CN108603224B - 高水平多路复用扩增 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了一种“环状扩增(looping amplification)”方法以增加核酸扩增的特异性。该增加的特异性将多路复用推进至比先前可能高得多的程度。

Description

高水平多路复用扩增
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月16日提交的美国临时申请号62/268,263的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
关于根据联邦政府资助的研究与开发进行的发明的权利的声明
不适用。
领域
本公开内容一般涉及核酸扩增的领域。特别地，本公开内容涉及可用于靶重测序(re-sequencing)的方法和组合物。
背景
靶重测序作为用于临床研究、临床试验和疾病诊断的重要工具而出现。然而，用于靶重测序的DNA文库制备仍然为非常具有挑战性的，遭受低靶覆盖率、低测序特异性和高成本。Fluidigm Corporation在Fluidigm Access
Figure GDA0003399194400000011
系统上允许每个反应10个复用或每个样品480个复用，这提供了一个成本有效且易于使用的工作流程。在该工作流程中，多重测定需要芯片外(off-chip)条形码化和定制测序引物，以便与Illumina测序仪相容。由于引物二聚体形成和降低的测序特异性，基因组覆盖率受限于难以将多路复用水平增加至高于10-个复用。
概述
本公开内容描述了一种显著增加多路复用水平而不牺牲测序特异性的方法。该方法可以用于例如靶向的测序文库制备方法Fluidigm ACCESS
Figure GDA0003399194400000021
系统来以低成本实现每个反应大于15,000个复用。凭借“芯片上(on-chip)”条形码化，甚至更多的“多路复用”是可能的，因为Fluidigm的芯片，诸如ACCESS ARRAYTMIFC(Integrated Fluidic Circuit)，可以同时进行数千个反应。
本文考虑的多种实施方案可以包括，但不必限于以下实施方案中的一个或更多个：
实施方案1：一种用于扩增一种或更多种靶核酸的方法，所述方法包括：使样品核酸与用于每一种靶核酸的正向引物和反向引物接触，其中每一个引物包含靶特异性部分和靶特异性部分5’的共同序列；以及扩增所述靶核酸以产生至少一种靶扩增子，其中靶核苷酸序列在一个末端上侧翼为共同序列且在另一末端上为共同序列的反向互补序列，从而靶扩增子的单链可以形成茎环结构。
实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中多于一种(a plurality of)靶核酸被扩增。
实施方案3：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中多于一种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案4：根据实施方案3所述的方法，其中多于10种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案5：根据实施方案4所述的方法，其中至少100种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案6：根据实施方案5所述的方法，其中至少1000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案7：根据实施方案6所述的方法，其中至少5000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案8：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中少于17,000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
实施方案9：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中所述共同序列包括转座子序列。
实施方案10：根据实施方案9所述的方法，其中所述转座子序列包含5’-AGATGTGTNNNAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:1)。
实施方案11：根据实施方案10所述的方法，其中所述转座子序列包含5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:2)。
实施方案12：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中用于每一种靶核酸的正向引物和/或反向引物包含所述共同序列5’的靶核苷酸序列。
实施方案13：根据实施方案12所述的方法，其中两个引物均包含标签核苷酸序列，并且所述正向引物中的标签核苷酸序列不同于所述反向引物中的标签核苷酸序列。
实施方案14：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中与当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时相比，扩增交叉杂交被抑制。
实施方案15：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中平均靶扩增子尺寸比当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时大。
实施方案16：根据实施方案12-15中任一项所述的方法，其中所述正向引物或反向引物包含标签核苷酸序列3’的另外核苷酸序列。
实施方案17：根据实施方案16所述的方法，其中所述正向引物包含所述标签核苷酸序列3’的第一另外核苷酸序列，其中所述第一另外核苷酸序列包含用于第一DNA测序引物的第一结合位点。
实施方案18：根据实施方案17所述的方法，其中所述反向引物包含所述标签核苷酸序列3’的第二另外核苷酸序列，其中所述第二另外核苷酸序列包含用于第二DNA测序引物的第二结合位点。
实施方案19：根据实施方案18所述的方法，其中所述正向引物或反向引物另外包含标签核苷酸序列5’的第一流通池细胞附接位点。
实施方案20：根据实施方案12-19中任一项所述的方法，其中所述扩增使用第三引物进行，其中所述第三引物包含标签特异性部分和标签特异性部分5’的第二另外核苷酸序列。
实施方案21：根据实施方案20所述的方法，其中所述第二另外核苷酸序列包含条形码核苷酸序列和/或第二流通池附接位点。
实施方案22：根据实施方案21所述的方法，其中所述第二另外核苷酸序列包含所述标签特异性部分5’的条形码核苷酸序列和/或所述条形码核苷酸序列5’的第二流通池附接位点。
实施方案23：根据实施方案18所述的方法，其中使用第三引物进行扩增，其中所述第三引物包含标签特异性部分、所述标签特异性部分5’的条形码核苷酸序列和所述条形码核苷酸序列5’的第二流通池附接位点，其中所述扩增产生具有以下结构的靶扩增子：5’-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。
实施方案24：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中扩增在多于一个分开的反应混合物中进行。
实施方案25：根据实施方案24所述的方法，其中扩增在多于一个反应室的每一个中以多路复用进行。
实施方案26：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中所述扩增在微流体装置中进行。
实施方案27：根据实施方案26所述的方法，其中所述微流体装置包括多于一个反应室。
实施方案28：根据实施方案27所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
实施方案29：根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中扩增在多于一个反应室的每一个中以多路复用进行。
实施方案30：根据实施方案29所述的方法，其中多于10种靶核酸在所述多于一个反应室的每一个中被扩增。
实施方案31：根据实施方案30所述的方法，其中多于100种靶核酸在所述多于一个反应室的每一个中被扩增。
实施方案32：根据实施方案30-31中任一项所述的方法，其中在所述微流体装置中对来自特定样品的至少4800种靶核酸进行同时扩增。
实施方案33：根据实施方案32所述的方法，其中在所述微流体装置中对来自至少48个样品的至少4800种靶核酸进行同时扩增。
实施方案34：根据实施方案26-33中任一项所述的方法，其中在扩增之后从所述微流体装置回收靶扩增子。
实施方案35：根据实施方案23-34中任一项所述的方法，其中至少一个另外的核苷酸序列被添加至所述靶扩增子中的每一个。
实施方案36：根据实施方案35所述的方法，其中所述另外核苷酸序列包含通过使用具有对第一核苷酸标签特异性的部分和所述标签特异性部分5’的第一流通池附接位点的正向引物和对所述第二流通池附接位点特异性的反向引物扩增靶扩增子添加的第一流通池附接位点。
实施方案37：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中所述方法被进行以产生DNA测序文库，其中所述文库的每一个成员具有以下结构：5’-第一流通池附接位点-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。
实施方案38：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中扩增在2-吡咯烷酮的存在下伴随或不伴随海藻糖进行。
实施方案39：根据任一项前述实施方案所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
实施方案40：一种试剂盒，所述试剂盒包含引物集，其中所述引物集包括选自根据实施方案1、9-13、16-23、35、和36中任一项所述的方法中采用的任何引物中的至少两个引物。
附图简述
图1：扩增的扩增子的茎环形成。蓝色：特异性反向引物；绿色：特异性正向引物；紫色：转座子序列(共同序列)，黄色：标签1；棕色：标签2。
图2：1-步骤、3-引物PCR条形码化方案，用于在矩阵型微流体装置中使用。
图3：2-步骤PCR条形码化方案，具有在矩阵型微流体装置中在芯片上(“芯片上”)的3-引物条形码化和添加测序衔接子(adaptor)的1-管PCR(“芯片外”)。
图4A-4B：PCR扩增特异性：非环状PCR对比环状PCR。(A)使用具有不能形成茎环的标签的引物在管中216个复用的2-引物测定产生290bp的平均扩增子尺寸(约为预期尺寸的一半)。(B)使用具有形成如图1中示出的茎环的标签的引物在管中192个复用的2-引物测定产生约600bp的平均扩增子尺寸。
图5：用2-引物、3-引物(图2)和4-引物测定方案在管中进行192个复用测定的凝胶图像。
图6：“超复用”(高度复用)反应的测序特异性。用图3中示出的修改的3-引物芯片上条形码化方案在ACCESS ARRAYTMIFC(Integrated Fluidic Circuit)上产生的超复用文库的映射率。多重水平范围从78个复用至168个复用，具有总计1075个反应物。
图7：超复用PCR的GC覆盖率和扩增均匀度(uniformity)。两个样品通过具有平均500bp的扩增子的GC含量分选。1075种扩增子的GC含量范围至25％-82％。
图8：“重叠扩增子”的示意图，其中针对样品核酸的相同一般区域的三种引物可以产生比预期的三种扩增子更多的扩增子，因为给定的正向引物可以与多于一种(multiple)反向引物配对。
图9A-9D：图9A示出了由实施例4得到的凝胶的代表性图像。“PreAmp”泳道显示20个循环PCR扩增以添加DNA测序引物的核苷酸标签和结合位点的第一步骤的结果。如指示的，6062个引物对中的每一个以2纳摩尔/升(nM或nm)的浓度存在。在“衔接子添加”下的三条泳道显示了在10个循环PCR扩增以添加DNA测序衔接子的第二步骤之后的结果。这三条泳道中指示的引物浓度指20个循环PCR的第一步骤中的引物浓度。预期的扩增子尺寸范围为320-380个碱基对(包括衔接子)。允许重叠扩增子产生16,564个可能的引物对，这将产生预期的160-1000个碱基对扩增子尺寸范围。用于第一步骤的2nM的引物浓度产生在预期的320-380bp扩增子尺寸范围的强衔接子添加后(post-Adaptor Addition)条带，表明6062个复用扩增工作正常。将第一步骤引物浓度降低至1nM或0.5nM导致扩增子重叠增加，其中0.5nM产生在预期的160-1000bp扩增子尺寸范围内的一系列条带。图9B示出了对应于来自图9A的2nM泳道的生物分析仪迹线。蓝色迹线(具有较低峰)来自2nM泳道的PreAmp，显示在20个循环PCR的第一步骤之后的结果。红色迹线(具有较高峰)来自2nM泳道的衔接子添加，显示在添加DNA测序衔接子的10个循环PCR的第二步骤之后的结果。图9C示出了对应于0.5nM泳道的衔接子添加的生物分析仪迹线，显示在重叠扩增子情况下添加DNA测序衔接子的10个循环PCR的第二步骤之后的结果，显示扩增子尺寸范围从160-1000bp，如预期的。图9D示出了当文库在Illumina NextSeq 500测序仪上测序时，以引物浓度为0.5-2nM在单个管中6062个复用的基因组映射率，表明实现了非常特异性的扩增。
详细说明
定义
除非另有说明，在权利要求书和说明书中使用的术语如下文列出的来定义。这些术语出于清楚起见而定义，但所有定义与本领域技术人员将如何理解这些术语一致。
术语“核酸”指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括可以以与天然存在的核苷酸相似的方式起作用(例如，杂交)的天然核苷酸的已知类似物。
术语核酸包括DNA或RNA的任何形式，包括，例如，基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其为mRNA的DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得；合成或通过扩增产生的DNA分子；mRNA；非编码RNA；以及微小RNA。
术语核酸包括双链或三链核酸以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必为共延伸的(coextensive)(即，双链核酸不必沿着两条链的整个长度为双链的)。
术语核酸还包括其任何化学修饰，诸如通过甲基化和/或通过加帽(capping)。核酸修饰可以包括化学基团的添加，所述化学基团掺入另外的电荷、可极化性(polarizability)、氢键、静电相互作用和官能度至单独的核酸碱基或作为一个整体的核酸。此类修饰可以包括碱基修饰，诸如2’-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修饰、异常碱基配对组合诸如异碱基(isobases)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。
更具体地，在某些实施方案中，核酸可以包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)和为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型核酸，以及包含非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚吗啉(作为Neugene从Anti-Virals Inc、Corvallis、Oregon商购可得)聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物包含呈以下构型的核碱基(nucleobases)：允许诸如在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆积。术语核酸还包括在美国专利号6,794,499、6,670,461、6,262,490、和6,770,748中描述的连接核酸(linked nucleic acids)(LNA)，所述美国专利关于其LNA的公开内容通过引用以其整体并入本文。
核酸可以来源于完全化学合成过程，诸如固相介导的化学合成，来自生物来源；诸如通过从产生核酸的任何物种分离，或者来源于牵涉通过分子生物学工具，诸如DNA复制、PCR扩增、逆转录操作核酸的过程，或来源于这些过程的组合。
术语“靶核酸”在本文中用于指在本发明的方法中待检测的特定核酸。尽管可以同时扩增多于一种靶核酸，“靶核酸”指反应混合物中存在的核酸的完整互补序列的子集(即少于完整互补序列的某些)。
如本文使用的，术语“靶核苷酸序列”指包含靶核酸的核苷酸序列的分子，诸如，例如通过扩增靶核酸获得的扩增产物或逆转录RNA靶核酸后产生的cDNA。
如本文所用，术语“互补”指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成典型的氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置处彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合，或当在单链分子之间存在总互补性(total complementarity)时，它可以是完整的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列被称为第二序列的“互补序列”。如果第一核苷酸序列与为第二序列的反向(即核苷酸顺序被逆转)的序列互补，则第一核苷酸序列被称为第二序列的“反向互补序列”。
“特异性杂交”指在定义的严格条件下，在不存在对杂交混合物中存在的其他核苷酸序列的实质结合下，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员认识到，放松杂交条件的严格性允许耐受序列错配。
在特定实施方案中，杂交在严格的杂交条件下进行。措辞“严格杂交条件”通常指在定义的离子强度和pH在低于特定序列的解链温度(Tm)从约5℃至约20℃或25℃的范围内的温度。如本文使用的，Tm为双链核酸分子的群体半解离(half-dissociated)为单链时的温度。用于计算核酸Tm的方法是本领域熟知的(参见，例如，Berger和Kimmel(1987)METHODSIN ENZYMOLOGY，第152卷：GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES,San Diego:Academic Press,Inc.以及Sambrook等(1989)MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory)，两者通过引用并入本文)。如由标准参考文献所指示的，当核酸在1M NaCl水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算，(参见例如，Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridizationin NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交体的解链温度(并且因此用于严格杂交的条件)受多种因素影响，所述多种因素诸如引物或探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)以及靶核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)及盐和其他组分的浓度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)。这些因素的影响是本领域熟知的，并且在本领域的标准参考文献中讨论。适于实现大多数序列特异性杂交的说明性严格条件为：至少约60℃的温度和在pH7约0.2M的盐浓度。
术语“寡核苷酸”用于指是相对短的，通常短于200个核苷酸，更特别地，短于100个核苷酸，最特别地，短于50个核苷酸的核酸。寡核苷酸可以是单链或双链的DNA分子。
术语“引物”指能够在适当的缓冲液中和在合适的温度，在适当的条件下(即，在四种不同的核苷三磷酸和用于聚合的剂，诸如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下)与核酸杂交(还称为“退火”)并用作用于核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位点的寡核苷酸。引物的适当长度取决于引物的预期用途，但引物的长度通常为至少7个核苷酸长，并且更通常范围从10个至30个核苷酸，或者甚至更通常从15个至30个核苷酸。其他引物可以稍微更长，例如，30个至50个核苷酸长。在该上下文，“引物长度”指与互补靶序列杂交并引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不必反映模板的准确序列，但必须足够互补，以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”指引物与其杂交的模板区段。
如果引物或其一部分与另一核酸内的核苷酸序列杂交，则该引物被称为与该核酸退火。引物与特定核苷酸序列杂交的陈述并不意图暗示引物与该核苷酸序列完全地或排他地杂交。
引物可以与靶核酸序列完全互补，或者可以不太完全互补。在某些实施方案中，引物与靶核酸序列的互补序列在至少7个核苷酸的序列上，更通常在10-30个核苷酸的范围内的序列上，并且通常在至少14-25个核苷酸的序列上具有至少65％的同一性，并且更通常具有至少75％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性。将理解，某些碱基(例如，引物的3’碱基)通常可期望与靶核酸序列的相应碱基完全互补。引物通常在严格杂交条件下与靶序列退火。
术语“引物对”指一组引物，其包括与待扩增的DNA序列的5’末端的互补序列杂交的5’“上游引物”或“正向引物”和与待扩增的序列的3’末端杂交的3’“下游引物”或“反向引物”。如本领域技术人员将认识到的，术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”不意图为限制性的，而是在特定实施方案中提供说明性的方向。
在其中使用两个引物对的实施方案中，例如在扩增反应中，引物对可以被表示为“内部”和“外部”引物对以指示它们的相对位置；即“内部”引物在掺入外部引物的位置之间的位置处掺入到反应产物(例如扩增子)中。
如本文提及引物的部分使用的，术语“靶特异性部分”指在合适的退火条件下可以与靶核酸或靶核苷酸序列特异性退火的序列。
如本文提及引物对使用的，“共同序列”指在两个引物中都存在的序列。
术语“标签核苷酸序列”在本文中用于指被添加至靶核苷酸序列中的预定核苷酸序列。核苷酸标签可以编码关于靶核苷酸序列的信息项目，例如靶核苷酸序列的身份或该核苷酸序列源自的样品的身份。在某些实施方案中，此类信息可以被编码在一个或更多个核苷酸标签中，例如两个核苷酸标签的组合(在靶核苷酸序列的任一末端上的一个核苷酸标签)可以编码靶核苷酸序列的同一性。
如本文提及引物的部分使用的，术语“标签特异性部分”指在合适的退火条件下可以与核苷酸标签特异性退火的序列。
术语“转座子”指能够通过转座酶被掺入到核酸中的核酸分子。转座子包括通过足够长以在转座酶存在下形成环的序列连接的两个转座子末端(也称为“臂”)。根据用于插入转座子的转座酶，转座子可以是双链的、单链的或混合的，包含单链和双链区域。对于Mu、Tn3、Tn5、Tn7或Tn10转座酶，转座子末端是双链的，但连接序列不必是双链的。在转座事件中，这些转座子被插入到双链DNA中。
术语“转座子末端”指与转座酶相互作用的序列区域。对于转座酶Mu、Tn3、Tn5、Tn7、Tn10等，转座子末端是双链的。对于转座酶IS200/IS605和ISrad2，转座子末端是单链的，但形成二级结构，就像双链区域一样。在转座事件中，单链转座子通过转座酶被插入到单链DNA中。
术语“人工转座子末端”指其中野生型转座子末端中的一个或更多个位置已经被一个或更多个不同核苷酸取代的转座子末端。
术语“转座酶”指与转座子末端结合并且催化其与其他双链或单链核酸(诸如基因组DNA)的连接的酶。转座酶通常包含偶数个亚基并且结合两个转座子末端。两个转座子末端可以具有相同的序列或不同的序列。
如本文使用的，术语“条形码核苷酸序列”用于指编码信息的核苷酸序列。例如，条形码核苷酸序列可以鉴定例如经受分析的样品核酸的来源，诸如来自特定样品或特定反应的核酸。条形码可以用于区分不同的细胞(cell)、不同的处理、不同的时间点、不同的空间位置等。
术语“茎-环结构”由单链核酸中的分子内碱基配对产生。该结构也被称为“发夹”或“发夹环”结构。它发生在同一链的两个区域碱基配对以在一个末端形成具有未配对环的双螺旋时,当以相反方向读取时，所述两个区域是在核苷酸序列中通常互补的。
根据本发明的教导，“扩增”包括至少一种靶核酸的至少一部分藉以复制(通常以模板依赖性方式)的任何手段(means)，包括但不限于，用于线性或指数扩增核酸序列的宽范围技术。用于进行扩增步骤的说明性手段包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接随后是Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增(hyperbranched strand displacement amplification)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、2-步骤多重复用扩增、滚环扩增(RCA)等，包括其多重版本及组合，例如，但不限于，OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(还称为组合链式反应(combined chain reaction)--CCR)等。除了其他来源以外，此类技术的描述可以见于以下中：Ausbel等；PCR Primer:A Laboratory Manual,Diffenbach,编著,ColdSpring Harbor Press(1995)；The Electronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002)；Msuih等，J.Clin.Micro.34:501-07(1996)；The Nucleic Acid ProtocolsHandbook,R.Rapley，编著，Humana Press,Totowa,N.J.(2002)；Abramson等，Curr OpinBiotechnol.1993Feb.；4(1):41-7，美国专利号6,027,998；美国专利号6,605,451，Barany等，PCT公布号WO 97/31256，Wenz等，PCT公布号WO 01/92579；Day等，Genomics,29(1):152-162(1995),Ehrlich等，Science 252:1643-50(1991)；Innis等，PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications,Academic Press(1990)；Favis等，NatureBiotechnology18:561-64(2000)；以及Rabenau等，Infection 28:97-102(2000)；Belgrader、Barany、和Lubin,Development of a Multiplex Ligation DetectionReaction DNA Typing Assay,Sixth International Symposium on HumanIdentification,1995(available on the world wide web at:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；LCR Kit Instruction Manual,目录号#200520、Rev.#050002,Stratagene,2002；Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:188-93(1991)；Bi和Sambrook,Nucl.Acids Res.25:2924-2951(1997)；Zirvi等，Nucl.AcidRes.27:e40i-viii(1999)；Dean等，Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66(2002)；Barany和Gelfand,Gene 109:1-11(1991)；Walker等，Nucl.Acid Res.20:1691-96(1992)；Polstra等，BMC Inf.Dis.2:18-(2002)；Lage等，Genome Res.2003Feb.；13(2):294-307，以及Landegren等，Science 241:1077-80(1988),Demidov,V.,Expert Rev Mol Diagn.2002第2卷(6):542-8.，Cook等，J Microbiol Methods.2003May；53(2):165-74,Schweitzer等，Curr Opin Biotechnol.2001Feb.；12(1):21-7，美国专利号5,830,711，美国专利号6,027,889，美国专利号5,686,243，PCT公布号WO0056927A3，以及PCT公布号WO9803673A1。
在一些实施方案中，扩增包括至少一个循环的以下顺序程序：使至少一个引物与在至少一种靶核酸中的互补或基本上互补的序列退火；使用聚合酶以模板依赖性方式合成至少一条核苷酸链；并且使新形成的核酸双链体变性以将链分开。循环可以重复或者也可以不重复。扩增可以包括热循环或可以等温进行。
如本文使用的，术语“扩增交叉杂交”指扩增子内引物与非靶序列的杂交。
如本文使用的，“流通池附接位点”指可以与例如，正如在由Illumina,Inc.,SanDiego,CA商业化的桥式扩增(簇产生)和测序方法中固定在基底上的引物杂交的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“微流体装置”指包括多个流体流动路径的装置，其中每一个流动路径具有少于1毫米的至少一个维度，并且通常具有两个维度。
如提及反应使用的，术语“多路复用”指其中多于一个此类反应在单个反应混合物中同时执行的情况。因此，“多路复用扩增”指在单个反应混合物中同时扩增多于一个靶核酸。
如本文关于反应、反应混合物、反应体积等使用的，术语“分开的”指其中反应与其他反应隔离进行的反应、反应混合物、反应体积等。分开的反应、反应混合物、反应体积等包括在液滴中进行的那些(参见，例如，2007年11月13日授予Quake等的标题为“Microfabricated crossflow devices and methods,”的美国专利号7,294,503，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述；由Link等2010年2月28日公布的,标题为“Droplet libraries,”的美国专利公布号20100022414，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述；以及由Miller等2011年1月6日公布的标题为“Manipulation ofMicrofluidic Droplets,”的美国专利公布号20110000560，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述)，液滴可以但不必在乳状液，以及其中反应、反应混合物、反应体积等通过机械屏障分开的那些中，例如分开的容器、微量滴定板的分开的孔、或矩阵型微流体装置的分开的室。
“单核苷酸多态性”(SNP)发生在被单个核苷酸占据的多态位点，这为等位基因序列之间的变异位点。该位点通常前后为等位基因的高度保守序列(例如，在群体的小于1/100或1/1000个成员中变化的序列)。SNP通常由于在多态位点处的一种核苷酸取代为另一种核苷酸而产生。转换为一种嘌呤替代为另一种嘌呤或一种嘧啶替代为另一种嘧啶。颠换(transversion)为嘌呤替代为嘧啶，或者反之亦然。SNP也可以起因于相对于参考等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入。
关于核苷酸序列类型的命名“第一”和“第二”包括其中这些类型的核苷酸序列相同或不同的实施方案。然而，在典型的实施方案中，这些类型的核苷酸序列是不同的。
一般扩增方法
环状扩增(loopingamplification)
通过使用“环状扩增”降低扩增子交叉杂交，可以增加核酸扩增的特异性。这一增加的特异性将多路复用推进至比先前可能高得多的程度。在一个实施方案中，使用环状扩增方法来扩增一种或更多种靶核酸。该方法允许使样品核酸与用于每一种靶核酸的新型正向引物对接触。新型引物对包括正向引物和反向引物，其中每一个引物包含靶特异性部分和靶特异性部分5’的共同序列。用引物对扩增靶核酸以产生至少一种靶扩增子，其中靶核苷酸序列在一个末端上侧翼为共同序列且在另一末端上为共同序列的反向互补序列。该构型将倾向于形成茎环结构。参见图1。在退火步骤期间，与当使用仅包含靶特异性序列的标准引物进行扩增反应时相比，除非适当的靶特异性引物可用于引发聚合，否则将倾向于形成茎-环结构，这降低扩增子交叉杂交。在一些实施方案中，平均靶扩增子尺寸比当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时更大(例如，更接近预测的扩增子尺寸)。
该方法可以用于在反应混合物或多于一种靶核酸(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种)中高特异性扩增单种靶核酸。该方法特别便于高水平多路复用扩增，例如，其中多于10种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。在多种实施方案中，至少15种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种、90种、95种、100种、110种、120种、130种、140种、150种、160种、170种、180种、190种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、1000种、1500种、2000种、2500种、3000种、3500种、4000种、4500种、5000种、5500种、或6000种、或更多种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。在一些实施方案中，不多于25,000种、20,000种、19,000种、18,000种、17,000种、16,000种、15,000种、14,000种、13,000种、12,000种、11,000种、10,000种、9000种、8000种、7000种、6000种、5000种、4000种、3000种、2000种、1000种、900种、800种、700种、600种、500种、450种、400种、350种、300种、250种、200种、或150种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。在单个反应混合物中扩增的靶核酸的数目可以落入以任何以上值为边界的任何范围内，例如，20-170、40-160、50-150、60-140、70-130、80-120、90-110、100-25,000、110-20,000、120-19,000、130-18,000、140-17,000、150-16,000、160-15,000、170-14,000、180-13,000、190-12,000、200-1100。在一些实施方案中，最高水平的多路复用由“重叠扩增子”产生。当多于一个引物对针对样品核酸的相同一般区域时，产生重叠的扩增子。在这种情况下，来自给定引物对的正向引物可以从该对中的反向引物中产生扩增子，但也可以从其他反向引物产生扩增子。这种现象示意性地示于图8中。
共同序列可以是任何序列并且必须足够长以形成茎，即至少2个核苷酸，并且更通常至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、14个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、或40个核苷酸。在一些实施方案中，茎不多于100个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、或20个核苷酸。茎的长度可以落入以任何以上值为边界的任何范围内，例如，5-45个、8-40个、10-35个、13-30个、15-25个或18-20个核苷酸。
在特定的实施方案中，共同序列为便于靶扩增子的下游分析(诸如，例如通过DNA测序)的序列。在这种情况下，可以使用环状扩增来在靶核苷酸序列侧翼引入便于DNA测序的序列(例如，DNA测序衔接子)。
例如，环状扩增可以用于制备与Illumina的桥式PCR系统相容的DNA测序模板。Illumina相容的文库常规通过标签化(tagmentation)(NEXTERATMDNA样品制备试剂盒)制备，该标签化(NEXTERATMDNA样品制备试剂盒)使用转座子以同时片段化并且添加核苷酸标签，所述核苷酸标签用作用于DNA测序引物的结合位点并且还用于添加流通池附接位点。因为所得模板包含转座子序列，用于环状扩增的共同序列可以是合适的转座子序列，例如，5’-AGATGTGTNNNAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:1)。下文表1显示了SEQ ID NO:1中关于NNN序列的所有可能的核苷酸序列。
表1
Figure GDA0003399194400000171
Figure GDA0003399194400000181
Figure GDA0003399194400000191
“指示与以上相同的核苷酸。
在具体的实施方案中，共同序列为NEXTERATMDNA样品制备试剂盒中使用的转座子序列，其为5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:2)。
在某些实施方案中，用于每一种靶核酸的正向引物和/或反向引物包含共同序列5’的标签核苷酸序列。在特定的实施方案中，两个引物均包含标签核苷酸序列，并且正向引物中的标签核苷酸序列不同于反向引物中的标签核苷酸序列。可以使用不同的标签将不同的序列添加至靶扩增子的任一个末端，例如在Illumina的桥式测序系统中使用的两个不同的流通池附接位点。
为了便于测序，正向引物和/或反向引物可以包含标签序列3’的另外的核苷酸序列，其可以是例如用于DNA测序引物的结合位点。在说明性实施方案中，正向引物可以包含：5’-第一标签核苷酸序列-用于第一DNA测序引物的第一结合位点-共同序列-第一靶特异性序列-3’，并且反向引物可以包含：5’-第二标签核苷酸序列-用于第二DNA测序引物的第二结合位点-共同序列-第二靶特异性序列-3’。这种类型的说明性正向引物和反向引物示于图2中，其中DNA测序引物结合位点被表示为“SP”，并且显示了它们相对于“标签1”和“标签2”的位置(靶特异性序列和共同序列未示出)。
用1-步骤添加序列的环状扩增用于DNA测序
使用环状扩增以用于制备用于桥式测序的模板的一种方法为1-步骤、3-引物方法。参见图2。在该方法中，用于在测序中使用的以上描述的正向引物或反向引物另外包含标签核苷酸序列5’的第一流通池附接位点。为了在Illumina系统上进行测序，该第一流通池附接位点可以是PE1，如图2中示出的。除了正向引物和反向引物以外，可以使用第三引物进行扩增以添加第二另外核苷酸序列。所有引物均存在于一个扩增混合物中，并且所有期望的序列均在一个(多循环(multi-cycle))扩增步骤中被添加。在这种情况下，第三引物包含标签特异性部分，并且第二另外核苷酸序列位于标签特异性部分5’。对于1-步骤扩增，第三引物通常以正向引物和反向引物浓度的至少5倍被包含在扩增混合物中。第二另外核苷酸序列可以包括任选的条形码核苷酸序列，如果存在的话，其为标签特异性部分的5’。对于桥式测序，第二另外核苷酸序列包含5’第二流通池附接位点5’。图2示出了具有5’P7序列作为第二流通池附接位点的说明性第三引物，其与标签特异性部分(标签1)通过条形码核苷酸序列(“BC”)分开。如图2中示出的，如果第一流通池附接位点为正向引物的一部分，第三引物对反向引物上的标签是特异性的。相反地，如果第一流通池附接位点为反向引物的一部分，第三引物对正向引物上的标签是特异性的。
用2-步骤添加用于DNA测序的序列的环状扩增
使用环状扩增以用于制备用于桥式测序的模板的另一种方法为2-步骤法，其中第一步骤采用3个引物，并且第二步骤采用2个引物。参见图3。通常，这些步骤在分开的扩增混合物中进行。在特定的实施方案中，第一步骤使用用于在测序中使用的以上描述的正向引物和反向引物进行，例如：正向引物包含：5’-第一标签核苷酸序列-用于第一DNA测序引物的第一结合位点-共同序列-第一靶特异性序列-3’，并且反向引物包含：5’-第二标签核苷酸序列-用于第二DNA测序引物的第二结合位点-共同序列-第二靶特异性序列-3’。这些正向引物和反向引物在图3中被示出为“标签1SP”和“SP标签2”。第一步骤还包括第三引物，其中所述第三引物包含标签特异性部分、所述标签特异性部分5’的条形码核苷酸序列和所述条形码核苷酸序列5’的第二流通池附接位点。为了在Illumina系统上进行测序，该第二流通池附接位点可以是PE7，如图3中示出的，其中该第三引物被指示为“P7BCX标签2”。使用这三种引物的第一扩增步骤产生具有以下结构的靶扩增子：5’-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。
在一些实施方案中，以上描述的1-步骤方法或2-步骤方法的第一步骤可以在多于一个分开的反应混合物中进行。每一个分开的反应混合物可以包含适于扩增一个或更多个靶核酸的一个或更多个引物集。为了增加通量，以多路复用方式进行扩增(即在每一个反应混合物中用针对多于一个靶的引物)。如以上讨论的，环状扩增允许高水平多路复用，这在DNA测序环境中对靶向的重测序特别有用。
反应混合物可以以任何方式，例如作为液滴(例如在乳液中)或在微流体装置的室内形成。可用于本文描述的方法中的微流体装置在下文更详细地讨论。对于高通量分析，可以使用具有多于一个反应室的微流体装置。矩阵型微流体装置适于这一目的，特别是当在一个实验中要在不同样品中分析多于一个靶时。矩阵型装置允许样品以一个维度(即，列或行)装载到装置中，而引物可以以另一个维度(即分别为行或列)装载到装置中。如果将不同的样品装载到列中并且将不同的引物装载到行中，可以通过将多于一个引物集装载到每一行中来在装置中的多于一个反应室中的每一个中扩增多于一种靶核酸。在这种情况下，可以在装置中进行的同时扩增的数目为反应室的数目×每一个反应室中的引物集的数目。例如，如果，微流体装置包含用于48个不同样品的48个列和48个分开的行，并且使用环状扩增来扩增每一个室中多于10种靶核酸，可以为每一个样品扩增480种靶核酸。如果使用环状扩增来扩增每一个室中的至少100种靶核酸，可以为每一个样品扩增至少4800种靶核酸。
在进行扩增以制备用于DNA测序的模板并且使用以上描述的2-步骤方法的情况下，回收来自第一扩增的反应产物(“靶扩增子”)并且用两种不同的引物进行第二扩增步骤。如果第一步骤在微流体装置中进行，靶扩增子可以被回收并且在微流体装置之外或在不同的微流体装置中进行第二扩增步骤。因此，图3涉及用于第一步骤的“芯片上条形码化”和用于第二步骤的“芯片外衔接子添加”。例如，该方法的芯片上部分使用FluidigmCorporation的ACCESS ARRAYTMIFC(Integrated Fluidic Circuit)方便地进行。
如图3中示出的，在一些实施方案中，将至少一个另外核苷酸序列添加至由第一扩增步骤产生的靶扩增子中的每一个是有利的。当要进行桥式测序时，该另外核苷酸序列可以是第一流通池附接位点，第二流通池附接位点已经在第一扩增步骤中被添加。将第一流通池附接位点添加至与第二流通池附接位点相对的扩增子的末端。在以上描述中，由于第二流通池附接位点被引入在扩增子的“反向引物”末端处，用于第二扩增步骤的正向引物具有对第一核苷酸标签特异性的部分和所述标签特异性部分5’的第一流通池附接位点。该正向引物在图3中被示出为“P5标签1”。用于第二扩增步骤的反向引物对第二流通池附接位点是特异性的(图3中的“P7”)。
在一些实施方案中，用于添加用于DNA测序的序列的1-步骤或2-步骤方法的结果为DNA测序文库，其中文库的每一个成员具有以下结构：5’-第一流通池附接位点-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。
在一些实施方案中，将另外条形码核苷酸序列添加至每一个靶扩增子。例如，可以将另外条形码核苷酸序列引入在靶扩增子的末端处，该末端与携带以上讨论(且在图3中被示出为BCX)的条形码核苷酸序列的末端相对。当添加用于DNA测序的序列时，DNA测序文库的每一个成员可以具有以下结构：5’-第一流通池附接位点-第一条形码核苷酸序列-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-第二条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。在图3的方案中，可以例如通过在正向引物中包含第一条形码核苷酸序列(未示出)产生该结构，正向引物在芯片外接头添加中被显示为“P5标签1”。“第二”条形码核苷酸序列(被鉴定为BCX)已经在芯片上条形码化步骤中被掺入到靶扩增子中。
根据是否需要扩增子重叠，并且因此是否需要更大数目的可能引物对，可以调整两步骤循环扩增方案的第一步骤的引物浓度。例如，当目标为对样品核酸的特定区域进行测序时，情况可能如此。实施例4显示，对于第一步骤，2nM的引物浓度产生在非重叠扩增子的预期扩增子尺寸范围内的主要条带。将该浓度降低至1nM允许更大的扩增子重叠，并且进一步降低至0.5nM允许甚至更多的扩增子重叠，这产生在宽得多的范围的扩增子尺寸内的多于一个条带。此外，在环状扩增中引物浓度的降低促进了扩增特异性。
样品核酸
核酸(“样品”)的制备可以从生物来源获得并且使用本领域已知的常规方法制备。特别地，可用于本文描述的方法中的DNA或RNA可以从任何来源提取和/或扩增，任何来源包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器，以及高等生物体诸如植物或动物，特别是哺乳动物，并且更特别是人类。合适的核酸还可以从环境来源(例如，池塘水)，从人造制品(例如食品)，从法医样品等来获得。核酸可以通过多种标准技术中的任何技术从细胞、体液(例如，血液、血液级分、尿液等)，或组织样品中提取或扩增。说明性样品包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液(oral fluid)、和皮肤的外部部分的样品；来自呼吸道、肠道、生殖道和尿道的样品；眼泪、唾液、血细胞、干细胞、或肿瘤样品。例如，胎儿DNA的样品可以从胚胎或从母体血液中获得。样品可以从活的或死的生物体或从体外培养物中获得。说明性样品可以包括单个细胞、福尔马林固定的和/或石蜡包埋的组织样品、和穿刺活检。可用于本文描述的方法中的核酸也可以源自一个或更多个核酸文库，包括cDNA、粘粒、YAC、BAC、P1、PAC文库等。
感兴趣的核酸可以使用本领域熟知的方法分离，并根据核酸的来源、性质和相似因素选择具体的方法。样品核酸不必呈纯的形式，但通常足够纯以允许进行感兴趣的反应。在靶核酸为RNA的情况下，可以通过本领域已知的标准方法并且如以下中描述的将RNA逆转录为cDNA：例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,和Maniatis,T.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,第1、2、3卷(1989)。
靶核酸
可用于本文描述的方法中的靶核酸可以源自以上描述的任何样品核酸。在典型的实施方案中，靶核酸的至少一些核苷酸序列信息将是已知的。例如，如果采用PCR作为扩增反应，则对于给定靶核酸的每一个末端通常可获得足够的序列信息以允许设计合适的扩增引物。在可选的实施方案中，引物中的靶特异性序列可以被随机或简并的核苷酸序列替换。
靶可以包括，例如，与病原体，诸如病毒、细菌、原生动物、或真菌相关的核酸；RNA，例如，其过表达或低表达指示疾病的那些、以组织特异性或以发育特异性方式表达的那些；或由特定的刺激诱导的那些；基因组DNA，其可以针对特定多态性(诸如SNP)、等位基因或单倍型进行分析，例如在基因分型中。其中特别感兴趣的是在遗传疾病或其他病理中被改变(例如，扩增、缺失、重排和/或突变)的基因组DNA；与期望或不期望的性状相关的序列；和/或独特鉴定个体的序列(例如，在法医鉴定或亲子鉴定中)。当采用多于一种靶核酸时，这些可以在相同或不同的染色体上。
在多种实施方案中，待扩增的靶核酸可以是，例如，25个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、500个碱基或750个碱基。在本文描述的方法的某些实施方案中，可以采用长片段(long-range)扩增方法诸如长片段PCR以从扩增混合物产生扩增子。长片段PCR允许扩增范围从一个或几千个碱基(kb)至超过50kb的靶核酸。在多种实施方案中，通过长片段PCR扩增的靶核酸的长度为至少约1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、或50kb。靶核酸也可以落入具有任何这些值作为终点的任何范围(例如，25个碱基至100个碱基或5-15kb)内。
引物设计
适于核酸扩增的引物足够长以在用于聚合的剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度和组成将取决于许多因素，包括，例如，退火反应的温度、引物的来源和组成。例如，取决于靶核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含在约15个至约30个范围内的核苷酸，但它可以包含更多或更少的核苷酸。引物应该足够互补以选择性退火至它们各自的链并形成稳定的双链体。本领域技术人员知道如何选择适当的引物对来扩增感兴趣的靶核酸。例如，PCR引物可以通过使用任何商购可得软件或开源软件诸如Primer3(参见，例如，Rozen和Skaletsky(2000)Meth.Mol.Biol.,132:365-386；www.broad.mit.edu/node/1060，等)或通过访问Roche UPL网站来设计。
引物可以通过任何合适的方法制备，包括，例如，克隆和限制适当的序列或通过以下方法直接化学合成：诸如Narang等(1979)Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等(1979)Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸三酯方法；Beaucage等(1981)Tetra.Lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；美国专利号4,458,066的固体支撑方法(solid support method)，或者可以由商业来源提供。
可以通过使用Sephadex柱(Amersham Biosciences,Inc.,Piscataway,NJ)或本领域技术人员已知的其他方法纯化引物。引物纯化可以改进本文描述的方法的灵敏度。
扩增
核酸可以根据本文描述的方法扩增用于任何有用的目的，例如以检测和/或定量和/或测序一种或更多种靶核酸。扩增可以在液滴中、在乳液中、在容器中、在微量滴定板的孔中、在矩阵型微流体装置的室中等进行。
在某些实施方案中，采用扩增方法来产生适于自动化DNA测序的扩增子。许多当前的DNA测序技术依赖于“边合成边测序(sequencing by synthesis)”。这些技术需要文库创建、文库分子的大规模并行PCR扩增和测序。通常，文库创建始于将样品核酸转化为适当尺寸的片段，将衔接子序列连接到片段的末端，并且选择适当地附加衔接子的分子。文库分子末端上的衔接子序列的存在允许扩增随机序列插入片段(inserts)。以上描述的用于使靶核苷酸序列加标签的方法可以替代为连接，以掺入衔接子序列。
以上描述的方法提供了靶核苷酸序列的实质上均匀的扩增，这有助于制备具有良好覆盖率的DNA测序文库。在自动化DNA测序的情况下，术语“覆盖率”指测序时测量序列的次数。具有实质上均匀覆盖率的DNA测序文库可以产生其中覆盖率也实质上均匀的序列数据。因此，在多种实施方案中，在对如本文描述制备的多于一个靶扩增子进行自动化测序后，至少50％的靶扩增子的序列以大于靶扩增子序列的平均拷贝数的50％和少于靶扩增子序列的平均拷贝数的2倍存在。在该方法的多种实施方案中，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的靶扩增子序列以大于靶扩增子序列的平均拷贝数的50％和少于靶扩增子序列的平均拷贝数的2倍存在。
本文描述的方法可以包括使用任何可用的DNA测序方法对至少一种靶扩增子进行DNA测序。在特定的实施方案中，使用高通量测序方法对多于一个靶扩增子进行测序。此类方法通常使用体外克隆步骤来扩增单独的DNA分子。例如，乳液PCR(emPCR)将单独的DNA分子与在油相内的水性液滴中的引物包被的珠分开。PCR产生与珠上的引物结合的DNA分子的拷贝，随后固定以用于稍后的测序。体外克隆扩增也可以通过“桥式PCR”进行，其中片段在引物被附接至固体表面后扩增。与表面物理结合的DNA分子可以并行测序，例如通过焦磷酸测序或边合成边测序方法。
微流体装置
在某些实施方案中，本文描述的方法可以使用微流体装置进行。在说明性实施方案中，装置为矩阵型微流体装置，其允许多于一个底物溶液与试剂溶液在分开的隔离的反应室中同时组合。将认识到的是，底物溶液可以包括一种或多于一种底物(例如，靶核酸)，并且试剂溶液可以包括一种或更多种试剂(例如，扩增引物)。例如，微流体装置可以允许多于一个不同样品和扩增引物的同时成对组合。在某些实施方案中，装置被配置为在每一个不同的室中包含不同组合的引物和样品。在多种实施方案中，分开的反应室的数目可以大于50，通常大于100，更通常大于500，甚至更通常大于1000，并且有时大于5000或大于10,000。
在特定的实施方案中，矩阵型微流体装置为DYNAMIC ARRAYTMIFC(“DA”)微流体装置。DA微流体装置为一种矩阵型微流体装置，被设计为将样品和试剂(例如，扩增引物、检测探针等)的成对组合分开，并且适于进行定性和定量PCR反应，包括实时定量PCR分析。在一些实施方案中，DA微流体装置至少部分地由弹性体制造。DA微流体装置在PCT公布号WO05107938A2(Thermal Reaction Device and Method For Using The Same)和美国专利公布号US20050252773A1中描述，二者关于它们对DA微流体装置的描述通过引用以其整体并入本文。DA微流体装置可以掺入高密度矩阵设计，其利用微流体装置的层之间的流体连通通路(vias)来编织穿过装置和层之间的控制线路和流体线路。凭借弹性体模块的多于一层中的流体线路，高密度反应池布置是可能的。可选地，DA微流体装置可以被设计为使得所有的试剂和样品通道都在相同的弹性体层中，而控制通道(control channels)位于不同的层中。在某些实施方案中，DA微流体装置可以用于使M个数的不同样品与N个数的不同试剂反应。
尽管WO05107938中描述的DA微流体装置非常适于执行本文描述的方法，本发明不限于任何特定的装置或设计。可以使用分配样品和/或允许试剂和样品的独立成对组合的任何装置。美国专利公布号20080108063(其在此通过引用以其整体并入)包括说明48.48DYNAMIC ARRAYTMIFC的图，该48.48DYNAMIC ARRAYTMIFC为一种从Fluidigm Corp.(South San Francisco Calif.)可得的商购可得装置。应当理解的是，其他配置是可能的并且被考虑，例如，48×96；96×96；30×120；等。
在具体的实施方案中，微流体装置可以是适于进行数字扩增的DIGITALARRAYTMIFC微流体装置。此类装置可以具有集成的通道和阀门，该集成的通道和阀门将样品和试剂的混合物分配到纳升体积的反应室中。在一些实施方案中，DIGITAL ARRAYTMIFC微流体装置至少部分地由弹性体制造。说明性的DIGITAL ARRAYTMIFC微流体装置在由FluidigmCorp.(South San Francisco,CA)拥有的共同未决的美国申请，诸如美国申请号12/170,414，题为“Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation UsingDigital PCR”中描述。一个说明性实施方案具有12个输入端口，对应于至装置的12个分开的样品输入。该装置可以具有12个面板，并且12个面板中的每一个可以包含765个6nL反应室，其中总体积为4.59μL/面板。微流体通道可以将面板上的多个反应室连接至流体源。可以将压力施加至蓄压器(accumulator)，以打开和关闭将反应室连接至流体源的阀。在说明性实施方案中，可以提供12个入口用于装载样品试剂混合物。可以使用48个入口来为试剂提供源，当将压力施加至蓄压器时，所述试剂被供应至芯片。另外，可以提供两个或更多个入口以将水合作用(hydration)提供至芯片。
虽然DIGITAL ARRAYTMIFC微流体装置非常适于进行本文描述的某些扩增方法，本领域普通技术人员将认识到这些装置的许多变化形式和替代方案。给定的DIGITALARRAYTMIFC微流体装置的几何学取决于特定的应用。关于适于在本文描述的方法中使用的装置的另外描述提供于美国申请公布号20050252773中，关于其DIGITAL ARRAYTMIFC微流体装置的公开内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本文描述的方法可以使用提供反应产物回收的微流体装置来进行。此类装置被详细地描述于USPN 8,691,509中，(其在此通过引用以其整体并且特别地关于其允许反应产物回收的微流体装置及相关方法的描述并入)并且由Fluidigm Corp.作为ACCESS ARRAYTMIFC(Integrated Fluidic Circuit)销售。
在这种类型的说明性装置中，独立样品输入与引物输入以MxN阵列配置组合。因此，每一个反应为特定样品和特定试剂混合物的独特组合。在一种实现中，通过样品输入线路将样品装载到微流体装置中的样品室中，所述样品室布置为列。测定试剂(例如，引物)通过测定输入线路装载到微流体装置中的测定室中，所述测定室被布置为与列交叉的行。样品室和测定室在装载期间处于流体分开状态(isolation)。在装载过程完成之后，打开可操作以阻隔通过成对样品室和测定室之间的流体线路的界面阀门，以允许样品和测定的成对组合的自由界面扩散。样品和测定的精确混合物允许在多种成对组合之间发生反应，在每一个室中产生一种或更多种反应产物。收获反应产物，并且然后可以用于随后的过程。如本文使用的术语“测定”和“样品”是对一些实施方案中装置的特定用途的描述。然而，在所有实施方案中，装置的用途不限于“样品”和“测定”的用途。例如，在其他实施方案中，“样品”可以指“第一试剂”或多于一个“第一试剂”，并且“测定”可以指“第二试剂”或多于一个“第二试剂”。该装置的MxN特性允许任何一组第一试剂与任何一组第二试剂进行组合的组合。
根据特定的实施方案，来自MxN个成对组合的反应产物可以从微流体装置的离散池中，例如M个样品中的每一个样品一个池回收。通常，离散池被包含在载体上提供的样品输入端口中。在一些方法中，为了归一化的目的，可以在“每个扩增子”的基础上收获反应产物。利用本发明的实施方案，实现扩增产物的拷贝数在样品内变化不多于±25％和扩增产物的拷贝数在样品之间变化不多于±25％的结果(用于从样品和测定的相同输入溶液组装的重复实验)是可能的。因此，从微流体装置回收的扩增产物将代表通过具体已知基因分型的分布测量的输入样品。在某些实施方案中，输出样品浓度将大于2,000个拷贝/扩增子/微升，并且反应产物的回收将在少于两个小时内进行。
在一些实施方案中，反应产物通过扩张泵送回收。扩张泵送提供使用常规技术通常无法得到的益处。例如，扩张泵送允许从微流体装置中缓慢地取出反应产物。在示例性实施方案中，反应产物以少于100μl/小时的流体流量回收。在该实例中，对于分配在每一个列中的反应室中的48种反应产物，其中每一种反应产物的体积为约1.5μl，在约30分钟的时间段内取出反应产物将导致流体流量为72μl/小时。(即，48×1.5/0.5小时)。在其他实施方案中，反应产物的取出速率以以下的流量进行：少于90μl/小时、80μl/小时、70μl/小时、60μl/小时、50μl/小时、40μl/小时、30μl/小时、20μl/小时、10μl/小时、9μl/小时、少于8μl/小时、少于7μl/小时、少于6μl/小时、少于5μl/小时、少于4μl/小时、少于3μl/小时、少于2μl/小时、少于1μl/小时、或少于0.5μl/小时。
扩张泵送导致实质上清除微流体装置中存在的高百分比和潜在的所有反应产物。一些实施方案取出微流体装置的反应室(例如，样品室)中存在的多于75％的反应产物。作为实例，一些实施方案取出反应室中存在的多于80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％的反应产物。
本文描述的方法可以使用具有多于一个“单位单元(unit cells)”的微流体装置，所述“单位单元”通常包括样品室和测定室。此类单位单元可以具有数百微米量级的维度，例如单位单元具有以下的维度：500×500μm、525×525μm、550×550μm、575×575μm、600×600μm、625×625μm、650×650μm、675×675μm、700×700μm等。选择样品室和测定室的维度以提供足以用于期望过程的物质的量，同时降低样品和测定用量。作为实例，样品室可以具有100-400μm宽度×200-600μm长度×100-500μm高度的量级的维度。例如，宽度可以是100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm等。例如，长度可以是200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm等。例如，高度可以是100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm等。测定室可以具有相似的维度范围，通常提供在比更小室体积更小的范围内的相似步长。在一些实施方案中，样品室体积与测定室体积的比为约5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、或30:1。比所列范围更小的室体积被包括在本发明的范围内，并且使用微流体装置制造技术容易地制造。
较高密度的微流体装置将通常将利用较小的室体积以降低单位单元的覆盖区域(footprint)。在可得非常小的样品尺寸的应用中，降低的室体积将便于测试此类小样品。
对于单个颗粒分析，微流体装置可以被设计为便于装载和捕获待分析的特定颗粒。每一个单位单元具有“单元通道”(即，样品室)和“测定通道”(即，测定室)。单元通道为圆形的(rounded)，用于装载哺乳动物细胞，具有几十微米直径×几百微米长度的量级的维度。取决于被分析的细胞的尺寸，直径可以是约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、或约45μm或更多，或者可以落入具有任何这些值作为端点的范围内。取决于被分析的细胞的尺寸，长度可以是约60μm、约90μm、约120μm、约150μm、约170μm、约200μm、约230μm、约260μm或约290μm或更多，或者可以落入具有任何这些值作为端点的范围内。在基于ACCESSARRAYTMIFC平台的说明性微流体装置(“MA006”)中，用于装载哺乳动物细胞的单位单元可以是约30μm×170μm。此类装置可以被装备为在装载之后向单元通道提供或便于向单元通道提供热量以裂解细胞。该装置可以包括与单元通道分开的测定通道，用于执行反应诸如核酸扩增。可以使用170μm×170控制(containment)阀关闭细胞通道。
2012年2月29日提交的、且题为“Methods,Systems,And Devices For MultipleSingle-Particle or Single-Cell Processing Using Microfluidics”的共同未决的美国申请号61/605,016描述了用于利用微流体的多于一个单个颗粒或单个细胞处理的方法、系统和装置。多种实施方案提供从更大的颗粒或细胞群体捕获、分配和/或操作单独的颗粒或细胞以及产生与每一个单独的颗粒或细胞相关的遗传信息和/或反应。一些实施方案可以被配置用于使单独的颗粒或细胞或相关的反应产物成像作为处理的一部分。该申请通过引用以其整体，并且特别地关于其被配置为用于多于一个单个颗粒或单个细胞处理的微流体装置及相关系统的描述并入本文。
使用弹性体物质的制造方法以及用于设计装置及其组件的方法已经被详细地描述于科学和专利文献中。参见，例如，Unger等(2000)Science288:113-116；美国专利号US6,960,437(Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices)；6,899,137(Microfabricated elastomeric valve and pump systems)；6,767,706(Integratedactive flux microfluidic devices and methods)；6,752,922(Microfluidicchromatography)；6,408,878(Microfabricated elastomeric valve and pumpsystems)；6,645,432(Microfluidic devices including three-dimensionally arrayedchannel networks)；美国专利申请公布号2004/0115838；2005/0072946；2005/0000900；2002/0127736；2002/0109114；2004/0115838；2003/0138829；2002/0164816；2002/0127736；和2002/0109114；PCT公布号WO 2005/084191；WO 05/030822A2；和WO 01/01025；Quake&Scherer,2000,“From micro to nanofabrication with soft materials”Science290:1536-40；Unger等，2000,“Monolithic microfabricated valves and pumpsby multilayer soft lithography”Science 288:113-116；Thorsen等，2002,“Microfluidic large-scale integration”Science 298:580-584；Chou等，2000,“Microfabricated Rotary Pump”Biomedical Microdevices 3:323-330；Liu等，2003,“Solving the“world-to-chip”interface problem with a microfluidic matrix”Analytical Chemistry 75,4718-23,Hong等，2004,“A nanoliter-scale nucleic acidprocessor with parallel architecture”Nature Biotechnology22:435-39。
应用
在特定的实施方案中，本文描述的方法用于在分析一种或更多种核酸中使用例如(在一些实施方案中)。因此，例如，这些方法适于鉴定特定多态性(诸如SNP)、等位基因或单体型或染色体异常，诸如扩增、缺失、重排或非整倍性的存在。这些方法可以用于基因分型或测序中，其可以在许多情况下进行，包括遗传疾病或紊乱、癌症的诊断，药物基因组学(个体化药物)，农业(例如，对于种子或家畜)的质量控制，植物或动物群体的研究和管理(例如，在水产养殖或渔业管理中或在确定群体多样性时)或亲子鉴定或法医鉴定。本文描述的方法可以用于鉴定指示生物或环境样品中的特定状况或生物体的序列。例如，可以在测定中使用这些方法来鉴定病原体，诸如病毒、细菌和真菌。这些方法也可以用于旨在表征环境或微环境，例如表征人类消化道中的微生物物种的研究中。
在某些实施方案中，这些方法也可以用于确定DNA或RNA拷贝数。基因组DNA中异常DNA拷贝数的确定可用于例如遗传缺陷和疾病诸如癌症的诊断和/或预后。RNA“拷贝数”即表达水平的确定可用于在不同状况(例如，不同的外部刺激或疾病状态)下和/或处于不同的发育时期的例如不同的个体、组织或细胞中的感兴趣的基因的表达监测。
另外，可以采用这些方法来制备核酸样品用于进一步分析，诸如，例如，DNA测序。
此外，在随后分析之前，可以将核酸样品加标签作为第一步骤，以降低会损害结果的样品的错误标记或交叉污染的风险。例如，任何医师的办公室、实验室或医院均可以在收集之后立即使样品加标签，并且可以在分析时确认标签。相似地，可以在尽快可行的情况下使包含在犯罪现场收集的核酸的样品加标签，以确保样品不会被错误标记或篡改。每一次将样品从一方转移至另一方时检测标签可以用于建立样品的监管链。
试剂盒
根据本发明的试剂盒可以包含对于实践本文描述的方法中的一种或更多种有用的一种或更多种试剂。试剂盒通常包含具有一个或更多个容器的包装，所述一个或更多个容器容纳试剂(例如，引物)作为一种或更多种分开的组合物，或任选地，在试剂的相容性将允许的情况下，作为混合物。试剂盒还可以包含从使用者角度可期望的其他物质，诸如缓冲液、稀释剂、标准和/或可用于样品处理、洗涤、或执行方法的任何其他步骤中的任何其他物质。在具体的实施方案中，试剂盒包含以上讨论的一种或更多种矩阵型微流体装置。
在特定的实施方案中，试剂盒包含正向引物和反向引物，其中每一个引物包含靶特异性部分和靶特异性部分5’的共同序列。在某些实施方案中，共同序列包括转座子序列，诸如，例如，AGATGTGTNNNAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:1)或更具体地5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，用于每一种靶核酸的正向引物和/或反向引物包含共同序列5’的靶核苷酸序列。如果两个引物均包含标签序列，标签序列可以相同或不同。
在一些实施方案中，正向引物和/或反向引物可以包含标签核苷酸序列3’的另外核苷酸序列。在靶扩增子被测序的情况下，一个或两个引物可以包含为用于DNA测序引物的结合位点的另外核苷酸序列。例如，正向引物可以包含用于第一DNA测序引物的第一结合位点，和/或反向引物可以包含用于第二DNA测序引物的第二结合位点。
正向引物或反向引物可以另外包含标签核苷酸序列5’的流通池附接位点以便于Illumina平台上的测序。在某些实施方案中，正向引物包含第一流通池附接位点，并且第二流通池附接位点可以经由另一个引物添加至扩增子。
为了添加任何类型的另外核苷酸序列的目的，可以在试剂盒中包含第三引物。例如，在可用于进行1-步骤添加用于DNA测序的序列的实施方案中，第三引物可以包含标签特异性部分和标签特异性部分5’的第二另外核苷酸序列。在多种实施方案中，第二另外核苷酸序列包含条形码核苷酸序列和/或第二流通池附接位点，所述第二流通池附接位点可以与第一流通池附接位点不同。在特定的实施方案中，第二另外核苷酸序列包含标签特异性部分5’的条形码核苷酸序列和/或条形码核苷酸序列5’的第二流通池附接位点。
在可用于进行2-步骤添加用于DNA测序的序列的实施方案中，第三引物可以包含标签特异性部分、标签特异性部分3’的条形码核苷酸序列和条形码核苷酸序列3’的第二流通池附接位点。在用适当的正向引物和反向引物(如以上描述和图3说明的)扩增之后使用该引物产生具有以下结构的靶扩增子：5’-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-靶核苷酸序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第二流通池附接位点-3’。在这种情况下，试剂盒可以包含与第三引物结合使用以产生该扩增子的第四引物。第四引物通常对扩增子3’末端处的序列诸如第二流通池附接位点是特异性的。
试剂盒通常包含用于进行本文描述的一种或更多种方法的说明。包含在试剂盒中的说明，可以被贴到包装材料，或可以被包括作为包装说明书(package insert)。而说明通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明考虑能够储存此类说明，并将它们传达给最终使用者的任何介质。此类介质包括，但不限于，电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式贮存器、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)，RF标签等。如本文使用，术语“说明”可以包括提供说明的互联网网站的地址。
应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，且根据其的各种修改或改变对本领域技术人员将是暗示的，并被包括在本申请的精神和范围及所附的权利要求的范围内。
另外，本文引用的所有其他出版物、专利和专利申请通过引用以其整体为了所有目的并入本文。
实施例
实施例1-降低扩增子交叉杂交的环状PCR
为了与Illumina测序化学相容，公布的加标签的转座子序列被用作正向引物和反向引物两者中共同序列中加标签的特异性引物的一部分(转座子序列被加下划线)：
用于正向靶特异性引物的标签：
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:3)
用于反向靶特异性引物的标签：
5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:4)
(转座子序列为对于NEXTERATMDNA样品制备试剂盒公布的)。
将从扩增的扩增子形成茎环以抑制扩增子交叉杂交(图1)。引物中的共同序列也降低了引物二聚体形成的可能性(图4)。
实施例2-3-引物化学便于以最小的引物二聚体形成进行芯片上条形码化
现有的ACCESS ARRAYTM多路复用化学可以使用4个引物和两个PCR步骤提供10个复用。在第一步骤中，在ACCESS ARRAYTMIFC上执行PCR，并且在第二步骤中，将收获的样品在PCR板上进行条形码化。该工作流程可以用于10-20个复用，但具有少于期望的测序特异性，且易于样品交叉污染。为了以降低的非特异性扩增实现1-步骤样品条形码化，提出了1-步骤、3-引物方案。图2示出了了这种1-步骤、3-引物PCR条形码化方案。1-步骤、3-引物方法用于192个复用并且产生可与2-引物反应(没有条形码)相容的特异性产物，如图5中示出的。相比之下，1-步骤、4-引物测定未能在192个复用反应中产生PCR产物。
1-步骤、3-引物192个复用反应的测序数据对靶表现出>95％的映射比率。然而，正向引物的成本由于它们的长度是非常高的。因此，修改的2-步骤方案用于超复用靶测序文库制备，如图3中示出的。条形码化的扩增子文库在ACCESS ARRAYTMIFC上的3-引物反应中产生，收集在池中，并且然后将合并的文库在一个管中进一步扩增以添加测序衔接子。2-步骤方案的产物对基因组和靶两者表现出大于95％的映射比率，如图6中示出的。
实施例3-将2-吡咯烷酮或2-吡咯烷酮与海藻糖的混合物添加至PCR反应中以扩增 具有>65％GC含量的扩增子
具有高GC含量的扩增子的扩增在PCR领域，特别是在多路复用测定中一直具有挑战性。挑战为扩增具有高GC含量的扩增子，而不牺牲具有低GC含量的扩增子。为了改进GC覆盖率，将2-吡咯烷酮和海藻糖添加至商业PCR主混合物。2-吡咯烷酮和海藻糖的优化浓度分别为1％-2％和150mM。具有平均500bp的扩增子的GC含量被扩大至≥70％，而对具有<40％GC的扩增子的具有最小影响，如图7中示出的。
实施例4-单个反应混合物中的数千个复用PCR(thousands-plex PCR)
基本上如以上描述和图3中说明的，进行用2-步骤添加用于DNA测序的序列的环状PCR。将6062个引物对添加至单个反应管中。用不同的PCR主混合物准备多于一个管：(1)一个具有Aptataq DNA聚合酶，(2)Thermo的PreAmp主混合物，(3)4X TSP主混合物(以2X使用)，和(4)靶向的DNA Seq文库试剂盒(Targeted DNA Seq Library reagent kit,PN101-2511)。对于第一步骤，使用20个循环的PCR与6062个引物对，随后是对于第二步骤在10个循环PCR中的2X清除和衔接子添加。对于所有4种主混合物均观察到相似的结果。代表性的凝胶图像和对应的生物分析仪迹线示于图9A-9B中。结果表明，当对于第一步骤，20个循环PCR的引物浓度为2nM时，6062个复用扩增工作正常，产生预期320-380bp尺寸范围的主要扩增子条带。将该引物浓度降低至1nM或0.5nM产生更大的扩增子重叠，产生160-1000bp的扩增子尺寸范围，这为重叠扩增子的预期尺寸范围(参见图9C)。对基因组的测序映射比率(使用靶向的DNA Seq文库试剂盒确定)示于图9D中。这表明在0.5-2nM的引物浓度在6062个复用实现非常特异性的扩增。

Claims (33)

1.一种用于扩增一种或更多种靶核酸的非诊断目的的方法，所述方法包括：
使样品核酸与用于每一种靶核酸的正向引物和反向引物接触，其中每一个引物包含靶特异性部分、位于所述靶特异性部分的5’端的共同序列、位于所述共同序列5’端的DNA测序引物结合位点，以及位于所述DNA测序引物结合位点5’端的核苷酸标签，其中所述正向引物和所述反向引物中的第一核苷酸标签和第二核苷酸标签是不同的，并且其中所述共同序列包含转座子序列；以及
在第一扩增中扩增所述靶核酸以产生至少一种靶扩增子，其中靶核苷酸序列在一个末端上侧翼为所述共同序列且在另一末端上为所述共同序列的反向互补序列，从而所述靶扩增子的单链形成茎环结构，其中所述第一扩增在包含多于一个反应室的微流体装置中使用第三引物进行，其中所述第三引物包含第二核苷酸标签特异性部分、位于所述第二核苷酸标签特异性部分5’端的第二条形码核苷酸序列，和位于所述条形码核苷酸序列5’端的第一流通池附接位点，其中所述第一扩增产生具有以下结构的第一靶扩增子：5’-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第一流通池附接位点-3’；
在第一扩增之后从所述微流体装置回收所述第一靶扩增子；以及
在第二扩增中使用另外的引物扩增所述第一靶扩增子，所述另外的引物包括具有第一核苷酸标签特异性部分和位于所述第一核苷酸标签特异性部分5’端的第二流通池附接位点的正向引物和对所述第一流通池附接位点特异性的反向引物，其中所述第二扩增产生具有以下结构的第二靶扩增子：5’-第二流通池附接位点-第一核苷酸标签-第一引物结合位点-共同序列-靶核苷酸序列-共同序列的反向互补序列-第二引物结合位点-第二核苷酸标签-条形码核苷酸序列-第一流通池附接位点-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其中多于一种靶核酸被扩增。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中多于一种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
4.根据权利要求3所述的方法，其中至少100种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
5.根据权利要求4所述的方法，其中至少1000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
6.根据权利要求1、2、4-5中任一项所述的方法，其中少于17,000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
7.根据权利要求3所述的方法，其中少于17,000种靶核酸在单个反应混合物中被扩增。
8.根据权利要求1、2、4-5、7中任一项所述的方法，其中平均靶扩增子大小比当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时大。
9.根据权利要求3所述的方法，其中平均靶扩增子大小比当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时大。
10.根据权利要求6所述的方法，其中平均靶扩增子大小比当使用仅包含靶特异性序列的引物进行扩增时大。
11.根据权利要求1、2、4-5、7、9-10中任一项所述的方法，其中所述扩增在包含多于一个分开的反应混合物中进行。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述扩增在包含多于一个分开的反应混合物中进行。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述扩增在包含多于一个分开的反应混合物中进行。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述扩增在包含多于一个分开的反应混合物中进行。
15.根据权利要求11所述的方法，其中多于一个靶核酸被扩增，并且其中扩增在多于一个反应室的每一个中以多路复用进行。
16.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中多于一个靶核酸被扩增，并且其中扩增在多于一个反应室的每一个中以多路复用进行。
17.根据权利要求15所述的方法，其中多于100种靶核酸在所述多于一个反应室的每一个中被扩增。
18.根据权利要求16所述的方法，其中多于100种靶核酸在所述多于一个反应室的每一个中被扩增。
19.根据权利要求1、2、4-5、7、9-10、12-15、17-18中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
20.根据权利要求3所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
21.根据权利要求6所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
22.根据权利要求8所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
23.根据权利要求11所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述微流体装置包括矩阵型微流体装置。
25.根据权利要求1、2、4-5、7、9-10、12-15、17-18、20-24中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
26.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
27.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
28.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
29.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
30.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
31.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法另外包括对所述靶扩增子进行测序。
32.一种试剂盒，所述试剂盒包含引物集，其中所述引物集包括权利要求1所述的方法中采用的全部引物。
33.根据权利要求1所述的方法中采用的全部引物在制备用于扩增一种或更多种靶核酸的制剂中的用途。
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