CN107955831A - 用于淋巴细胞定量检测的标记物和淋巴细胞定量检测方法 - Google Patents

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CN107955831A CN201610895868.1A CN201610895868A CN107955831A CN 107955831 A CN107955831 A CN 107955831A CN 201610895868 A CN201610895868 A CN 201610895868A CN 107955831 A CN107955831 A CN 107955831A
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Abstract

本申请公开了一种用于淋巴细胞定量检测标记物和定量检测方法。本申请标记物，为DNA片段或含有DNA片段的质粒，DNA片段5’到3’端依序包括V区、M区和J区，V区由前导区基因和/或V基因全部或部分序列组成，J区由J基因全部或部分序列组成，M区包括外源核苷酸片段。本申请的标记物，在免疫组库建库时添加到gDNA中一起建库测序，定量标记物获得淋巴细胞数目。本申请的淋巴细胞定量方法，简单快速、明白直接；对生物实验要求和依赖度不高；可分析得致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞的比例，使基于高通量测序监控致病克隆比例成为现实，对免疫相关疾病早期诊断、预后监控、指导临床治疗有重要意义。

Description

用于淋巴细胞定量检测的标记物和淋巴细胞定量检测方法
技术领域
本申请涉及淋巴细胞检测领域，特别是涉及一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，以及采用该标记物的淋巴细胞定量检测方法。
背景技术
对免疫相关疾病而言，预后监控是尤为重要的。患者经过治疗后，微小残留往往会成为疾病复发的罪魁祸首。以白血病为例，经过治疗体内残留的白血病细胞通常低达109个以下。目前对于残留细胞的检测通常采用的是流式细胞仪，但是，流式细胞仪对于外周血中微量的残留细胞检测敏感性和特异性不好，会导致假阴性结果，不利于预后监控。
因此，亟需一种可以对免疫相关疾病微小残留细胞进行检测和监控的技术，以便于预后监控或早期诊断。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，以及采用该标记物的淋巴细胞定量检测方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，标记物为DNA片段或者含有该DNA片段的质粒，该DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，其中，V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成，J区由J基因的全部或部分连续序列组成，M区包括外源核苷酸片段。
需要说明的是，“V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成”是指，V区为前导区基因的全部或部分连续序列，或者V区为V基因全部或部分连续序列，或者V区为前导区基因的全部或部分连续序列加上V基因全部或部分连续序列。其中，“前导区基因的全部或部分连续序列”是指，可以是前导区基因的全部基因序列，或者前导区基因中的任意一段序列，并且这段序列必须是前导区基因中的连续的序列。类似的，“V基因全部或部分连续序列”、“J基因的全部或部分连续序列”、“D基因的全部或部分连续序列”，也是指这些基因的全部序列，或者其中任意一段序列。
还需要说明的是，本申请的标记物，其关键就在于，在其DNA片段的5’端和3’端分别具有V区和J区，这样在标记物添加到人基因组DNA中，进行免疫组库构建时，标记物的DNA片段就可以一起被PCR扩增和测序。但是，为了区分添加的标记物DNA片段和人基因组DNA片段，本申请的标记物DNA片段中，在V区和J区之间还具有M区。该M区可以是任意一段已知的外源核苷酸片段，例如其它和人基因组DNA没有同源性的微生物的片段，或者是一段随机序列，这样就可以和人基因组DNA的免疫组库区分开来。
还需要说明的是，本申请的标记物，其分子拷贝数是已知的，使用时，将其添加到人基因组DNA样本中，一起进行免疫组库建库和测序，可以通过本申请的标记物定量出淋巴细胞的数量。可以理解，本申请的标记物是要添加到人基因组DNA样本中一起进行免疫组库建库和测序的，因此，标记物的DNA片段必须包含能够被人免疫组库建库引物识别和扩增的区域，即位于5’端的V区，和位于3’端的J区；与此同时，本申请的标记物DNA片段又必须与人基因组DNA的抗体序列区分开来，因此，还需要M区。
优选的，M区中，外源核苷酸片段为barcode。
优选的，在外源核苷酸片段为barcode时，M区还包括D基因的全部或部分连续序列。
优选的，D基因的全部或部分连续序列的长度为0bp-100bp。
需要说明的是，本申请中barcode是指识别序列，通常是一段随机序列，用于区分样本和标记物，长度通常在4-12bp。如前面提到的，本申请中M区可以是任意的外源核苷酸片段，只要能够将本申请的标记物DNA片段与人免疫组库DNA序列区分开来即可；在V区和J区够长的情况下，M区可以只是barcode。当然，M区也可以进一步的模拟人免疫组库的抗体序列，即M区为D基因的全部或部分连续序列，barcode可以在D基因全部或部分连续序列的前面或后面，或者直接插入D基因全部或部分连续序列之中。也就是说barcode的位置可以不做限定，只要是在V区和J区之间即可；甚至，在V区或者J区比较长的时候，在不影响标记物DNA片段跟人基因组DNA一起进行免疫组库构建的情况下，barcode还可以插入到V区或者J区；当然，前提是不影响标记物DNA片段跟人基因组DNA一起进行免疫组库构建，同时，barcode也必须被扩增和测序到，如果barcode插入V区或者J区，而不能被测序获得，就没有意义了。
也就是说，M区实际上有三种情况，第一，M区为外源核苷酸片段；第二，M区为识别序列；第三，M区为识别序列加上D基因全部或部分连续序列。
如前面提到的，M区的作用是将标记物DNA片段与人基因组DNA的抗体序列区分开来，因此，在M区为外源核苷酸片段时，其自然就具备区分人基因组DNA的抗体序列的功能，而M区为D基因的全部或部分连续序列时就需要额外添加识别序列，所以M区可以由D基因的全部或部分连续序列和识别序列组成，进一步的，M区也可以仅由识别序列，而不需要D基因，所以D基因的全部或部分连续序列的长度可以为0bp。
优选的，V区的长度为10bp-400bp。
优选的，J区的长度为10bp-100bp。
优选的，DNA片段的总长度为100-500bp。
需要说明的是，标记物DNA片段的总长度是根据所采用的测序平台的测序长度而调整的，选择测序平台最适合的测序长度，使得标记物DNA片段能够最有效的被扩增。
本申请的另一面公开了本申请的标记物在淋巴细胞定量检测中的应用。
本申请的再一面公开了本申请的标记物在免疫相关疾病的致病细胞检测，或者在制备免疫相关疾病早期诊断或预后监控检测试剂盒或设备中的应用。
本申请的再一面公开了一种用于免疫相关疾病的致病细胞检测的试剂盒，其该试剂盒中含有本申请的标记物。
需要说明的是，目前通过高通量测序技术已经可以准确的获得免疫相关疾病的致病克隆在T/B淋巴细胞中的准确比例，而临床上通常是根据致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例来分析判断的。本申请的淋巴细胞定量检测方法，可以获得淋巴细胞数目，即可以定量出T/B淋巴细胞在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例，从而将致病克隆在T/B淋巴细胞中的比例，转换成致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例，与临床标准接轨。因此，本申请的标记物完全可以用于免疫相关疾病的致病细胞检测，或者用于制备免疫相关疾病早期诊断或预后监控检测试剂盒或设备。
本申请的再一面公开了一种淋巴细胞定量检测的方法，包括在免疫组库测序的过程中，将已知分子拷贝数的本申请的标记物人为掺入人基因组DNA样本中，然后对混合样本进行免疫组库建库，上机测序获得淋巴细胞的reads数，和标记物中DNA片段的reads数，即标记序列的reads数，根据公式，(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)，获得淋巴细胞的分子数，即淋巴细胞的数量。
需要说明的是，本申请的关键在于，在人基因组DNA样本中掺入已知分子拷贝数的标记物，对淋巴细胞的分子数进行标记定量，通过(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)的等比关系，计算出淋巴细胞的数量。至于，免疫组库建库可以参考现有的高通量免疫组库测序；而上机测序、标记序列的reads数和淋巴细胞的reads数的分析获得等，都可以在现有的高通量测序平台进行，在此不做具体限定。
优选的，淋巴细胞为B淋巴细胞或T淋巴细胞。
本申请的再一面公开了一种免疫相关疾病致病细胞的检测方法，包括利用本申请的淋巴细胞定量检测方法检测淋巴细胞的数量，并通过高通量测序技术检测致病克隆在淋巴细胞中的准确比例，根据淋巴细胞的数量和致病克隆在淋巴细胞中的比例，计算免疫相关疾病的致病细胞数量。
本申请中的V基因、J基因、D基因、前导区序列基因(leader sequence简称LS)具体序列参考:http://www.imgt.org/vquest/refseqh.html。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的用于淋巴细胞定量检测的标记物，在免疫组库建库的过程中添加到gDNA中，一起建库并测序，最终通过标记物定量能够获得淋巴细胞的数目。基于本申请的标记物的淋巴细胞定量检测方法，简单快速、明白直接；并且，对生物实验要求不高，依赖度也不高；借助淋巴细胞定量检测方法，可分析得出致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞的比例，使得基于高通量测序技术手段监控致病克隆比例成为现实，对免疫相关疾病早期诊断、预后监控、指导临床治疗都有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中标记物DNA片段的总体结构示意图；
图2是本申请实施例中一种结构的标记物DNA片段结构示意图；
图3是本申请实施例中另一种结构的标记物DNA片段结构示意图；
图4是本申请实施例中另一种结构的标记物DNA片段结构示意图；
图5是本申请实施例中另一种结构的标记物DNA片段结构示意图；
图6是本申请实施例中另一种结构的标记物DNA片段结构示意图；
图7是本申请实施例中另一种结构的标记物DNA片段结构示意图。
具体实施方式
本申请的标记物是特别针对T/B淋巴细胞定量检测而研究的，具体来说，是针对基于高通量测序技术的淋巴细胞定量检测方法而研究的。本申请在人免疫组库测序的研究过程中发现，免疫相关疾病的致病克隆在T/B淋巴细胞中的准确比例是可以测定的，如果可以测定T/B淋巴细胞数目，就可以得到致病克隆在在PBMC/BMMC/有核细胞中的比例，与临床应用接轨，补齐高通量测序技术检测致病克隆的“缺环”。因此，本申请特别研究了一种特殊结构的DNA片段标记物，将该已知分子数的标记物添加到人基因组DNA中，与人基因组DNA一起进行免疫组库建库和测序，最后通过标记物分子数和淋巴细胞分子数的等比公式，(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)，计算出淋巴细胞的分子数，即T/B淋巴细胞数目，其中，标记序列的reads数就是标记物的DNA片段的reads数，标记序列的分子数即已知的标记物的DNA片段的分子数或称标记物分子数。
需要说明的是，通常一个淋巴细胞只含有一种IgH分子，这里说的淋巴细胞的IgH分子数，就是淋巴细胞数目，反之亦然。分析免疫组库数据后可以得到致病克隆占淋巴细胞的精确比例，这是已存在技术；借助本申请的标记物和本申请的淋巴细胞定量检测方法，可以分析得到淋巴细胞占PBMC/BMMC/有核细胞的比例，这样就可得到致病克隆在PBMC/BMMC/有核细胞的比例，该比例可直接用于免疫性疾病的临床评价，包括早期诊断、预后监控和用药指导等。因此，本申请标记物和淋巴细胞定量检测方法，对免疫相关疾病的早期诊断、预后监控和临床治疗指导具有重要意义。
本申请中前导区基因(leader sequence，缩写LS)、V基因、D基因、J基因都是人基因组中的特定基因。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的淋巴细胞定量检测的标记物直接为DNA片段，如图1所示，DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，根据各区的不同组成，本例的标记物DNA片段总共可以有六种结构，分别如图2至图7所示。第一种，如图2所示，V区为前导区基因全部或部分连续序列、M区为外源核苷酸片段、J区为J基因的全部或部分连续序列。第二种，如图3所示，V区为V基因全部或部分连续序列、M区为外源核苷酸片段、J区为J基因的全部或部分连续序列。第三种，如图4所示，V区为前导区基因全部或部分连续序列、M区为D基因的全部或部分连续序列、J区为J基因的全部或部分连续序列，同时，在DNA片段中还具有一个识别序列barcode，图示barcode在M区，且位于D基因之后。第四种，如图5所示，V区为V基因全部或部分连续序列、M区为D基因的全部或部分连续序列、J区为J基因的全部或部分连续序列，同样的，在DNA片段中也具有一个识别序列barcode，图示barcode在M区，且位于D基因之后。第五种，如图6所述，V区为前导区基因全部或部分连续序列加上V基因全部或部分连续序列，M区为外源核苷酸片段、J区为J基因的全部或部分连续序列。第六种，如图7所述，V区为前导区基因全部或部分连续序列加上V基因全部或部分连续序列，M区为D基因的全部或部分连续序列、J区为J基因的全部或部分连续序列，同样的，在DNA片段中也具有一个识别序列barcode，图示barcode在M区，且位于D基因之后。其中，第三种、第四种和第六种结构中，D基因的长度可以为0bp，即不插入D基因，仅仅插入barcode；并且，barcode位置不限制必须在D基因后面，在D基因的前面、中间、后面均可。就像前面提到的，也可以插入到V或者J基因里面，只要在不影响扩增前提下barcode的位置在可以在任意位置。
本例中，V区的长度为10bp-100bp，M区的长度为10bp-100bp，J区的长度10bp-100bp，总的来说，DNA片段的总长度优选为100-500bp。需要说明的是，DNA片段的总长度是根据所采用的测序平台而定的，DNA片段的总长度以小于或等于测序平台的测序长度为佳。
本例的T/B淋巴细胞定量检测方法基于高通量测序技术进行，包括将已知分子拷贝数的标记物(下称Marker)人为掺入人基因组DNA样本(缩写gDNA)中，采用多重引物聚合酶链式反应扩增技术建立免疫组库，上机测序后根据标记序列、T/B细胞免疫组库序列二者的测序reads数和分子拷贝数的等比例关系，快速推导得出T/B细胞免疫组库序列分子拷贝数即T/B淋巴细胞数目，对于一些与免疫相关的疾病来说，能够通过一步测序法得到致病克隆占待检测样品的比例，对免疫相关疾病的早期诊断和预后监控，指导临床治疗都有重要意义。
本实验采用的gDNA样本为深圳儿童医院提供的白血病或者微小残留病病人外周血单个核细胞提取的基因组DNA，附带样本信息如下：这些样本名称为L、M、S和Y。它们对应的PBMC中B细胞比例分别为71％，21.2％，4.16％和31.17％。目前白血病病人的B细胞比例动态检测普遍采用的是流式细胞仪检测法等，基本原理如下，将患者PBMC和带有荧光染料的B细胞表面标志物抗体如CD19抗体或者B220抗体等孵育，之后经流式细胞仪检测，与对照组相比根据B细胞荧光信号强度得出B细胞比例。
本例的T/B淋巴细胞定量检测方法的具体实验步骤如下：
1、标记序列的制备
本例的标记物的DNA片段的制备方法不限，可以采用基因合成，也可以采用PCR获得。获得后，可以通过现有的定量方法获知拷贝数，例如可以采用安捷伦2100检测浓度后公式计算得出，也可以是QPCR测定浓度后公式计算得出，也可以是数字PCR定量。本例的标记物直接是一段DNA片段，可以理解，本例实际上需要的是这段DNA片段，其可以单独一个片段存在和使用，也可以存在于质粒等载体中。另外，需要补充说明的是，加入到人基因组DNA的标记物DNA片段拷贝数可以是任意的已知拷贝数，例如可以是1条、100条、300条等，该数值是不限的，只要方便计算即可。此外，在采用多条DNA片段混合作为混合标记物时，多条DNA片段的混合方式，或混合比例，也是可以随意混合的，本例的一种实现方式中是采用等比例混合，这也是为了方便计算。
本例的一种实现方式中，具体的是通过PCR扩增获得的标记物DNA片段的，PCR扩增产物经过磁珠回收后，送检安捷伦2100检测，获得PCR扩增回收产物的质量浓度，即标记物DNA片段的质量。其中，所扩增片段要求V基因区域和J基因区域，与gDNA的免疫组库序列类似，并且所扩增片段内部需要含有特征识别序列，在分析中能够和免疫组库序列辨别开来，达到标记序列的目的。本例具体的采用了三对引物，分别对商品化质粒pMD-18进行PCR扩增，获得三个标记物DNA片段，即本例制备了三个标记物，最终采用三个DNA片段的混合物作为混合标记物加入到gDNA中。制备三个标记物DNA片段的引物如表1所示，最终获得的三个标记物DNA片段如表2所示。PCR扩增标记物DNA片段的反应体系和反应条件按照常规PCR扩增pMD-18质粒进行，在此不做具体限定。
表1扩增三个标记序列采用的三对引物
引物编号 引物序列5’-3’ Seq ID No.
Marker1F AGAGTCACCATGACCACAGACCTGTCTATTTCGTTCATCCAT 1
Marker1R CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTCGGTATCATTGCAGCACT 2
Marker2F AGAGTCACGATTACCGCGGACTCAGCAATAAACCAGCCAGC 3
Marker2R CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTAACTGGCGAACTACTTACTCTA 4
Marker3F AGTCGAATAACCATCAACCCAGCGCTGCGCCTTATCCGGT 5
Marker3R CTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCACCACTTCAAGAACTCTGTAG 6
表1中Marker1F和Marker1R为扩增获得第一标记物的上下游引物，Marker2F和Marker2R为扩增获得第二标记物的上下游引物，Marker3F和Marker3R为扩增获得第三标记物的上下游引物。其中，表中Marker1F、Marker2F和Marker3F的5’端下划线加粗部分为V基因接头序列；Marker1R、Marker2R和Marker3R的5’端下划线加粗部分为J基因接头序列。
表2三个标记物DNA片段序列
表2中，Marker1、Marker2和Marker3的5’端下划线加粗部分为V基因接头序列；Marker1、Marker2和Marker3的3’端下划线加粗部分为J基因接头序列。
根据分子拷贝数N的计算公式，N＝(6.02×1023)×(m/DNA length×660)。其中m为标记序列的质量；DNA length为标记序列的长度即碱基数，如100bp的标记序列，则DNAlength＝100。计算出每种标记序列的分子拷贝数以后，按相等比例混合，如本例中采用三个标记物，每个标记物按照相同的拷贝分子数1.00×1010个进行混合，然后10倍倍比稀释至特定拷贝数100个，共计300个。
2、免疫组库建库
将以上300个拷贝分子数的Marker掺入患者待检测样品1μg gDNA中，二者体积之和通常不能超过18μL，混合形成PCR模板来进行BCR(IgH)免疫组库建库。其中，300个拷贝分子数的Marker中，三个标记物DNA片段各100个拷贝；gDNA为从人外周血中分离得到的PBMC中提取得到的基因组DNA。本例的BCR(IgH)免疫组库建库包括两步PCR。
第一步PCR扩增的体系如表3所示。
表3第一步PCR扩增体系
PCR反应条件：98℃1min；然后进入28个循环：98℃20s，65℃30s，72℃30s；循环结束后72℃5min。
表3中，IGHV混合引物和IGHJ引物分别是指人IgH免疫组库抗体基因V区和J区扩增引物的混合物，引物序列如表4所示。具体可参考文献Degenerate primer design toclone the human repertoire of immunoglobulin heavy chain variable regions(DOI10.1007/s11274-011-0830-3)。
表4IGHV混合引物和IGHJ引物
本例中，IGHV混合引物是指IGHV1至IGHV6六条引物的混合物，其中“CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAG”属于illumina测序平台接头的部分区域overlap重叠序列；IGHJ引物中的“CTACACGACGCTCTTCCGATCT”也属于上机接头部分区域overlap重叠序列。IGHV1中3’端下划线加粗部分为V基因互补序列接头，有该部分序列，IGHV1引物可以和人基因组中真实抗体IgHVDJ序列的V基因结合建库，也能够和带V基因接头的Marker1标记物结合建库。IGHV3中3’端下划线加粗部分也为V基因互补序列接头，有该部分序列，IGHV3引物可以和人基因组中真实抗体IgHVDJ序列的V基因结合建库，也能够和带V基因接头的Marker2标记物结合建库。IGHV6中3’端下划线加粗部分也为V基因互补序列接头，有该部分序列，IGHV6引物可以和人基因组中真实抗体IgHVDJ序列的V基因结合建库，也能够和带V基因接头的Marker3标记物结合建库。IGHJ中3’端下划线加粗部分也为J基因互补序列接头，有该部分序列，IGHJ引物可以和人基因组中真实抗体IgHVDJ序列的J基因结合建库，也能够和带J基因接头的Marker1、Marker2和Marker3标记物结合建库。IGHJ中R和K为简并碱基，R表示该碱基可以为A或G，K表示该碱基可以为G或T。
第一步PCR扩增完成后，用1.0倍XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，去除引物二聚体的影响。具体的纯化步骤如下：将第一步PCR扩增产物转移至1个1.5mL离心管中，用AMPureXP DNA Purification kit(SPRI beads)纯化扩增后的样品。
1)取出4℃保存的Ampure XP Beads，室温放置30min平衡；
2)使用前振荡均匀，按照样品体积1.0倍体积加入50μL磁珠，混匀，静置5min，瞬时离心3秒；
3)将1.5mL离心管转移放置在磁力架上，静置3-5min至澄清；
4)1.5mL离心管放在磁力架上，小心吸去上清，不要触及磁珠；
5)加入500μL 70％乙醇，轻轻吹打磁珠2-3次，等待30秒，弃上清(加入乙醇时应缓缓加入，尽量不要让液体往磁珠方向添加，否则会使磁珠脱离管体而损耗；
6)重复步骤5)，尽量去除上清；
7)置恒温混匀仪37℃干燥3-5min左右，磁珠表面没有水分即可；
8)往1.5mL离心管中加入24μL nuclease-free water，充分混匀，静置5min，然后置于磁力架约5min至澄清；
9)将23μL澄清液转移至事先准备好的新1.5mL离心管中，即获得第一步PCR扩增产物的纯化产物。
以第一步PCR扩增产物的纯化产物为模板进行第二步PCR扩增，第二步PCR扩增的体系如表5所示。
表5第二步PCR扩增体系
表5中，P1引物为引入的PCR产物一端公用的测序接头引物，index_X引物为引入的PCR产物另一端含有识别该文库信息的引物。本例的P1引为Seq ID No.17所示序列，index_X引物为Seq ID No.18所示序列物。
Seq ID No.17：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3’
Seq ID No.18：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAG ACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
Seq ID No.18所示序列中，“NNNNNN”为区别免疫组库文库用的index，本例所用到的index序列信息如下index-119：CCAGTGTG；index-120:AACCGGCC；index-122:TGCGCGCC；index-123:AGGTGGCG；index-124:GCCGCATG；index-125:CTGTTGCC；index-129:CACTCTGT；index-130:GGCTGCGT。
第二步PCR扩增产物采用切胶回收目，即获得用于测序的免疫组库测序文库。
采用illumina测序平台对第二步PCR扩增的回收产物进行上机测序。测序结果采用Imonitor软件进行生物信息学分析，具体的，将测序获得的免疫组库序列结果与国际通用的免疫组库数据库IMGT中人的胚系基因进行分析比对，IMGT的网址为http://www.imgt.org/vquest/refseqh.html。统计得出测序获得的免疫组库的CDR3序列区域丰度信息、长度分布信息、V基因使用序列条数、J基因使用序列条数、VJ基因组合使用信息，以及该免疫组库多样性信息等。以微小残留病为例，分析获得B淋巴细胞和掺入的标记序列的reads数，而标记序列的分子数是已知的，因此，根据以下等比例关系，(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(B淋巴细胞的reads数)/(B淋巴细胞的分子数)，可以得到B淋巴细胞的分子数，即B淋巴细胞数目。
本例采用L、M、S和Y四个gDNA样本进行试验，其中L样本设置三个重复平行试验，M样本设置两个重复平行试验，S样本设置两个重复平行试验，Y样本设置一个试验。本例在各个试验的gDNA中分别添加了三个标记物DNA片段，三个标记物DNA片段的添加量均为100拷贝分子数。最终测量结果如表6所示。
表6标记物reads数和B淋巴细胞分子数和比例
样品编号 Marker-1 Marker-2 Marker-3 All marker B cell reads B cell number B cell rate
L1-119 2132 7165 2731 12028 3335048 138636.8 0.762503
L2-120 3482 9540 4143 17165 3664240 106735.8 0.640415
L3-122 2242 7754 4283 14279 3280225 114861.9 0.689171
M1-123 9806 29386 5785 44977 3135918 34861.35 0.209168
M2-124 9045 22942 6873 38860 3205790 41247.94 0.247488
S2-125 23826 120825 18100 162751 2193365 6738.407 0.04043
S3-129 24600 88060 31843 144503 2058388 7122.302 0.042734
Y-130 7219 19651 6731 33601 3559000 52959.73 0.317758
表6中，样品编号L1-119、L2-120、L3-122为L样本的三个重复平行试验，M1-123、M2-124为M样本的两个重复平行试验，S2-125、S3-129为S样本的两个重复平行试验，Y-130为Y样本的试验。Marker-1、Marker-2和Marker-3是三个标记序列的reads数，All marker是每个试验中三个标记序列的reads总数。B cell reads是每个试验中B淋巴细胞的reads数，B cell number是根据等比关系计算的B淋巴细胞的分子数，B cell rate是指计算得到的B细胞在PBMC的比例。计算方法如下，每个细胞的gDNA平均含量是5.5pg，根据建库时模板用量1μg gDNA除以5.5pg得到样本提取时PBMC的总数目；B淋巴细胞数目除以PBMC的总数目得到B淋巴细胞在PBMC中的比例。
根据表6的结果可以看出，L样本三次平行重复试验的平均B细胞含量为69.73％，与该样本流式细胞法分析结果71％相当；M样本平行重复试验平均B细胞含量为22.83％，与该样本的流式细胞法分析结果21.2％相当；S样本两次平行重复试验平均B细胞含量为4.16％，与该样本的流式细胞法分析结果4.64％相当；Y样本一次试验B细胞含量为31.17％，与该样本的流式细胞法分析结果29.1％相当。综合来讲，本例的淋巴细胞定量检测方法，与流式细胞法相比误差小，可以代替流式细胞法动态监测B细胞比例变化，由此可以利用高通量测序技术手段精确监测致病克隆的变化。
需要说明的是，理论上来讲，只要有一个致病克隆都能够被测序到，而通过本例基于高通量测序技术的B淋巴细胞定量检测方法，可以推算出致病克隆占PBMC的比例，与临床其它方法所用的评价标准一致，因此，本申请的标记物及采用该标记物的淋巴细胞定量检测方法补了高通量测序技术检测致病克隆的“缺环”。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于淋巴细胞定量检测的标记物，其特征在于：所述标记物为DNA片段或者含有所述DNA片段的质粒，所述DNA片段从5’端到3’端依序包括V区、M区和J区，所述V区由前导区基因和/或V基因全部或部分连续序列组成，所述J区由J基因的全部或部分连续序列组成，所述M区包括外源核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述M区中，外源核苷酸片段为barcode；优选的，所述M区还包括D基因的全部或部分连续序列；优选的，所述D基因的全部或部分连续序列的长度为0bp-100bp。
3.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述V区的长度为10bp-400bp。
4.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于：所述J区的长度为10bp-100bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的标记物，其特征在于：所述DNA片段的总长度为100-500bp。
6.根据权利要求1-5任一项所述的标记物在淋巴细胞定量检测中的应用。
7.根据权利要求1-5任一项所述的标记物在免疫相关疾病的致病细胞检测，或者在制备免疫相关疾病早期诊断或预后监控检测试剂盒或设备中的应用。
8.一种用于免疫相关疾病的致病细胞检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-5任一项所述的标记物。
9.一种淋巴细胞定量检测的方法，其特征在于：包括在免疫组库测序的过程中，将已知分子拷贝数的权利要求1-5任一项所述的标记物人为掺入人基因组DNA样本中，然后对混合样本进行免疫组库建库，上机测序获得淋巴细胞的reads数，和标记物中DNA片段的reads数，即标记序列的reads数，根据公式，(标记序列的reads数)/(标记序列的分子数)＝(淋巴细胞的reads数)/(淋巴细胞的分子数)，获得淋巴细胞的分子数，即淋巴细胞的数量。
10.一种免疫相关疾病致病细胞的检测方法，包括利用权利要求9的方法检测淋巴细胞的数量，并通过高通量测序技术检测致病克隆在淋巴细胞中的准确比例，根据淋巴细胞的数量和致病克隆在淋巴细胞中的比例，计算免疫相关疾病的致病细胞数量。
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