JP7280191B2 - 複数の標的を増幅するためのダイマー回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 - Google Patents

複数の標的を増幅するためのダイマー回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2017年3月9日に出願された「複数の標的を増幅するためのダイマー回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(Dimer Avoided Multiplex Polymerase Chain Reaction for Amplification of Multiple Targets)」と題される米国特許出願第62/469,309号の優先権を主張し、これを参照により本明細書に組み入れるものとする。
関連技術
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、分子診断検査を含む様々な用途にDNA増幅を用いることを可能にしている。試料中の複数の核酸を増幅するマルチプレックスPCR法が開発されており、複数の標的配列の検出および同定が可能になっている。マルチプレックスPCRでは、異なる標的配列を増幅できるように、それらの配列に特異的に結合する複数のプライマーを選択しなければならない。しかし、異なるプライマーにとって必要となり得る異なる条件を満たすためにプライマーセット、温度条件、および酵素の最適化を要する従来のマルチプレックスPCR方法論の下では複数のプライマーの使用は問題となることが証明されている。したがって、従来のマルチプレックスPCR法に適合するプライマーセットを見つけるために、相当な計画および試験が必要となり得る。
マルチプレックスPCRに関する困難は、複数のプライマーが用いられる場合に生じやすいプライマーダイマーの形成によりさらに悪化する。プライマーダイマーの形成は、一部の標的配列は非常に効率よく増幅するが、他の配列は非常に効率悪く増幅するか、まったく増幅できないという結果をもたらし得る。このように増幅にむらが生じ得ることはまた、最終目的の定量分析を正確に行うことを困難または不可能にし、かつ、特定のマルチプレックスPCRアッセイにどのプライマーを好適に組み合わせることができるかを決定するために、相当なプライマー最適化を要する。このプライマーダイマーの問題は、初回PCRサイクルで遺伝子特異的プライマーを用いて標的配列を濃縮してから共通プライマーを用いてさらに増幅する方法にも絡み得る。にもかかわらず、現パラダイムは、マルチプレックスPCRの理想的性能を実現するためにはプライマーの選択を最適化しなければならない、というものである[たとえばCanzar, et al. Bioinformatics, 2016, 1-3（非特許文献1） (「Canzar」)]。
したがって、厄介でコストのかかるプライマー最適化を必要とせずに、プライマーダイマー形成の負の影響を回避しつつ複数のプライマーを用いて複数の標的配列を増幅することができる方法に対する需要が、依然として存在する。
Canzar, et al. Bioinformatics, 2016, 1-3
一態様では、本開示は、以下の工程を含む方法に関する：少なくとも1つの標的配列を含有するmRNAから、リバースプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第1鎖を逆転写し、第1鎖cDNAを形成する工程であって、該リバースプライマーミックスは、リバース共通プライマー結合部位を各cDNA第1鎖に組み込むように構成されている少なくとも1つのリバースプライマーを含有している、工程；各第1鎖cDNAを選択する工程；該少なくとも1つのcDNA第1鎖の各々から、フォワードプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第2鎖を合成し、少なくとも1つの第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、該フォワードプライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードプライマーを含有しており、各フォワードプライマーは、特定のcDNA第1鎖に結合するようにかつフォワード共通プライマー結合部位を各cDNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；各cDNA第2鎖を選択する工程；各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；該少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ該少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、cDNA鎖を増幅する工程；および該増幅されたcDNA鎖を選択する工程。特定の態様では、方法は、該少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ該少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、該増幅されたcDNA鎖を増幅する工程をさらに含む。方法の特定の態様では、リバースプライマーミックスは、少なくとも1つのリバースプライマーを含み、該少なくとも1つのリバースプライマーは、各第1cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む。方法の特定の態様では、フォワードプライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードプライマーを含み、該少なくとも1つのフォワードプライマーは、各第2cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む。方法の特定の態様では、各選択は、磁気ビーズを用いてcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む。方法の特定の態様では、各選択は、カラム精製によりcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む。方法の特定の態様では、各選択は、プライマーミックスの酵素的切断を含む。特定の態様では、第1鎖cDNAは、第1鎖cDNA：RNA複合体を含む。特定の態様では、本開示は、対象における疾患の存在を診断する方法に関し、該方法は、以下の段階を含む：該対象由来の試料を提供する段階であって、該試料は疾患因子を含有する疑いがあり、該疾患因子は標的配列により特徴づけられる、段階；この段落に記載の方法を該試料中の核酸に対し実施する段階；増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；および該疾患因子から標的配列を検出する段階。特定の態様では、本開示は、対象の免疫状態プロファイルを作成する方法に関し、該方法は、この段落に記載の方法を該対象由来の白血球の試料からの核酸に対し実施する段階；増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；ならびにT細胞受容体、抗体、およびMHC再編成を表す1つまたは複数のDNA配列を同定し定量して、該対象の免疫状態プロファイルを作成する段階を含む。特定の態様では、mRNAは単細胞から得られる。
特定の態様では、本開示は、以下の工程を含む方法に関する：少なくとも1つの標的配列を含有するゲノムDNAから、第1プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第1鎖を合成し、第1鎖：DNA複合体を形成する工程であって、該第1プライマーミックスは、少なくとも1つの第1プライマーを含有し、各第1プライマーは、特定の標的配列に結合するようにかつ第1共通プライマー結合部位を各DNA第1鎖に組み込むように構成されている、工程；各第1鎖：DNA複合体を選択する工程；該少なくとも1つのDNA第1鎖の各々から、第2プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第2鎖を合成し、第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、該第2プライマーミックスは、少なくとも1つの第2プライマーを含有し、各第2プライマーは、特定のDNA第1鎖に結合するようにかつ第2共通プライマー結合部位を各DNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；該少なくとも1つの第1共通プライマー結合部位に結合する第1共通プライマーを用いてかつ該少なくとも1つの第2共通プライマー結合部位に結合する第2共通プライマーを用いて、DNA鎖を増幅する工程；および該増幅されたDNA鎖を選択する工程。特定の態様では、ゲノムDNAは単細胞から得られる。特定の態様では、本開示は、対象における疾患の存在を診断する方法に関し、該方法は、以下の段階を含む：該対象由来の試料を提供する段階であって、該試料は疾患因子を含有する疑いがあり、該疾患因子は標的配列により特徴づけられる、段階；該試料から核酸を単離すること；この段落に記載の方法を該単離された核酸に対し実施する段階；増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；および該疾患因子から標的配列を検出する段階。特定の態様では、本開示は、対象の免疫状態プロファイルを作成する方法に関し、該方法は、以下の段階を含む：この段落に記載の方法を該対象由来の白血球の試料からの核酸に対し実施する段階；増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；ならびにT細胞受容体、抗体、およびMHC再編成を表す1つまたは複数のDNA配列を同定し定量して、該対象の免疫状態プロファイルを作成する段階。
方法の特定の態様では、第1プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第1プライマーはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位であり；第2プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第2プライマーはフォワードプライマーであり、各第2共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位である。方法の特定の態様では、第1プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第1プライマーはフォワードプライマーであり、各第1共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位であり；第2プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第2プライマーはリバースプライマーであり、各第2共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位である。方法の特定の態様では、第1プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含むプライマーミックスであり、各第1プライマーは、フォワードまたはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位であり；第2プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含み、ここで第2プライマーミックス中のフォワードおよびリバースプライマーはいずれも第1プライマーミックスには含まれておらず、各第2共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位である。特定の態様では、方法は、少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、増幅されたDNA鎖を増幅する工程をさらに含む。方法の特定の態様では、第1プライマーミックスは、各第1DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含むプライマーを含む。方法の特定の態様では、第2プライマーミックスは、各第2DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含むプライマーを含む。方法の特定の態様では、各選択は、磁気ビーズを用いてDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む。方法の特定の態様では、各選択は、カラム精製によりDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む。方法の特定の態様では、各選択は、プライマーミックスの酵素的切断を含む。
[本発明1001]
少なくとも1つの標的配列を含有するmRNAから、リバースプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第1鎖を逆転写し、少なくとも1つの第1鎖cDNAを形成する工程であって、前記リバースプライマーミックスは、リバース共通プライマー結合部位を各cDNA第1鎖に組み込むように構成されている少なくとも1つのリバースプライマーを含有している、工程；
各第1鎖cDNAを選択する工程；
前記少なくとも1つのcDNA第1鎖の各々から、フォワードプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第2鎖を合成し、少なくとも1つの第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、前記フォワードプライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードプライマーを含有しており、各フォワードプライマーは、特定のcDNA第1鎖に結合するようにかつフォワード共通プライマー結合部位を各cDNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；
各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；
前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記cDNA鎖を増幅する工程；および
前記増幅されたcDNA鎖を選択する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記増幅されたcDNA鎖を増幅する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記リバースプライマーミックスが、少なくとも1つのリバースプライマーを含み、前記少なくとも1つのリバースプライマーが、各第1cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記フォワードプライマーミックスが、少なくとも1つのフォワードプライマーを含み、前記少なくとも1つのフォワードプライマーが、各第2cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
各選択が、磁気ビーズを用いてcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
各選択が、カラム精製によりcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
各選択が、プライマーミックスの酵素的切断を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記第1鎖cDNAが、第1鎖cDNA：RNA複合体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
以下の段階を含む、対象における疾患の存在を診断する方法：
前記対象由来の試料を提供する段階であって、前記試料は疾患因子を含有する疑いがあり、前記疾患因子は標的配列により特徴づけられる、段階；
本発明1001の方法を前記試料中の核酸に対し実施する段階；
増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；および
前記疾患因子から標的配列を検出する段階。
[本発明1010]
以下の段階を含む、対象の免疫状態プロファイルを作成する方法：
本発明1001の方法を前記対象由来の白血球の試料からの核酸に対し実施する段階；
増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；ならびに
T細胞受容体、抗体、およびMHC再編成を表す1つまたは複数のDNA配列を同定し定量して、前記対象の免疫状態プロファイルを作成する段階。
[本発明1011]
前記mRNAが単細胞から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1012]
少なくとも1つの標的配列を含有するゲノムDNAから、第1プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第1鎖を合成し、第1鎖：DNA複合体を形成する工程であって、前記第1プライマーミックスは、少なくとも1つの第1プライマーを含有し、各第1プライマーは、特定の標的配列に結合するようにかつ第1共通プライマー結合部位を各DNA第1鎖に組み込むように構成されている、工程；
各第1鎖：DNA複合体を選択する工程；
前記少なくとも1つのDNA第1鎖の各々から、第2プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第2鎖を合成し、第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、前記第2プライマーミックスは、少なくとも1つの第2プライマーを含有し、各第2プライマーは、特定のDNA第1鎖に結合するようにかつ第2共通プライマー結合部位を各DNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；
各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；
前記少なくとも1つの第1共通プライマー結合部位に結合する第1共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つの第2共通プライマー結合部位に結合する第2共通プライマーを用いて、前記DNA鎖を増幅する工程；および
前記増幅されたDNA鎖を選択する工程
を含む、方法。
[本発明1013]
前記第1プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第1プライマーはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位であり；
前記第2プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第2プライマーはフォワードプライマーであり、各第2共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位である、
本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記第1プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第1プライマーはフォワードプライマーであり、各第1共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位であり；
前記第2プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第2プライマーはリバースプライマーであり、各第2共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位である、
本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記第1プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含むプライマーミックスであり、各第1プライマーは、フォワードまたはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位であり；
前記第2プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含み、ここで前記第2プライマーミックス中のフォワードおよびリバースプライマーはいずれも前記第1プライマーミックスには含まれておらず、各第2共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位である、
本発明1012の方法。
[本発明1016]
前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記増幅されたDNA鎖を増幅する工程をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
前記第1プライマーミックス中のプライマーは、各第1DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、本発明1012の方法。
[本発明1018]
前記第2プライマーミックス中のプライマーは、各第2DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、本発明1012の方法。
[本発明1019]
各選択が、磁気ビーズを用いてDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、本発明1012の方法。
[本発明1020]
各選択が、カラム精製によりDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、本発明1012の方法。
[本発明1021]
各選択が、プライマーミックスの酵素的切断を含む、本発明1012の方法。
[本発明1022]
前記ゲノムDNAが単細胞から得られる、本発明1012の方法。
[本発明1023]
以下の段階を含む、対象における疾患の存在を診断する方法：
前記対象由来の試料を提供する段階であって、前記試料は疾患因子を含有する疑いがあり、前記疾患因子は標的配列により特徴づけられる、段階；
本発明1012の方法を前記試料中の核酸に対し実施する段階；
増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；および
前記疾患因子から標的配列を検出する段階。
[本発明1024]
以下の段階を含む、対象の免疫状態プロファイルを作成する方法：
本発明1012の方法を前記対象由来の白血球の試料からの核酸に対し実施する段階；
増幅されたDNA鎖をシーケンシングする段階；ならびに
T細胞受容体、抗体、およびMHC再編成を表す1つまたは複数のDNA配列を同定し定量して、前記対象の免疫状態プロファイルを作成する段階。
本開示は、以下の図面を参照することでより良く理解することができる。図面中の諸要素の縮尺は、互いに対し必ずしも相対的ではなく、代わりに強調により本開示の原理を明示している。さらに、いくつかの図にわたって同様の符番で対応する部分を指している。
図1A～図1Cは、RNA鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図1Aは、逆転写による単サイクルの第1鎖cDNA合成（第1鎖タグ付け）、未使用リバースプライマーミックスの除去、および第1鎖cDNAの選択の工程を示す。 図1A～図1Cは、RNA鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図1Bは、単サイクルの第2鎖DNA合成（第2鎖タグ付け）、未使用フォワードプライマーミックスの除去、および第1鎖：第2鎖DNAデュプレックスの選択の工程を示す。 図1A～図1Cは、RNA鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図1Cは、共通プライマーを用いて標的を増幅する工程、および選択と増幅を反復する任意の工程を示す。 図2A～2Cは、ゲノムDNA（「gDNA」）鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図2Aは、第1プライマーミックスでの第1鎖DNA合成（第1鎖タグ付け）、未使用第1プライマーミックスの除去、および第1鎖：DNAデュプレックスの選択の工程を示す。 図2A～2Cは、ゲノムDNA（「gDNA」）鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図2Bは、第2鎖DNA合成の工程、および未使用第2プライマーミックスの除去を示す。 図2A～2Cは、ゲノムDNA（「gDNA」）鋳型を用いるdam-PCR方法論の例示的態様の工程を図示している。図2Cは、共通プライマーを用いて標的を増幅する工程、および選択と増幅を反復する任意の工程を示す。 図3Aおよび3Bは、プライマーダイマー形成が出力に及ぼす影響を図示している。図3Aは、単細胞にarm-PCRを用いた場合のプライマーダイマー形成の優勢、およびそれに対応するプライマーダイマー形成による主産物バンド強度の低下を示すゲルである。ゲル上の百分率は、最終ライブラリクリーンアップ後も残留するプライマーダイマー産物のシーケンシングで無駄になったシーケンシングリード数の百分率を示し、各細胞データの次世代シーケンシングデータを分析して得た。個々のレーンは、アルファおよびベータTCR遺伝子座ならびに追加の表現型マーカーをカバーするarm-PCRマルチプレックスミックスでの増幅後のユニーク単細胞を表している。 図3Aおよび3Bは、プライマーダイマー形成が出力に及ぼす影響を図示している。図3Bは、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方を含むミックスにおいてPCR中にプライマー対の間でプライマーダイマー形成が生じる可能性、およびプライマーダイマー形成の結果無駄になったリード数を示す表であり、後者は、試料について企図されたリード数の31％も占める場合がある。 図4Aおよび4Bは、わずか1つの塩基対重複によるプライマーダイマー形成を図示している。図4Aは、鋳型の非存在下、RT-単細胞プロトコル（scRT）、no-RT単細胞プロトコル（scPCR）、およびiR-10-10プロトコル（iR1010）を含むいくつかのサイクル条件でarm-PCRを実施することによる意図的なプライマーダイマー形成を示すゲルである。レーン1～3は、1ヌクレオチド重複のプライマーダイマー形成を表し、これはプロトコルを用いたにもかかわらず、プライマーiTRAV_2とプライマーiTRACとの間で形成される。レーン4～6は、プライマーiTRAV_2とプライマーIL-17F-Ri-09との間の4ヌクレオチド重複のプライマーダイマー形成を表し、これはプロトコルを用いたにもかかわらず形成される。レーン6～9は、プライマーiTRAV_2とプライマーBCL6Ri_MD_11との間の6ヌクレオチド重複のプライマーダイマー形成を表し、これはプロトコルを用いたにもかかわらず形成される。レーン10～12は、プライマーiTRAV_40とプライマーBCL6Ri_MD_11との間の6ヌクレオチド重複のプライマーダイマー形成を表し、これはプロトコルを用いたにもかかわらず形成される。 図4Aおよび4Bは、わずか1つの塩基対重複によるプライマーダイマー形成を図示している。図4Bは、特定のプライマーダイマーにおいて特異的に重複する塩基対を図示している。図3Aおよび3Bに示したarm-PCRで増幅された単細胞のシーケンシング結果のプライマーダイマー産物のランクも提供されており、「トップ1」はNGSシーケンシング結果のなかで最高ランクのプライマーダイマー頻度を表し、「トップ2」はNGSシーケンシング結果のなかで2番目に多いプライマーダイマー頻度を表し、以下同様である。 図5は、プライマーダイマー傾向が高い一対のプライマーが所望の産物バンドの増幅を排除し得ることを示すゲルである。図示のアガロースゲルのレーン6では、標的IL-10を増幅するための4プライマーが成功裏PCRに含まれる。T-bet_Fiを添加すると、レーン7に示すように、関心対象となるバンドの増幅が排除される。同様に、T-betの4プライマーをカバーし、かつIL-17A-Foを含むマルチプレックスプライマーミックスは、レーン9に示すように、標的を成功裏に増幅する。しかし、有害なプライマーを1つ、つまりFoxP3Riリバース内側プライマーを添加すると、レーン10に示すように、主産物バンドの増幅は排除される。 図6は、アニーリング温度を調節してもプライマーダイマー効果が除去されないことを示すゲルである。プライマーダイマーを形成することが公知である4つの異なるプライマー対を、プライマーダイマー形成を除去するために59.9℃から66℃までいくつかのアニーリング温度で試験したが、奏功しなかった。 図7Aおよび7Bは、arm-PCR対dam-PCRのプライマーダイマー形成効果を図示するゲルである。図7Aは、dam-PCRが、ビーズ選択により、阻害的なプライマーダイマー効果を克服することを示すゲルである。レーン1～2は、arm-PCR対照である。レーン3～4は、ダイマー化の原因となることが公知である一対のプライマーのスパイクインを有するarm-PCR対照である。レーン5～6は、プライマーダイマー対のスパイクインなしの単サイクルdam-PCRである。レーン7～8は、プライマーダイマー対のスパイクインありの単サイクルdam-PCRである。レーン9～10は、プライマーダイマー対のスパイクインなしの、線形増幅を有するdam-PCRである。レーン11～12は、プライマーダイマー対のスパイクインありの、線形増幅を有するdam-PCRである。レーン13は陰性対照である。 図7Aおよび7Bは、arm-PCR対dam-PCRのプライマーダイマー形成効果を図示するゲルである。図7Bは、dam-PCRの場合は共通フォワードおよびリバースプライマーを用いての第1ラウンドの増幅後に、またはarm-PCRの場合は第1ラウンドのRT-PCR後に、dam-PCRがビーズ選択の代わりにトランスファーによって阻害的なプライマーダイマー効果を克服することを示すゲルである。レーン1～2はarm-PCR対照である。レーン3～4は、ダイマー化の原因となることが公知である一対のプライマーのスパイクインを有するarm-PCR対照である。レーン5～6は、プライマーダイマー対のスパイクインなしの単サイクルdam-PCRである。レーン7～8は、プライマーダイマー対のスパイクインありの単サイクルdam-PCRである。レーン9～10は、プライマーダイマー対のスパイクインなしの、線形増幅を有するdam-PCRである。レーン11～12は、プライマーダイマー対のスパイクインありの、線形増幅を有するdam-PCRである。レーン13は陰性対照である。 図8は、単細胞の増幅についてdam-PCR対arm-PCRで比較したゲルである。レーン1～6は、dam-PCRで増幅された単細胞を表し、レーン7～14は、arm-PCRで増幅された単細胞を表す。dam-PCRで増幅された細胞は、類似のエンドポイント強度を有し、かつプライマーダイマーは存在しないが、arm-PCRで増幅された細胞は、エンドポイントPCRにおいて多様性を示し、かつプライマーダイマーの増幅を示す。 図9は、未使用プライマーを除去するための選択工程の能力を示すゲルである。「標準曲線」と標識したレーンは、第1鎖タグ付けから第2鎖タグ付け間の、および第2鎖タグ付けから増幅間のプライマーのキャリーオーバーの量を評価するのに用いた。レーン1および2は、2回実施される磁気ビーズ選択工程を表し、標準曲線と比べると、未使用プライマーの99.99％超を除去する。レーン3および4は、1回実施される磁気ビーズ選択工程を表し、標準曲線と比べると、未使用プライマーの99.9％超を除去する。 図10A～10Bは、様々なマルチプレックスプライマーミックスを用いる、gDNAのdam-PCRを示すゲルである。図10Aは、TCRベータ遺伝子座増幅に関するarm-PCR（レーン1～4）対dam-PCR（レーン5～9）を示す。 図10A～10Bは、様々なマルチプレックスプライマーミックスを用いる、gDNAのdam-PCRを示すゲルである。図10Bは、gDNAの2つの投入量の腫瘍マルチプレックスパネルによるarm-PCR対dam-PCRを示す。レーン1～7は、200 ngのgDNA投入を表し、レーン1～3はarm-PCRで実施し、レーン4～7はdam-PCRで実施した。レーン8～14は、540 ngの投入を表し、レーン8～10はarm-PCRで実施し、レーン11～14はdam-PCRで実施した。 図11は、2つのエキソンをカバーするように設計されたプライマーを用いた、普通のgDNAマルチプレックスPCRを表す図である。このタイプの設計は、生物情報科学的プロセス中に遺伝子再構築ができるよう、2つの増幅産物間に重複を導入する。そのような方法は、重複の生成に必要な追加プライマーの適合性により非標的増幅を生産し、その結果として競合するより短いPCR産物が生じる。 図12は、gDNAのdam-PCR、および普通のマルチプレックスPCRと比べてdam-PCRに付随するメリットを示す図である。具体的には、第1サイクルのタグ付け中、より大きいエキソン産物をカバーする1セットのプライマーを使用することができる。第1プライマーミックスのクリーンアップ後、第2プライマーミックスは、それぞれの第1鎖産物とのみ相互作用する内側プライマーを含む。これらのプライマーはどの増幅にも関与せず、タグ付け中に1回使用されるだけなので、競合するより短いPCR産物が生じない。 図13は、重複部分を含む長いgDNA遺伝子標的をカバーする、具体的にはHLA標的をカバーする、arm-PCRマルチプレックスPCR戦略とdam-PCR戦略とのアガロースゲル比較である。アガロースゲル上方に、アガロースゲル中に参照されるプライマーの位置をわかりやすく示す図を提供する。レーン1は、arm-PCRを用いて遺伝子標的Aのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン2は、arm-PCRを用いて遺伝子標的Bのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン3は、重複セグメントをわざわざ生じさせたことによるT2フォワードとT1リバースとの相互作用からの1つの可能な標的外増幅の増幅パターンを示す。レーン4は、T1フォワードプライマーおよびT2リバースプライマーの長い増幅産物を示す。レーン5～6は、完全マルチプレックス化ミックスからのarm-PCRを示す。この結果は、あまり望ましくない、短い、標的外の産物にほぼ占められている。（T1フォワードおよびT1リバースから生産される）標的Aのみの遺伝子標的、（T2フォワードおよびT2リバースから生産される）標的Bのみの遺伝子標的、および（T1フォワードおよびT2リバースから生産される）標的Aと標的B両方の遺伝子標的は、短い産物が所望の産物とDNAポリメラーゼ活性に関して競合したせいで、スメアが生じ、ほとんど存在していない。レーン7は、dam-PCRを用いて、第1サイクルタグ付け中にT1リバースで、そして第2サイクルタグ付け中にT1フォワードで、遺伝子標的Aのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン8は、dam-PCRを用いて、第1サイクルタグ付け中にT2リバースで、そして第2サイクルタグ付け中にT2フォワードで、遺伝子標的Bのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン9～10は、完全マルチプレックス化dam-PCR戦略の結果を示す。第1ラウンドのタグ付けでは、T1フォワードおよびT2リバースを用いてより長い第1鎖産物を生成させた。第2ラウンドのタグ付けでは、T1リバースおよびT2フォワードが、第1鎖タグ付け中に生成した第1鎖産物と独立して相互作用して、第2鎖を合成した。第2鎖タグ付け、クリーンアップ、および第1ラウンドの標的に共通する一対のプライマーを用いての増幅後に、競合する短い産物は存在せず、所望の産物の増幅が得られた。
詳細な説明
本開示は、プライマーダイマー形成に関する問題を回避する核酸増幅法に関する。本方法は、本明細書においてダイマー回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（dam-PCR）と呼ばれる。本明細書で開示する方法は概して、以下の工程を含む：RNA試料から、少なくとも1つのDNA第1鎖たとえばcDNAを逆転写する工程であって、各DNA第1鎖にはリバース共通プライマー結合部位が組み込まれる、工程;各DNA第1鎖を選択する工程;該少なくとも1つのDNA第1鎖の各々から少なくとも1つのDNA第2鎖を合成する工程であって、各cDNA第2鎖にはフォワード共通プライマー結合部位が組み込まれる、工程;各cDNA第2鎖を選択する工程;および共通プライマーを用いて該DNA鎖を増幅する工程。あるいは、本方法はgDNA鋳型を用いて実施される場合がある。本明細書に記載の方法は、DNA鎖の選択、および増幅前のプライマーの除去により、プライマーダイマー形成を回避し、従来のマルチプレックスPCR法と比べて非常に高い感度および効率を可能にする。
本明細書で用いられる場合、「疾患」は、ある因子に起因または関連する感染、症状、または状態を意味する。
本明細書で用いられる場合、「疾患因子」は、その形態にかかわらず、核酸配列を含有し対象における疾患の原因または一因となる、限定ではないが細菌、癌細胞、ウイルス、または寄生体を含むあらゆる生物を意味する。
本明細書で用いられる場合、「第1プライマーミックス」は、gDNAに結合するように構成されている少なくとも1つのリバースプライマーおよび／または少なくとも1つのフォワードプライマーを含む混合物を意味する。
本明細書で用いられる場合、「フォワードプライマーミックス」は、少なくとも1つのフォワードプライマーを含む混合物を意味する。
本明細書で用いられる場合、「同定マーカー」は、mRNAまたはgDNAの特定の試料、核酸鎖、または単細胞供給源を同定するための標識として用いられるヌクレオチド配列を意味する。
本明細書で用いられる場合、「リバースプライマーミックス」は、少なくとも1つのリバースプライマーを含む混合物を意味する。
本明細書で用いられる場合、「試料」は、DNAまたはRNAを含む物質を意味する。
本明細書で用いられる場合、「第2プライマーミックス」は、少なくとも1つのDNA第1鎖に結合するように構成されている少なくとも1つのリバースプライマーおよび／または少なくとも1つのフォワードプライマーを含む混合物を意味する。
本明細書で用いられる場合、「対象」は哺乳類を、好ましくはヒトを意味する。
従来のマルチプレックスPCR法には選択工程（すなわち、プライマーミックスの除去またはDNA鎖の分離）が含まれるが、この工程を行うにしても、それはPCRで増幅産物が生産された後である(たとえばarm-PCR[WO/2009/124293]、tem-PCR[WO/2005/038039]、各々入れ子式プライマーの使用をさらに要する)。しかしPCR完了後に選択を実施すると、最初の2、3回のPCRサイクルでプライマーダイマーが形成される機会があるばかりでなく、プライマーダイマーがPCR反応の間中ずっとDNAポリメラーゼ活性に関して標的配列と競合することになるのでプライマーダイマーは反応感度の低下も招くことを、本出願人らは示す。さらに、増幅産物とプライマーダイマーとは分子量および電荷が類似しているため、分離が難しくなる。下の実施例で示すように、極端な場合には、プライマーダイマーの増幅が反応を独占し、標的配列の増幅を完全に排除してしまう。DNAポリメラーゼは、より長い産物の生産よりも、より短い増幅産物の生産およびそれとの結合に長けており、したがってさらにプライマーダイマーの生成に拍車がかかる。プライマーダイマーが形成されるが標的配列の増幅を完全に阻害するわけではない場合でも、標的配列とプライマーダイマーとの競合により所望の増幅産物の量は低下し、それは、反応全体の感度を低下させ、かつ、シーケンシングまでキャリーオーバーされるとシーケンシングリード数の損失および不要コストをもたらす産物を生成する。
本出願人らは、マルチプレックス最適化の現パラダイムには、本質的に欠点があると主張する。なぜなら、わずか1 bpの重複でもプライマーダイマーが形成し得るからである。したがってプライマーダイマーの予測は不可能であり、新規の方法論により対処する必要がある。ここで本出願人らは、所望のDNA鎖をプライマーミックスから分離する（本明細書では「選択」と呼ぶ）効率が、選択をPCR後ではなく逆転写後に実施するほうがはるかに良いことを明らかにする。次世代シーケンシング（NGS）に適合するライブラリを作成する場合などに比較的長いオリゴヌクレオチドを用いる場合、プライマーダイマー形成によりおよそ200 bp長の産物が生産されることがあり、所望の産物バンドからの分離がはるかに困難になり、効率も悪い。しかし、選択工程を逆転写後にもってくれば、およそ2 kbのRNA:DNAデュプレックスを個々のプライマー（典型的には80 bp未満）から分離することになり、はるかに簡単に分離できる。記載の方法における第2鎖合成後の追加の選択も、PCR後の選択よりも容易であるが、それは、プライマーダイマーが形成していないので第1鎖DNA：DNAデュプレックスとより短いプライマー（80 bp未満）との間の分離になるためである。要するに、単細胞用途において重要な感度は、PCR後に増幅産物をプライマーダイマーから分離または救済するまで待っていては、すでに失われてしまう。これに対し、リバースプライマーミックスがフォワードプライマーミックスと相互作用するのを防止すること（たとえば、逆転写と第2鎖cDNA合成との分離）により、またはgDNAの場合は第1プライマーミックスが第2プライマーミックスと相互作用するのを防止することにより、そして一切のPCR工程前にリバースプライマーまたはフォワードプライマーミックスを除去することにより（またはgDNAの場合に用いた第1プライマーミックスまたは第2プライマーミックスを除去することにより）、プライマーダイマー形成の可能性が排除され、反応エネルギーが所望の産物の増幅に集中する。
さらなる裏付けとして、本出願人らは、単細胞を様々な遺伝子発現パターンを有する動的鋳型とみなすことができると主張する。単細胞では、異なる鋳型量の存在または不存在を前提として、マルチプレックス系がどのように応答するかを予測することができない。鋳型の存在下では形成しないはずのプライマーダイマーは、特定遺伝子が不存在ならば形成することもあり、単細胞レベルの発現の多様性のせいでプライマー設計は不可能となる。
こうした難点を克服するために、本出願人らは、本明細書においてダイマー回避マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（dam-PCR）と呼ばれるRNAの多工程マルチプレックス逆転写（RT）PCRまたはgDNAの多工程マルチプレックスPCRにおいてプライマーダイマーを回避する方法論を開発した。逆転写工程は、第2鎖DNA合成とも、ユニバーサルプライマーを用いるPCR増幅とも別に実施される。同様にgDNAについても、第1プライマーミックスによる鎖タグ付けは、第2プライマーミックスにより実施される第2鎖タグ付けとは別に実施される。合成されたDNAを各工程で選択すること、そして1サイクルのタグ付けおよび伸長により第1鎖cDNAまたはgDNAにタグ付けすることにより、プライマーダイマー形成の傾向が回避され、DNAポリメラーゼ活性はプライマーダイマーよりも関心対象となる標的の増幅に集中し、増幅感度は大幅に増加する。RNA鋳型を用いる本開示の方法の例示的な態様を図1A～1Cに示し、gDNA鋳型を用いる本開示の方法の例示的な態様を図2A～2Cに示す。
逆転写中、3'遺伝子特異的であり5'ユニバーサルである結合部位を含有する1つまたは複数のリバースプライマーが、第1鎖cDNA合成に用いられる。逆転写後のプライマーダイマー軽減のためのひとつの鍵となるのは、第1鎖cDNA：RNA複合体（「第1鎖：RNA複合体」）の非常に正確な選択、およびこの主産物バンドからの（典型的には80 bp未満の）配列長のオリゴヌクレオチドの高効率の除去である。個別のオリゴヌクレオチドで各RNAを標識することによりRNAを定量する場合、ユニーク標識されたプライマーのキャリーオーバーが、標識された核酸種を正確に定量する能力を損なうので、このことは特に重要である。逆転写後、選択工程を実施して未使用リバースプライマーを除去する。この「選択」工程は、DNA鎖（たとえば、溶液中の第1cDNA鎖：RNA複合体または単鎖の第1鎖cDNA）を未使用プライマーミックスから分離するものであり、磁気ビーズ（たとえば固相可逆固定化（SPRI）ビーズ）により、ストレプトアビジン－ビオチンビーズにより、酵素により、カラムにより、ゲル精製により、または他の物理的、化学的、もしくは生化学的手段により、積極的にDNA鎖を選択することもできるし、または逆に未使用プライマーおよび一切のDNAポリメラーゼを除去することもできる。実施例では、本出願人らは、未使用プライマーを99.99％超除去する選択効率を示している。
第1鎖cDNA合成が完了し第1鎖cDNAの選択により逆転写プライマーが効率よく除去されると、フォワードプライマーミックスを用いて第2鎖cDNA合成が実施され、これは第2鎖DNA「タグ付け」と称される。リバースプライマーの一切の非存在下でのフォワードプライマーミックスによる第1鎖cDNA産物のタグ付けには、1サイクルのDNAポリメラーゼ活性化および後続のアニーリングで十分である。1サイクルしか実施されず、未使用プライマーはPCR前に除去されるので、個々の核酸種のタグもこの工程で導入することができる。この時点で、限定されたサイクル数の線形増幅（リバースプライマーの非存在下でプライマーのアニーリングおよび伸長および／または等温増幅）を実施して収率を上げることも可能である。しかし、アニーリングおよび伸長の追加サイクルが多すぎると、フォワードミックス中のプライマー間で有害なプライマーダイマーが形成するリスクが高まり得るので、所与のマルチプレックス系について実験的に決定しておく必要があろう。本出願人らは、単細胞からの増幅で明らかなように、第1および第2鎖のタグ付けはそれぞれ単サイクルで十分に増幅できることを示す。第2鎖DNA合成後、第2選択工程を実施して未使用フォワードプライマーミックスを除去する。この選択工程は、DNA鎖を未使用プライマーミックスから分離するものであり、磁気ビーズ（たとえばSPRIビーズ）により、ストレプトアビジン－ビオチンビーズにより、酵素により、カラムにより、ゲル精製により、または他の物理的、化学的、もしくは生化学的手段により、積極的にDNA鎖を選択することもできるし、または逆に未使用プライマーおよび一切のDNAポリメラーゼを除去することもできる。基本概念は最初の選択と同じであり、プライマーの複雑さを除去して、所望の主産物を打ち負かし得るプライマーダイマーを形成させないことである。
この時点で、「タグ付き」DNAは、5'末端にも3'末端にもユニバーサルプライマー結合部位を含有している。リバースプライマーおよびフォワードプライマーのタグ付け用ミックスはすべて、このステージによって除去される。ユニバーサル部位は、一般に、選択されたNGSプラットフォームに必要なシーケンシングアダプターまたはアダプターの一部分である。しかし、どのようなユニバーサル工学設計部位でも利用可能である。PCRは、ユニバーサル「タグ付き」第2鎖cDNAに共通のプライマー対を用いて実施される。これらのプライマーが、幾何級数的増幅ステージを補完する。プライマー複雑度が2プライマー系にまで減じられているので（ここで3'末端は逆相補的ではなく、そしてプライマー対はプライマーダイマー形成に関しスクリーニング済みである）、このPCR中にプライマーダイマーが生産される傾向は排除される。
単細胞などの低投入量の場合、第2ラウンドのPCRの実施が必要となり得る。その場合、前述したようにして第1ラウンドのPCRの選択を完了し、ユニバーサルプライマー対を用いる2工程PCRを新たな酵素、バッファー、およびdNTPを用いて実施して、第1ラウンドの産物を濃縮する。どの場合も最終ライブラリの選択を実施し、そのようなライブラリは、当技術分野で公知の技法を用いるプーリング、プレシーケンシングQC、およびシーケンシングにそのまま用いることができる。
gDNAの改変を行う場合もあるが、全体として同じ原理が適用され、プライマーダイマーの作製が回避される。第1ラウンドのPCRを、1セットのマルチプレックス化プライマー（第1プライマーミックス）のみを用いて単サイクルの変性およびアニーリング工程で実施する。感度を高めるために、ミックス中のプライマーダイマー形成が制限される限りは、線形増幅または等温増幅を実施することができる。第1鎖：DNA複合体を前述したようにして精製し、第2プライマーミックスを用いて第2鎖合成を単サイクルで実施する。感度を高めるために、線形増幅または等温増幅を実施することができる。第2鎖合成後、前述したようにして選択を実施し、RNAプロセスで記載したようにしてユニバーサルプライマー対を用いてPCRを実施する。
本明細書で開示する方法は、医学的試料、環境試料、食物試料、および他の試料を評価してそれら試料中の微生物および他の因子を同定するために、ウイルス、細菌、真菌、植物および／または動物細胞由来の核酸の存在および相対的な存在量を検出するのに用いることができる。
本明細書に記載の方法の1つの利点は、従来のマルチプレックスPCR法とは異なり、プライマーダイマー形成が回避されることであり、それにより、標的配列の増幅に影響を及ぼす能力のあるプライマーダイマーが普通なら生じかねないプライマーセットの選択が、非常に簡単になる。本明細書に記載の方法の別の利点は、プライマーダイマー形成が回避される結果、マルチプレックスPCRが単細胞に至るまで高感度になることである。本開示の方法を用いて、単細胞レベルでRNAを標的とすることができる。さらに、普通ならプライマーダイマーの存在により生じるはずの無駄なリード数が減少することにより、各標的配列のリード当たりのコストが大幅に低下する。本方法の別の利点は、特にgDNAの大きな遺伝子セグメントのカバレッジ（coverage）に関するものであり、感度を下げる有害なより短い増幅産物副産物の導入なしに、重複増幅産物に由来するデータを作成できることである。これらの副産物は、同様の戦略を通常のマルチプレックスPCRで用いる場合には避けられない。本dam-PCR法は、第1および第2プライマーミックスの戦略的設計を可能にし、より長いカバレッジを可能にしながら、DNAポリメラーゼ活性に関して競合する短い増幅産物を生産する特定プライマー間の相互作用を制限する。
材料および方法：dam-PCRおよびarm-PCRのセットアップ
T細胞受容体アルファ遺伝子座、ベータ遺伝子座、および追加の表現型マーカーをカバーするプライマーを、PCR戦略に応じて同一ミックス中またはフォワードおよびリバースミックス中にマルチプレックス化させた。arm-PCRミックスは、同一ミックス中218のフォワードプライマーおよび68のリバースプライマーからなり、247またはそれ以上の標的をカバーした。標的は基準配列の観点から定義されるが、再編成TCR遺伝子座の変異性により、所与の試料中の実際の標的配列数はバルクRNA試料では典型的には数千ある。単細胞については、細胞表現型によるが、5～10、またはそれ以上の標的が存在し得る。dam-PCRについては、フォワードミックスをリバースミックスとは別に処理し、arm-PCRの入れ子部分に関する外側プライマーを排除し、全部で107のフォワードプライマーおよび32のリバースプライマーとした。ユニバーサルタグを含有する内側プライマーは両ミックスに共通であり、プライマーダイマー形成の原因となることが公知であるプライマー対を含んでいた。両プライマーセットにおいて、Illumina 2インデックス・コンパチブル・シーケンシング・プライマーBの一部分を各フォワード内側プライマーに連結し、Illumina 2インデックス・シーケンシング・コミュナル(communal)・プライマーAの一部分および6ヌクレオチドの試料バーコード配列をリバース内側プライマーに連結した。特定の実験では、個々の核酸種にタグ付けする20のランダムヌクレオチドのインデックスを、試料バーコードに隣接して含めた。
arm-PCRアプローチでは、286プライマーの入れ子式プライマーミックス、およびOneStep RT-PCRキット（Qiagen社、カリフォルニア州バレンシア）の試薬を用いて、全RNA試料からcDNAを逆転写した。arm-PCRでは、第1ラウンドのRT-PCR（「RT-PCR1」または「PCR1」と称する）を次のように実施した：50℃で60分;95℃で15分;94℃で30秒、60℃で5分、72℃で30秒を10サイクル;94℃で30秒、72℃で3分を10サイクル;72℃で5分、および4℃でホールド。RT-PCR1後に、0.7x SPRISelectビーズ選択（Beckman Coulter社、カリフォルニア州ブレア）を1回実施し、Promega Gotaq G2 Hotstart PCRミックス（Promega社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて核酸産物をビーズから溶離した。第2ラウンドのPCR（「PCR2」と称する）を、Illumina アダプター配列を補完する1セットのコミュナルプライマーを用いて次のように実施した：95℃で3分;94℃で30秒、72℃で90秒を30サイクル;72℃で5分、および4℃でホールド。
dam-PCRでは、逆転写工程は、リバースプライマーミックスの存在下、50℃で240分間、Qiagen OneStep RT-PCRキットを用いて実施し、0.7x SPRIビーズ選択を2回実施することにより、第1鎖cDNAをリバースプライマーミックスから分離した。逆転写後、Biorad C1000サーモサイクラー内で、Promega GoTaq G2 HotStart DNAポリメラーゼを用い、フォワードプライマーミックスのみ（リバースプライマーなし）を用いて、1サイクルのタグ付け:95℃で3分の初期変性およびホットスタート;60～65℃でアニーリング、1℃の変化につき3分;72℃で10分伸長し4℃で最終ホールド、または線形増幅戦略:初期変性およびホットスタート95℃で3分、次いで6サイクルのアニーリングおよび伸長;60℃で5分アニーリング、72℃で1分伸長、および4℃で最終ホールドのどちらかにより、第2鎖DNA合成を実施した。第2鎖DNA合成後、0.7x SPRIビーズ選択を2回用いて第2鎖DNA：DNAデュプレックスをフォワードプライマーミックスから分離した。リバースおよびフォワードプライミング工程で導入された部分アダプター配列に共通の一対のプライマーを含有させたPromega Gotaq G2 Hotstart PCRミックスを用いて、DNA産物をビーズから溶離した。arm-PCRアプローチの全サイクルに相当する20サイクルのPCRで、該ユニバーサルプライマー対とともにcDNAを次のように増幅した：95℃で3分;94℃で30秒、72℃で6分を10サイクル;94℃で30秒、72℃で3分を10サイクル;72℃で5分、および4℃でホールド。dam-PCRでは、先述したようにして追加のSPRIビーズ選択を1回実施し、新たな酵素、バッファー、およびdNTPの存在下、2回目のPCRを次のように実施した：95℃で3分;94℃で30秒、72℃で90秒を30サイクル;72℃で5分、および4℃でホールド。
第2PCR反応（すなわち、arm-PCRの場合のPCR2）後、10 μLのPCR産物を2.5％アガロースゲルにかけて増幅の成功度を評価した。arm-PCRとdam-PCR両者の産物のシーケンシングに先立ち、0.7x SPRIビーズ選択を1回用いて、ライブラリを選択した。ヌクレアーゼを含まない水25 μL中、最終ライブラリをビーズから溶離し、Nanodrop（Thermoscientific社、カリフォルニア州カールスバッド）で測定した。プライマーダイマーのスパイクインを有して生成したライブラリ以外、シーケンシング用に各ライブラリの等モル量をプールした。スパイクインを有するライブラリは、ライブラリの入手可能性を理由に、その半量をプールした。プールしたライブラリをQubit定量により定量し、Bioanalyzerで評価した。次いでライブラリをKappa qPCRで定量し、10％ PhiXのスパイクインにより8 pMまで希釈し、250ペアエンドリードのIllumina MiSeq v2、500サイクルキットを用いて配列決定した。記載のgDNA鋳型には、逆転写工程を除いたこと以外同様の戦略を用いた。本明細書に記載の第1および第2プライマーミックスの設計時は戦略的プライマー設計を用いて、短い産物の生産を回避した。
プライマーダイマー形成がNGS出力に及ぼす影響:関心対象となる遺伝子に対する感度の喪失、無駄なリード数、したがってシーケンシングコストの増加を招く
図3Aでアガロースゲルに示すように、従来のarm-PCRを最適化マルチプレックスミックスと一緒に用いて単細胞を増幅した。単細胞は、当技術分野で公知の技法を用いて単離してもよい。arm-PCRは、産物が「救済」される入れ子式のマルチプレックスRT PCRであり、たとえば、RT-PCR後、完了した第1増幅反応から少量を抽出して第2増幅用の増幅産物とすることができる。
増幅後、各細胞を表すライブラリをプールし、250ペアエンドリードのIllumina MiSeq v2 500サイクルキットでのシーケンシングに先立ち、追加の1ラウンドの選択に供した。プライマーダイマーの証拠について、生データを成功裏の標的リードに対し相対的に分析した。プライマーダイマー配列が占めるリードの百分率は、主産物バンドのバンド強度と反比例することが見出された（図3B）。たとえば、試料BB-S73については、主産物バンドが強く、プライマーダイマーはこの細胞のシーケンシングリード数の1％しか占めなかったが、試料XH-S28については、産物シーケンシングリード数は比較的少なく、この細胞データの89％をプライマーダイマーが占めていた。試料BB-S25などの比較的強い産物バンドのデータでも、プライマーダイマーが25％を占めていた。
RNAseqなどの他の方法と比べて、標的指向されたシーケンシングアプローチのメリットは、関心対象となる遺伝子をカバーするのに要するシーケンシング深度がより浅いことであり、それは、関心対象となる遺伝子が特異的に標的指向され増幅されるからである。単細胞を分析する場合、特に各単細胞を試料として扱う場合は、標的指向されたseqアプローチと同じカバレッジを得るために25倍のリード数が必要だとすると、コストはたちまち法外なものになり得る。記載の実験のプライマーダイマー配列の分析結果によると、全シーケンシングリード数の31％もがプライマーダイマーに占められて貴重なシーケンシングリソースを無駄にしており、結果として所与の細胞の関心対象となる遺伝子をカバーする感度の喪失のみならず、不適切なコストがかかる。しかし、最強の増幅産物バンドと等価な増幅が得られれば、プライマーダイマーの無駄は本質的に排除され、その上シーケンシングコストの低下ならびに感度および関心対象となる遺伝子のカバレッジの増大というメリットがもたらされる。
プライマーダイマーのNGSによると、1 bpの重複でもプライマーダイマーが形成するには十分であり、設計のみによる除去は不可能である
プライマーダイマーを除去しようと努めて、本出願人らは、鋳型の非存在下でマルチプレックスミックスを用いてarm-PCRを実施することにより意図的にプライマーダイマーを生じさせ（図4A）、得られた増幅産物の配列を次世代シーケンシング（NGS）技術により決定して、再設計が必要であり得るプライマー配列を際立たせた。驚くべきことに、データ中、わずか1 bpの重複でダイマー化産物を生じる数百を超える異なる相互作用対が明らかになった（図4B）。実は、1 bp重複プライマーダイマーは、最も頻繁に観測されたプライマーダイマー対の一つであった。塩基対の相補性および各プライマーの3'末端に基づきいくつかの潜在的な対は予測可能であったが、1 bpの重複を予測することは不可能であり、したがって関連の設計も不可能なので、またしてもマルチプレックスPCRのプライマー「最適化」の現パラダイムの欠点が明らかになった（たとえばCanzar）。
しかし、プライマーダイマーのクローニングおよび個々のクローンのシーケンシングからは、この問題の全容および可能な相互作用の純粋な数を知ることはできない。プライマーダイマーバンドの配列をNGSで物理的に観測するまでは、プライマーダイマーに「打ち勝つ設計」が不可能であることは明らかでなかった。先の結果（図3A）は、「成功裏の」マルチプレックスPCRでも、やはり有意なプライマーダイマー生産があることを示している。このプライマーダイマー産物は、PCRの間中、関心対象となるバンドと競合し、PCR感度を大幅に低下させ、試料について関心対象となる遺伝子のカバレッジを損なわせる。NGSより以前は、プライマーダイマー効果の程度を観測することはできなかった。まとめると、これらの結果はどちらも、本明細書で開示するdam-PCRを用いるPCRの代替アプローチが、マルチプレックスPCRにおける適合性および感度の問題を解決する唯一可能な策であることを明らかにしている。
単一のプライマー対がマルチプレックスPCRに及ぼし得るダメージの証拠
上述した図3Aから、増幅が比較的「成功」したとみなされる場合でも、プライマーダイマー形成がシーケンシング収率に影響を及ぼし得ることは明らかである。換言すると、増幅は関心対象となるバンドをもたらしたが、シーケンシング結果は、関心対象となる産物と一緒に有意な量のプライマーダイマーを示した。しかし、本出願人らはまた、マルチプレックスPCRミックスにおいて所望の産物バンドの増幅を皆無にする1つのプライマー対の極端な場合の一例を示すことができる。図5に示すように、IL-10のプライマーを含有するミックスにT-betフォワードプライマーを加えた結果、この1つのプライマーをミックスに加える以前は存在した所望の産物バンドが排除された。同様に、T-betフォワードとリバースプライマーとのミックスにFoxP3リバースプライマーを加えると、同じく主産物バンドの増幅の喪失という結果になった。
本出願人らは、1つのプライマー対が関心対象となる標的の増幅を排除し得ることを示した。PCR中にプライマーダイマーが所望の産物とDNAポリメラーゼ活性に関して競合することを示す本開示の観点からは、多くのマルチプレックスPCRの失敗は、（所望ではないが）「成功裏の」プライマーダイマー増幅産物とみなすことができ、これはマルチプレックスPCRを理解する上でのパラダイムシフトとなる。このポイントを明白にしたところで、本開示は、最良のPCRアプローチとは、本開示のdam-PCR方法論により達成されるように、主産物バンドと潜在的プライマーダイマーとの間のDNAポリメラーゼ活性の競合を回避することである、ということを示す。
アニーリング温度を上げても、プライマーダイマー傾向の克服には不十分である
プライマーダイマー形成を除去するために最も頻繁に試みられる方法の一つは、PCRサイクル数を減じること、およびプライマーダイマー形成はより高温で阻害されるという概念により、アニーリング温度を上げることである。単細胞を増幅する場合、開始コピー数が少ないため、増幅を実現するには多数のサイクルが必要なので、感度を維持するのであればサイクル数の減少は実行可能なオプションではない。図6で、本出願人らは、ミックス中のプライマーが標的鋳型に結合しなくなるポイントにアニーリング温度を調節することは、プライマーダイマー形成の除去には不十分であることを示し、アニーリング温度を上げるだけでは競合が除去されないことを示す。プライマーダイマーを形成することが公知であるプライマー対を様々なアニーリング温度で試験した。アニーリング温度を上げることによりプライマーダイマーの生産を低減できるならば、温度を上げればプライマーダイマーバンドの強度が低下したはずである。ところが、どの場合にも、アニーリング温度の上昇にもかかわらず、プライマーダイマー産物のバンド強度は比較的変化しなかった。許容される最高のアニーリング温度で、試験した対のうち2つにわずかな減少があっただけであった。
arm-PCRとdam-PCRとの比較のための、プライマーダイマー傾向のあるプライマー対の意図的なスパイクイン
dam-PCRは、プライマーダイマーが増幅に及ぼす阻害的影響を克服する能力がある。arm-PCRとdam-PCRとの比較実験を、CD3+T細胞と脾臓との混合物から得た150 ngのRNAを含有するマルチプレックスミックスを用いて実施した。arm-PCR実験は、プライマーダイマー形成の原因となることが公知である追加のプライマー対の存在下および非存在下、フォワード内側プライマーとリバース内側プライマー両方の（外側プライマーではより良い比較にならない）プライマーミックスを加えることにより実施した。dam-PCRでは、arm-PCR増幅で用いたのと同じリバースプライマーミックスを逆転写工程中に加えた。磁気ビーズを用いて第1鎖cDNAを選択し、arm-PCR実験で用いたのと同じフォワードプライマーミックスを用いて第2鎖タグ付けを実施した。単サイクルdam-PCR（1サイクルの熱変性、アニーリング、および伸長）と線形増幅dam-PCR（熱変性後、6サイクルのアニーリングおよび伸長）との比較も実施した。磁気ビーズを用いてタグ付きdam-PCRライブラリを選択し、一対のコミュナルプライマーを用いて20サイクルでライブラリを増幅した。タグ付けおよびこの共通プライマー対を用いての1ラウンドの増幅の後、2 μLのdam-PCRライブラリを第1PCR増幅産物から第2PCR反応へのトランスファー実験に用い（図7B）、同様のトランスファーarm-PCR試験と直接比較した。磁気ビーズを用いて残りのdam-PCRライブラリを選択し、新たな酵素およびバッファーの存在下、同じユニバーサルプライマー対を用いて、さらに30サイクルで増幅した。増幅サイクルの全回数はarm-PCRプロトコルと等しく、20サイクル増幅のRT-PCR工程および30サイクルの第2PCRが含まれた。
図7Aおよび7Bに示す結果は、プライマーダイマー回避のdam-PCR戦略が、ダイマー化の可能性が高い一対のプライマーの存在にもかかわらず高感度の増幅をもたらすことを、はっきりと示している。技術的には、dam-PCRではこの問題のプライマー対は決して接触しないので、ダイマー化する機会がまったくない。したがって、タグ付け工程は2つの独立した工程で実施され、PCRによる増幅は実際には（マルチプレックスミックスの代わりに）一対の共通プライマーにより実施される。プライマーのマルチプレックス化されている部分は、フォワードセットおよびリバースセット（またはgDNAでは第1プライマーミックスおよび第2プライマーミックス）のそれぞれだけである。しかし、各セット、フォワードミックスおよびリバースミックスは、一度しか使用されないので、潜在的なミックス内プライマーダイマー対は決して蓄積することができない。図7Aおよび7Bのすべての増幅は、テクニカルレプリケートを含んでいる。図7Aは、第1PCR反応から第2PCR反応間のビーズ選択を表し、図7Bは、第1PCR反応から第2PCR反応間の2 μLトランスファーを表している。図7Aおよび7Bに示すように、公知の有害なプライマー対の存在下でarm-PCRを実施すると、所望の産物の増幅効率は低下した。この影響は、図7BのPCR1からPCR2間のトランスファーの場合に顕著であり、主産物バンドを排除している。図7Aおよび7Bでは、同じ鋳型RNAについて、dam-PCRアプローチが非常に強い主産物バンドおよびプライマーダイマーの不生産をもたらすことが、特に、2 μLトランスファーの場合と同じくプライマーキャリーオーバーのチャンスがない図7Aで、明白である。アガロースゲル上でdam-PCRの単サイクルと線形増幅アプローチとの間に明らかな差異はなく、単サイクルのタグ付けが実施可能なアプローチであることが示される。
dam-PCRと単細胞の増幅
単細胞は、おそらく最も困難な鋳型の一つである。それは、標的のコピー数が少なく、また、細胞ごとの表現型の多様性によりマルチプレックスミックスと鋳型との各相互作用が動的なものになるからである。鋳型の非存在下では、集合的なバルク測定では高いプライマーダイマー形成傾向を示さない特定のプライマー対が、標的がないためダイマー化し始めることがある。そのため複雑さが一層増すが、それは、高度にマルチプレックス化されたプライマーミックスとコピー数が少ない様々な鋳型との相互作用の予測または関連の設計ができないためである。図8で、本出願人らは、単細胞レベルでの遺伝子発現の多様性にもかかわらず、dam-PCRが単細胞レベルでプライマーダイマーの形成なしにバンド強度が強い増幅産物を生産したことを示すが、arm-PCRは、単細胞の動的性質のせいで関心対象となる標的の増幅の程度にばらつきが生じ、プライマーダイマー形成およびスメアが増加し、プライマーダイマー形成が明確に回避されなかったことを示した。これらの負の副作用は、結果として関心対象となる標的がシーケンシング結果から脱落するので単細胞の出力を低下させ、十分な遺伝子カバレッジを与えるために細胞当たりより多くのシーケンシングリード数の充当を要し、無用なプライマーダイマーのために高額なシーケンシングを行うことになり、結局は単細胞の分析コストを相当増大させる。
選択後のプライマーのキャリーオーバー
本明細書で開示する方法が、工程から工程の間に未使用プライマーを100％近く除去することになる、ということを示すため、本出願人らはある実験を実施し、ここで本出願人らはリバースプライマーの2 pmol原液を0.5％から0まで系列希釈して標準曲線を作成した。これらの希釈物を、2種類のクリーンアップ方法からのプライマー残留キャリーオーバーを測定するための基準として用いた。これらの希釈物は、リバースプライマーの0.5％から0％のキャリーオーバーが逆転写から第2鎖合成間に発生する場合を模倣している。プライマーダイマー傾向が公知であるフォワードプライマーを、系列希釈ミックスの各々に加え、ミックスをPCRに供して「残留」リバースプライマーの割合を間接的に視覚化した。試験試料には、4つの試験の各々で2 pmolのリバースプライマーを含めた（テクニカルレプリケートを含む）。これらのミックスを2つの異なるSPRIビーズクリーンアップ法に供した。クリーンアップ後の残留プライマーを検出するため、系列希釈試料に用いたのと同じフォワードプライマー2 pmolを、試験試料の選択済み産物に加えた。この場合、クリーニング後の残留リバースプライマーが、可能な増幅の唯一の供給源であった。試験試料を標準希釈曲線と同じPCRに供した。こうすれば、試験試料の増幅のバンド強度は、図9に示す標準曲線との比較により、クリーンアップ試験の残留リバースプライマーの割合を直接示すことができる。結果によると、残留プライマーはゲル上で検出されず、したがってCES選択は0.01％未満のキャリーオーバーを有した（または99.99％超の除去率）が、0.7x SPRI選択は0.10％のキャリーオーバーを有した（または99.9％超の除去率）。
gDNAへのdam-PCRの適用
異なる標的をカバーする3つの別々のマルチプレックスミックスを用いてdam-PCRでgDNAを増幅した。1つの標的ミックスは、フォワードプライマーがV遺伝子セグメント、そしてリバースプライマーがJ領域で、ヒトTCRベータ遺伝子座の可変領域をカバーし、gDNAからのTCRベータ遺伝子座のVDJ再編成の割り出しを可能にする。再編成可変領域とC遺伝子との間のイントロンギャップが、シーケンシング長の制限と相まって、gDNAカバレッジのためにこの位置にリバースプライマーを配置する必要をもたらし、この遺伝子セグメントをカバーするために13のリバースプライマー、および33以上のフォワードプライマーが必要となる。比較として、このミックスをarm-PCR戦略にも用いた。図10Aに示すように、dam-PCR増幅は、gDNAに適用すると増幅産物バンドを生産したが、arm-PCRは、おそらく部位外のバックグラウンド増幅のせいでスメアを発生させた。（典型的なマルチプレックスPCR戦略と同じく）フォワードおよびリバースプライマーミックスを同時に用いると、プライマーは再編成に用いられていない部位に結合することがあり、そして関心対象となる再編成シグナルと競合する産物を最初の数サイクルで生じさせることがある。これらの部位外反応は、dam-PCRでは、両方向とも1サイクルのタグ付けしか許容されず、また、工程から工程の間で主たる関心対象となる標的だけが選択されるので、減少する。
dam-PCRが適応免疫細胞以外の標的にも有効であることを示すため、癌性悪性病変での変異が一般的な遺伝子標的（腫瘍パネル；図10B）をカバーするマルチプレックスミックス、および個人のヒト白血球抗原型（HLA型）を検出するためのプライマーミックスも、gDNAに適用した。
gDNAでは、どのプライマーを各ミックスに含めるかに関して、より柔軟性が高い。フォワードミックスだけ、またはリバースミックスだけを含める必要はない。したがって、出願人らは、プライマーミックスを第1ミックスおよび第2ミックスと呼ぶ。この戦略は、増幅プロセスにもシーケンシングにも有害なバックグラウンドを減じつつ、重複する増幅産物によるより長いシーケンシングカバレッジを可能にするプライマーミックスを設計する際に適用することができる。RNAとの第1鎖cDNAの合成の方向性により、最初にリバースミックスを用いる必要がある。gDNAを鋳型として用いる場合、センス鎖とアンチセンス鎖とのミックス中に必ずしもプライマーミックスを階層化させなくてもよい。プライマーを用いて重複部分を設計して、シーケンス後、より大きい遺伝子産物を生物情報科学的に下流で再構築するのを容易にすることができる。通常、典型的なマルチプレックスPCRでもそうであるように、全プライマーミックスが同一ミックス内で相互作用できる場合、標的外の増幅が生産され、関心対象となる産物と競合するバックグラウンドが生成し、それによって図11に示すようにシーケンサーで高コストとなるバックグラウンドが生じる。dam-PCRでは、このプライマーミックス戦略は、より大きい遺伝子標的をカバーしようとする場合に、バックグラウンドが減じられた標的指向シーケンシングを可能にする。第1プライマーミックスには、図12に図示するように、はるかに大きい標的をカバーする一対のプライマーを用いることができる。各鎖は独立して処理されるので、次のセットのプライマー、または第2プライマーミックスが第2鎖に適用されると、それぞれの第1鎖産物としか適合しない。こうして、このdam-PCR戦略により、より短い無用の産物を生じ得るプライマー相互作用を完全に回避することができる。
gDNA由来のHLA標的に適用されたarm-PCRとdam-PCR両方の例を、図13に提供する。レーン1および2はそれぞれ、arm-PCRを用いて遺伝子標的Aまたは標的Bを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン3は、T2フォワードとT1リバースとの相互作用からの増幅パターンを示す。これはパターンを示すに過ぎないが、この産物は、4つのプライマーすべてが同一PCRミックス中でマルチプレックス化した場合に生産され得る標的外の産物である。レーン4は、T1フォワードプライマーおよびT2リバースプライマーの長い増幅産物を示す。この特定の例では、この産物は、配列長の制限により現在使用されているNGSプラットフォームではカバーできないので、やはりあまり望ましくない。しかし、より長い産物をカバーできるNGSプラットフォームならば、このような産物の配列を決定できる。レーン5～6は、完全マルチプレックス化ミックスからのarm-PCRを示す。この結果は、あまり望ましくない、短い、標的外の産物にほぼ占められている。（T1フォワードおよびT1リバースから生産される）標的Aのみの遺伝子標的、（T2フォワードおよびT2リバースから生産される）標的Bのみの遺伝子標的、および（T1フォワードおよびT2リバースから生産される）標的Aと標的B両方の遺伝子標的は、短い産物が所望の産物とDNAポリメラーゼ活性に関して競合したせいで、スメアが生じ、ほとんど存在しなかった。レーン7は、dam-PCRを用いて、第1サイクルタグ付け中にT1リバースで、そして第2サイクルタグ付け中にT1フォワードで遺伝子標的Aのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン8は、dam-PCRを用いて、第1サイクルタグ付け中にT2リバースで、そして第2サイクルタグ付け中にT2フォワードで遺伝子標的Bのみを増幅した場合の増幅パターンを示す。レーン9～10は、完全マルチプレックス化dam-PCR戦略の結果を示す。第1プライマーミックスでの第1ラウンドのタグ付けでは、T1フォワードおよびT2リバースを用いてより長い第1鎖産物を生成させた。第2プライマーミックスでの第2ラウンドのタグ付けでは、T1リバースおよびT2フォワードが、第1鎖タグ付け中に生成した第1鎖産物と独立して相互作用した。第2鎖タグ付け、クリーンアップ、および第1ラウンドの標的に共通するタグを有する一対のプライマーを用いての増幅後に、競合する短い産物は存在せず、所望の産物の増幅が得られた。レーン9～10のゲル画像から明らかなように、産物バンドは、レーン1～2またはレーン7～8に表示される所望の産物の合計であった。単サイクルのタグ付けが重要であることは特筆すべきである。普通のPCRのように、プライマーT1フォワードおよびT2リバースを追加のサイクルにかけていたなら、短い競合産物が生産された可能性がある。しかし、これらの潜在的に有害なプライマーは、dam-PCRでは、共通ユニバーサルプライマーを用いて一切の真の増幅を行う前に除去される。
単数形のものへの言及は、特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、複数形のものも含むものと理解すべきであり、逆もまた然りである。文法的接続詞は、特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、等位接続節、文、単語等の離接的および接続的組み合わせの一切を表わすものとする。したがって、「or」という用語は概して「and/or」を意味する等々と理解すべきである。
本明細書に記載の系および方法の様々な態様は、例示的なものである。本明細書に記載の系および方法の様々な他の態様が可能である。

Claims (20)

  1. 少なくとも1つの標的配列を含有するmRNAから、リバースプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第1鎖を逆転写し、少なくとも1つの第1鎖cDNAを形成する工程であって、前記リバースプライマーミックスは、リバース共通プライマー結合部位を各cDNA第1鎖に組み込むように構成されている少なくとも1つのリバースプライマーを含有している、工程；
    未使用リバースプライマーを除去することにより、各第1鎖cDNAを選択する工程；
    前記少なくとも1つのcDNA第1鎖の各々から、フォワードプライマーミックスを用いて少なくとも1つのcDNA第2鎖を合成し、少なくとも1つの第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、前記フォワードプライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードプライマーを含有しており、各フォワードプライマーは、特定のcDNA第1鎖に結合するようにかつフォワード共通プライマー結合部位を各cDNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；
    未使用フォワードプライマーを除去することにより、各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；
    前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記cDNA鎖を増幅する工程；および
    前記増幅されたcDNA鎖を選択する工程
    を含む、方法。
  2. 前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記増幅されたcDNA鎖を増幅する工程
    をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記リバースプライマーミックスが、少なくとも1つのリバースプライマーを含み、前記少なくとも1つのリバースプライマーが、各第1cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
  4. 前記フォワードプライマーミックスが、少なくとも1つのフォワードプライマーを含み、前記少なくとも1つのフォワードプライマーが、各第2cDNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
  5. 各選択が、磁気ビーズを用いてcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、請求項1記載の方法。
  6. 各選択が、カラム精製によりcDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、請求項1記載の方法。
  7. 各選択が、プライマーミックスの酵素的切断を含む、請求項1記載の方法。
  8. 前記第1鎖cDNAが、第1鎖cDNA：RNA複合体を含む、請求項1記載の方法。
  9. 前記mRNAが単細胞から得られる、請求項1記載の方法。
  10. 少なくとも1つの標的配列を含有するゲノムDNAから、第1プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第1鎖を合成し、第1鎖：DNA複合体を形成する工程であって、前記第1プライマーミックスは、少なくとも1つの第1プライマーを含有し、各第1プライマーは、特定の標的配列に結合するようにかつ第1共通プライマー結合部位を各DNA第1鎖に組み込むように構成されている、工程；
    未使用の第1プライマーミックスを除去することにより、各第1鎖：DNA複合体を選択する工程；
    前記少なくとも1つのDNA第1鎖の各々から、第2プライマーミックスを用いて少なくとも1つのDNA第2鎖を合成し、第1鎖：第2鎖複合体を形成する工程であって、前記第2プライマーミックスは、少なくとも1つの第2プライマーを含有し、各第2プライマーは、特定のDNA第1鎖に結合するようにかつ第2共通プライマー結合部位を各DNA第2鎖に組み込むように構成されている、工程；
    未使用の第2プライマーミックスを除去することにより、各第1鎖：第2鎖複合体を選択する工程；
    前記少なくとも1つの第1共通プライマー結合部位に結合する第1共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つの第2共通プライマー結合部位に結合する第2共通プライマーを用いて、前記DNA鎖を増幅する工程；および
    前記増幅されたDNA鎖を選択する工程
    を含む、方法。
  11. 前記第1プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第1プライマーはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位であり；
    前記第2プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第2プライマーはフォワードプライマーであり、各第2共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位である、
    請求項10記載の方法。
  12. 前記第1プライマーミックスはフォワードプライマーミックスであり、各第1プライマーはフォワードプライマーであり、各第1共通プライマーはフォワード共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位はフォワード共通プライマー結合部位であり；
    前記第2プライマーミックスはリバースプライマーミックスであり、各第2プライマーはリバースプライマーであり、各第2共通プライマーはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位はリバース共通プライマー結合部位である、
    請求項10記載の方法。
  13. 前記第1プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含むプライマーミックスであり、各第1プライマーは、フォワードまたはリバースプライマーであり、各第1共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第1共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位であり；
    前記第2プライマーミックスは、少なくとも1つのフォワードおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含み、ここで前記第2プライマーミックス中のフォワードおよびリバースプライマーはいずれも前記第1プライマーミックスには含まれておらず、各第2共通プライマーは、フォワードまたはリバース共通プライマーであり、各第2共通プライマー結合部位は、フォワードまたはリバース共通プライマー結合部位である、
    請求項10記載の方法。
  14. 前記少なくとも1つのリバース共通プライマー結合部位に結合するリバース共通プライマーを用いてかつ前記少なくとも1つのフォワード共通プライマー結合部位に結合するフォワード共通プライマーを用いて、前記増幅されたDNA鎖を増幅する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
  15. 前記第1プライマーミックス中のプライマーは、各第1DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、請求項10記載の方法。
  16. 前記第2プライマーミックス中のプライマーは、各第2DNA鎖に同定マーカーとして組み込まれる追加のヌクレオチドを含む、請求項10記載の方法。
  17. 各選択が、磁気ビーズを用いてDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、請求項10記載の方法。
  18. 各選択が、カラム精製によりDNA鎖をプライマーミックスから分離することを含む、請求項10記載の方法。
  19. 各選択が、プライマーミックスの酵素的切断を含む、請求項10記載の方法。
  20. 前記ゲノムDNAが単細胞から得られる、請求項10記載の方法。
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