CN109554440A - 多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类t细胞免疫组库的方法 - Google Patents

多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类t细胞免疫组库的方法 Download PDF

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CN109554440A CN201811597549.8A CN201811597549A CN109554440A CN 109554440 A CN109554440 A CN 109554440A CN 201811597549 A CN201811597549 A CN 201811597549A CN 109554440 A CN109554440 A CN 109554440A
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Abstract

本发明公开了一种多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，属于分子生物学检测领域。本发明的多重引物组，由一组上游引物和一条下游引物组成，所述上游引物由接头1、引物条码1、测序引物1、针对可变区V区设计的特异性引物V1‑V24串联而成；所述下游引物由接头2、引物条码2、测序引物2、针对恒定区C区设计的特异性引物Vc串联而成；引物条码1和引物条码2的序列不同；测序引物1与测序引物2序列相同。利用本发明方法可以基于DNA样本或RNA样本构建TCR免疫组库，高通量测序后可以得到几百万条TCR序列，能够全面覆盖TCR的多样性信息。且构建效率高，构建成本低。

Description

多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类T细胞 免疫组库的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及一种多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法。
背景技术
免疫组库是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。
人体淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞。T细胞主要功能是介导细胞免疫。T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，大多数TCR由α和β肽链组成，少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分，而α和β两条肽链的V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。TCR的CDR3由V、D、J三个基因编码，在淋巴细胞的成熟过程中，通过V、D、J基因的重排形成了各种重组序列片段，再加上DNA碱基的SNP、Indel突变形成了T细胞的多样性，免疫细胞群中TCR的多样性多达1016。正是这种多样性对健康起着至关重要的作用，免疫蛋白的亚型越多，越能有效抵抗病原体，亚型越少越容易感染疾病。除此之外，其它很多年龄、环境、疾病诱发以及用药等因素也影响着免疫组库的多样性。
SSCP技术、GeneScan技术、荧光定量溶解曲线技术等免疫组库构建方法覆盖范围窄，不能全面、均衡地反应免疫组库的多样性，高通量测序可以满足庞大的、多样的序列测序要求。
在高通量测序的实验步骤中，测序文库的制备是非常关键的一步。由于TCR的多样性，引物的扩增偏好性以及模板丰度的差异等因素，建库时引物设计以及PCR扩增方法显得尤为重要。此外，传统测序文库的制备需要样本核酸提取、酶前处理或机械剪切、加接头进行连接、PCR扩增等等工序，操作复杂。
因此，提供一种基于高通量测序的TCR免疫组库构建方法，简化实验操作步骤，降低PCR引物扩增的偏好性，提高扩增效率，尤为必要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法。
本发明的技术方案为：
一种多重引物组，由一组上游引物和一条下游引物组成，所述上游引物由接头1、引物条码1、测序引物1、针对可变区V区设计的特异性引物V1-V24串联而成；所述下游引物由接头2、引物条码2、测序引物2、针对恒定区C区设计的特异性引物Vc串联而成；引物条码1和引物条码2的序列不同；测序引物1与测序引物2序列相同。
作为优选方案，接头1序列为AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC AC；接头2序列为CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT。
作为优选方案，测序引物1与测序引物2的序列为GCT CTT CCG ATC T。
作为优选方案，引物条码1、引物条码2由6个或者8个核苷酸组成，不同样本的引物条码1、引物条码2间至少有一个核苷酸的差异。
引物条码1、引物条码2可以为为GTGTCA、TCTGAC、TGACTA、CGCTCT、TACGTACG、TGAGCGAT、TACAGTCT或GTATGTAC。
作为优选方案，上游引物中特异性引物V1-V24分别为：
V1：5′CAA CAG TTC CRT GAC TMG CAC-3′
V2：5′-CAT ATG AGA WTG GAT TAG TCA TT-3′
V3：5′-TAC TTT AAY AAC AAC GCT CCG-3′
V4：5′-TCT CGA AAA KAG AAG ACG TAT-3′
V5：5′-GAG TCA GGA MTG CCA CAG GAA-3′
V6：5′-AGG CCT SAG GGA TCC AGC TC-3′
V7：5′-GAC AAA GGA GW A GTC AGA GAT-3′
V8：5′-ACA GTC TCC TCT ATA AGG ACG-3′
V9：5′-TCT AGA GAG TTC AAG GAG CGC-3′
V10：5′-GAT ATG AGA ATG AGG AYG CAG-3′
V11：5′-TCA ACC ARG CAA CGG TGA CCT-3′
V12：5′-TTC AGT GAG AYA CAG ARA AAC-3′
V13：5′-CTG AAT GCC AAT ACA GMT CTC-3′
V14：5′-GAC CAA CCT GAA GTC CMC AAT-3′
V15：5′-TCT GAG GTG GGG CAG AYT CTC-3′
V16：5′-CAC AGA AAG TAA AMG ATT TTC AG-3′
V17：5′-GAG TCT TTT CAG GAT GTG TCC-3′
V18：5′-TCA TTT CGT AAC ATG AAA AMA TGC-3′
V19：5′-AAA GAT TTT CAG AAT GAA YCA GAC-3′
V20：5′-GTC TCT CGAGCA GCA CAM GCT-3′
V21：5′-CAG AGA TCA CTG AAA GAT TCG A-3′
V22：5′-CCT AAC TAT AMC TCT GAG GTG-3′
V23：5′-AAA TCT GCA GAC AYA GAT CAC-3′
V24：5′-GTT GGT GAG RGT GCA ACT GCC-3′；
下游引物中特异性引物为：
Vc：5‘-GTGTCATGGGTTCACMTTYTTCAGGTGC-3′。
特异性引物的设计方法为：以IMGT数据库中公开的人TCR CDR3序列为参考序列，针对所有的可变区V区(variable)和恒定区(constant)C区基因进行比对分析，采用PrimerPremier 5.0进行引物设计，采用oligo7进行引物二聚体以及茎环错配进行分析，针对可变区V区保守序列设计出24条上游引物V1-V24，针对C区保守序列设计出1条下游引物Vc。
利用所述多重引物组基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，包括步骤：
1)提取样本核酸DNA或RNA；
2)样本核酸DNA或RNA第一轮PCR扩增，得到PCR扩增产物1；
3)PCR扩增产物1回收；
4)以PCR扩增产物1的回收产物为模板进行第二轮PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
5)PCR扩增产物2回收，回收产物即构成TCR测序文库；
6)文库检测：
所得TCR测序文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库的纯度和大小；利用Nanodrop one测定TCR文库浓度；
7)高通量测序：
将纯化后的TCR文库利用Illumina公司的Hiseq2500进行测序，测序模式为PE150；
8)数据分析：
测序数据过滤掉测序背景后，将下机数据与IMGT免疫细胞受体库数据进行V\D\J基因比对分析，建立T细胞免疫组库谱。
作为优选方案，当使用样本为DNA时，步骤2)中，所述第一轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.5-1mM，多重PCR引物组上游引物组3-5μM，下游引物3-5μM，Mg2+终浓度3-4mM，Taq酶1.5-3unit，DNA样本200-800ng，加入DEPC水补足体积至25μL。
进一步的，第一轮PCR扩增的扩增程序如下：
95℃热启动酶活化10-20min；94-95℃变性15sec，55-60℃退火60-120sec，72℃延伸30-40sec，进行6-10个循环；94-95℃变性15sec，65-70℃退火40-60sec，72℃延伸30-40sec，进行10-20个循环；16℃保存。
作为优选方案，当使用样本为RNA时，步骤2)中，所述第一轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.5-1mM，多重PCR引物组上游引物组3-5μM，下游引物3-5μM，RNase抑制剂0.25μL，Mg2+终浓度3-4mM，反转录酶、Taq酶混合物2.0-3.5unit，RNA样本200-800ng，加入DEPC水补足体积至25μL。
进一步的，第一轮PCR扩增的扩增程序如下：
45-50℃反转录35-40min；95℃热启动酶活化10-20min；94-95℃变性15sec，55-60℃退火60-120sec，72℃延伸30-40sec，进行6-10个循环；94-95℃变性15sec，65-70℃退火40-60sec，72℃延伸30-40sec，进行10-20个循环；16℃保存。
作为优选方案，步骤3)和步骤5)中，PCR扩增产物1回收和PCR扩增产物2回收采用琼脂糖凝胶电泳、纯化柱纯化或磁珠纯化方式进行纯化回收。
作为优选方案，步骤4)中，第二轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.2-0.4mM，接头1终浓度0.2-0.5μM、接头2终浓度0.1-0.2μM，Mg2+终浓度2-2.5mM，Taq酶1.5-2unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至50μL。
进一步的，第二轮PCR扩增的扩增程序如下：
95℃热启动酶活化10～20min；94～95℃变性10～20sec，50～55℃退火30～40sec，72℃延伸30-40s，进行30-40个循环，16℃保存。
作为优选方案，多重PCR引物组上游引物组由以下24条上游引物混合而成：
1：5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCAA CAG TTC CRT GAC TMG CAC-3′
2：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCAT ATG AGA WTG GAT TAG TCA TT-3′
3：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTAC TTT AAY AAC AAC GCT CCG-3′
4：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTCT CGA AAA KAG AAG ACG TAT-3′
5：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGAG TCA GGA MTG CCA CAG GAA-3′
6：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTAGG CCT SAG GGA TCC AGC TC-3′
7：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGAC AAA GGA GW A GTC AGA GAT-3′
8：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTACA GTC TCC TCT ATA AGG ACG-3′
9：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTCT AGA GAG TTC AAG GAG CGC-3′
10：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGAT ATG AGA ATG AGG AYG CAG-3′
11：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTCA ACC ARG CAA CGG TGA CCT-3′
12：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTTC AGT GAG AYA CAG ARA AAC-3′
13：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCTG AAT GCC AAT ACA GMT CTC-3′
14：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGAC CAA CCT GAA GTC CMC AAT-3′
15：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTCT GAG GTG GGG CAG AYT CTC-3′
16：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCAC AGA AAG TAA AMG ATT TTC AG-3′
17：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGAG TCT TTT CAG GAT GTG TCC-3′
18：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTTCA TTT CGT AAC ATG AAA AMA TGC-3′
19：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTAAA GAT TTT CAG AAT GAA YCA GAC-3′
20：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGTC TCT CGAGCA GCA CAM GCT-3′
21：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCAG AGA TCA CTG AAA GAT TCG A-3′
22：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTCCT AAC TAT AMC TCT GAG GTG-3′
23：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTAAA TCT GCA GAC AYA GAT CAC-3′
24：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGTT GGT GAG RGT GCA ACT GCC-3′；
其中，上游引物组中NNNNNN(NN)表示引物条码1；
下游引物为：
5‘-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNN(NN)GCT CTT CCG ATCTGTGTCATGGGTTCACMTTYTTCAGGTGC-3′；
其中，下游引物中NNNNNN(NN)表示引物条码2。
进一步的，上游引物组由24条上游引物等摩尔混合而成。
作为优选方案，上游引物组总摩尔数与下游引物摩尔数相同。
本发明的有益效果为：
利用本发明方法可以基于DNA样本或RNA样本构建TCR免疫组库，高通量测序后可以得到几百万条TCR序列，能够全面覆盖TCR的多样性信息。从操作方法上看，本发明直接将引物条码及测序引物通过PCR扩增的方式引入构建的文库中，降低了文库构建步骤的繁琐，提高了构建效率，节约了时间，降低了人工、试剂等成本消耗。通过两步法的PCR扩增也降低了多重PCR扩增的偏斜性，更好地反应了TCR多样性的真实状态。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库方法的原理图；
图2为实施例2中得到的TCR文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库纯度和大小的检测结果；
图3为实施例2中CDR3长度分布图；其中，横轴表示CDR3的核苷酸长度，纵轴表示对应长度的CDR3所占的比例；
图4为实施例2中高丰度CDR3序列分析图；
图5为实施例3中得到的TCR文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库纯度和大小的检测结果；
图6为实施例3中CDR3长度分布图；其中，横轴表示CDR3的核苷酸长度，纵轴表示对应长度的CDR3所占的比例；
图7为实施例3中高丰度CDR3序列分析图。
具体实施方式
材料及试剂说明
健康自愿受试者知情同意。非特殊说明，本发明采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
实施例1
一种用于扩增人类TCR CDR3编码序列的多重引物组，由一组上游引物和一条下游引物组成，上游引物由接头1、引物条码1、测序引物1、针对可变区V区设计的特异性引物V1-V24串联而成；下游引物由接头2、引物条码2、测序引物2、针对恒定区(constant)C区设计的特异性引物Vc串联而成；测序引物1与测序引物2序列相同。
接头1序列为AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC AC；
接头2序列为CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT。
测序引物1与测序引物2的序列为GCT CTT CCG ATC T。
引物条码1、引物条码2由NNNNNN(NN)表示，由6个或者8个核苷酸组成，便于不同样本文库一起上机测序，不同样本的引物条码序列至少有一个核苷酸的差异，引物条码1和引物条码2的序列不同。
引物条码1、引物条码2为GTGTCA、TCTGAC、TGACTA、CGCTCT、TACGTACG、TGAGCGAT、TACAGTCT或GTATGTAC。
特异性引物的设计方法为：以IMGT数据库中公开的人TCR CDR3序列为参考序列，针对所有的可变区V区(variable)和恒定区(constant)C区基因进行比对分析，采用PrimerPremier 5.0进行引物设计，采用oligo7进行引物二聚体以及茎环错配进行分析，针对可变区V区保守序列设计出24条上游引物V1-V24，针对C区保守序列设计出1条下游引物Vc。
表1特异性引物组
注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T
故，用于实现文库构建所用的多重引物组序列如表2所示。表2多重扩增引物组
本发明提供了一种人类T细胞免疫组库的文库构建方法，主要包括引物的使用比例以及PCR扩增程序。本发明所使用的样本可以是DNA样本也可以是RNA样本。
当使用DNA样本时，通过多重PCR扩增出目的序列进行文库构建，共进行两轮PCR。
当使用RNA样本时，文库构建可以使用两步法RT-PCR扩增，即先使用逆转录酶进行逆转录合成cDNA，再进行第二链DNA的合成；也可以使用一步法RT-PCR扩增进行文库构建。以下的实施例选用一步法RT-PCR进行多重PCR扩增。但本领域技术人员可以根据一步法RT-PCR扩增方法在不付出创造性劳动的情况下推断出两步法RT-PCR扩增的方法。
实施例2
使用DNA样本，通过多重PCR扩增出目的序列进行文库构建：
1、外周血淋巴细胞的快速分离
1)检查：取出淋巴细胞抗凝分离管，观察分离胶之上是否有游离的分离液，如果有，2000g，室温离心1min。
2)采样：往抗凝分离管中加入外周血5ml。
3)离心：800g，soft常温离心15min。
4)用巴氏吸管或移液器吸弃血浆层，至临近PBMC细胞层，再小心吸出PBMC(白膜层：在分离胶与血浆之间)，转移到一个新的15ml离心管中。
5)加入生理盐水或1*PBS至15ml，洗涤1次，300g，soft常温离心10min。
6)弃去上清，加入2ml生理盐水或1*PBS，重悬，补加至5ml，混匀后计数。
7)300G，离心10min，弃去上清，按计数调整细胞浓度至20*106/ml。
2、样本核酸DNA提取
使用商业化试剂盒来提取DNA，如使用QIAGEN血液、组织DNA提取试剂盒(CAT：65904)提取DNA，或者采用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA。本实施例采用QIAGEN血液、组织DNA提取试剂盒(CAT：65904)提取DNA，此方法为本领域技术人员熟知，在此不多加赘述。
DNA提取完毕，采用Nanodrop one分光光度计测定DNA的纯度、浓度，1％的琼脂糖电泳检测DNA的质量。
经测定，提取的DNA浓度为238ng/ul，OD260/280为1.93。
3、第一轮PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.8mM，多重PCR引物组上游引物组3.6μM(由等浓度上游引物1-24混合而成)，下游引物组3.6μM，Mg2+终浓度3.5mM，Taq酶2unit，DNA样本2.5μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物1：
95℃热启动酶活化10min；95℃变性15sec，56℃退火90sec，72℃延伸30sec，进行8个循环；95℃变性15sec，70℃退火60sec，72℃延伸30sec，进行15个循环；16℃保存。
4、PCR扩增产物1回收
PCR扩增产物1用磁珠纯化方式进行纯化回收，回收产物作为第二轮PCR扩增的模板。产物回收纯化去除了没有参加反应的引物、dNTP、酶等，也消除了这些因素对第二轮PCR扩增的影响。
磁珠纯化具体步骤为：
1)取出磁珠振荡混匀5min，取出45μl/个样本的量放于室温10min；
2)将上述PCR扩增产物1取出，向其中加入30μl H2O，混匀，向室温平衡完毕的磁珠中加入45μl稀释的PCR扩增产物，用枪吸吹10次混匀，放于室温2min；
3)开盖放于磁力架上1min，液体变得澄清即可吸出液体，加入125μl 85％的乙醇，1min后洗出弃掉，磁珠放于室温8min晾干；
4)加上30μl dd H2O回溶。
5、第二轮PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.3mM，接头1终浓度0.4μM、接头2终浓度0.2μM，Mg2+终浓度2mM，Taq酶1.5unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至50μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物2。
95℃热启动酶活化10min；95℃变性15sec，52℃退火30sec，72℃延伸30s，进行35个循环，16℃保存。
6、PCR扩增产物2回收
得到的PCR扩增产物2用磁珠纯化方式进行纯化回收，纯化具体方法参照步骤4。所得到的回收产物即构成TCR测序文库。回收产物去掉了没有反应的引物、dNTP等，可以进一步提高所构建测序文库的测序效率与准确性。
7、文库检测
所得到的TCR文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库的纯度和大小，检测结果如图2所示，文库大小在359bp，且文库纯度较高，并未见其他非特异性扩增序列。利用Nanodrop one测定TCR文库浓度，回收的文库浓度为18ng/ul。
8、高通量测序
将纯化后的TCR文库送交测序公司利用Illumina公司的Hiseq2500进行测序，测序模式为PE150。
9、数据分析
测序数据过滤掉测序背景后，将下机数据与IMGT免疫细胞受体库数据进行V\D\J基因比对，通过搜索相应的基因片段，获得VDJ基因频率，克隆频率分布，特有TCR序列、条数等信息，建立T细胞免疫组库谱。部分数据结果如表3所示。
表3.文库测序结果计数
注：
1)Sample：样本名称；
2)Total reads：样本测序的所有reads(序列)数目；
3)Used reads：样本中又完整克隆的reads(序列)数目；
4)Percent(％)：Used reads占Total reads的百分比；
5)Clones：样本的克隆数。
CDR3长度分布如图3所示，其中，横轴表示CDR3的核苷酸长度，纵轴表示对应长度的CDR3所占的比例。高丰度CDR3序列分析如图4所示。
在免疫组库中寻找并排列出丰度最高(reads数目最多)的前10条CDR3序列。其中，横轴表示CDR3的长度，纵轴表示对应长度的序列出现的频率，图例中分别列出了频率最高的10条序列(从上到下频率依次递减)。
实施例3
使用RNA样本时，通过多重RT-PCR扩增出目的序列进行文库构建：
1、外周血淋巴细胞快速分离
1)检查：取出淋巴细胞抗凝分离管，观察分离胶之上是否有游离的分离液，如果有，2000g，室温离心1min。
2)采样：往抗凝分离管中加入外周血5ml。
3)离心：800g，soft常温离心15min。
4)用巴氏吸管或移液器吸弃血浆层，至临近PBMC细胞层，再小心吸出PBMC(白膜层：在分离胶与血浆之间)，转移到一个新的15ml离心管中。
5)加入生理盐水或1*PBS至15ml，洗涤1次，300g，soft常温离心10min。
6)弃去上清，加入2ml生理盐水或1*PBS，重悬，补加至5ml，混匀后计数。
7)300G，离心10min，弃去上清，按计数调整细胞浓度至20*106/ml。
2、样本核酸RNA提取
使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN RNeasy midi Kit(CAT：75142)提取RNA，或者采用Trizol方法提取总RNA。本实施例采用Trizol方法提取总RNA，提取步骤为本领域技术人员所熟知，在此不多加赘述。
RNA提取完毕，采用Nanodrop one分光光度计测定RNA的浓度，1％的琼脂糖电泳检测RNA的质量。
提取的RNA浓度为184ng/ul，OD260/280为2.01。
3、第一轮RT-PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度1mM，多重PCR引物组上游引物组4.8μM，下游引物组4.8μM，RNase抑制剂0.25μL，Mg2+终浓度4mM，反转录酶、Taq酶混合物3unit，RNA样本3μL，加入DEPC水补足体积至25μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物1：
50℃反转录35-40min；95℃热启动酶活化10min；95℃变性15sec，60℃退火120sec，72℃延伸40sec，进行10个循环；95℃变性15sec，70℃退火60sec，72℃延伸40sec，进行15个循环；16℃保存.
4、PCR扩增产物1回收
PCR扩增产物1用磁珠纯化方式进行纯化回收，回收产物作为第二轮PCR扩增的模板。产物回收纯化去除了没有参加反应的引物、dNTP、酶等，也消除了这些因素对第二轮PCR扩增的影响。
磁珠纯化具体步骤为：
1)取出磁珠振荡混匀5min，取出45μl/个样本的量放于室温10min；
2)将上述PCR扩增产物1取出，向其中加入30μl H2O，混匀，向室温平衡完毕的磁珠中加入45μl稀释的PCR扩增产物，用枪吸吹10次混匀，放于室温2min；
3)开盖放于磁力架上1min，液体变得澄清即可吸出液体，加入125μl 85％的乙醇，1min后洗出弃掉，磁珠放于室温8min晾干；
4)加上30μl dd H2O回溶。
5、第二轮PCR扩增
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix终浓度0.4mM，接头1终浓度0.35μM、接头2终浓度0.15μM，Mg2+终浓度2.5mM，Taq酶2unit，PCR扩增产物1回收产物5μL，加入DEPC水补足体积至50μL。
按照如下扩增条件进行扩增，得到PCR扩增产物2。
95℃热启动酶活化10min；95℃变性15sec，54℃退火30sec，72℃延伸30s，进行40个循环，16℃保存.
6、PCR扩增产物2回收
得到的PCR扩增产物2用磁珠纯化方式进行纯化回收，纯化具体方法参照步骤4。所得到的回收产物即构成TCR测序文库。回收产物去掉了没有反应的引物、dNTP等，可以进一步提高所构建测序文库的测序效率与准确性。
7、文库检测
所得到的TCR文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库的纯度和大小，检测结果如图5所示，文库大小在357bp，且文库纯度较高，并未见其他非特异性扩增序列。利用Nanodrop one测定TCR文库浓度，回收的文库浓度为21ng/ul。
8、高通量测序
将纯化后的TCR文库送交测序公司利用Illumina公司的Hiseq2500进行测序，测序模式为PE150。
9、数据分析
测序数据过滤掉测序背景后，将下机数据与IMGT免疫细胞受体库数据进行V\D\J基因比对，通过搜索相应的基因片段，获得VDJ基因频率，克隆频率分布，特有TCR序列、条数等信息，建立T细胞免疫组库谱。部分数据结果如表4所示。
表4文库测序结果计数
注：
1)Sample：样本名称；
2)Total reads：样本测序的所有reads(序列)数目；
3)Used reads：样本中又完整克隆的reads(序列)数目；
4)Percent(％)：Used reads占Total reads的百分比；
5)Clones：样本的克隆数。
CDR3长度分布如图6所示，其中，横轴表示CDR3的核苷酸长度，纵轴表示对应长度的CDR3所占的比例。高丰度CDR3序列分析如图7所示。
在免疫组库中寻找并排列出丰度最高(reads数目最多)的前10条CDR3序列。其中，横轴表示CDR3的长度，纵轴表示对应长度的序列出现的频率，图例中分别列出了频率最高的10条序列(从上到下频率依次递减)。
T细胞免疫组库拥有广阔的应用领域，通过高通量测序平台的巨大的通量测量T细胞免疫组库多样性，可提供个体某一特定时期完整的多样性信息，探究抗体与TCR在适应性免疫过程中的变化。T细胞免疫组库测序可应用于疫苗和医药的研发、生物标志物的发现、微小残留病检测、自身免疫性疾病的研究以及移植后监测等领域。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东艾克韦生物技术有限公司
<120> 多重引物组及利用该引物组基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法
<130> 2018
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agat 24
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<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcttccga tct 13
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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caacagttcc rtgactmgca c 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catatgagaw tggattagtc att 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tactttaaya acaacgctcc g 21
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<212> DNA
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tctcgaaaak agaagacgta t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagtcaggam tgccacagga a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggcctsagg gatccagctc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gacaaaggag wagtcagaga t 21
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<213> 人工序列
<400> 11
acagtctcct ctataaggac g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tctagagagt tcaaggagcg c 21
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<213> 人工序列
<400> 13
gatatgagaa tgaggaygca g 21
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcaaccargc aacggtgacc t 21
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<212> DNA
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ttcagtgaga yacagaraaa c 21
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<212> DNA
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ctgaatgcca atacagmtct c 21
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gaccaacctg aagtccmcaa t 21
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cacagaaagt aaamgatttt cag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagtcttttc aggatgtgtc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcatttcgta acatgaaaam atgc 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaagattttc agaatgaayc agac 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtctctcgag cagcacamgc t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cagagatcac tgaaagattc ga 22
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<213> 人工序列
<400> 25
cctaactata mctctgaggt g 21
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<213> 人工序列
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aaatctgcag acayagatca c 21
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<213> 人工序列
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gttggtgagr gtgcaactgc c 21
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gtgtcatggg ttcacmttyt tcaggtgc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 29
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct caacagttcc 60
rtgactmgca c 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 30
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct catatgagaw 60
tggattagtc att 73
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct tactttaaya 60
acaacgctcc g 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct tctcgaaaak 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 33
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct gagtcaggam 60
tgccacagga a 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct aggcctsagg 60
gatccagctc 70
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<212> DNA
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<223> n is a, c, g, or t
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wagtcagaga t 71
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct acagtctcct 60
ctataaggac g 71
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct tctagagagt 60
tcaaggagcg c 71
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 39
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<223> n is a, c, g, or t
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct cacagaaagt 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct gagtcttttc 60
aggatgtgtc c 71
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
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tgaaagattc ga 72
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct cctaactata 60
mctctgaggt g 71
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct aaatctgcag 60
acayagatca c 71
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnngct cttccgatct gttggtgagr 60
gtgcaactgc c 71
<210> 53
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngctcttcc gatctgtgtc atgggttcac 60
mttyttcagg tgc 73

Claims (16)

1.一种多重引物组，其特征在于：由一组上游引物和一条下游引物组成，所述上游引物由接头1、引物条码1、测序引物1、针对可变区V区设计的特异性引物V1-V24串联而成；所述下游引物由接头2、引物条码2、测序引物2、针对恒定区C区设计的特异性引物Vc串联而成；引物条码1和引物条码2的序列不同；测序引物1与测序引物2序列相同。
2.如权利要求1所述的多重引物组，其特征在于：接头1序列为AAT GAT ACG GCG ACCACC GAG ATC TAC AC；接头2序列为CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT。
3.如权利要求1所述的多重引物组，其特征在于：测序引物1与测序引物2的序列为GCTCTT CCG ATC T。
4.如权利要求1所述的多重引物组，其特征在于：引物条码1、引物条码2由6个或者8个核苷酸组成，不同样本的引物条码1、引物条码2间至少有一个核苷酸的差异。
5.如权利要求1所述的多重引物组，其特征在于，
上游引物中特异性引物V1-V24分别为：
V1：5′ CAA CAG TTC CRT GAC TMG CAC-3′
V2：5′- CAT ATG AGA WTG GAT TAG TCA TT-3′
V3：5′- TAC TTT AAY AAC AAC GCT CCG-3′
V4：5′- TCT CGA AAA KAG AAG ACG TAT-3′
V5：5′- GAG TCA GGA MTG CCA CAG GAA-3′
V6：5′- AGG CCT SAG GGA TCC AGC TC-3′
V7：5′- GAC AAA GGA GW A GTC AGA GAT-3′
V8：5′- ACA GTC TCC TCT ATA AGG ACG-3′
V9：5′-TCT AGA GAG TTC AAG GAG CGC-3′
V10：5′- GAT ATG AGA ATG AGG AYG CAG-3′
V11：5′- TCA ACC ARG CAA CGG TGA CCT-3′
V12：5′- TTC AGT GAG AYA CAG ARA AAC-3′
V13：5′- CTG AAT GCC AAT ACA GMT CTC-3′
V14：5′- GAC CAA CCT GAA GTC CMC AAT-3′
V15：5′- TCT GAG GTG GGG CAG AYT CTC-3′
V16：5′- CAC AGA AAG TAA AMG ATT TTC AG-3′
V17：5′- GAG TCT TTT CAG GAT GTG TCC-3′
V18：5′-TCA TTT CGT AAC ATG AAA AMA TGC-3′
V19：5′- AAA GAT TTT CAG AAT GAA YCA GAC-3′
V20：5′- GTC TCT CGAGCA GCA CAM GCT-3′
V21：5′- CAG AGA TCA CTG AAA GAT TCG A-3′
V22：5′- CCT AAC TAT AMC TCT GAG GTG-3′
V23：5′- AAA TCT GCA GAC AYA GAT CAC-3′
V24：5′- GTT GGT GAG RGT GCA ACT GCC-3′；
下游引物中特异性引物为：
Vc：5‘- GTGTCATGGGTTCACMTTYTTCAGGTGC -3'。
6.利用如权利要求1所述多重引物组基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，包括步骤：
1）提取样本核酸DNA或RNA；
2）样本核酸DNA或RNA第一轮PCR扩增，得到PCR扩增产物1；
3）PCR扩增产物1回收；
4）以PCR扩增产物1的回收产物为模板进行第二轮PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
5）PCR扩增产物2回收，回收产物即构成TCR测序文库；
6）文库检测：
所得TCR测序文库利用Aglilent 2100 Bioanalyser检测文库的纯度和大小；利用Nanodrop one测定TCR文库浓度；
7）高通量测序：
将纯化后的TCR文库利用Illumina公司的Hiseq2500进行测序，测序模式为PE150；
8）数据分析：
测序数据过滤掉测序背景后，将下机数据与IMGT免疫细胞受体库数据进行V\D\J基因比对分析，建立T细胞免疫组库谱。
7.如权利要求6所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于：当使用样本为DNA时，步骤2）中，所述第一轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：5×PCRBuffer 5.0 µL，dNTP Mix 终浓度0.5-1 mM，多重PCR引物组上游引物组3-5µM，下游引物3-5µM，Mg2+终浓度3-4 mM， Taq酶1.5-3 unit，DNA样本200-800ng，加入DEPC水补足体积至25µL。
8.如权利要求7所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，第一轮PCR扩增的扩增程序如下：
95℃热启动酶活化10-20 min；94-95℃变性15 sec，55-60℃退火60-120 sec，72℃延伸30-40 sec，进行6-10个循环；94-95℃变性15 sec，65-70℃退火40-60 sec，72℃延伸30-40 sec，进行10-20个循环；16℃保存。
9.如权利要求6所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于：当使用样本为RNA时，步骤2）中，所述第一轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR Buffer 5.0 µL，dNTP Mix 终浓度0.5-1 mM，多重PCR引物组上游引物组3-5µM，下游引物3-5µM，RNase抑制剂0.25 µL，Mg2+终浓度3-4 mM，反转录酶、Taq酶混合物2.0-3.5 unit，RNA样本200-800 ng，加入DEPC水补足体积至25 µL。
10.如权利要求9所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，第一轮PCR扩增的扩增程序如下：
45-50℃反转录35-40 min；95℃热启动酶活化10-20 min；94-95℃变性15 sec，55-60℃退火60-120 sec，72℃延伸30-40 sec，进行6-10个循环；94-95℃变性15 sec，65-70℃退火40-60 sec，72℃延伸30-40 sec，进行10-20个循环；16℃保存。
11.如权利要求6所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，步骤3）和步骤5）中，PCR扩增产物1回收和PCR扩增产物2回收采用琼脂糖凝胶电泳、纯化柱纯化或磁珠纯化方式进行纯化回收。
12.如权利要求6所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，步骤4）中，第二轮PCR扩增的PCR扩增体系按照如下配制：
在PCR管中加入下列物质：5×PCR Buffer 5.0 µL，dNTP Mix 终浓度0.2-0.4 mM，接头1终浓度0.2-0.5μM、接头2终浓度0.1-0.2μM，Mg2+终浓度2-2.5mM，Taq酶1.5-2 unit，PCR扩增产物1回收产物5 µL，加入DEPC水补足体积至50 µL。
13.如权利要求12所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，第二轮PCR扩增的扩增程序如下：
95℃热启动酶活化10~20 min；94~95℃变性10~20 sec，50~55℃退火30~40 sec，72℃延伸30-40s，进行30-40个循环，16℃保存。
14.如权利要求7或9所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，多重PCR引物组上游引物组由以下24条上游引物混合而成：
1：5-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TCAACAG TTC CRT GAC TMG CAC-3′
2：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TCATATG AGA WTG GAT TAG TCA TT-3′
3：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TTACTTT AAY AAC AAC GCT CCG-3′
4：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TTCTCGA AAA KAG AAG ACG TAT-3′
5：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TGAGTCA GGA MTG CCA CAG GAA-3′
6：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TAGGCCT SAG GGA TCC AGC TC-3′
7：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TGACAAA GGA GW A GTC AGA GAT-3′
8：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TACAGTC TCC TCT ATA AGG ACG-3′
9：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATC TTCTAGA GAG TTC AAG GAG CGC-3′
10：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGAT ATG AGA ATG AGG AYG CAG-3′
11：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTTCA ACC ARG CAA CGG TGA CCT-3′
12：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTTTC AGT GAG AYA CAG ARA AAC-3′
13：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTCTG AAT GCC AAT ACA GMT CTC-3′
14：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGAC CAA CCT GAA GTC CMC AAT-3′
15：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTTCT GAG GTG GGG CAG AYT CTC-3′
16：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTCAC AGA AAG TAA AMG ATT TTC AG-3′
17：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGAG TCT TTT CAG GAT GTG TCC-3′
18：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTTCA TTT CGT AAC ATG AAA AMA TGC-3′
19：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTAAA GAT TTT CAG AAT GAA YCA GAC-3′
20：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGTC TCT CGAGCA GCA CAM GCT-3′
21：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTCAG AGA TCA CTG AAA GAT TCG A-3′
22：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTCCT AAC TAT AMC TCT GAG GTG-3′
23：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTAAA TCT GCA GAC AYA GAT CAC-3′
24：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACNNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGTT GGT GAG RGT GCA ACT GCC-3′；
其中，上游引物组中NNNNNN（NN）表示引物条码1；
下游引物为：
5‘-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNN（NN）GCT CTT CCG ATCTGTGTCATGGGTTCACMTTYTTCAGGTGC -3'；
其中，下游引物中NNNNNN（NN）表示引物条码2。
15.如权利要求14所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，上游引物组由24条上游引物等摩尔混合而成。
16.如权利要求14所述基于高通量测序构建人类T细胞免疫组库的方法，其特征在于，上游引物组总摩尔数与下游引物摩尔数相同。
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