JP6321757B2

JP6321757B2 - Ｎｇｓライブラリ作製用プライマーセットおよびこれを用いたｎｇｓライブラリ作製法およびキット

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Publication number: JP6321757B2
Application number: JP2016212064A
Authority: JP
Inventors: ヤンハンイ; ジョンミンチョン; ミニキム; ウリアン; ミニョンイ
Original assignee: 大韓民国行政自治部国立科学捜査研究院
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2018-05-09
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: US10329616B2; JP2017079735A; KR101651817B1; US20170121765A1

Description

本発明は、次世代塩基配列分析（ＮｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）に使用されるライブラリ作製用プライマーセット、これを用いたライブラリ作製法およびキットに関し、より詳細には、様々なサンプルにおいて標的ＤＮＡを効果的に増幅し、ＮＧＳに用いられることができるように作製されたプライマーセット、これを用いたライブラリ作製法およびキットに関する。

次世代塩基配列分析の技術は、既存の方法とは異なり、大容量のデータを短時間で生成することができることから、遺伝子解読に必要な時間と費用を画期的に低減した技術である。次世代塩基配列分析の技術は、時間が経つにつれてシーケンシングプラットフォームは発展し、分析コストはますます安くなっており、メンデル性遺伝子疾患と希少疾患、癌などにおいて次世代塩基配列分析法を用いて疾病の原因遺伝子を探し出すことに成功している。現在、最も多く用いられているｉｌｌｕｍｉｎａ社の次世代塩基配列分析法は、検体からＤＮＡを抽出してから機械的に断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）した後、特定のサイズを有するライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）を作製しシーケンシングに使用する。大容量シーケンシング装置を使用して一つの塩基単位で４種類の相補的ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）結合および分離反応を繰り返して、初期シーケンシングデータを生成することになり、以降、初期データの加工（Ｔｒｉｍｍｉｎｇ）、マッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ）、遺伝子変異の同定および変異情報の解釈（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）など、生物情報学（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いた分析ステップが行われる。

かかる次世代塩基配列分析法は、疾病および様々な生物学的表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に影響を及ぼしたり、可能性の高い遺伝子変異を探し出して革新的な治療剤の開発および産業化による新たな付加価値の創造に寄与している。次世代塩基配列分析法は、ＤＮＡだけでなく、ＲＮＡおよびメチル化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）解読にも応用可能であり、タンパク質をコードするエキソーム（Ｅｘｏｍｅ）領域のみを捕捉（Ｃａｐｔｕｒｅ）してシーケンスする全エキソームシーケンシング（Ｗｈｏｌｅ‐ｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＥＳ）も可能である。

一方、ＮＧＳにおいてライブラリ作製（Ｌｉｂｒａｒｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、試料のランダムなＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片で５´から３´方向のアダプタ（ａｄａｐｔｅｒ）を接合して配列分析に必要なライブラリを準備する過程である。初期ＮＧＳライブラリ作製は、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料のランダム切断、３´および５´末端修理（ｒｅｐａｉｒ）、アダプタ連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ＰＣＲ増幅および精製過程などの複雑な過程と、一日から二日の長い時間を必要とした。ｉｌｌｕｍｉｎａ社は、これを改善し、「ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡｌｉｂｒａｒｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」のようなｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ方法を開発した。これは、ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅにｔａｇ（既存のアダプタ）を結合した複合体をサンプルＤＮＡに処理して、切断とアダプタ連結を同時に行ってからＰＣＲで増幅する方法であり、８個のサンプルでライブラリを作製する際にかかる時間を３時間に低減する成果を上げた。

しかし、前記方法もまた、大量の試料を分析する場合に以下のような様々なステップがあり、実験者の労動と実験時間がかかる。まず、大量の試料それぞれのＤＮＡを定量してｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを行い、次に、ｔａｇｍｅｎｔａｉｏｎした生成物のサイズを確認し精製する過程を経てこれをＰＣＲ増幅し、増幅したＰＣＲ生成物を精製する過程が終了した後、同一量でライブラリ平均化（ｌｉｂｒａｒｙｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行ってからシーケンシング作業が可能であるという欠点がある。

これに対し、本発明者らは、前記問題点を解決し、少数のサンプルから多量の情報を得るＮＧＳの概念を覆して考え、多くのサンプルから所望の情報のみがより簡単且つ効率的な方法で得られる方式を開発するために鋭意研究を重ねた結果、アダプタとインデックス、および標的ＤＮＡ特異的配列を全て含むプライマーセットを用いる場合、一回のＰＣＲでライブラリ作製を完了することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、様々なサンプルにおいて標的ＤＮＡの配列を分析することができるＮＧＳライブラリ作製用プライマーセットを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記プライマーセットの組み合わせを用いて、様々なサンプルにおいて標的ＤＮＡ配列を分析することができるＮＧＳライブラリ作製法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記プライマーセットの組み合わせを含むＮＧＳライブラリ作製用キットを提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、第１アダプタ配列、第１インデックス配列、第１シーケンシング配列、および第１標的配列からなる第１プライマーと、第２アダプタ配列、第２インデックス配列、第２シーケンシング配列、および第２標的配列からなる第２プライマーと、を含むＮＧＳライブラリ作製用プライマーセットを提供する。

本発明はまた、（ａ）前記プライマーセットの組み合わせを用いて標的ＤＮＡを増幅するステップと、（ｂ）増幅した生成物を精製し、ライブラリプーリング（ｌｉｂｒａｒｙｐｏｏｌｉｎｇ）を行うステップと、を含むＮＧＳライブラリ作製法を提供する。

本発明はまた、前記プライマーセットの組み合わせを含むＮＧＳライブラリ作製用キットを提供する。

本発明に係るプライマーセットを用いたＮＧＳライブラリ作製法は、既存のライブラリ作製法およびｉｌｌｕｍｉｎａ社のｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ方法より簡単に大量の試料を分析することができ、大量の試料の標的ＤＮＡ配列分析や、データベースの構築に効果的に使用可能であることから有用である。

本発明に係るプライマーセットの概念図である。本発明のプライマーセットを用いたライブラリ作製過程と他の方法とを比較した概念図である。本発明で使用したＮＧＳ用プライマーセットの組み合わせを示す図である。本発明の一実施例により分析したＮＧＳ分析結果と既存のサンガーシーケンシング（ｓａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法の結果とを比較した図である。

他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家により通常理解されるものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野において周知であり、通常使用されるものである。

本発明では、標的ＤＮＡ特異的プライマーとＮＧＳライブラリ作製用プライマーとを結合してＮＧＳライブラリを作製する場合、大量の試料で分析を希望する標的ＤＮＡを増幅するだけでなく、ＮＧＳを用いた配列分析により標的ＤＮＡを分析できるということを確認しようとした。

本発明では、標的ＤＮＡに特異的に結合するプライマーとＮＧＳライブラリの作製に必須なアダプタプライマー、インデックスプライマーおよびシーケンシングプライマーを全て含む統合プライマーを作製して、ＮＧＳ用ライブラリ作製を行った。その結果、一回のＰＣＲおよび精製過程によりＮＧＳ用ライブラリを作製できるということを確認した。

すなわち、本発明の一実施例では、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域１（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ１、ＨＶ１）に特異的に結合するプライマーとＰ５またはＰ７アダプタプライマー、インデックスプライマーおよびシーケンシングプライマーを全て含む統合プライマーを用いてＮＧＳ用ライブラリを作製した結果、既存の方法に比べてはるかに簡単且つ迅速にＮＧＳ用ライブラリを作製できるということを確認することができた。

したがって、本発明は、一観点から、第１アダプタ配列、第１インデックス配列、第１シーケンシング配列、および第１標的配列からなる第１プライマーと、第２アダプタ配列、第２インデックス配列、第２シーケンシング配列、および第２標的配列からなる第２プライマーと、を含むＮＧＳライブラリ作製用プライマーセットに関するものである。

本発明において、前記第１アダプタ配列はＰ５（配列番号１）であり、第２アダプタ配列はＰ７（配列番号２）であることを特徴としてもよい。

配列番号１：Ｐ５５´‐ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ‐３´
配列番号２：Ｐ７５´‐ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ‐３´

本発明において、前記第１インデックス配列は、配列番号３〜１０からなる群から選択されるいずれか一つの配列であってもよく、第２インデックス配列は、配列番号１１〜２２からなる群から選択されるいずれか一つの配列であってもよいことを特徴としてもよい。

本発明のシーケンシング配列は、ＮＧＳ装置において配列分析のために共通して適用される配列であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、第１プライマーまたは第３プライマーのシーケンシング配列は配列番号２３であってもよく、第２プライマーまたは第４プライマーのシーケンシング配列は配列番号２４であってもよい。

配列番号２３：５´‐ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ‐３´
配列番号２４：５´‐ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ‐３´

本発明において、前記第１標的配列および第２標的配列は、標的ＤＮＡに特異的に結合可能な配列であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、標的ＤＮＡの特定の領域に結合することを特徴としてもよく、より好ましくは、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域１（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ１、ＨＶ１）に結合することを特徴としてもよく、最も好ましくは、配列番号２５および２６であることを特徴としてもよい。

配列番号２５：５´‐ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＣＣＣＡＡＡ‐３´
配列番号２６：５´‐ＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧ‐３´

本発明において、前記第１プライマーは、配列番号２７〜３４のいずれか一つであることを特徴としてもよく、第２プライマーは、配列番号３５〜４６のいずれか一つであることを特徴としてもよい。

本発明の標的ＤＮＡは、血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、口腔細胞、胎盤細胞または胎児細胞を含む羊水およびその混合物を含む群から選択される組織から分離したＤＮＡであり、これに限定されない。

本発明の標的ＤＮＡは、当業界において公知の通常の方法により取得することができる。例えば、前記組織にＤＮＡ溶解緩衝液（例えば、ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＳＤＳ、デオキシコール酸塩（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、およびトリトンＸ（ｔｒｉｔｏｎＸ）および／またはＮＰ‐４０を含む）を処理してＤＮＡを分離してもよいが、これに限定されない。

一方、標的ＤＮＡが複数個である場合、プライマーを多様に組み合わせてライブラリを作製することができると予測した。

本発明の他の実施例では、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域１（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ１、ＨＶ１）または超可変領域２（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２、ＨＶ２）に特異的に結合するプライマーとＰ５またはＰ７アダプタプライマー、インデックスプライマーおよびシーケンシングプライマーを全て含む統合プライマーを用いてＮＧＳ用ライブラリを作製した結果、迅速にＮＧＳ用ライブラリを作製できるということを確認することができた。

したがって、本発明は、他の観点から、前記プライマーセットを含み、第１アダプタ配列、第１インデックス配列、第１シーケンシング配列、および第３標的配列からなる第３プライマーと、第２アダプタ配列、第２インデックス配列、第２シーケンシング配列、および第４標的配列からなる第４プライマーと、を含むプライマーセットをさらに含むプライマーセットの組み合わせに関するものである。

本発明において、第３標的配列は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域２（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２、ＨＶ２）であることを特徴としてもよい。

本発明において、前記第３標的配列、および第４標的配列は、標的ＤＮＡに特異的に結合できる配列であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、標的ＤＮＡの特定の領域に結合することを特徴としてもよく、より好ましくは、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域２（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２、ＨＶ２）に結合することを特徴としてもよく、最も好ましくは、配列番号６７および６８であることを特徴としてもよい。

配列番号６７：５´‐ＣＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣＧ‐３´
配列番号６８：５´‐ＣＴＧＧＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＧ‐３´

本発明において、前記第３プライマーは配列番号４７〜５４のいずれか一つであることを特徴としてもよく、第４プライマーは配列番号５５〜６６のいずれか一つであることを特徴としてもよい。

本発明において、前記プライマーセットの組み合わせは、前記プライマーセットと標的配列のみが相違するプライマーセットを１〜２２個さらに含むことを特徴としてもよい。すなわち、本発明のプライマーセットの組み合わせは、１〜４８個の標的を同時に検出することができる。

本発明はまた、（ａ）サンプルからＤＮＡを抽出するステップと、（ｂ）前記プライマーセットの組み合わせを用いて標的ＤＮＡを増幅するステップと、（ｃ）増幅した生成物を精製して、ライブラリプーリング（ｌｉｂｒａｒｙｐｏｏｌｉｎｇ）を行うステップと、を含むＮＧＳライブラリ作製方法に関するものである。

本発明において、前記ＤＮＡは、標的ＤＮＡを含有する核酸であればいずれも利用可能であるが、好ましくは、ミトコンドリアＤＮＡであることを特徴としてもよい。

本発明において、前記標的ＤＮＡは、ミトコンドリアのＨＶ１またはＨＶ２であることを特徴としてもよい。

本発明において、標的ＤＮＡは、ＤＮＡを含む生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅ）である。一方、前記標的ＤＮＡは、単一ソース（ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｏｕｒｃｅ）試料または２以上ソースの混合試料（ｍｉｘｔｕｒｅ）からなることができる。

本発明の方法は、生物学的試料から分離されたＤＮＡに適用してもよいが、前記生物学的試料を直接用いて核酸分子が関与する直接ＰＣＲ（ＤｉｒｅｃｔＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を実施してもよい（韓国登録特許１０‐０７４６３７２参照）。

本発明における用語「増幅」は、核酸分子を増幅する反応を意味する。様々な増幅反応が当業界において報告されており、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという）（米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２、および４，８００，１５９号）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ‐ＰＣＲと表記する）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（２００１））、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．（ＷＯ８９／０６７００）およびＤａｖｅｙ，Ｃ．ら（ＥＰ３２９，８２２）の方法、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）（１７，１８）、Ｇａｐ‐ＬＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、復旧連鎖反応（ｒｅｐａｉｒｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＥＰ４３９，１８２）、転写‐増幅法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ‐ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）（１９）（ＷＯ８８／１０３１５）、自家持続配列複製（ｓｅｌｆｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（２０）（ＷＯ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド塩基配列の選択的増幅（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｐｒｉｍｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＣＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意的プライムポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙｐｒｉｍｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＡＰ‐ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号および第５，８６１，２４５号）、核酸塩基配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）（米国特許第５，１３０，２３８号、第５，４０９，８１８号、第５，５５４，５１７号、および第６，０６３，６０３号）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびループ介在等温性増幅（ｌｏｏｐ‐ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ）を含むが、これに限定されない。

使用可能な他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４、５，４９４，８１０、４，９８８，６１７号および米国特許第０９／８５４，３１７号に記述されている。

ＰＣＲは、最もよく知られている核酸増幅方法であり、その様々な変形と応用が開発されている。例えば、ＰＣＲの特異性または敏感性を増進させるために伝統的なＰＣＲ手順を変形してタッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ、ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）ＰＣＲ、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲおよびブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）ＰＣＲが開発された。また、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、リアルタイム（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ）ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙＰＣＲ、Ｄ‐ＰＣＲ）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ、ＲＡＣＥ）、インバースＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：IＰＣＲ）、ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）ＰＣＲ、およびＴＡＩＬ‐ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ）が特定の応用のために開発された。

ＰＣＲに関する詳細な内容は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．およびＭｏｌｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．ＰＣＲ．ＢＩＯＳＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐ＶｅｒｌａｇＮｅｗＹｏｒｋＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎ．Ｙ．（２０００）に記載されており、その教示事項は、本発明に参照として挿入される。

本発明において、前記増幅された生成物を精製する方法は、当業界に知られている一般的な方法であればいずれも利用可能であるが、好ましくは、ゲル濾過、カラムを用いた方法および電磁場を用いた方法からなる群から選択される方法を用いることを特徴としてもよい。

本発明はまた、前記プライマーセットの組み合わせを含むＮＧＳライブラリ作製用キットに関するものである。

本発明のキットは、ＤＮＡを切断する製剤を含有する第一の容器および標的ＤＮＡを増幅するための統合プライマー組み合わせを含有する一つ以上の容器を含む。本発明により使用されるプライマーセットの組み合わせは、配列番号２７〜６６に記載の配列、機能的組み合わせおよびその断片を含む。

本発明において、前記キットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ補因子およびデオキシリボヌクレオチド‐５‐トリホスフェートのような標的増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するために必要な試薬を選択的に含むことができ、様々なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、様々なバッファーおよび試薬、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことも可能である。

本発明のキットを用いると、共通のＰＣＲ条件をもって本発明で作製した２種以上のプライマーセットを全て同時に用いたマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）を実施して１回ＰＣＲを行うことにより、ＮＧＳ用ライブラリを作製することが可能である。

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明なことである。

≪実施例１：大量の試料において特定の部位の増幅のためのＮＧＳライブラリ作製用統合プライマーの作製≫
１．１試料の準備
計９１名の血縁関係のない韓国人から口腔細胞を採取し、ＱＩＡＧＥＮＭｉｃｒｏｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、４℃で保管した。

１．２ＰｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎａｎｄＰＣＲ
ミトコンドリアＤＮＡの高度可変部位１（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ１；以下、ＨＶ１）と高度可変部位２（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２；以下、ＨＶ２）領域に対するＮＧＳ方式を適用して設計されたａｄａｐｔｅｒ（Ｐ７またはＰ５領域とｉｎｄｅｘ、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｒｉｍｅｒ）と既知のＨＶ１とＨＶ２領域のｐｒｉｍｅｒを５´から３´の方向に構成された統合ｐｒｉｍｅｒを作製した（図１）。

このように作製したＨＶ１とＨＶ２統合プライマーセット（ｐｒｉｍｅｒｓｅｔ）は、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供するそれぞれ異なるインデックス（ｉｎｄｅｘ）を有しており、一回の実行で計９６個の試料分析が可能で、且つ各試料別にＨＶ１とＨＶ２を一回に増幅することができる。ＰＣＲ増幅の条件は、９６℃で１５分間ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎさせた後、９４℃で１５秒間ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ、５６℃で３０秒間ａｎｎｅａｌｉｎｇ、７２℃で１分間ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを３５回反応させた後、７２℃で７分間ｅｘｔｅｎｓｉｏｎした。このように増幅されたＰＣＲ増幅生成物４μｌを同量の２Ｘｌｏａｄｉｎｇｄｙｅを混合して２％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ）に１１０Ｖで１０分間電気泳動してＵＶトランスイルミネータ（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）を用いてｇｅｌｂａｎｄを確認した。このように増幅されたＰＣＲ生成物（ＨＶ１およびＨＶ２）を全て集めてＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ生成物の濃度を定量し、ｉｌｌｕｍｉｎａ社が提供する方法によりＭｉＳｅｑ装置で実験を行った（図３）。

１．３ＮＧＳｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ
塩基配列の結果は、マッピングプログラムであるＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ‐ＷｈｅｅｌｅｒＡｌｉｇｎｅｒ）とＧＡＴＫ（ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓＴｏｏｌＫｉｔ）に基づいて作られたＭｉＳｅｑＲｅｐｏｒｔｅｒ（ＭＳＲ；ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；ｖ２．５．１）を用いて分析した。

その結果、既存のサンガーシーケンシング（ｓａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析法と本研究の結果とを比較した時に、ＨＶ１領域計３０６９０ｂａｓｅｐａｉｒ（ｂｐ）のうち３０６６６ｂｐが一致しており、ＨＶ２領域計１７２８０ｂｐのうち１７２７５ｂｐが一致していることを確認し、その正確度が高いことが分かった（図４）。

以上、本発明における内容の特定の部分について詳細に記述しており、当業界における通常の知識を有する者にとってかかる具体的技術は、単に好ましい実施様態であって、これにより本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。

Claims

配列番号２７〜３４の中の一つに表示され、第１アダプタ配列、第１インデックス配列、第１シーケンシング配列、および第１標的配列からなる第１プライマーと、配列番号３５〜４６の中の一つに表示され、第２アダプタ配列、第２インデックス配列、第２シーケンシング配列、および第２標的配列からなる第２プライマーと、を含むＮＧＳライブラリ作製用プライマーセット。
前記第１アダプタ配列はＰ５（配列番号１）であり、第２アダプタ配列はＰ７（配列番号２）であることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
前記第１インデックス配列は、配列番号３〜１０からなる群から選択されるいずれか一つの配列であって、第２インデックス配列は、配列番号１１〜２２からなる群から選択されるいずれか一つの配列であることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
前記第１標的配列および第２標的配列は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域１（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ１、ＨＶ１）に結合することを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
前記第１標的配列は配列番号２５に表示されることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
前記第２標的配列は配列番号２６に表示することを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
前記第１シーケンシング配列は配列番号２３に表示され、第２シーケンシング配列は、配列番号２４に表示されることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
請求項１〜７の中の何れか一つのプライマーセットを含み、配列番号４７〜５４の中の一つに表示され、第１アダプタ配列、第１インデックス配列、第１シーケンシング配列、および第３標的配列からなる第３プライマーと、配列番号５５〜６６の中の一つに表示され、第２アダプタ配列、第２インデックス配列、第２シーケンシング配列、および第４標的配列からなる第４プライマーと、を含むプライマーセットをさらに含むプライマーセットの組み合わせ。
前記第３標的配列及び第４標的配列は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの超可変領域２（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ２、ＨＶ２）に結合することを特徴とする請求項８に記載のプライマーセットの組み合わせ。
前記第３標的配列は配列番号６７に表示されることを特徴とする請求項８に記載のプライマーセットの組み合わせ。
前記第４標的配列は配列番号６８に表示されることを特徴とする請求項８に記載のプライマーセットの組み合わせ。
前記プライマーセットと標的配列のみが相違するプライマーセットを１〜２２個さらに含むことを特徴とする請求項８に記載のプライマーセットの組み合わせ。
次のステップを含むＮＧＳライブラリ作製方法；
（ａ）請求項８〜１２の中の何れか一つに記載のプライマーセットの組み合わせを用いて標的ＤＮＡを増幅するステップと、
（ｂ）増幅した生成物を精製して、ライブラリプーリング（ｌｉｂｒａｒｙｐｏｏｌｉｎｇ）を行うステップ。
前記標的ＤＮＡは、ミトコンドリアのＨＶ１またはＨＶ２であることを特徴とする請求項１３に記載のＮＧＳライブラリ作製方法。
請求項８〜１２の中の何れか一つに記載のプライマーセットの組み合わせを含むＮＧＳライブラリ作製用キット。