물의 순위 또한 제공되어 있으며, 여기서, "탑(Top) 1"은 NGS 서열분석 결과에서 최고 순위의 프라이머-이량체 빈도수를 나타내고, 여기서, "탑 2"는 NGS 서열분석 결과에서 두 번째로 가장 풍부한 프라이머-이량체 빈도수를 나타내고, 그 다음도 그러하다.
도 5는 프라이머-이량체 성향이 높은 프라이머의 단일 쌍이 원하는 생성물 밴드의 증폭을 제거할 수 있다는 것을 입증하는 겔이다. 도시된 아가로스 겔의 레인 6에서, 표적 IL-10을 증폭시키는 4개의 프라이머가 성공적인 PCR에 포함된다. 레인 7에서 입증되는 바와 같이, T-bet_Fi 첨가는 관심 밴드의 증폭을 제거한다. 유사하게, T-bet에 대한 4개의 프라이머를 커버하고, IL-17A-Fo를 포함하는 다중 프라이머 믹스는 레인 9에 제시된 바와 같이, 표적을 성공적으로 증폭시킨다. 그러나, 한 분열 프라이머, FoxP3Ri 역방향 인사이드 프라이머의 첨가는 레인 10에 제시된 바와 같이, 1차 생성물 밴드의 증폭을 제거한다.
도 6은 어닐링 온도 조절이 프라이머-이량체 효과를 제거하지 않는다는 것을 입증하는 겔이다. 프라이머-이량체 형성을 제거하기 위해, 프라이머-이량체를 형성하는 것으로 공지된 4개의 상이한 프라이머 쌍을 59.9℃ 내지 66℃ 범위의 여러 어닐링 온도하에서 시험하였지만, 아무 효과가 없었다.
도 7a 및 7b는 arm-PCR 대 dam-PCR 사용시의 프라이머-이량체 형성의 효과를 도시한 겔이다. 도 7a는 dam-PCR은 비드 선택을 이용하여 억제성 프라이머-이량체의 효과를 극복한다는 것을 입증하는 겔이다. 레인 1-2는 arm-PCR 대조군이다. 레인 3-4는 이량체화를 유발하는 것으로 공지된 프라이머 쌍의 스파이크-인 존재하의 arm-PCR 대조군이다. 레인 5-6은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 부재하의 단일 사이클 dam-PCR이다. 레인 7-8은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 존재하의 단일 사이클 dam-PCR이다. 레인 9-10은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 부재하의 dam-PCR이다. 레인 11-12는 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 존재하의 선형 증폭을 포함하는 dam-PCR이다. 레인 13은 음성 대조군이다. 도 7b는 dam-PCR이 dam-PCR에 대한 공통 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하는 제1 라운드의 증폭 후, 또는 arm-PCR에 대한 제1 라운드의 RT-PCR 후, 비드 선택 대신 이동을 이용하여 억제성 프라이머-이량체의 효과를 극복한다는 것을 입증하는 겔이다. 레인 1-2는 arm-PCR 대조군이다. 레인 3-4는 이량체화를 유발하는 것으로 공지된 프라이머 쌍의 스파이크-인 존재하의 arm-PCR 대조군이다. 레인 5-6은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 부재하의 단일 사이클 dam-PCR이다. 레인 7-8은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 존재하의 단일 사이클 dam-PCR이다. 레인 9-10은 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 부재하의 dam-PCR이다. 레인 11-12는 프라이머-이량체 쌍 스파이크-인 존재하의 선형 증폭을 포함하는 dam-PCR이다. 레인 13은 음성 대조군이다.
도 8은 dam-PCR 대 arm-PCR을 이용한 단일 세포 증폭을 비교하는 겔이다. 레인 1-6은 dam-PCR로 증폭된 단일 세포를 나타내는 반면, 레인 7-14는 arm-PCR로 증폭된 단일 세포를 나타낸다. dam-PCR로 증폭된 세포는 종점 강도가 유사하고, 프라이머-이량체는 존재하지 않지만, arm-PCR로 증폭된 세포는 종점 PCR 변동을 나타내고, 프라이머-이량체 증폭을 보인다.
도 9는 비사용 프라이머를 제거할 수 있는 선택 단계의 능력을 입증하는 겔이다. "표준 곡선"으로 표지된 레인을 사용하여 제1 가닥 태깅과 제2 가닥 태깅 사이, 및 제2 가닥 태깅과 증폭 사이의 이월량을 평가하였다. 레인 1 및 2는 2회 수행되고, 표준 곡선과 비교하였을 때, 99.99% 초과의 비사용 프라이머를 제거하는 자기 비드 선택 단계를 나타낸다. 레인 3 및 4는 1회 수행되고, 표준 곡선과 비교하였을 때, 99.9% 초과의 비사용 프라이머를 제거하는 자기 비드 선택 단계를 나타낸다.
도 10a-10b는 gDNA와 함께 다양한 다중 프라이머 믹스를 이용한 dam-PCR을 나타내는 겔을 보여주는 것이다. 도 10a는 TCR 베타 유전자좌 증폭을 위한 arm-PCR(레인 1-4) 대 dam-PCR(레인 5-9)을 보여주는 것이다. 도 10b는 두 유입량의 gDNA로 종양 다중 패널을 이용한 arm-PCR 대 dam-PCR을 보여주는 것이다. 레인 1-7은 레인 1-3에 대해 수행된 arm-PCR 및 레인 4-7에 대해 수행된 dam-PCR을 이용한 200 ng gDNA 유입물을 나타낸다. 레인 8-14는 레인 8-10에 대해 수행된 arm-PCR 및 레인 11-14에 대해 수행된 dam-PCR을 이용한 540 ng 유입물을 나타낸다.
도 11은 두 엑손을 커버하기 위해 디자인된 프라이머를 이용한 gDNA의 일반 다중 PCR을 도시하는 도해이다. 상기 유형의 디자인은 생물정보 프로세싱 동안 유전자 어셈블리를 가능하도록 두 앰플리콘 사이에 오버랩을 도입한다. 상기 방법은 오버랩 생성에 필요한 추가의 프라이머의 양립성에 기인하여 비표적 증폭을 일으키고, 그 결과, 더 짧은 경쟁 PCR 생성물이 생성된다.
도 12는 gDNA의 dam-PCR, 및 일반 다중 PCR과 비교하여 dam-PCR과 연관된 이익을 도시한 도해이다. 특히, 제1 사이클 태깅 동안, 더욱 큰 엑손 생성물을 커버하는 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 제1 프라이머 믹스 세정 후, 제2 프라이머 믹스는 오직 그의 각 제1 가닥 생성물과 상호작용하는 인사이드 프라이머를 포함한다. 이들 프라이머는 어느 증폭에도 관여하지 않고, 태깅 동안 단 1회 사용되는 바, 더 짧은 경쟁 PCR 생성물은 생성되지 않는다.
도 13은 중복부를 포함하면서, 구체적으로, HLA 표적을 커버하면서, 긴 gDNA 유전자를 커버하는 arm-PCR 다중 PCR 전략법 및 dam-PCR 전략법의 아가로스 겔 비교이다. 도해는 아가로스 겔에서 참조된 프라이머의 위치를 입증하도록 명확하게 하기 위해 아가로스 겔 위에 제공된다. 레인 1은 arm-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 A만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 2는 arm-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 B만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 3은 중복 세그먼트를 생성하고자 하는 노력에 기인한 T2 정방향 및 T1 역방향의 상호작용으로부터의 한 잠재적 오프-타겟 증폭의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 4는 T1 정방향 프라이머 및 T2 역방향 프라이머의 긴 증폭 생성물을 보여주는 것이다. 레인 5-6은 완전히 다중화된 믹스로부터의 arm-PCR 증폭을 보여주는 것이다. 그 결과는 대개 덜 바람직한 짧은 오프-타겟 생성물이 지배적이다. 표적 A 단독, 그에 대한 유전자 표적(T1 정방향 및 T1 역방향으로부터 제조), 표적 B 단독, 그에 대한 유전자 표적(T2 정방향 및 T2 역방향으로부터 제조), 및 표적 A 및 B 함께, 그에 대한 유전자 표적(T1 정방향 및 T2 역방향으로부터 제조)은 스미어되어 있고, DNA 폴리머라제 활성에 대하여 원하는 생성물과 경쟁하는 짧은 생성물에 기인하여 거의 존재하지 않는다. 레인 7은 제1 사이클 태깅 동안 T1 역방향 및 제2 사이클 태깅 동안 T1 정방향과 함께, dam-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 A만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 8은 제1 사이클 태깅 동안 T2 역방향 및 제2 사이클 태깅 동안 T2 정방향과 함께, dam-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 B만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 9-10은 완전히 다중화된 dam-PCR 전략법으로부터의 결과를 보여주는 것이다. 제1 라운드의 태깅에서, 더욱 긴 제1 가닥 생성물을 생성하는 데 T1 정방향 및 T2 역방향이 사용된다. 제2 라운드의 태깅에서, T1 역방향 및 T2 정방향은 제1 가닥 태깅 동안 생성된 제1 가닥 생성물과 독립적으로 상호작용하여 제2 가닥을 합성한다. 제2 가닥 태깅, 세정, 및 제1 라운드 표적에 공통된 프라이머 쌍을 이용한 증폭 후에는 더 짧은 경쟁 생성물은 없고, 원하는 생성물의 증폭이 달성된다.
상세한 설명
본 개시내용은 프라이머-이량체 형성과 연관된 문제를 회피하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본원에서 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응(dam-PCR)으로 지칭된다. 본원에 개시된 방법은 일반적으로 RNA 샘플로부터 DNA, 예를 들어, cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사시키는 단계로서, DNA의 각각의 제1 가닥은 역방향 공통 프라이머 결합 부위를 도입하는 것인 단계; DNA의 각각의 제1 가닥을 선택하는 단계; DNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 DNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하는 단계로서, cDNA의 각각의 제2 가닥은 정방향 공통 프라이머 결합 부위를 도입하는 것인 단계; cDNA의 각각의 제2 가닥을 선택하는 단계; 및 공통 프라이머를 사용하여 DNA 가닥을 증폭시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 본 방법은 gDNA 주형을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 증폭 이전의 DNA 가닥 선택 및 프라이머의 제거에 기인하여 프라이머-이량체 형성을 회피하고, 종래 다중 PCR 방법과 비교하여 감도 및 효율을 더욱 크게 증가시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "질환"은 상기 질환 인자에 의해 유발되거나, 또는 그와 관련된 감염, 증상 또는 병태를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "질환 인자"란, 핵산 서열을 도입하여 피험체에서 질환을 유발하거나, 또는 그에 기여하는, 형태와 상관없이, 박테리아, 암 세포, 바이러스, 또는 기생충을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 유기체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "제1 프라이머 믹스"란, gDNA에 결합하도록 구성된 적어도 하나의 역방향 프라이머 및/또는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 포함하는 혼합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "정방향 프라이머 믹스"란, 적어도 하나의 정방향 프라이머를 포함하는 혼합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "식별 마커"란, mRNA 또는 gDNA에 대한 특정 샘플, 핵산 가닥 또는 단일 세포 공급원을 식별하기 위한 표지로서 사용되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "역방향 프라이머 믹스"란, 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 혼합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "샘플"이란, DNA 또는 RNA를 포함하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "제2 프라이머 믹스"란, DNA의 적어도 하나의 제1 가닥에 결합하도록 구성된 적어도 하나의 역방향 프라이머 및/또는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 포함하는 혼합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "피험체"란, 포유동물, 바람직하게, 인간을 의미한다.
종래 다중 PCR 방법은 선택 단계(즉, 프라이머 믹스 제거, 또는 DNA 가닥 분리)를 포함하는데, 그렇다고 해도, 이는 단지 앰플리콘이 PCR(예컨대, arm-PCR [WO/2009/124293], tem-PCR [WO/2005/038039], 이들은 각각 네스티드 프라이머 사용을 추가로 요구한다)로부터 생성된 이후에만 포함된다. 그러나, 선택이 PCR 완료 이후에 수행된다면, 프라이머-이량체는 처음 몇 PCR 사이클 동안 형성될 기회를 가지게 될 뿐만 아니라, 프라이머-이량체는 PCR 반응 동안 DNA 폴리머라제 활성에 대해 표적화된 서열과 계속 경쟁하게 되는 바, 이에 프라이머-이량체는 또한 반응 감도를 감소시키게 될 것이라고 출원인은 밝혔다. 추가로, 앰플리콘 및 프라이머-이량체는 분자량 및 전하가 유사하기 때문에 분리하기 어려울 것이다. 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 극단적인 경우, 프라이머-이량체의 증폭이 상기 반응보다 우세해져 표적 서열의 증폭은 완전히 제거된다. DNA 폴리머라제는 더욱 긴 생성물을 생성하는 데보다는 더 짧은 앰플리콘을 생성하고, 그에 결합하는 데 더욱 능숙하며, 이에 프라이머-이량체의 생성은 추가로 악화된다. 프라이머-이량체가 형성되지만, 그가 표적 서열의 증폭을 완전히 억제시키지는 않는 경우에도, 표적 서열과 프라이머-이량체 사이의 경쟁에 기인하여, 원하는 앰플리콘 양은 여전히 감소되며, 이는 전체 반응 감도를 감소시키고, 서열분석으로 이월되었을 때, 서열분석 리드 상실 및 불필요한 비용을 초래하는 생성물을 생성하게 된다.
1 bp 정도로 적은 오버랩을 가지고 프라이머-이량체가 형성될 수 있기 때문에 다중 최적화에 관한 현 패러다임에는 본질적으로 결함이 있다고 본 출원인들은 주장하고 있다. 그러므로, 프라이머-이량체를 예측하는 것은 불가능하고, 새로운 방법으로 처리되어야 한다. 여기서, 본 출원인들은 (본원에서 "선택"으로 지칭되는 것인) 프라이머 믹스로부터 원하는 DNA 가닥을 분리시키는 것의 효율은 선택을 PCR 후 대신 역전사 후에 수행할 때 훨씬 더 우수하다고 보여주고 있다. 예컨대, 차세대 서열분석(NGS: next generation sequencing)-양립성 라이브러리를 제작할 때와 같이, 비교적 긴 올리고뉴클레오티드를 사용한다면, 프라이머-이량체 형성은 대략 200 bp 길이의 생성물을 생성할 수 있고, 이는 원하는 생성물 밴드로부터의 분리를 훨씬 더 어렵게 만들고, 효율성을 더 작게 감소시킬 수 있다. 그러나, 선택 단계를 역전사 다음으로 배치한다는 것은 개별 프라이머(전형적으로 <80 bp)로부터 대략 2 kb RNA:DNA 이중체를 분리한다는 것을 시사하는데, 이 분리를 달성하는 것은 훨씬 더 간단하다. 기술된 방법에서 제2 가닥 합성 후 추가의 선택 또한 PCR 후의 선택보다 용이한데, 그 이유는 프라이머-이량체가 형성되지 않고, 따라서, 분리는 제1 가닥 DNA:DNA 이중체와 더 짧은 프라이머(<80 bp) 사이에 진행되기 때문이다. 요약하면, 프라이머-이량체로부터 앰플리콘을 분리 또는 구조하기 위해 PCR 이후까지 기다린다면, 단일 세포 적용에 중요한 감도는 이미 상실한 상태가 된다. 그에 반해, 역방향 프라이머 믹스가 정방향 프라이머 믹스와 상호작용하지 못하게 막음으로써(예컨대, 역전사 분리 및 제2 가닥 cDNA 합성) 또는 제1 프라이머 믹스가 gDNA와 같이 제2 프라이머 믹스와 상호작용하지 못하게 막음으로써 및 임의의 PCR 단계 이전에 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머 믹스를 제거함으로써(또는 제1 프라이머 믹스 또는 gDNA와 같이 사용된 제2 프라이머 믹스를 제거함으로써), 프라이머-이량체 형성 가능성은 제거되고, 반응 에너지는 원하는 생성물 증폭에 집중된다.
추가 증거로서, 단일 세포는 유전자 발현 패턴이 다양한 역학적 주형인 것으로 간주될 수 있다고 본 출원인들은 주장하고 있다. 단일 세포의 경우, 양이 달라지는 주형이 존재 또는 부재한다고 가정할 때, 다중 시스템이 어떻게 반응하게 되는지를 예측한다는 것은 불가능하다. 다르게는 주형의 존재하에서는 형성되지 않는 프라이머-이량체가 특정 유전자 부재시에 형성될 수 있으며, 이는 단일 세포 수준에서의 발현 변동에 기인하여 프라이머 디자인을 불가능하게 만든다.
이러한 어려움을 극복하기 위해, 본 출원인들은 본원에서 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응(dam-PCR)으로 지칭되는, 프라이머-이량체를 회피하는 방법을 개발하게 되었고, 이는 RNA의 경우, 다단계 다중 역전사(RT: reverse transcription) PCR, 또는 gDNA의 경우, 다단계 다중 PCR이다. 역전사 단계는 제2 가닥 DNA 합성으로부터 및 범용 프라이머를 사용하는 PCR 증폭으로부터 별개로 수행된다. gDNA의 경우, 유사하게, 가닥 태깅은 제2 프라이머 믹스를 이용하여 수행되는 제2 가닥 태깅과는 별개로 제1 프라이머 믹스에 의해 수행된다. 1 사이클의 태깅 및 연장과 함께, 각 단계에서 합성된 DNA를 선택하고, 제1 가닥 cDNA 또는 gDNA 태깅을 수행함으로써, 프라이머-이량체 형성 성향은 회피되고, DNA 폴리머라제 활성은 프라이머-이량체보다는 관심 표적을 증폭시키는 데 집중되며, 이로써, 증폭 감도는 크게 증가하게 된다. RNA 주형을 사용한, 개시된 방법의 예시적인 실시양태는 도 1a-1c에 제시되어 있고, gDNA 주형을 사용한, 개시된 방법의 예시적인 실시양태는 도 2a-2c에 제시되어 있다.
역전사 동안, 제1 가닥 cDNA 합성 동안 3' 유전자 특이적 및 5' 범용 결합 부위, 둘 모두를 함유하는 하나 이상의 역방향 프라이머가 사용된다. 역전사 후, 프라이머-이량체 경감에 대한 단서는 제1 가닥 cDNA:RNA 복합체("제1 가닥:RNA 복합체")를 매우 정확하게 선택하는 것, 및 상기 1차 생성물 밴드로부터 서열 길이(전형적으로 <80 bp)의 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 제거한다는 것이다. 이는 특이한 올리고뉴클레오티드로 각 RNA를 표지함으로써 RNA를 정량화한다면, 특히 중요한데, 그 이유는 독특하게 표지된 프라이머의 이월이 표지된 핵산 종을 정확하게 정량화할 수 있는 능력을 손상시킬 수 있기 때문이다. 역전사 후, 선택 단계를 수행하여 비사용 역방향 프라이머를 제거한다. "선택" 단계는 비사용 프라이머 믹스로부터 DNA 가닥(예컨대, 용액 중 제1 cDNA 가닥:RNA 복합체 또는 단일 가닥 제1 가닥 cDNA)을 분리시키고, 자기 비드 기반(예를 들어, 고체상 가역성 고정화(SPRI: solid-phase reversible immobilization) 비드), 스트렙트아비딘-비오틴 비드 기반, 효소적, 칼럼 기반, 겔 정제에 의한, 또는 DNA 가닥을 능동적으로 선택하거나, 또는 역으로, 비사용 프라이머 및 임의의 DNA 폴리머라제를 제거하는 다른 물리적, 화학적, 생화학적 수단에 의한 것일 수 있다. 본 실시예에서, 출원인들은 99.99% 초과의 비사용 프라이머 제거인 선택 효율을 입증한다.
일단 제1 가닥 cDNA 합성이 완료되고, 역전사 프라이머가 제1 가닥 cDNA 선택에 의해 효율적으로 제거되고 나면, 정방향 프라이머 믹스를 이용하여 제2 가닥 DNA "태깅"으로 명명되는 제2 가닥 cDNA 합성이 수행된다. 역방향 프라이머의 부재하에 정방향 프라이머 믹스로 제1 가닥 cDNA 생성물 태깅을 수행하는 데에는 1 사이클의 DNA 폴리머라제 활성화, 이어서, 어닐링이면 충분하다. 오직 1 사이클만이 수행되고, 비사용 프라이머가 PCR 이전에 제거되기 때문에, 개별 핵산 종에 대한 태그는 또한 이 단계에서 도입될 수 있다. 수율 증가를 위해 이 시점에서 (역방향 프라이머의 부재하에 프라이머 어닐링 및 연장 및/또는 등온 증폭) 제한된 사이클의 선형 증폭을 수행하는 것도 가능하다. 그러나, 너무 많은 추가 사이클의 어닐링 및 연장은 정방향 믹스 중 프라이머 사이의 유해한 프라이머-이량체를 형성할 수 있는 위험을 증가시킬 수 있고, 주어진 다중 시스템에 대해 실험적으로 측정하는 것을 필요로 할 수 있을 것이다. 본 출원인들은 단일 세포로부터의 증폭에 의해 입증된 바와 같이, 제1 및 제2 가닥 태깅을 위해 단일 사이클이면 증폭을 달성하는 데 충분하다고 입증한다. 제2 가닥 DNA 합성 후, 제2 선택 단계를 수행하여 비사용 정방향 프라이머 믹스를 제거한다. 선택 단계는 비사용 프라이머 믹스로부터 DNA 가닥을 분리시키고, 자기 비드 기반(예를 들어, SPRI 비드), 스트렙트아비딘-비오틴 비드 기반, 효소적, 칼럼 기반, 겔 정제에 의한, 또는 DNA 가닥을 능동적으로 선택하거나, 또는 역으로, 비사용 프라이머 및 임의의 DNA 폴리머라제를 제거하는 다른 물리적, 화학적, 생화학적 수단에 의한 것일 수 있다. 기본 개념은, 프라이머 복합성을 제거하여 1차 및 원하는 생성물을 능가할 수 있는 프라이머-이량체가 형성되지 못하도록 하는 것인 원래의 선택과 동일하다.
이 시점에서, "태깅된" DNA는 5' 및 3' 말단 양쪽 모두에 범용 프라이머 결합 부위를 함유한다. 모든 역방향 프라이머 및 정방향 프라이머 태깅 믹스가 이 단계에서 제거된다. 범용 부위는 일반적으로 선택된 NGS 플랫폼에 필요한 서열분석 어댑터 또는 어댑터의 일부이다. 그러나, 임의의 범용 조작 부위도 가능할 것이다. PCR은 범용 방식으로 "태깅된" 제2 가닥 cDNA에 공통된 프라이머 쌍을 사용하여 수행된다. 이들 프라이머는 기하급수적인 증폭 단계를 완료한다. 프라이머 복합성이 2-프라이머 시스템이 감소됨에 따라(여기서, 3' 말단은 역상보적이지 않고, 여기서, 프라이머 쌍은 프라이머-이량체 형성에 대해 스크리닝된다), 상기 PCR 동안 프라이머-이량체를 생성하는 성향은 제거된다.
유입물, 예컨대, 단일 세포가 소량인 경우, 제2 라운드의 PCR을 수행하여야 할 필요가 있을 수 있다. 이 경우, 제1 라운드의 PCR의 선택은 상기 언급된 바와 같이 완료되고, 범용 프라이머 쌍을 이용하는 2 단계 PCR은 제1 라운드 생성물을 농축시키기 위해 새로운 효소, 완충제 및 dNTP를 이용하여 수행된다. 모든 경우에서, 최종 라이브러리 선택이 수행되고, 라이브러리는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 풀링, 사전 서열분석 QC, 및 서열분석을 바로 수행할 준비가 된 상태이다.
gDNA가 변형될 수 있지만; 그러나, 프라이머-이량체 생성 회피라는 동일한 전반적 원리가 적용된다. 제1 라운드의 PCR은 단일 사이클 변성 및 어닐링 단계를 이용하여 오직 1 세트의 다중화된 프라이머만(제1 프라이머 믹스)으로 수행된다. 감도를 증가시키기 위해, 믹스 사이의 프라이머-이량체 형성이 제한되는 한, 선형 증폭 또는 등온 증폭도 수행될 수 있다. 제1 가닥:DNA 복합체는 상기 언급된 바와 같이 정제되고, 제2 프라이머 믹스를 이용하여 단일 사이클로 제2 가닥 합성이 수행된다. 감도를 증가시키기 위해, 선형 증폭 또는 등온 증폭이 수행될 수 있다. 제2 가닥 합성 후, 선택이 상기 언급된 바와 같이 수행되고, PCR은 RNA 프로세스 동안의 기술된 바와 같이, 범용 프라이머 쌍으로 수행된다.
본원에 개시된 방법은 의학적, 환경, 식품 및 다른 샘플을, 상기 샘플 내의 미생물 및 다른 작용 물질의 확인을 위해 평가하기 위하여 바이러스, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물 세포로부터의 핵산의 존재, 및 그의 상대적인 존재량을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법의 한 가지 장점은 종래 다중 PCR 방법과 달리, 프라이머-이량체 형성이 회피되고, 그렇지 않다면, 표적 서열의 증폭에 영향을 줄 수 있는 프라이머-이량체를 생성할 수 있는 프라이머 세트의 선택을 크게 간소화시킨다는 점이다. 본원에 개시된 방법의 또 다른 장점은 프라이머-이량체 형성 회피를 통해 단일 세포로까지 고감도 다중 PCR이 이루어진다는 점이다. 개시된 방법 사용으로, RNA가 단일 세포 수준에서 표적화될 수 있다. 추가로, 그렇지 않다면, 프라이머-이량체 존재에 기인하여 발생할 수 있는, 폐기되는 리드의 개수를 감소시킴으로써, 각 표적 서열에 대한 리드 1개당 비용은 상당히 절감된다. 본 방법, 특히, gDNA와 함께 큰 유전자 세그먼트의 커버리지와 관련된 방법의 또 다른 장점은 불리하게 감도를 감소시키는 더 짧은 앰플리콘 부산물을 도입하지 않고, 중복 앰플리콘으로부터 데이터를 만들 수 있다는 점이다. 일반 다중 PCR을 사용하여 유사한 전략법을 이용할 경우, 상기 부산물은 피할 수 없다. dam-PCR 방법을 통해, DNA 폴리머라제 활성에 대해 경쟁하는 짧은 앰플리콘 생성물을 생성하는 특정 프라이머 사이의 상호작용을 제한함과 동시에, 더욱 긴 커버리지를 허용하면서, 제1 및 제2 프라이머 믹스를 전략적으로 디자인할 수 있다.
실시예
물질 및 방법: dam- PCR 및 arm- PCR 셋업
T 세포 수용체 알파 유전자좌, 베타 유전자좌, 및 추가의 표현형 마커를 커버하는 프라이머는 PCR 전략법에 의존하여 동일한 믹스로, 또는 정방향 및 역방향 믹스로 다중화될 수 있다. arm-PCR 믹스는 동일한 믹스로 247개 이상의 표적을 커버하는, 218개의 정방향 프라이머 및 68개의 역방향 프라이머로 구성되었다. 표적은 참조 서열에 의해 정의되지만, 재배열된 TCR 유전자의 가변성에 기인하여, 주어진 샘플 중 표적 서열의 실제 개수는 전형적으로 벌크 RNA 샘플의 경우, 전형적으로 수천 개에 달한다. 단일 세포의 경우, 세포 표현형에 의존하여 어디든 5-10개 이상의 표적이 존재할 수 있다. dam-PCR을 위해, 총 107개의 정방향 프라이머 및 32개의 역방향 프라이머에 대하여, 정방향 믹스를 역방향 믹스와 따로 처리하였고, arm-PCR의 네스티드 부분과 연관된 아웃사이드 프라이머는 배제시켰다. 범용 태그를 함유하는 인사이드 프라이머는 두 믹스 모두에 공통되었고, 프라이머-이량체 형성을 유발하는 것으로 공지된 프라이머-쌍을 포함하였다. 두 프라이머 세트 모두에서, 일루미나(Illumina) 이중 인덱싱된 양립성 서열분석 프라이머 B의 일부는 각 인사이드 프라이머에 결합되어 있는 반면, 일루미나 이중 인덱싱된 서열분석 공동 프라이머 A의 일부 및 6개의 뉴클레오티드로 이루어진 샘플 바코드 서열은 역방향 인사이드 프라이머에 결합되어 있었다. 특정 실험에서, 개별 핵산 종에 태깅하는 20개의 무작위 뉴클레오티드로 이루어진 인덱스는 샘플 바코드에 인접하게 포함되었다.
arm-PCR 접근법을 위해, 원스텝(OneStep) RT-PCR 키트(Qiagen: 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)로부터 시약 및 286개의 프라이머의 네스티드 프라이머 믹스를 이용하여 전체 RNA 샘플로부터 cDNA를 역전사시켰다. arm-PCR을 위해, 제1 라운드의 RT-PCR("RT-PCR1" 또는 "PCR1"로 명명)을 50℃, 60분; 95℃, 15분; 10 사이클을 위해, 94℃, 30초, 60℃, 5분, 72℃, 30초; 10 사이클을 위해, 94℃, 30초, 72℃, 3분, 4℃로 유지로 수행하였다. RT-PCR1 후, 0.7x SPRI셀렉트(SPRISelect) 비드 선택(Beckman Coulter: 미국 캘리포니아주 브레아 소재)을 수행하였고, 프로메가 고태크 G2 핫스타트(Promega Gotaq G2 Hotstart) PCR 믹스(Promega: 위스콘신주 매디슨 소재)를 이용하여 핵산 생성물을 비드로부터 용출시켰다. 제2 라운드의 PCR("PCR2"로 명명)을 일루미나 어댑터 서열을 완성하는 공동 프라이머 세트를 이용하여 95℃, 3분; 30 사이클을 위해, 94℃, 30초, 72℃, 90초; 72℃, 5분 및 4℃로 유지로 수행하였다.
dam-PCR을 위해, 퀴아젠 원스텝(Qiagen OneStep) RT-PCR 키트를 사용하여 역방향 프라이머 믹스 존재하에 50℃에서 240분 동안 역전사 단계를 수행하였고, 0.7x SPRI 비드 선택을 2회 수행함으로써 제1 가닥 cDNA를 역방향 프라이머 믹스로부터 분리시켰다. 역전사 후, 프로메가 고태크 G2 핫스타트 DNA 폴리머라제를 이용하여 바이오래드(Biorad) C1000 써모사이클러에서 오직 정방향 프라이머 믹스만을 사용하여(역방향 프라이머 부재) 95℃, 3분 초기 변성 및 고온 개시; 60-65℃, 어닐링, 1도당 3분 변화; 및 72℃, 10분 연장, 최종적으로 4℃로 유지인 1 사이클 태깅; 또는 초기 변성 및 고온 개시 95℃, 3분, 이어서, 6 사이클의 어닐링 및 연장; 60℃, 5분 어닐링, 72℃, 1분 연장 및 최종적으로 4℃로 유지인 선형 증폭 전략법으로 제2 가닥 DNA 합성을 수행하였다. 제2 가닥 DNA 합성 후, 0.7x SPRI 비드 선택을 2회 사용하여 제2 가닥 DNA:DNA 이중체를 정방향 프라이머 믹스로부터 분리시켰다. 프로메가 고태크 G2 핫스타트 PCR 믹스를 이용하여 DNA 생성물을 비드로부터 용출시켰고, 이는 역방향 및 정방향 프라이밍 단계 동안 도입된 부분 어댑터 서열에 공통된 한 쌍의 프라이머를 함유한다. 총 사이클의 arm-PCR 접근법과 등가인 20 사이클의 PCR을 사용하여 범용 프라이머 쌍으로 cDNA를 증폭시키고: 95℃, 3분; 10 사이클을 위해 94℃, 30초, 72℃, 6분; 10 사이클을 위해 94℃, 30초, 72℃, 3분; 72℃, 5분, 및 4℃로 유지. dam-PCR을 위해, 추가의 SPRI 비드 선택을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였고, 제2회차 PCR은 새 효소, 완충제, 및 dNTP의 존재하에 수행하였다: 95℃, 3분; 30 사이클을 위해 94℃, 30초, 72℃, 90초; 72℃, 5분, 및 4℃로 유지.
제2 PCR 반응(즉, arm-PCR의 경우, PCR2) 후, 10 ㎕의 PCR 생성물을 2.5% 아가로스 겔 상에서 전개시켜 증폭 성공 여부를 평가하였다. 0.7x SPRI 비드 선택을 사용하여 arm-PCR 및 dam-PCR 생성물, 둘 모두에 대해 서열분석 이전에 라이브러리를 선택하였다. 25 ㎕ 뉴클레아제 무함유 물 중에서 최종 라이브러리를 비드로부터 용출시키고, 나노드롭(Nanodrop)(Thermoscientific: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 이용하여 측정하였다. 동몰량의 각 라이브러리를 서열분석을 위해 풀링하였고, 단, 프라이머-이량체 스파이크-인으로 생성된 라이브러리는 예외로 하였다. 이들 라이브러리는 라이브러리의 이용가능성에 기인하여 절반량만큼 풀링하였다. 풀링된 라이브러리를 큐비트(Qubit) 정량화로 정량화하고, 바이오애널라이저(Bioanalyzer)로 평가하였다. 이어서, 라이브러리를 카파(Kappa) qPCR로 정량화하고, 10% PhiX 스파이크-인으로 8 pM으로 희석하고, 250개의 페어링된 말단 리드를 사용하여 일루미나 MiSeq v2, 500 사이클 키트로 서열분석하였다. 기술된 gDNA 주형에 대해서도 유사한 전략법을 사용하였고, 단, 예외적으로, 역전사 단계는 삭제되었다. 짧은 생성물의 생성을 회피하기 위해, 논의에 기술된 바와 같이 제1 및 제2 프라이머 믹스를 디자인할 때에는 전략적 프라이머 디자인을 사용하였다.
프라이머 - 이량체 형성이 NGS 결과에 미치는 효과: 이는 관심 유전자에 대한 감도를 상실시키고, 리드는 폐기되고, 이로써, 서열분석 비용은 증가하게 된다.
도 3a의 아가로스 겔에서 입증된 바와 같이, 단일 세포를 증폭시키기 위해 다중화된 다중 믹스와 함께 전통적인 arm-PCR을 사용하였다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 단일 세포를 단리시킬 수 있다. arm-PCR은 생성물이 "구조되는", 예를 들어, RT-PCR 후, 제2 증폭을 위한 앰플리콘을 제공하기 위해 완료된 제1 증폭 반응으로부터 소량의 샘플링이 수행될 수 있는, 네스티드, 다중 RT PCR이다.
증폭 후, 각 세포를 나타내는 라이브러리를 풀링하고, 250개의 페어링된 말단 리드를 사용하여 일루미나 MiSeq v2, 500 사이클 키트로 서열분석하기 전에 추가 라운드의 선택을 수행하였다. 성공적인 표적 리드 대비 프라이머-이량체의 증거에 대해 원시 데이터를 분석하였다. 프라이머-이량체 서열에 의해 점유된 리드의 비율(%)은 1차 생성물 밴드의 밴드 강도와 반비례하는 것으로 나타났다(도 3b). 예를 들어, 샘플 BB-S73의 경우, 1차 생성물 밴드가 강력하게 나타났고, 상기 세포의 경우, 서열분석 리드 중 단 1%만이 프라이머-이량체에 의해 점유된 반면, 샘플 XH-S28의 경우, 생성물 서열분석 리드는 상대적으로 거의 없었고, 상기 세포의 데이터 중 89%는 프라이머-이량체가 지배적이었다. 심지어, 예컨대, 샘플 BB-S25와 같이, 상대적으로 강력한 생성물 밴드에 대한 데이터도 25%로 프라이머-이량체가 지배적이었다.
예컨대, RNAseq와 같은 다른 방법과 비교하였을 때, 표적화된 서열분석 접근법의 이점은 관심 유전자를 커버하는 데 서열분석 깊이가 덜 요구된다는 점인데, 이는 관심 유전자가 특이적으로 표적화되고, 증폭되기 때문이다. 단일 세포를 분석할 때, 만약 표적화된-seq 접근법과 동일한 커버리지를 달성하기 위해 25배 초과의 리드가 요구된다면, 특히, 각 단일 세포가 샘플로서 처리될 때, 비용은 매우 빠르게 터무니없이 과도하게 비싸지게 될 수 있다. 기술된 실험에서 프라이머-이량체의 서열 분석 결과, 전체 서열분석 리드 중 31% 정도가 프라이머-이량체에 의해 점유되고, 가치있는 서열분석 자원은 폐기되고, 주어진 세포에 대한 관심 유전자를 커버하는 데 있어서의 감도 상실 이외에도, 과도한 비용을 초래하는 것으로 나타났다. 그러나, 증폭이 가장 강력한 앰플리콘 밴드와 등가로 달성될 수 있다면, 서열분석 비용 절감 및 관심 유전자의 감도 및 커버리지 증가라는 이점을 제공하면서, 프라이머-이량체 폐기는 본질적으로 삭제된다.
프라이머 - 이량체의 NGS는 프라이머- 이량체를 형성하는 데 1 bp 오버랩이면 충분하고, 이는 디자인만으로는 제거하는 것이 불가능하다고 밝히고 있다.
프라이머-이량체를 제거하고자 하는 노력으로, 본 출원인들은 주형 부재하에 다중 믹스를 이용하여 arm-PCR을 수행하고(도 4a), 생성된 앰플리콘을 차세대 서열분석(NGS) 기술을 이용하여 서열분석하여 재디자인되어야 할 수도 있는 프라이머 서열을 강조함으로써 프라이머-이량체를 의도적으로 생성하였다. 놀랍게도, 1 bp만큼 적은 오버랩이 이량체화된 생성물을 생성한다는 데이터에서 수백 개 초과의 상이한 상호작용 쌍이 명확하게 입증되었다(도 4b). 실제로, 1 bp 오버랩 프라이머-이량체가 가장 빈번하게 관찰되는 프라이머-이량체 쌍 중 하나였다. 잠재적 쌍 중 일부가 염기쌍 상보성 및 각 프라이머의 3' 말단에 기초하여 예측가능하였지만, 1 bp 오버랩은 예측이 불가능하고, 따라서, 우회적인 방식으로 디자인하는 것도 불가능하며, 이는 다시, 다중 PCR을 위해 프라이머를 "최적화"하는 것에 관한 현 패러다임(예컨대, Canzar)의 오류를 보여주는 것이다.
그러나, 프라이머-이량체의 개별 클론을 클로닝하고, 서열분석하는 것은 해당 사안의 전모 및 순수하게 가능한 상호작용의 수만을 볼 수 있는 힘을 제공하지는 못하였다. 프라이머-이량체를 능가하는 것을 디자인한다는 것은 불가능하다는 것이 프라이머-이량체 밴드의 서열을 NGS로 물리적으로 관찰하기 전에는 명확하지 않았다. 이전 결과(도 3a)는 심지어 "성공적인" 다중 PCR에서도 여전히 유의적인 프라이머-이량체가 제조되고 있다는 것을 입증한다. 이러한 프라이머-이량체 생성물은 전체 PCR 동안에 걸쳐 관심 밴드와 경쟁하여 PCR의 감도를 크게 감소시키고, 샘플에 대한 관심 유전자의 커버리지를 손상시킨다. NGS 전에는 프라이머-이량체 효과 정도를 관찰한다는 것은 불가능한 것이었다. 종합해 보면, 상기 두 결과 모두, 본원에 개시된 바와 같이, dam-PCR을 사용하는 것인, PCR에 대한 대안적 접근법이 다중 PCR에서의 양립성 및 감도에 관한 사안을 해결하는 데 있어 유일하게 가능한 해결 방안이 된다고 밝히고 있다.
단일 프라이머 쌍이 다중 PCR에 대해 가할 수 있는 손상의 증거
상기 기술된 도 3a로부터, 심지어 증폭이 비교적 "성공적인" 것으로 간주된 때에도 프라이머-이량체 형성이 서열분석 결과에 영향을 줄 수 있다는 것이 입증된다. 다시 말해, 증폭이 관심 밴드를 생성하였지만, 서열분석 결과는 관심 생성물과 함께 상당량의 프라이머-이량체를 보였다. 그러나, 출원인들을 또한 극단적인 경우, 다중 PCR 믹스에서 원하는 생성물 밴드의 증폭을 완전히 제거하는 프라이머 쌍에 대한 예도 입증할 수 있다. 도 5에서 입증된 바와 같이, T-bet 정방향 프라이머를 IL-10에 대한 프라이머를 함유하는 믹스에 첨가하였을 때, 상기 단일 프라이머를 믹스에 첨가하기 전에는 존재하였던 원하는 생성물 밴드가 제거되었다. 유사하게, FoxP3 역방향 프라이머를 T-bet 정방향 및 역방향 프라이머의 믹스에 첨가하였을 때에도 유사하게 1차 생성물 밴드의 증폭은 상실되었다.
본 출원인들은 단일 프라이머 쌍이 관심 표적의 증폭을 제거할 수 있다고 입증하였다. 프라이머-이량체는 PCR 동안 DNA 폴리머라제 활성에 대하여 원하는 생성물과 경쟁한다는 것을 보여주는 본 개시내용을 고려해 보면, 다수의 다중 PCR 실패는 "성공적인" (특히 원하지 않는) 프라이머-이량체 증폭 생성물로 간주될 수 있으며, 이는 다중 PCR 이해에서의 패러다임 변환을 나타낸다. 일단 이러한 의견이 자명해지고 나면, 본 개시내용은 최고의 PCR 접근법은 본 개시된 dam-PCR 방법으로 달성되는 바와 같이, DNA 폴리머라제 활성에 대한 1차 생성물 밴드와 잠재적 프라이머-이량체 사이의 경쟁을 회피하는 것임을 입증한다.
어닐링 온도를 상승시키는 것은 프라이머 - 이량체 성향을 극복하는 데에는 불충분하다.
프라이머-이량체 형성을 제거하기 위해 가장 빈번하게 시도되는 방법 중 하나는 PCR 사이클을 감소시키고, 프라이머-이량체 형성은 더 높은 고온에서는 억제될 것이라는 개념하에 어닐링 온도를 증가시키는 것이다. 단일 세포 증폭의 경우, 출발 카피수는 적고, 이에, 만약 감도를 그대로 유지시키고자 한다면, 사이클 감소는 실현가능한 옵션이 되지 못하기 때문에, 증폭을 달성하기 위해서는 높은 사이클수가 필요하다. 도 6에서, 본 출원인들은 믹스 중 프라이머가 더 이상 표적 주형에 결합하지 못하게 되는 지점으로 어닐링 온도를 조정하는 것은 프라이머-이량체 형성을 제거하는 데 불충분하며, 이는 단순히 어닐링 온도를 상승시키는 것은 경쟁을 제거하지 못할 것이라는 것을 보여주는 것이라고 입증하고 있다. 프라이머-이량체를 형성하는 공지된 프라이머 쌍을 다양한 어닐링 온도에서 시험하였다. 어닐링 온도 상승에 의해 프라이머-이량체 생산이 감소될 수 있다면, 이때 온도가 상승함에 따라, 프라이머-이량체 밴드의 강도도 감소되어야 한다. 대신, 모든 경우에서, 프라이머-이량체 생성물에 대한 밴드 강도는 어닐링 온도 증가에도 불구하고, 비교적 변함이 없었다. 단지 최고 허용가능한 어닐링 온도에서 시험된 쌍 중 2개에서만 약간의 감소가 있을 뿐이었다.
arm- PCR 및 dam- PCR 사이를 비교하기 위한 프라이머 - 이량체 성향을 가진 프 라이머 쌍의 의도된 스파이크-인
dam-PCR은 증폭에 미치는 프라이머-이량체의 억제 효과를 극복할 수 있다. CD3+ T 세포 및 비장의 혼합물로부터의 150 ng RNA를 함유하는 다중 믹스를 이용하여 dam-PCR 실험과의 arm-PCR 비교를 수행하였다. 프라이머-이량체 형성을 유발하는 것으로 공지된 추가의 프라이머 쌍의 부재 및 존재하에서 정방향 및 역방향 인사이드 프라이머, 둘 모두의 프라이머 믹스(우수한 비교를 위해 아웃사이드 프라이머는 무함유)를 첨가함으로써 arm-PCR 실험을 수행하였다. dam-PCR을 위해, arm-PCR 증폭에서 사용된 것과 동일한 역방향 프라이머 믹스를 억전사 단계 동안에 사용였다. 자기 비드를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 선택하였고, arm-PCR 실험에서 사용된 것과 동일한 정방향 프라이머 믹스를 이용하여 제2 가닥 태깅을 수행하였다. 단일 사이클 dam-PCR(열 변성, 어닐링, 및 연장의 1 사이클) 및 선형 증폭 dam-PCR(열 변성 후, 이어서, 어닐링 및 연장의 6 사이클) 비교 또한 수행하였다. 자기 비드를 이용하여 태깅된 dam-PCR 라이브러리를 선택하고, 20 사이클 동안 공동 프라이머 쌍을 이용하여 라이브러리를 증폭시켰다. 태깅 및 공통 프라이머 쌍을 이용한 1 라운드의 증폭 후, 유사한 이동 arm-PCR 시험과의 직접적인 비교를 위해 제1 PCR 앰플리콘을 제2 PCR 반응으로의 이동 실험을 위해 2 ㎕의 dam-PCR 라이브러리를 사용하였다(도 7b). 남은 dam-PCR 라이브러리를 자기 비드를 사용하여 선택하고, 새 효소 및 완충제 존재하에서 동일한 범용 프라이머 쌍을 이용하여 30 초과의 사이클 동안 증폭시켰다. 총 증폭 사이클수는 20 사이클 증폭으로 이루어진 RT-PCR 단계 및 30 사이클의 제2 PCR을 포함한 arm-PCR 프로토콜과 등가였다.
도 7a 및 7b의 결과는 프라이머-이량체 회피인 dam-PCR 전략법을 통해, 높은 이량체화 잠재능을 가진 프라이머 쌍의 존재와 상관없이, 고감도 증폭이 이루어진다는 것이 명확하게 입증하다. 기술상, dam-PCR의 경우, 문제가 되는 프라이머 쌍은 결과 접촉하지 않고, 그러므로, 이량체화될 기회는 전혀 없다. 따라서, 태깅 단계는 2회의 독립 단계로 수행되며, PCR에 의한 증폭은 실제로 (다중 믹스 대신) 공통 프라이머 쌍으로 수행된다. 다중화되는 프라이머 중 오직 일부만이 각각 정방향 및 역방향 세트이다(또는 제1 프라이머 믹스 및 gDNA와 함께 하는 제2 프라이머 믹스이다). 그러나, 각 세트, 정방향 믹스 및 역방향 믹스는 단 한 번 사용되기 때문에, 잠재적인 믹스 내 프라이머-이량체 쌍은 결코 축적될 수 없다. 도 7a 및 7b에서의 모든 증폭은 기술적 복제를 포함한다. 도 7a는 제1 PCR 반응과 제2 PCR 반응 사이의 비드 선택을 나타내는 반면, 도 7b는 제1 PCR 반응과 제2 PCR 반응 사이의 2 ㎕ 이동을 나타낸다. 도 7a 및 7b에서 입증된 바와 같이, 공지된 손상 프라이머 쌍의 존재하에서 arm-PCR이 수행될 때, 원하는 생성물의 증폭 효율은 감소되었다. 도 7b에서 PCR1과 PCR2 사이의 이동의 경우, 1차 생성물 밴드를 제거하는 효과는 탁월하였다. 도 7a 및 7b에서 동일한 주형 RNA에 대해 명백하게 제시된 바와 같이, dam-PCR 접근법을 통해 매우 강력한 1차 생성물 밴드가 생성되고, 프라이머-이량체는 생성되지 않으며, 특히, 도 7a에서는 2 ㎕ 이동 경우와 같이, 프라이머가 이월될 기회는 없는 것으로 제시되어 있다. dam-PCR에 대한 단일 사이클 및 선형 증폭 접근법 사이의 아가로스 겔에서의 뚜렷한 차이는 없고, 이는 단일 사이클 태깅이 유연한 접근법이라는 것을 시사하는 것이다.
dam- PCR 및 단일 세포 증폭
단일 세포는, 표적 카피수가 적고, 세포간 표현형 변동으로 인해 다중 믹스와 주형 사이의 각각의 상호작용이 역동적으로 활발해지기 때문에, 거의 틀림없이 가장 큰 도전과제가 되는 주형들 중 일부가 된다. 주형 부재하에서, 전체적인 벌크 측정에서 프라이머-이량체 형성에 대해 높은 성향을 보이지 않는 특정 프라이머 쌍은 표적이 없기 때문에 이량체화를 시작할 수 있다. 이는, 고도로 다중화된 프라이머 믹스와 가변 저카피 주형 사이의 상호작용은 예측할 수 없거나, 또는 우회적인 방식으로 디자인될 수 없기 때문에, 복합성 층을 추가한다. 도 8에서, 본 출원인들은 단일 세포 수준에서 dam-PCR는 단일 세포 수준에서의 유전 발현의 변동에도 불구하고, 프라이머-이량체 형성이 존재하지 않는 강력한 밴드 강도를 가진 앰플리콘을 생성한 반면, arm-PCR은 단일 세포의 역학적 성질은 관심 표적을 다양한 정도로 증폭시키고, 스미어링 및 프라이머-이량체 형성을 증가시키는 초래하여, 프라이머-이량체 형성은 명백하게 회피되지 못했음을 보여주었다고 입증하고 있다. 이러한 부정적인 부작용은 서열분석 결과에서 관심 표적을 탈락시켜 단일 세포 산출량을 감소시켰고, 충분한 유전자 커버리지를 공급하도록 세포당 전용 서열분석 리드의 개수를 증가시키게 만들었고, 비유용한 프라이머-이량체의 비용이 많이 드는 서열분석을 초래하여, 궁극적으로는 단일 세포 분석 비용을 크게 증가시켰다.
프라이머 선택 후 이월
본원에 개시된 방법이 단계 사이에 비사용 프라이머를 거의 100% 제거한다는 것을 입증하기 위해, 본 출원인들은, 2 pmol 역방향 프라이머 스톡을 0.5% 내지 0으로 연속 희석하여 출원인들이 표적 곡선을 작성한 실험을 수행하였다. 상기 희석액을 두 유형의 세정 방법으로부터의 프라이머의 잔류 이월을 측정하기 위한 참조로서 사용하였다. 상기 희석액은 0.5%에서 0%로의 역방향 프라이머의 이월이 역전사와 제2 가닥 합성 사이에 이루어진 경우를 모방한다. 프라이머-이량체 성향이 있는 것으로 공지된 정방향 프라이머를 각각의 연속 희석된 믹스에 첨가하였고, 믹스에 대해 PCR을 수행하여 "잔류" 역방향 프라이머의 비율(%)을 간접적으로 시각화하였다. 시험 샘플에서, 2 pmol의 역방향 프라이머를 4개 시험(기술상 복제 포함) 각각에 포함시켰다. 상기 믹스에 대해 2개의 상이하 SPRI 비드 세정 방법을 수행하였다. 세정 후 잔류 프라이머를 검출하기 위해, 연속 희석된 샘플에 대해 사용된 것과 동일한 정방향 프라이머 2 pmol을 시험 샘플의 선택된 생성물에 첨가하였다. 이 경우, 세정 후의 잔류 역방향 프라이머는 잠재적 증폭을 위한 공급원만이 될 뿐이었다. 시험 샘플에 대해 표준 희석 곡선과 동일한 PCR을 수행하였다. 이러한 방식으로, 시험 샘플에 대한 증폭의 밴드 강도는 도 9에 제시된 바와 같은 표준 곡선과 비교함으로써 세정 시험에서 잔류 역방향 프라이머의 비율(%)을 직접적으로 나타낼 수 있다. 본 결과는 잔류 프라이머가 겔 상에서 검출불가능하고, 그러므로, CES 선택의 경우, 0.01% 미만의 이월(또는 99.99% 초과의 제거)을 보인 반면, 0.7x SPRI 선택은 0.10% 이월(또는 99.9% 초과의 제거)을 보였다는 것을 나타낸다.
dam- PCR의 gDNA에의 적용
다양한 표적을 커버하는 3개의 별개의 다중 믹스를 이용하여 dam-PCR로 gDNA를 증폭시켰다. 한 표적 믹스는 V 유전자 세그먼트에 대해 정방향 프라이머, 및 J 영역에 대해 역방향 프라이머로 인간 TCR 베타 유전자좌의 가변 영역을 커버하여, gDNA로부터 TCR 베타 유전자좌의 VDJ 재배열이 선택될 수 있게 한다. 서열분석 길이 제약과 함께 재배열된 가변 영역과 C 유전자 사이의 인트론 갭으로 인해 gDNA 커버리지를 위해서는 상기 위치에 역방향 프라이머를 배치하여야 하며, 이는 상기 유전자 세그먼트 커버를 위해 13개의 역방향 프라이머, 및 33개 초과의 정방향 프라이머를 필요로 한다. 비교하면, 상기 믹스는 또한 arm-PCR 전략법과 함께 사용되었다. 도 10a에서 입증된 바와 같이, dam-PCR 증폭은 gDNA에 적용되었을 때, 앰플리콘 밴드를 생성한 반면, arm-PCR은 가능하게는 오프-사이트 배경 증폭에 기인하여 스미어링을 생성하였다. (전형적인 다중 PCR 전략법과 같이) 정방향 및 역방향 프라이머 믹스가 동시에 사용될 때, 프라이머는 재배열에 사용되지 않는 부위에 결합할 수 있고, 처음 몇 사이클 후에 관심 재배열의 신호와 경쟁하는 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 오프-사이트 반응은 dam-PCR 경우에는 감소되는데, 그 이유는 어느 한 방향으로 단 1 사이클의 태깅만이 허용되고, 오직 1차 관심 표적만이 단계 사이에 선택되기 때문이다.
dam-PCR은 또한 적응 면역 세포 이외의 다른 표적에도 작용한다는 것을 입증하기 위해, 암성 악성 종양(종양 패널; 도 10b)에서 공통적으로 돌연변이화된 유전자 표적을 커버하는 다중 믹스, 및 개체의 인간 백혈구 항원 타입(HLA 타입: human leukocyte antigen type)을 검출하기 위한 프라이머 믹스 또한 DNA에 적용하였다.
gDNA의 경우, 어떤 프라이머가 각 믹스에 포함되는지와 관련하여 더욱 유연적이다. 오직 정방향 믹스만을 또는 오직 역방향 믹스만을 포함해야 할 필요는 없다. 그러므로, 본 발명자들은 제1 믹스 및 제2 믹스로서 프라이머 믹스를 지칭한다. 본 전략법은, 증폭 프로세스 및 서열분석, 둘 모두에 유해한 배경을 감소시키면서, 앰플리콘 생성물을 중복시켜 더욱 긴 서열분석 커버리지를 허용하도록 프라이머 믹스를 디자인할 때 적용될 수 있다. RNA를 이용하는 제1 가닥 cDNA 합성의 방향성으로 인해 먼저 역방향 믹스의 사용이 요구된다. 주형으로서 gDNA를 사용할 때, 프라이머 믹스가 반드시 센스 가닥 및 안티센스 가닥 믹스로 계층화될 필요는 없다. 생물정보학적 방식의 서열분석 후 더욱 큰 유전자 생성물의 더욱 용이한 하류 재어셈블리를 용이하게 하는 프라이머를 이용하여 중복부를 디자인할 수 있다. 보통, 전형적 다중 PCR과 마찬가지로, 전체 프라이머 믹스가 동일한 믹스에서 상호작용이 허용된다면, 오프 타겟 증폭이 생성될 것이며, 관심 생성물과 경쟁하게 되는 배경이 생성될 것이고, 그에 의해 도 11에 제시된 바와 같이, 서열분석기 상에서 손실이 큰 배경이 생성될 것이다. dam-PCR의 경우, 프라이머 믹스 전략법을 통해서 더욱 큰 유전자 표적을 커버할 수 있도록 시도될 때, 배경 감소하에 표적화된 서열분석이 이루어질 수 있다. 제1 프라이머 믹스에서, 훨씬 더 큰 표적을 커버하는 프라이머 쌍은 도 12에 도시된 바와 같이 사용될 수 있다. 다음 프라이머 세트, 또는 제2 프라이머 믹스가 제2 가닥에 적용될 때, 가닥은 독립적으로 처리되기 때문에, 오직 각기 각각의 제1 가닥 생성물과 양립성을 띨 뿐이다. 더 짧은 비유용한 생성물을 수득할 수 있는 프라이머의 상호작용은 이제 dam-PCR 전략법을 통해 완전하게 회피될 수 있다.
gDNA로부터의 HLA 표적에 적용된 arm-PCR 및 dam-PCR, 둘 모두의 예가 도 13에 제시되어 있다. 레인 1 및 2는 각각 arm-PCR을 이용하여 표적 A 또는 표적 B를 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 3은 T2 정방향 및 T1 역방향의 상호작용으로부터의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 이것이 바로 상기 패턴을 입증하는 것이지만, 이러한 생성물은 4개의 프라이머 모두가 동일한 PCR 믹스에서 다중화되었을 때 생성될 수 있는 오프-타겟 생성물이다. 레인 4는 T1 정방향 프라이머 및 T2 역방향 프라이머의 긴 증폭 생성물을 보여주는 것이다. 이러한 특정 경우에서, 상기 생성물은 또한 생성물이 서열 길이 제한에 기인하여 현재 사용되는 NGS 플랫폼으로 커버될 수 없기 때문에 덜 바람직할 수 있다. 그러나, 더욱 긴 생성물을 커버할 수 있는 NGS 플랫폼은 상기 생성물을 서열분석할 수 있다. 레인 5-6은 완전히 다중화된 믹스로부터의 arm-PCR 증폭을 보여주는 것이다. 그 결과는 대개 덜 바람직한 짧은 오프-타겟 생성물이 지배적이다. 표적 A 단독(T1 정방향 및 T1 역방향으로부터 제조), 표적 B 단독(T2 정방향 및 T2 역방향으로부터 제조), 및 표적 A 및 B 함께(T1 정방향 및 T2 역방향으로부터 제조)은 스미어되었고, DNA 폴리머라제 활성에 대하여 원하는 생성물과 경쟁하는 짧은 생성물에 기인하여 거의 존재하지 않았다. 레인 7은 제1 사이클 태깅 동안 T1 역방향 및 제2 사이클 태깅 동안 T1 정방향과 함께, dam-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 A만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 8은 제1 사이클 태깅 동안 T2 역방향 및 제2 사이클 태깅 동안 T2 정방향과 함께, dam-PCR을 이용하여 오직 유전자 표적 B만을 증폭시켰을 때의 증폭 패턴을 보여주는 것이다. 레인 9-10은 완전히 다중화된 dam-PCR 전략법으로부터의 결과를 보여주는 것이다. 제1 프라이머 믹스를 이용하는 제1 라운드의 태깅에서, T1 정방향 및 T2 역방향을 사용하여 더욱 긴 제1 가닥 생성물을 생성하였다. 제2 프라이머 믹스를 이용하는 제2 라운드의 태깅에서, T1 역방향 및 T2 정방향은 제1 가닥 태깅 동안 생성된 제1 가닥 생성물과 독립적으로 상호작용하였다. 제2 가닥 태깅, 세정, 및 제1 라운드 표적에 공통된 태그를 포함하는 프라이머 쌍을 이용한 증폭 후에는 짧은 경쟁 생성물은 없었고, 원하는 생성물의 증폭이 달성되었다. 레인 9-10의 겔 이미지에서 명백하게 나타난 바와 같이, 생성물 밴드는 레인 1-2에서 또는 레인 7-8에서 나타난 원하는 생성물의 총합이었다. 단일 사이클의 태깅이 중요하다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 프라이머 T1 정방향 및 T2 역방향이 일반 PCR과 같이 추가의 사이클링이 이루어질 수 있도록 허용된다면, 짧은 경쟁 생성물이 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 잠재적으로 유해한 프라이머는 공통 범용 프라이머를 이용하는 실제 증폭 이전에 dam-PCR에서 제거된다.
단수 형태로 언급된 사항들은 달리 명확하게 언급되거나, 본문을 통해 명백해지지 않는 한, 복수 형태의 사항을 포함한다는 것, 및 그 반대의 경우도 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 문법상 접속사는 달리 명확하게 언급되거나, 본문을 통해 명백해지지 않는 한, 결합된 절, 문장, 단어 등의 임의의 모든 이접 및 접속 조합을 표현하는 것으로 의도된다. 따라서, "또는"이라는 용어는 일반적으로 "및/또는" 등을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 기술된 시스템 및 방법의 다양한 실시양태는 예시적인 것이다. 본원에 기술된 시스템 및 방법에 대한 다양한 다른 실시양태도 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> iRepertoire, Inc. <120> Dimer Avoided Multiplex Polymerase Chain Reaction for Amplification of Multiple Targets <130> 15759-0044 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtctctcag ctggtacacg 20 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgtgatagtc tctcagctgg tacacgcagg tcagggtggc cgttt 45 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcaggtcagg gtggccgttt 20 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgataggat gacaggggtg acgcag 26 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgataggat gacaggggtg acgcaggtca gggtggccgt tt 42 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gcaggtcagg gtggccgttt 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tacgtagaga gccgcaggac gtgcactt 28 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gcaggtcagg gtggccgttt 20 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tacgtagaga gccgcaggac gtgcactt 28 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tacgtagaga gccgcaggac gtgcacttca gctccactgg gg 42 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gcacttcagc tccactgggg 20 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgataggat gacaggggtg acgcag 26 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atgataggat gacaggggtg acgcagtacg tggtgaagtc ct 42 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gcagtacgtg gtgaagtcct 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgatattga tcttgaggtc aggggc 26 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgatattga tcttgaggtc aggggcaggt cagggtggcc gttt 44 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gcaggtcagg gtggccgttt 20 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tacgtagaga gccgcaggac gtgcactt 28 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tacgtagaga gccgcaggac gtgcacctca gctccacagg gg 42 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gcacctcagc tccacagggg 20 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atgataatgc ccaggtagta tggcgg 26 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 atgataatgc ccaggtagta tggcggcagg agcaaggcgg tca 43 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cggcaggagc aaggcggtca 20

Claims (24)

  1. 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 cDNA 가닥을 증폭하는 방법으로서,
    역방향 프라이머 믹스를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사시켜 적어도 하나의 제1 가닥 cDNA를 형성하는 단계로서, 상기
    역방향 프라이머 믹스는 역방향 공통 프라이머 결합 부위를 cDNA의 각각의 제1 가닥 내로 도입하도록 구성된 적어도 하나의 역방향 프라이머를 함유하는 것인 단계;
    비사용 역방향 프라이머 믹스를 제거하여 각각의 제1 가닥 cDNA를 선택하는 단계;
    정방향 프라이머 믹스를 사용하여 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 cDNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하여 적어도 하나의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 형성하는 단계로서, 상기
    정방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 함유하고, 각각의 정방향 프라이머는, cDNA의 특정 제1 가닥에 결합하고 정방향 공통 프라이머 결합 부위를 cDNA의 각각의 제2 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 단계;
    비사용 정방향 프라이머 믹스를 제거하여 각각의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 선택하는 단계;
    적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 cDNA 가닥을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 cDNA 가닥을 선택하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 증폭된 cDNA 가닥을, 적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 역방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하고, 적어도 하나의 역방향 프라이머는 식별 마커로서 각각의 제1 cDNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 정방향 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머를 포함하고, 적어도 하나의 정방향 프라이머는 식별 마커로서 각각의 제2 cDNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 각 선택은 자기 비드를 사용하여 프라이머 믹스로부터 cDNA 가닥의 분리를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 각 선택은 칼럼 정제에 의해 프라이머 믹스로부터 cDNA 가닥의 분리를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 각 선택은 프라이머 믹스의 효소적 절단을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 제1 가닥 cDNA는 제1 가닥 cDNA:RNA 복합체를 포함하는 것인 방법.
  9. 질환 인자(disease agent)를 함유하는 것으로 의심되는 피험체로부터의 샘플 중의 핵산에 대해 제1항의 방법을 수행하는 단계로서, 질환 인자는 표적 서열에 의해 특징지어지는 것인 단계;
    증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및
    질환 인자로부터 표적 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는, 피험체에서 질환의 존재를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 피험체로부터의 백혈구 샘플로부터의 핵산에 대해 제1항의 방법을 수행하는 단계;
    증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및
    T 세포 수용체, 항체, 및 MHC 재배열을 나타내는 하나 이상의 DNA 서열을 확인 및 정량화하여 피험체의 면역 상태 프로파일을 생성하는 단계
    를 포함하는, 피험체에 대한 면역 상태 프로파일을 생성하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, mRNA는 단일 세포로부터 수득된 것인 방법.
  12. 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 cDNA 가닥을 증폭하는 방법으로서,
    제1 프라이머 믹스를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 게놈 DNA로부터 DNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 합성하여 제1 가닥:DNA 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 제1 프라이머 믹스는 적어도 하나의 제1 프라이머를 함유하고, 각각의 제1 프라이머는, 특정 표적 서열에 결합하고 제1 공통 프라이머 결합 부위를 DNA의 각각의 제1 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 단계;
    비사용 제1 프라이머 믹스를 제거하여 각각의 제1 가닥:DNA 복합체를 선택하는 단계;
    제2 프라이머 믹스를 사용하여 DNA의 적어도 하나의 제1 가닥 각각으로부터 DNA의 적어도 하나의 제2 가닥을 합성하여 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 제2 프라이머 믹스는 적어도 하나의 제2 프라이머를 함유하고, 각각의 제2 프라이머는, DNA의 특정 제1 가닥에 결합하고 제2 공통 프라이머 결합 부위를 DNA의 각각의 제2 가닥 내로 도입하도록 구성된 것인 단계;
    비사용 제2 프라이머 믹스를 제거하여 각각의 제1 가닥:제2 가닥 복합체를 선택하는 단계;
    DNA 가닥을, 적어도 하나의 제1 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 제1 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 제2 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 제2 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 DNA 가닥을 선택하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    제1 프라이머 믹스는 역방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 역방향 프라이머이며, 각각의 제1 공통 프라이머는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이며;
    제2 프라이머 믹스는 정방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제2 프라이머는 정방향 프라이머이며, 각각의 제2 공통 프라이머는 정방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 공통 프라이머 결합 부위인 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    제1 프라이머 믹스는 정방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 정방향 프라이머이며, 각각의 제1 공통 프라이머는 정방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 공통 프라이머 결합 부위이며;
    제2 프라이머 믹스는 역방향 프라이머 믹스이고, 각각의 제2 프라이머는 역방향 프라이머이며, 각각의 제2 공통 프라이머는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 역방향 공통 프라이머 결합 부위인 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    제1 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 믹스이고, 각각의 제1 프라이머는 정방향 또는 역방향 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제1 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머 결합 부위이며;
    제2 프라이머 믹스는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 프라이머 믹스의 정방향 또는 역방향 프라이머는 제1 프라이머 믹스에 포함되지 않으며, 각각의 제2 공통 프라이머는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머이고, 각각의 제2 공통 프라이머 결합 부위는 정방향 또는 역방향 공통 프라이머 결합 부위인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 증폭된 DNA 가닥을, 적어도 하나의 역방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 역방향 공통 프라이머를 사용하고, 적어도 하나의 정방향 공통 프라이머 결합 부위에 결합하는 정방향 공통 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 제1 프라이머 믹스의 프라이머는, 식별 마커로서 각각의 제1 DNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  18. 제12항에 있어서, 제2 프라이머 믹스의 프라이머는, 식별 마커로서 각각의 제2 DNA 가닥 내로 도입되는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  19. 제12항에 있어서, 각 선택은 자기 비드를 사용하여 프라이머 믹스로부터 DNA 가닥의 분리를 포함하는 것인 방법.
  20. 제12항에 있어서, 각 선택은 칼럼 정제에 의해 프라이머 믹스로부터 DNA 가닥의 분리를 포함하는 것인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 각 선택은 프라이머 믹스의 효소적 절단을 포함하는 것인 방법.
  22. 제12항에 있어서, 게놈 DNA는 단일 세포로부터 수득된 것인 방법.
  23. 질환 인자를 함유하는 것으로 의심되는 피험체로부터의 샘플 중의 핵산에 대해 제12항의 방법을 수행하는 단계로서, 질환 인자는 표적 서열에 의해 특징지어지는 것인 단계;
    증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및
    질환 인자로부터 표적 서열을 검출하는 단계
    를 포함하는, 피험체에서 질환의 존재를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  24. 피험체로부터의 백혈구 샘플로부터의 핵산에 대해 제12항의 방법을 수행하는 단계;
    증폭된 DNA 가닥을 서열분석하는 단계; 및
    T 세포 수용체, 항체, 및 MHC 재배열을 나타내는 하나 이상의 DNA 서열을 확인 및 정량화하여 피험체의 면역 상태 프로파일을 생성하는 단계
    를 포함하는, 피험체에 대한 면역 상태 프로파일을 생성하는 방법.
KR1020197029634A 2017-03-09 2018-03-09 다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응 KR102593421B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762469309P 2017-03-09 2017-03-09
US62/469,309 2017-03-09
PCT/US2018/021816 WO2018165593A1 (en) 2017-03-09 2018-03-09 Dimer avoided multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190127804A KR20190127804A (ko) 2019-11-13
KR102593421B1 true KR102593421B1 (ko) 2023-10-25

Family

ID=63448939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197029634A KR102593421B1 (ko) 2017-03-09 2018-03-09 다중 표적의 증폭을 위한 이량체 회피 다중 중합효소 연쇄 반응

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20200071763A1 (ko)
EP (1) EP3585797A4 (ko)
JP (1) JP7280191B2 (ko)
KR (1) KR102593421B1 (ko)
CN (1) CN110662756B (ko)
AU (2) AU2018230777B2 (ko)
BR (1) BR112019018714A2 (ko)
CA (1) CA3055764A1 (ko)
RU (1) RU2019131022A (ko)
SG (1) SG11201908312TA (ko)
WO (1) WO2018165593A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3880845B1 (en) * 2018-11-13 2024-01-03 Idbydna Inc. Directional targeted sequencing
EP3908678A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
KR20240041142A (ko) 2022-09-22 2024-03-29 성균관대학교산학협력단 타액, 혈액 및 정액 동시 검출을 위한 다중분석 역전사 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 검출 키트

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011516069A (ja) * 2008-04-03 2011-05-26 ハドソン アルファ インスティテュート フォー バイオテクノロジー 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応
JP2014503223A (ja) * 2011-01-14 2014-02-13 シービー バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 免疫多様性の評価方法およびその使用
WO2016149837A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 Axela Inc. Solid phase nucleic acid target capture and replication using strand displacing polymerases
WO2016181128A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Genefirst Ltd Methods, compositions, and kits for preparing sequencing library

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965363A (en) * 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US20040086867A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-06 Jian Han Method for detecting nucleic acid
JP2011500092A (ja) * 2007-10-26 2011-01-06 ロゼッタ、インファーマティクス、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー 非ランダムプライマーを用いたｃＤＮＡ合成の方法
GB2470672B (en) * 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
WO2010103522A1 (en) * 2009-03-10 2010-09-16 Rosetta Genomics Ltd. Method for detection of nucleic acid sequences
WO2012062753A1 (de) * 2010-11-09 2012-05-18 Qiagen Gmbh Verfahren und vorrichtung zur isolierung und reinigung von doppelsträngigen nukleinsäuren

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011516069A (ja) * 2008-04-03 2011-05-26 ハドソン アルファ インスティテュート フォー バイオテクノロジー 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応
JP2014503223A (ja) * 2011-01-14 2014-02-13 シービー バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 免疫多様性の評価方法およびその使用
WO2016149837A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 Axela Inc. Solid phase nucleic acid target capture and replication using strand displacing polymerases
WO2016181128A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Genefirst Ltd Methods, compositions, and kits for preparing sequencing library

Also Published As

Publication number Publication date
EP3585797A4 (en) 2020-12-30
JP7280191B2 (ja) 2023-05-23
CA3055764A1 (en) 2018-09-13
AU2018230777A1 (en) 2019-10-31
CN110662756A (zh) 2020-01-07
AU2023204205A1 (en) 2023-09-21
RU2019131022A (ru) 2021-04-10
WO2018165593A1 (en) 2018-09-13
CN110662756B (zh) 2023-09-15
EP3585797A1 (en) 2020-01-01
SG11201908312TA (en) 2019-10-30
KR20190127804A (ko) 2019-11-13
JP2020509747A (ja) 2020-04-02
US20200071763A1 (en) 2020-03-05
BR112019018714A2 (pt) 2020-06-02
AU2018230777B2 (en) 2023-03-30
RU2019131022A3 (ko) 2021-06-09
US20220259653A1 (en) 2022-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220267845A1 (en) Selective Amplfication of Nucleic Acid Sequences
US20220259653A1 (en) Dimer avoided multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets
EP2906715B1 (en) Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
CN113166797A (zh) 基于核酸酶的rna耗尽
US20190136305A1 (en) Methods for next generation genome walking and related compositions and kits
CN107532219B (zh) 使用链置换聚合酶的固相靶核酸捕获和复制
Ivanov et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes
JP5663491B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP2019514360A (ja) 超並列シークエンシングのためのｄｎａライブラリーを生成する方法及びキット
US20140336058A1 (en) Method and kit for characterizing rna in a composition
EP2820153A1 (en) Method of identifying vdj recombination products
EP3565906B1 (en) Quantifying dna sequences
CN110612355B (zh) 用于定量pcr扩增的组合物及其应用
US20220411861A1 (en) A Multiplex Method of Preparing a Sequencing Library
US20230323451A1 (en) Selective amplification of molecularly identifiable nucleic 5 acid sequences
Davies et al. Current cellular and molecular biology techniques for the orthopedic surgeon-scientist
CA3218561A1 (en) Method for parallel real-time sequence analysis
JP2001231599A (ja) 発現変化の異なる遺伝子の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right