CN106283201B - 基于高通量测序的tcr多样性检测和文库构建 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及构建TRB基因的可变区(V区)的测序文库的方法，和用于该方法的试剂盒。进一步地，所述测序文库通过应用新一代测序技术来对TCR免疫库中的TRB基因V区表达信息进行快速方便、低成本的检测和鉴定。

Description

基于高通量测序的TCR多样性检测和文库构建
发明领域
本发明涉及构建TRB基因的可变区(V区)的测序文库的方法，和用于 该方法的试剂盒。所述测序文库通过应用新一代测序技术来对TCR免疫库中 的TRB基因V区表达信息进行快速方便、低成本的检测和鉴定。
发明背景
淋巴细胞通过其表面抗原识别受体识别特异性抗原，其对抗原识别的特 异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞具有相同的抗原受体，识别同 一抗原表位。T细胞抗原受体(T cell antigen receptor,TCR)是T细胞特异性 识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，可以由α和β肽链，或者由γ和δ肽 链组成。
TRB(T细胞受体β基因座，T Cell Receptor Beta Locus)是编码TCR分子 中β肽链的基因位座。原始状态下TRB基因座包含V(variable)、J(joining)、 D(diversity)和C(constant)四个基因区域，其中V、D、J各包含若干等位基因。 在T细胞发育过程中，TRB基因座内发生DNA重组，首先一个D基因与一个J 基因重组连接，紧接着一个V基因与之发生重组，最后C段在RNA转录后加 工修饰的过程中，通过减掉内含子与VDJ基因相连。TRB基因位座在该重组 过程中通过选择不同的V、D、J等位基因，以及在重组位点附近碱基的随机 插入和缺失等机制，使得最终翻译形成多样性极高的β肽链，以满足机体识 别抗原的需要。
TCR的α和β肽链各有三个高度可变区(统称为V区)，又称为互补决定 区(CDR)，即CDR1、CDR2和CDR3。其中CDR3由于其在TCR识别抗原过 程中的核心地位，以及序列的高度可变性，被认为是T细胞克隆来源的标识。 得益于新一代测序技术的发展，对整个T细胞群中TCR的CDR3同步测序成为 现实。Gerlinger等通过对TCR深度测序发现了每种肿瘤位置的多克隆T细胞 库具有约367–16,289个独特TCRb序列，独特T细胞克隆数在例如3780-25,930的范围内(Gerlinger M等，Ultra-deep T cell receptor sequencing reveals thecomplexity and intratumour heterogeneity of T cell clones in renal cellcarcinomas.J Pathol.2013；231(4):424-432)。
虽然测序技术具有低样品需求、可扩展的超高通量和高质量的数据等多 种优点，然而当前CDR3序列鉴定时面临的一个问题是，测序的引物较难设 计，测序错误率较高。此外，在进行测序前首先要扩增CDR3的cDNA序列并 构建文库。传统多重PCR虽然易于操作，但由于扩增过程中模板拷贝数与扩 增效率难以控制，使得扩增产物往往发生漂移，违背了初始的分布状态。而 且随着反应体系内引物数量的增加，加上引物复杂度高，彼此影响，更容易 产生PCR扩增偏倚，错误引发扩增和引物相互干扰的机会大大增加，表现为 多重PCR反应体系内多个分子靶点的扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性 差等问题，给测序结果也带来了不利影响。
因此，本领域需要一种避免后续标准建库中的PCR偏倚，优选在获得目 的片段的同时完成文库构建，从而直接用于高通量测序的方法。
发明概述
本发明提供构建TRB基因V区的测序文库的方法，其包括通过PCR来扩 增TRB基因的V区的cDNA序列，其中通过使用包含测序接头的部分或全部序 列的引物在PCR扩增过程中将测序接头的该序列掺入扩增产物的两端。
在一个方面，所述方法包括如下两轮PCR：(a)使用一组引物扩增TRB基 因的V区，进行第一轮PCR；和(b)以第一轮PCR产物为模板，采用另一组引 物进行第二轮PCR扩增；其中所述另一组引物在一端含有所述测序接头的部 分或全部序列，其正向引物和反向引物在另一端分别与第一组引物的正向引 物和反向引物重叠以将第一轮PCR产物作为模板进行扩增。
在进一步的一个方面，所述方法包括其中所述第一组引物在一端含有所 述测序接头的第一部分序列，所述另一组引物在一端含有所述测序接头的第 二部分序列或由所述测序接头的第二部分序列组成，从而通过两轮PCR逐步 将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。
在另一个方面，所述方法还可以包括在进行第一轮PCR之前先进行一轮 PCR，该轮PCR中使用不含测序接头序列的部分的引物从而与靶物完全退火。 此种情况下，该轮PCR与第一轮PCR可构成巢式PCR，即该轮PCR中使用的 引物是巢式PCR的外侧引物，而相应地第一轮PCR中使用的引物是巢式PCR 的内侧引物。
本发明还提供构建TRB基因V区的测序文库的方法，包括将总RNA反转 录成cDNA，然后通过巢式PCR来扩增TRB基因V区。优选地，在扩增过程中 在扩增产物的两端掺入测序用接头的至少一部分。更优选地，所述至少一部 分是测序用接头的全长。
在一个实施方案中，所述方法包括如下三轮PCR：(a)使用第一组引物从 所述cDNA扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；(b)以第一轮PCR的产物为 模板，采用第二组引物进行第二轮PCR扩增；和(c)以第二轮PCR产物为模板， 使用第三组引物进行第三轮PCR扩增；其中所述第二组引物在一端含有测序 接头的部分序列，第三轮PCR中使用的第三组引物的正向引物和反向引物在 一端分别与第二组引物的正向引物和反向引物重叠以将第二轮PCR产物作 为模板进行扩增。
进一步地，所述第三组引物可以包含另一部分的测序接头序列或由另一 部分的测序接头序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分 或全部掺入扩增产物中。
在一个例示的实施方案中，第一轮PCR可以使用包括反向引物TRBCRo (SEQ IDNo:1)和正向引物TRBVFo(包括TRBV1Fo-TRBV30Fo，SEQ ID No:2-30)在内的第一组引物，从反转录获得的cDNA扩增TRBV基因；接着 以第一轮PCR产物为模板，采用包括反向引物TRBCRi(SEQ ID No:31)和 正向引物TRBVFi(包括TRBV1Fi-TRBV30Fi，SEQ ID No:32-65)在内的第 二组引物，进一步扩增；然后，任选地在移除或不移除第一组和第二组引物 的情况下，继续以第二轮PCR产物为模板，使用包括正向引物SuperF(SEQ ID No:66)和反向引物SuperR(SEQ ID No:67)在内的第三组引物，进一步扩 增。在该方法中，第二轮PCR中使用的引物序列TRBVFi可以含有Illumina测 序平台的部分接头序列，第三轮PCR中使用的引物SuperF和SuperR的序列在 一端分别与TRBVFi和TRBCRi重叠/相同以便以第二轮PCR的产物为模板进 一步扩增(如图3所示)。在一个实施方案中，SuperR可以包含有6-8个碱基 的barcode作为每个样品PCR产物的独有标记。
所述方法可以进一步包括通过Illumina测序技术对获得的TRB基因V区 的测序文库进行测序。在一个优选的实施方案中，所述测序适用于Illumina HiSeq2000测序仪，以双端250bp(PE250)方法检测。由于现有Illumina测序 平台上使用的接头序列是一样的，因此所述方法也可以用于其他Illumina测 序方案，例如针对MiSeq测序仪的建库方案，以双端测序300bp(PE300)方 法检测。
在上文所述的方法中，在PCR扩增前可能需要先从受试者样品提取总 RNA，然后将RNA逆转录为cDNA。所述样品包含T淋巴细胞例如肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)或外周血白细胞，可以是外周血、肿瘤组织、癌性胸腹水、 或由于自身免疫病而受累的器官组织等。受试者可以是哺乳动物，优选地， 所述受试者是人。在逆转录过程中使用的引物优选为TRB基因V区特异性引 物，更优选地是TRBCRo(SEQ ID No:1)。
在再一个方面，本发明提供了在PCR中掺入测序接头的方法，所述方法 包括：(a)在第一轮PCR扩增中通过含有测序接头的部分序列的第一组引物将 该部分接头序列掺入PCR产物中；和(b)在第二轮PCR扩增中，以第一轮PCR 产物为模板，通过在一端与所述第一组引物重叠且包含第二部分的测序接头 的第二组引物进一步将所述第二部分的接头序列掺入PCR产物中。在一个例 示的实施方案中，在第一步将TRBCRi和TRBVFi所含有的对应于Illumina测 序平台的第一部分接头序列掺入PCR产物中，在第二步通过引物SuperF和SuperR进一步将第二部分接头序列掺入PCR产物中，最终所得PCR产物可以 包含完整或大部分的Illumina测序接头。最终所得PCR产物通过纯化回收可以 直接用于测序，而无需通过DNA连接来添加接头。优选地，精心设计分配于 第一步和第二步中的所要掺入的接头序列部分。此外，所述方法不限于使用 Illumina测序接头。
本发明还涵盖所述引物中的一种或多种在制备用于构建TRB基因V区的 测序文库的试剂盒中的用途，所述测序文库用于Illumina测序。试剂盒可包 含放置在容器中的引物和/或试剂。试剂盒中包含的引物可以选自：分别包含 SEQ ID No:1-67的序列。进一步地，所述引物可以选自：分别由SEQ ID No:1-67组成的序列。所述试剂盒还可包含用法说明书，其可以是手册和/或 贴在一或多个容器上的标签。
本发明还提供用于构建TRB基因V区的测序文库的试剂盒，其可以包含 一种或多种引物，所述引物选自下组：分别包含SEQ ID No:1-67的序列。任 选地，还可包含用于逆转录和PCR扩增的多种试剂，包括例如RNA逆转录酶， DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP等。
本发明还涵盖在进行某种干预手段后，对同一受试者的样品之间的TRB 基因V区的测序文库的信息进行比较，从而用于评价某种干预手段对免疫应 答的影响。所述干预手段为例如疫苗接种。具体地，可将该干预手段与测序 文库中呈现的特定信息建立相关关系。
本发明还涵盖对来自未患病受试者与患病受试者的样品之间的TRB基 因V区的测序文库的信息进行比较，从而评价某种疾病对免疫应答的影响。 具体地，可将该疾病与测序文库中呈现的特定信息建立相关关系。
附图简述
图1显示了本发明的构建TRB基因V区的实验设计的流程图。
图2显示了在Fi引物中使用两种共有序列获得的扩增结果的比较。
图3显示了在一个具体实例中，设计的每轮PCR扩增中掺入的接头序列 的图。
图4显示了在一个具体实例中，三轮PCR扩增所得的扩增产物的电泳图。
发明详述
除非另外定义，本文所用的技术和科学术语与本发明所属领域技术人员 所通常理解的含义相同。
除非另外指示，当术语“一个/一种”在本公开中使用时，其指“至少一 个/一种”或“一种或多种”。
如本文中使用的，术语“扩增”指靶核酸及其互补序列的拷贝数增加。 可以通过使用本领域中已知的任何方法来实施扩增。核酸的扩增包括在扩增 过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下实施的方法。循环技术以需要 热循环的方法例示。需要热循环的方法包括聚合酶链式反应(PCR)，其是本 领域中公知的。PCR包括通过热变性将双链DNA变性成单链DNA，将引物与 单链DNA退火；并由所述引物合成互补链。
如本文中使用的，术语“巢式PCR”指使用两对(而非一对)PCR引物 扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称 为巢式引物(因为它们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产 物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于， 如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并 扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
如本文中使用的，术语“多重PCR”，又称多重引物PCR或复合PCR， 是指在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR基本相同。
高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪(目前已退 出市场)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪和ABI的SOLiD测序仪。根据 使用的测序技术，存在不同的测序文库构建方式。如本文中使用的，“文库 构建”的过程即是给目的片段添加测序接头的过程，使得目的片段能够被测 序仪捕获和检测。例如对于Roche 454，Solexa和ABI SOLID，存在单端测序 和双端测序两种方式。单端测序首先将DNA样本进行片段化处理形成 200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头， 将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。配对末端测 序(Paired-end)方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测 序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读 测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二 轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序。HiSeq2000是Illumina 公司于2010年推出的测序仪，测序原理是采用稳定的可逆终止法边合成边测序。在本发明中，采取的测序策略为双端测序，每端测250nt(读长250nt)。
通常，在测序建库过程中，测序引物在PCR反应后连接到PCR产物上。 在连接后还需要加做7-11个循环的PCR扩增连接片段以获得足够量的文库用 于测序。但是，本发明的发明人采用在PCR期间就将测序引物连接到PCR产 物的方案，从而在获得目的片段的同时就完成文库构建，因而简化步骤并降 低成本。与先获得目的片段，然后进行标准建库的过程相比，避免了后续标 准建库中的PCR，而减少PCR次数即减少扩增偏倚。本领域技术人员公知的 是，扩增偏倚(amplification bias)是在PCR中普遍存在的，扩增偏倚可以在扩 增短的靶核酸时根据靶核酸的类型而产生，可以随着靶核酸拷贝数或碱基序 列、例如AT含量或GC含量而变化。此外，除了简化测序文库构建过程以外， 发明人还设计了每轮PCR的循环次数，从而实现最大限度的获得目的片段与 减少由于PCR扩增而引入的目的片段相对含量上的差异以达到半定量的目 的之间的最佳平衡。
在本发明的一个具体的实施方案中，构建文库的方法中使用了三组引物，分别是包括TRBCRo和TRBVFo系列的第一组引物，包括TRBCRi和 TRBVFi系列的第二组引物，以及包括SuperF和SuperR的第三组引物。其中， TRB系列引物针对TRB基因V区，该基因采用国际标准基因命名。在TRBVFi 系列引物中，发明人设计了共有序列(见表2中粗体部分)，该共有序列是测序接头的一部分。SuperF和SuperR引物进一步包含测序接头的别的部分。以此种方式，发明人可以将所有的测序接头序列均掺入到PCR扩增产物中。在一个例示的实施方案中，所述测序接头是Illumina测序接头。
本发明的接头序列纳入到PCR产物中的过程是经过精心设计的。例如， 由于Illumina的两条接头序列是部分反向互补的(长度为13个碱基)，因此 第二轮PCR引物的共有序列必须覆盖这部分互补序列，并且要再多加一段序 列作为第三轮PCR的衔接部分，同时引物总长度还不能太长，否则复性困难。 具体而言，Illumina测序接头P5全长为59nt，P7为66-68nt(取决于barcode长 度)，如果要将此序列在两步PCR(如实施例中所示的第二轮和第三轮PCR) 中引入到产物中去，那么其中第三轮PCR引物(SuperF和SuperR)3’端还要有一定长度的序列与第二轮PCR引物(Fi和Ri)5’端序列重叠，才能达到在 产物中引入其他序列的目的。因此，每一步新引入的接头序列长度至少应在 25-35nt的范围内，SuperF/R与Fi/Ri间的重叠序列长度在15-23nt的范围内(常 规引物长度范围)。另外，由于Illumina接头序列的特殊性(P5和P7序列中 部分序列13nt为反向互补序列)，SuperF/R与Fi/Ri间的重叠序列必须避开此 段序列。综合考虑两组引物的总长度、barcode插入位置、引物合成的难度等 因素，发明人设计了如图3例示的将测序接头序列掺入PCR产物的方案。发 明人预料不到的发现，该设计方案取得了很好的特异性和扩增效率结果。在 该方案的基础上，甚至将Fi仅延长5nt(Fi中添加的共有序列变为粗体部分为新增序 列)，都会影响第二轮和第三轮PCR的特异性和扩增效率。
所述方法还可以包括提供包含T淋巴细胞的任意样品。可以从生物体直 接分离，或者分离并进一步加工(例如通过使用纯化和扩增)来获得样品。样 品可以包括RNA或DNA。
本发明还涵盖将来自正常受试者与已经诊断为患有某种疾病的受试者的TRB基因V区的测序文库的测序信息进行分析和比较，从而评价该疾病对受试者的免疫应答的影响。具体地，可将该疾病与从测序文库中测序得到的特定信息建立相关关系。
或者，本发明也可涵盖对于同一受试者，在进行某种治疗或处理后比较 治疗或处理之前和之后其TRB基因V区的测序文库的测序信息，从而评价该 治疗或处理对受试者的免疫应答的影响。具体地，可将该治疗或处理手段与 从测序文库中测序得到的特定信息建立相关关系。所述治疗或处理可以为例 如疫苗接种，从而本发明可以评价疫苗接种对于受试者的免疫应答的功效。
本发明还提供了用于构建TRB基因V区的测序文库的试剂盒。所述试剂 盒可包含选自以下的一种或多种引物：分别包含SEQ ID No:1-30的序列的引 物，和/或分别包含SEQID No:31-65的序列的引物，和/或分别包含SEQ ID No:66-67的序列的引物。所述试剂盒还可包含用于逆转录和PCR扩增的多种 试剂，包括例如RNA逆转录酶，DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP等。所述 试剂盒还可包含用法说明书，其可以是手册和/或贴在一或多个容器上的标签。
本发明进一步基于以下非限制性实施例来说明。
实施例
在下文中，将通过参考以下实施例更为详细描述本发明。这些实施例仅 仅用于例示性目的，而并不意图限制本发明的范围。
实施例1：TRB基因V区的测序文库的构建
1.制备引物工作液：
将如SEQ ID No:1-68所示的全部引物溶解于水，均制成浓度为100mM的 贮存液。TRBV1Fo-TRBV30Fo(SEQ ID No:2-30)各取1μl混合，加水至 终体积100μl，制备成PrimerFo混合液。TRBV1Fi-TRBV30Fi(SEQ ID No:32-65)各取1μl混合，加水至终体积100μl，制备成Primer Fi混合液。
2.总RNA的反转录
从中国医学科学院肿瘤医院的一名胶质母细胞瘤患者分离肿瘤组织及 该患者外周血单核细胞作为样品，总计获得11份样品。分别从每份样品提取 总RNA，并以TRBCRo(SEQID No:1)为引物，采用ProtoScript II逆转录酶 (NEB,cat.M0368X)试剂盒，进行引物特异性反转录，生成cDNA模板。 配制反应体系，按顺序加入以下试剂：
TRBCRo 1μl
dNTP 2μl
RNA(500ng)+H<sub>2</sub>O 9μl
总体积 12μl
将上述体系置于65℃水浴中5min，继续加入以下试剂：
5×PS 4μl
10×DTT(0.1M) 2μl
ProfoScriptⅡ 1μl
RNase OUT 1μl
总体积 20μl
将上述体系混匀后置于42℃水浴中孵育50min，然后置于65℃水浴 20min。以TRBCRo为引物，采用引物特异性反转录可以特异性富集TRB基因， 减少过多引物序列和不相干序列的干扰。
3.通过PCR扩增TRB基因V区的表达序列
以反转录获得的cDNA为模板，进行多重PCR+巢式PCR扩增。巢式PCR 采用内(o)外(i)两套嵌套式引物，首先进行外侧引物扩增，再以此产物 为模板，利用内侧引物再次扩增。
第一轮PCR：采用多重PCR 5x Master Mix(NEB,cat.M0284S)试剂盒， 引物为Primer Fo混合物和TRBCRo，作为巢式PCR中的外侧引物。配制多重 PCR体系，按顺序加入以下试剂：
5×PCR mix 5μl
Primer Fo 2μl
TRBCRo 2μl
cDNA 10μl
H<sub>2</sub>O 6μl
总体积 25μl
反应条件为：
第二轮PCR：以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR。同样采用多 重PCR 5xMaster Mix(NEB,cat.M0284S)试剂盒。此步骤中采用引物为 Primer Fi混合物和TRBCRi，作为巢式PCR的内侧序列。通过PCR扩增将一部 分的测序接头序列作为共有序列加入PCR产物中。
在此轮PCR中，发明人在Fi引物中设计了两种共有序列以逐步添加接头 序列。第一种共有序列是如表2中SEQ ID No:32-65中粗体显示的TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，第二种共有序列在前端延长了 5nt，即TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。图2显示了两种 共有序列获得的扩增结果的比较。可以清楚的看出，在相同的条件下，使用 第一种共有序列获得了显著优于第二种共有序列的特异性和扩增效率。因 此，下文中使用第一种共有序列(如表2所示)完成第二轮PCR。
多重PCR体系如下：
5×PCR mix 5μl
Primer Fi 2μl
TRBCRi 2μl
第一轮PCR产物 2μl
H<sub>2</sub>O 14μl
总体积 25μl
反应条件为：
发明人发现，循环次数过多会引入扩增偏倚，影响相对定量；而扩增次 数过少则无法得到足够的文库进行测序。在前两轮PCR中，由于使用的多种 引物的混合物，引物复杂度高，彼此影响，容易产生PCR扩增偏差，尤其需 要严格限制循环数目。因此，发明人在前两轮PCR中均采用10次循环，其原 理是在产量达到要求的情况下，使用最小的循环数，这样既最大限度的获得 目的片段，同时由于两轮扩增均严格控制扩增循环数，又减少由于PCR扩增 而引入的目的片段相对含量上的差异，达到半定量的目的。
第三轮PCR：以第二轮PCR产物为模板，SuperF和SuperR为引物，进行 第三轮PCR扩增。选用的酶为Deep VentR(exo-)DNA聚合酶(NEB,cat. M0259S)。如表2所示，SuperR在设计时包含有6-8个碱基作为barcode，每个 样品采用独有的barcode序列(Illumina公布有多种barcode序列)，可作为每 个样品PCR产物的独有标记以便多样品混合测序。
第三轮PCR体系如下：
10×ThermoPol反应缓冲液 5μl
SuperF 1μl
SuperR 1μl
第二轮PCR产物 2μl
dNTP 4μl
Deep VentR(exo-)DNA聚合酶 1μl
H<sub>2</sub>O 36μl
总体积 50μl
反应条件为：
在第三轮PCR中，将完整的接头序列掺入PCR产物中，由于是采用通用 引物进行普通PCR，扩增条件可以适当放宽，因此采用了25次循环。
4.文库的纯化和回收
将得到的产物在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，切胶纯化，并回收大小处 于250bp～500bp的条带(如图4所示)，建库完成。经质控合格后可用于混合 测序。
将所得文库用于Illumina HiSeq2000测序仪，以双端250bp(PE250)方 法检测，通过采用barcode，每个测序通道放5-8个免疫组库样品同时测序。 获得了下表1所示的结果。
表1.10个肿瘤样品与1个外周血样品经免疫组库检测后获得的有效读段 总数和从中获得的样品中T细胞克隆数目。
上表显示，从测序量上来看，本发明的结果明显优于现有技术中的结果， 现有技术中发现的克隆数目也与本发明相差1-2个数量级。
应当理解，本文中所描述的示例性实施方案应当仅在描述意义上考虑而 不是用于限制的目的。典型地应认为各实施方案内的特征或方面的描述可用 于其它实施方案中的其它类似特征或方面。
表2：引物和接头序列
1.上表2中粗体显示的序列即测序接头部分
2.barcode为NNNNNN，N为任意碱基，不同样品添加不同的6-8碱基组合作为barcode，在 样品混合测序时作为不同样品的标识。

Claims (22)

1.构建TRB基因V区的测序文库的方法，其包括通过PCR来扩增TRB基因的V区的cDNA序列，其中通过使用包含测序接头的部分或全部序列的引物在PCR扩增过程中将测序接头的该序列掺入扩增产物的两端；
所述方法包括如下两轮PCR：
(a)使用第一组引物扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；和
(b)以第一轮PCR产物为模板，采用第二组引物进行第二轮PCR扩增；
其中所述第二组引物在一端含有所述测序接头的部分或全部序列，其正向引物和反向引物在另一端分别与第一组引物的正向引物和反向引物重叠以将第一轮PCR产物作为模板进行扩增；
其中第一轮和第二轮PCR各扩增多达10个循环；
其中所述第一组引物在一端含有所述测序接头的第一部分序列，所述第二组引物在一端含有所述测序接头的第二部分序列或由所述测序接头的第二部分序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。
2.权利要求1的方法，其还包括在进行第一轮PCR之前先进行一轮PCR，该轮PCR中使用不含测序接头序列的部分的引物，从而与靶DNA片段完全退火。
3.权利要求2的方法，其中该轮PCR与第一轮PCR构成巢式PCR。
4.权利要求1的方法，其包括如下三轮PCR：
(a)使用第一组引物从所述cDNA扩增TRB基因的V区，进行第一轮PCR；
(b)以第一轮PCR的产物为模板，采用第二组引物进行第二轮PCR扩增；和
(c)以第二轮PCR产物为模板，使用第三组引物进行第三轮PCR扩增；
其中所述第二组引物在一端含有所述测序接头的部分序列，第三轮PCR中使用的第三组引物的正向引物和反向引物在一端分别与第二组引物的正向引物和反向引物重叠以将第二轮PCR产物作为模板进行扩增。
5.权利要求4的方法，其中所述第三组引物包含另一部分的测序接头序列或由另一部分的测序接头序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。
6.权利要求5的方法，其中所述第一组引物包括反向引物SEQ ID No:1和正向引物SEQID No:2-30。
7.权利要求5的方法，其中所述第二组引物包括反向引物SEQ ID No:31和正向引物SEQID No:32-65。
8.权利要求5的方法，其中所述第三组引物包括反向引物SEQ ID No:67和正向引物SEQID No:66。
9.权利要求5的方法，其中第一轮和第二轮PCR扩增的循环数显著少于第三轮PCR扩增的循环数。
10.权利要求9的方法，其中第一轮和第二轮PCR各扩增多达10个循环，第三轮PCR扩增多达25个循环。
11.权利要求5的方法，其中在进行第三轮PCR扩增之前，从扩增体系中除去第一组和第二组引物。
12.权利要求1的方法，其中所述cDNA是使用TRB基因V区特异性引物，从受试者样品提取的总RNA逆转录得到的。
13.权利要求12的方法，其中所述TRB基因V区特异性引物是第一轮PCR扩增中使用的反向引物SEQ ID No:1。
14.权利要求12或13的方法，其中所述样品包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或外周血白细胞。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述测序接头是用于Illumina测序平台的测序接头。
16.权利要求14的方法，其中所述测序接头是用于Illumina测序平台的测序接头。
17.权利要求15的方法，其中所述测序文库用于通过Illumina HiSeq2000测序仪，以双端250bp方法检测。
18.权利要求16的方法，其中所述测序文库用于通过Illumina HiSeq2000测序仪，以双端250bp方法检测。
19.通过PCR掺入测序接头的方法，所述方法包括至少两轮PCR扩增：
(a)在第一轮PCR扩增中通过含有测序接头的部分序列的第一组引物将该部分接头序列掺入PCR产物中；和
(b)在第二轮PCR扩增中，以第一轮PCR产物为模板，通过在一端与所述第一组引物重叠且包含第二部分的测序接头的第二组引物进一步将所述第二部分的接头序列掺入PCR产物中；
其中第一轮和第二轮PCR各扩增多达10个循环；
其中所述第一组引物在一端含有所述测序接头的第一部分序列，所述第二组引物在一端含有所述测序接头的第二部分序列或由所述测序接头的第二部分序列组成，从而通过两轮PCR逐步将测序接头序列的大部分或全部掺入扩增产物中。
20.权利要求19的方法，所述测序接头是Illumina测序接头。
21.权利要求19或20的方法，所得PCR产物包含完整Illumina测序接头。
22.权利要求1、4或19中任一项的方法，其还包括将最终所得PCR产物通过纯化回收直接用于测序。
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