CN106845155A - 一种用于检测内部串联重复的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测ITD的装置，其包括测序数据获取模块、比对模块、区分模块、模式比对模块、真实ITD判断模块、以及输出模块。本发明的用于检测ITD的装置具有检测速度快、资源要求低、稳定性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种用于检测内部串联重复的装置及方法。
背景技术
Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase3,FLT3)是III型受体酪氨酸激酶家族成员。内部串联重复(internal tandem duplication,ITD)是一类在临床上非常重要的染色体结构变异。已经证实在相当数量的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中，FLT3基因的外显子存在内部串联重复(Fms-like tyrosine kinase3-intenaltandem duplication,FLT3-ITD)。FLT3-ITD是AML的重要分子标志，精准的FLT3-ITD检测在AML的诊断及预后分层中起着重要作用。
传统上用于ITD的检测技术主要以实验室检查为诊断标准，包括从细胞形态学(Morphology，如骨髓涂片、骨髓活检，血涂片等)、免疫学(Immunology，如流式细胞仪)、细胞遗传学(Cytogenetics，如染色体核型)以及分子生物学(Molecular，如FISH、基因突变检测等)四个方面，即“MICM分型”。然而，相对较低的分辨率和通量限制了该种方法在复杂的预后分层的应用。
随着二代测序技术的发展，涌现了大量用于检测基因变异检测的算法，然而这些算法中能够用于ITD检测却不多。传统检测ITD的算法来源于INDEL(插入或缺失)的检测，如果检测的测序片段(read或reads)跨越ITD区域(存在内部串联重复并且其长度跨越了与参考基因组对应的突变区域)，传统的ITD检测可以准确检测。但是，传统算法存在五点缺陷：(1)read片段大小的限制；(2)ITD本身序列变长，导致INDEL假阳性、ITD假阴性；(3)比对信息利用太少；(4)断点附近，易错判为INDEL；(5)检测速度慢，资源要求高，需要将比对到参考基因组附近的多个read进行组装。
发明内容
本发明所要解决的技术问题
由于现有算法受到read长度的限制，比对过程需要对read组装，导致检测速度慢、资源要求高、出现假阴性检测等不足之处，同时由于组装序列均较短，对于重复序列的组装存在一定的不确定性。
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测ITD(特别是FLT3-ITD)的装置及方法，其具有检测速度快、资源要求低、稳定性高的优点。
与现有技术相比，本发明的装置及方法充分利用了PE测序下机reads的信息，由于FLT3-ITD主要发生在14号外显子区域，FLT3-ITD的长度一般在12～500bp，故而首先挑选出了14号外显子前后500bp的reads，大大减少了需要进行比对分析的reads个数及比对区域长度，提高了检测速度，减弱了资源要求，其次本发明的装置及方法减少了比对次数，只需要一次常规比对，而且不需要组装，提高了检测的稳定性。
即，本发明包括：
一种用于检测ITD的装置，其包括以下模块：
测序数据获取模块，用于获取测序数据；优选地，所述测序数据是采用双端测序(Paired-end Sequencing，PE测序)方法获得的测序数据；
比对模块：其与所述测序数据获取模块相连接，用于将获取的测序数据与参考序列进行比对，获取测序片段在基因中对应的位置；优选地，该模块可以利用bwa软件，查找测序片段在基因中对应的位置，并形成bam格式文件；优选地，该bam文件中，包括每条测序片段的描述信息(qname)，序列信息(seq)、比对位置(POS)，位标识(flag)，比对质量值(MAPQ),简要比对信息表达式(Cigar)，模板长度(Tlen)；
区分模块：其与所述比对模块相连接，用于区分可能发生ITD的测序片段和不可能发生ITD的测序片段；
模式比对模块，其与所述区分模块相连接，用于对于可能发生ITD的测序片段，根据其soft-clipping的模式，向前或向后进行比对；
真实ITD判断模块：其与所述模式比对相连接，用于判断所述可能发生ITD的测序片段是否真实发生了ITD；以及
输出模块：其与所述真实ITD判断模块相连接，用于输出ITD检测结果，所述检测结果可以包括：染色体(chr)、染色体起始位置(Start)、染色体终止位置(End)、参考基因组序列信息(Ref)、突变reads的序列信息(Alt)、功能区域(Func.refGene)、基因名(Gene.refGene)转录本号(GeneDetail.refGene)、氨基酸变异位置信息(AAChange.refGene)、碱基质量(QUAL)、插入入片段序列(INS)，插入片段长度(SVLEN)、ITD深度及支持数(DA)。
优选地，所述用于检测ITD的装置用于检测FLT3-ITD。
优选地，所述区分模块例如可以包括以下子模块：
长度过滤子模块：其与所述比对模块相连接，用于过滤soft-clipping长度小于设定值的测序片段；所述设定值可以视需要选择例如为10bp左右；
比对结果模式判断子模块：其与所述长度过滤模块相连接，用于根据所述比对模块的比对结果，对于两个片段描述信息(qname)相同的测序片段R1和R2，根据其cigar信息，分别确定该两个测序片段的比对信息，若测序片段左侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“TS”，若测序片段右侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“ST”，若测序片段无soft-clipping，则比对结果模式为“SS”，将测序片段中发生soft-clipping的部分与正常比对部分的结合处作为断点；
ITD区分子模块：其与所述比对结果模式判断模块相连接，用于根据所述测序片段R1和R2的比对结果模式信息和参考序列编号信息，判断与上述片段描述信息对应的DNA片段是否可能发生ITD；优选地，对于判断为可能发生ITD的DNA片段，从所述R1和R2分别获取所述断点上游的序列信息和所述断点下游的序列信息，并将获取的序列信息分别保存至两个文件中；优选地，所述文件可以是例如fastq文件；具体地，当所述R1和R2为下述组合时，可以判定上述片段描述信息对应的DNA片段有可能发生ITD：
若R1比对结果TS，R2比较结果模式为SS，且R1参考序列编号与read2参考序列编号相同，则该条DNA片段可能发生了ITD。
优选地，所述模式比对模块中，
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为ST，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段起始比对位置向前比对，取最大唯一比对序列，比对范围例如可以为2倍测序长度(2×PEsize)；
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为TS，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段末端比对位置向后比对，取最大唯一比对序列，比对范围例如可以为2倍测序长度(2×PEsize)。
优选地，所述真实ITD判断模块可以包括下述子模块：
断点信息获取子模块：其与所述区分模块相连接，用于将具体soft-clipping的测序片段根据断点分为左右两侧，获取ITD断点信息，所述ITD断点信息包括：
left_pos：断点左侧位置
left_seq：断点左侧碱基序列，
right_pos：断点右侧位置对应的比对位置，
right_seq：断点右侧碱基序列，以及
sup：断点支持度，支持该断点的reads个数，默认为1；
断点筛选子模块：其与所述断点信息获取子模块相连接，用于筛选真实ITD断点；
断点初次合并子模块：其与所述断点筛选子模块相连接，用于将具有相同的断点信息的断点合并为一个断点，并将具有相同断点信息的断点个数作为新合成的断点的支持度；其中，相同的断点信息是指left_chr、left_pos、right_chr和right_pos均相同；以及
断点再次合并子模块：其与所述断点初次合并子模块相连接，将left_chr和right_chr相同、但right_pos或left_pos相差一定值以内的真实ITD断点合并为一个ITD断点。
优选地，所述断点筛选子模块按如下规则筛选真实ITD断点：
a.若存在断点A和B，A中left_pos等于B中left_pos，A中right_pos等于B中right_pos，则只要存在此类断点A和B，将该断点A和B判断为真实ITD断点。
b.若存在断点A，A中sup个数大于一定值(例如5)，且断点支持度/断点右侧或左侧位置深度所得的值大于一定值(例如0.1)，且该断点支持度与soft-cliping reads支持参考基因组深度和健康人在该位点的测序深度做fisher精确检验，差异显著(例如p<0.05)，且因模式增长算法是无错匹配保证了比对质量，则确定该断点为ITD阳性断点(即真实ITD断点)；以及
c.模式ST发生soft-clipping的测序片段的序列位置与断点位置长度为ITD的长度，right_pos与断点之间的序列信息即为ITD的序列信息。
优选地，所述断点再次合并子模块根据以上断点信息，若存在断点A中left_pos与断点B中right_pos距离的绝对值小于ITD长度，且断点A确定的内部串联重复序列信息和断点B确定的内部串联重复序列信息一致，则将此断点A和断点B合并为同一个ITD断点。最终得到ITD检测结果。
在另一个方面中，本发明还提供一种检测ITD的方法，其包括以下步骤：
一种用于检测ITD的方法，其包括以下步骤：
测序数据获取步骤，获取测序数据；优选地，所述测序数据是采用双端测序(Paired-end Sequencing，PE测序)方法获得的测序数据；
比对步骤：将获取的测序数据与参考序列进行比对，获取测序片段在基因中对应的位置；优选地，该步骤可以利用bwa软件，查找测序片段在基因中对应的位置，并形成bam格式文件；优选地，该bam文件中，包括每条测序片段的描述信息(qname)，序列信息(seq)、比对位置(POS),位标识(flag),比对质量值(MAPQ),简要比对表达信息(Cigar)，模板长度(Tlen)；
区分步骤：区分可能发生ITD的测序片段和不可能发生ITD的测序片段；
模式比对步骤，对于可能发生ITD的测序片段，根据其soft-clipping的模式，向前或向后进行比对；
真实ITD判断步骤：判断所述可能发生ITD的测序片段是否真实发生了ITD；以及
输出步骤：输出ITD检测结果，所述检测结果可以包括：染色体(chr)、染色体起始位置(Start)、染色体终止位置(End)、参考基因组序列信息(Ref)、突变reads的序列信息(Alt)、功能区域(Func.refGene)、基因名(Gene.refGene)转录本号(GeneDetail.refGene)、氨基酸变异位置信息(AAChange.refGene)、碱基质量(QUAL)、插入入片段序列(INS)，插入片段长度(SVLEN)、ITD深度及支持数(DA)。
优选地，所述用于检测ITD的方法用于检测FLT3-ITD。
优选地，所述区分步骤例如可以包括以下子步骤：
长度过滤子步骤：过滤soft-clipping(soft-clipping)长度小于设定值的测序片段；所述设定值可以视需要选择例如为10bp左右；
比对结果模式判断子步骤：根据所述比对步骤的比对结果，对于两个片段描述信息(qname)相同的测序片段R1和R2，根据其cigar信息，分别确定该两个测序片段的比对信息，若测序片段左侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“TS”，若测序片段右侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“ST”，若测序片段无soft-clipping，则比对结果模式为“SS”，将测序片段中发生soft-clipping的部分与正常比对部分的结合处作为断点；
ITD区分子步骤：根据所述测序片段R1和R2的比对结果模式信息和参考序列编号信息，判断与上述片段描述信息对应的DNA片段是否可能发生ITD；优选地，对于判断为可能发生ITD的DNA片段，从所述R1和R2分别获取所述断点上游的序列信息和所述断点下游的序列信息，并将获取的序列信息分别保存至两个文件中；优选地，所述文件可以是例如fastq文件；具体地，当所述R1和R2为下述组合时，可以判定上述片段描述信息对应的DNA片段有可能发生ITD：
若R1比对结果TS，R2比较结果模式为SS，且R1参考序列编号与read2参考序列编号相同，则该条DNA片段可能发生了ITD。
优选地，所述模式比对步骤中，
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为ST，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段起始比对位置向前比对，取最大唯一比对序列，比对范围例如可以为2倍测序长度(2×PEsize)；
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为TS，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段末端比对位置向后比对，取最大唯一比对序列，比对范围例如可以为2倍测序长度(2×PEsize)。
优选地，所述真实ITD判断步骤可以包括下述子步骤：
断点信息获取子步骤：将具有soft-clipping的测序片段根据断点分为左右两侧，获取ITD断点信息，所述ITD断点信息包括：
left_pos:断点左侧位置，soft-clipping reads左侧比对位置加上它所比对的序列长度，
left_seq：断点左侧碱基序列，
right_pos：断点右侧位置对应的比对位置，
right_seq：断点右侧碱基序列，以及
sup：断点支持度，支持该断点的reads个数，默认为1；
断点筛选子步骤：筛选真实ITD断点；
断点初次合并子步骤：将具有相同的断点信息的断点合并为一个断点，并将具有相同断点信息的断点个数作为新合成的断点的支持度；其中，相同的断点信息是指left_chr、left_pos、right_chr和right_pos均相同；以及
断点再次合并子步骤：将left_chr和right_chr相同、但right_pos或left_pos相差一定值以内的真实ITD断点合并为一个ITD断点。
优选地，所述断点筛选子步骤按如下规则筛选真实ITD断点：
a.若存在断点A和B，A中left_pos等于B中left_pos，A中right_pos等于B中right_pos，则只要存在此类断点A和B，将该断点A和B判断为真实ITD断点。
b.若存在断点A，A中sup个数大于一定值(例如5)，且断点支持度/断点右侧或左侧位置深度所得的值大于一定值(例如0.1)，且该断点支持度与soft-cliping reads支持参考基因组深度和健康人在该位点的测序深度做fisher精确检验，差异显著(例如p<0.05)，且因模式增长算法是无错匹配保证了比对质量，则确定该断点为ITD阳性断点(即真实ITD断点)；以及
c.模式ST发生soft-clipping的测序片段的序列位置与断点位置长度为ITD的长度，right_pos与断点之间的序列信息即为ITD的序列信息。
优选地，所述断点再次合并子步骤根据以上断点信息，若存在断点A中left_pos与断点B中right_pos距离的绝对值小于ITD长度，且断点A确定的内部串联重复序列信息和断点B确定的内部串联重复序列信息一致，则将此断点A和断点B合并为同一个ITD断点。最终得到ITD检测结果。
根据本发明，能够提供一种检测速度快、资源要求低、稳定性高的用于检测ITD的装置及方法。
附图说明
图1是本发明的用于检测ITD的装置的优选实施方式的一例的示意图。
图2现有技术的用于检测ITD的装置的一例的示意图。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
参考序列(Refseq)：物种参考标准基因组序列。
内部串联重复(Internal Tandem Duplication/ITD)：序列以各自的核心序列(重复单元)首尾相连多次重复。
Reads(测序片段):基因组或转录组序列片段。
PE测序：双端测序，一种测序方法，本装置采用PEsize＝75bp。
read1/2：PE测序下机数据中，read1是第一轮测试得到的碱基序列，read2是第二轮测试得到的碱基序列。
bwa：一种比对方法软件，用于查找reads所在Refseq中的位置,最终可得到bam格式文件。
adapter序列：测序中DNA片段两侧的接头序列。
soft-clipping reads：软剪切片段，在reads进行比对后，若存在部分序列比对到Refseq某位置，另一部分比对到Refseq另一位置或不能比对到Refseq，则该reads被称为soft-clipping reads。
断点(breakpoint)：soft-clipping reads比对到参考基因组和未比到参考基因组的基因序列相互连接的点。
flag：bam格式文件中，用于描述序列比对模式、方向等信息的一个值。
cigar：简要比对信息表达式，其以参考序列为基础，使用数据加字母表示比对结果。
unmapped reads：指reads未比对到Refseq中某一位置。
duplication：重复序列，指由PCR扩增的序列。
qname：比对片段的(template)的编号。
错配率:在比对过程中，可以容许reads与Refseq存在一定的差异，差异值与reads长度之比为错配率。
比对质量值：表示比对到错误位置的可能性，值越高表示可能性越低。
实施例
以下给出实施例，对本发明进行更具体的说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1本发明的用于检测ITD的装置
实施例1的用于检测ITD的装置具备：
测序数据获取模块，用于获取测序数据；所述测序数据是采用双端测序(Paired-end Sequencing，PE测序)方法获得的测序数据；
比对模块：其与所述测序数据获取模块相连接，用于将获取的测序数据与参考序列进行比对，获取测序片段在基因中对应的位置；该模块利用bwa软件，查找测序片段在基因中对应的位置，并形成bam格式文件；用bedtools提取exon14上下游500bp的reads信息，生成后续分析的bam文件；该bam文件中，包括每条测序片段的描述信息(qname)，序列信息(seq)、比对位置(POS)、位标识(flag)、比对质量值(MAPQ)、简要比对表达信息(Cigar)，模板长度(Tlen)；
区分模块：其与所述比对模块相连接，用于区分可能发生ITD的测序片段和不可能发生ITD的测序片段；
模式比对模块，其与所述区分模块相连接，用于对于可能发生ITD的测序片段，根据其soft-clipping的模式，向前或向后进行比对；
真实ITD判断模块：其与所述模式比对相连接，用于判断所述可能发生ITD的测序片段是否真实发生了ITD；以及
输出模块：其与所述真实ITD判断模块相连接，用于输出ITD检测结果，所述检测结果可以包括：染色体(chr)、染色体起始位置(Start)、染色体终止位置(End)、参考基因组序列信息(Ref)、突变reads的序列信息(Alt)、功能区域(Func.refGene)、基因名(Gene.refGene)转录本号(GeneDetail.refGene)、氨基酸变异位置信息(AAChange.refGene)、碱基质量(QUAL)、插入入片段序列(INS)，插入片段长度(SVLEN)、ITD深度及支持数(DA)(例如DA＝1667,150:1667表示该位置的总深度，150表示支持ITD的reads数目)。
该用于检测ITD的装置可用于检测FLT3-ITD。
所述区分模块包括以下子模块：
长度过滤子模块：其与所述比对模块相连接，用于过滤soft-clipping(软剪切)长度小于10bp的测序片段；
比对结果模式判断子模块：其与所述长度过滤模块相连接，用于根据所述比对模块的比对结果，对于两个片段描述信息(qname)相同的测序片段R1和R2，根据其cigar信息，分别确定该两个测序片段的比对信息，若测序片段左侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“TS”，若测序片段右侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“ST”，若测序片段无soft-clipping，则比对结果模式为“SS”，将测序片段中发生soft-clipping的部分与正常比对部分的结合处作为断点；
ITD区分子模块：其与所述比对结果模式判断模块相连接，用于根据所述测序片段R1和R2的比对结果模式信息和参考序列编号信息，判断与上述片段描述信息对应的DNA片段是否可能发生ITD；对于判断为可能发生ITD的DNA片段，从所述R1和R2分别获取所述断点上游的序列信息和所述断点下游的序列信息，并将获取的序列信息分别保存至两个文件中；所述文件可以是例如fastq文件；具体地，当所述R1和R2为下述组合时，可以判定上述片段描述信息对应的DNA片段有可能发生ITD：
若R1比对结果TS，R2比较结果模式为SS，且R1参考序列编号与read2参考序列编号相同，则该条DNA片段可能发生了ITD。
所述模式比对模块完成下述操作：
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为ST，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段起始比对位置向前比对，取最大唯一比对序列，比对范围为2倍测序长度(2×PEsize)；以及
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为TS，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段末端比对位置向后比对，取最大唯一比对序列，比对范围为2倍测序长度(2×PEsize)。
所述真实ITD判断模块可以包括下述子模块：
断点信息获取子模块：其与所述区分模块相连接，用于将具有soft-clipping的测序片段根据断点分为左右两侧，获取ITD断点信息，所述ITD断点信息包括：
left_pos：断点左侧位置，soft-clipping reads左侧比对位置加上它所比对的序列长度，
left_seq：断点左侧碱基序列，
right_pos：断点右侧位置对应的比对位置，
right_seq：断点右侧碱基序列，以及
sup：断点支持度，支持该断点的reads个数，默认为1；
断点筛选子模块：其与所述断点信息获取子模块相连接，用于筛选真实ITD断点；
断点初次合并子模块：其与所述断点筛选子模块相连接，用于将具有相同的断点信息的断点合并为一个断点，并将具有相同断点信息的断点个数作为新合成的断点的支持度；其中，相同的断点信息是指left_chr、left_pos、right_chr和right_pos均相同；以及
断点再次合并子模块：其与所述断点初次合并子模块相连接，将left_chr和right_chr相同、但right_pos或left_pos相差一定值(例如小于插入片段长度(SVLEN))以内且断点A确定的内部串联重复序列信息与断点B确定的内部串联重复序列信息一致的真实ITD断点合并为同一个ITD断点。
所述断点筛选子模块按如下规则筛选真实ITD断点：
a.若存在断点A和B，A中left_pos等于B中left_pos，A中right_pos等于B中right_pos，则只要存在此类断点A和B，将该断点A和B判断为真实ITD断点。
b.若存在断点A，A中sup个数大于5，且断点支持度/断点右侧或左侧位置深度所得的值大于0.1，且该断点支持度与soft-cliping reads支持参考基因组深度和健康人在该位点的测序深度做fisher精确检验，差异显著(p<0.05)，且因模式增长算法是无错匹配保证了比对质量，则确定该断点为ITD阳性断点(真实ITD断点)；以及
c.模式ST发生soft-clipping的测序片段的序列位置与断点位置长度为ITD的长度，right_pos与断点之间的序列信息即为ITD的序列信息。
所述断点再次合并子模块根据以上断点信息，若存在断点A中left_pos与断点B中right_pos距离的绝对值小于ITD长度，且断点A确定的内部串联重复序列信息和断点B确定的内部串联重复序列信息一致，则将此断点A和断点B合并为同一个ITD断点。最终得到ITD检测结果。所述输出模块输出ITD检测结果。
实施例2
对一例急性髓细胞白血病(AML)患者的骨髓样本进行ITD检测
1.1血液样本DNA提取
使用过膜法提取骨髓样本基因组DNA，具体步骤参照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒操作手册。
1.2末端修复(End Repair)
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，单个样本配制量参见表1。
表1
(2)末端修复反应：加入DNA样本后将1.5mL离心管置于Thermomixer中20℃温浴30分钟。反应结束后使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于32μLEB。
1.3末端加“A”(A-Tailing)
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，单个样本配制量参见表2：
表2
(2)末端加“A”反应：加入32μL上一步纯化回收的DNA后将1.5mL离心管置于Thermomixer中37℃温浴30分钟。使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于18μL EB中。
1.4接头的连接(Adapter Ligation)
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，单个样本配制量参见表3：
表3
(2)接头的连接反应：加入18μL上一步纯化回收的DNA后将样本管置于Thermomixer中20℃温浴15分钟。使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于30μL的EB中。
1.5 PCR反应
(1)从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，2mL的PCR管中配制PCR反应体系：
表4
(2)设定PCR程序，PCR反应的程序设定如下：
反应结束及时将样品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出或关闭仪器。
(3)用0.9×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，纯化后的文库溶于20μL的ddH2O中。对文库进行Qubit检测，将文库送检安捷伦2100。
1.6血液病目标区域捕获芯片文库杂交
(1)本实验中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液、以及用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液、漂洗液均可从商业途径获得。
(2)准备杂交文库：将待杂交的DNA文库在冰上融化，取总质量1μg(在后续操作步骤中将此DNA文库称为样本文库)。
(3)制备Ann引物Pool：将样本文库Index对应的标签引物In1(100μM)及公共引物(1000μM)各取1000pmol混合，(在后续操作步骤中将此混合物称为Ann引物pool)。
(4)杂交样本的制备：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Lifetechnologies，1mg/mL)、1μg样本文库、Ann引物pool。用封口膜密封制备好的杂交样本EP管，将盛有样本文库pool/COT DNA/Ann引物pool的EP管置于真空装置中直到完全干燥。
(5)杂交样本的溶液：向样本文库pool/COT DNA/Ann引物pool的干粉中加入：
7.5μL 2×杂交缓冲液
3μL杂交组分A
(6)充分混匀后将上述混合物置于预先准备好的95℃加热模块上变性10分钟。
(7)将上述混合物转移至含有4.5μL捕获芯片的0.2mL平盖PCR管中。充分涡旋震荡3秒，将杂交样品混合物置于47℃加热模块上16小时。加热模块的热盖温度需设定为57℃，杂交后产物需进行后续洗脱回收操作。
(8)将10×清洗液(Ⅰ，Ⅱ与Ⅲ)、10×漂洗液和2.5×磁珠清洗液配置成1×工作液。
表5
(9)将下列试剂在47℃加热模块中预热：
400μL 1×漂洗液
100μL 1×清洗液I
1.7制备亲和吸附磁珠
(1)将链霉亲和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，以下简称磁珠)在室温下平衡30分钟后，将磁珠充分涡旋混匀15秒。
(2)向1.5mL离心管中分装100μL磁珠，将盛有100μL磁珠的离心管置于磁力架上，约5分钟后小心吸弃上清，加两倍于磁珠初始体积的1×磁珠清洗液，涡旋混匀10秒。将盛有磁珠的离心管放回磁力架，吸附磁珠。待溶液澄清，吸弃上清。重复次步骤，共洗涤两次。
(3)洗涤完毕后吸弃磁珠清洗液，用磁珠初始体积的1×磁珠清洗液涡旋重悬磁珠转入0.2mL的PCR管中。将PCR管置于磁力架上吸附磁珠澄清后吸弃上清。
1.8 DNA与亲和吸附磁珠的结合及漂洗
(1)将杂交的样本文库转入盛有亲和吸附磁珠的0.2mL PCR管中，涡旋振荡混匀。
(2)将0.2mL PCR管置于47℃加热模块45分钟，每隔15分钟涡旋混匀一次，使DNA与磁珠结合。
(3)45分钟孵育后，向15μL捕获的DNA样本中加入47℃预热的1×清洗液I 100μL。涡旋混匀10秒。将0.2mL PCR管中的全部组分转入1.5mL离心管中。将1.5mL离心管置于磁力架上吸附磁珠，弃上清。
(4)将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入200μL预热47℃的1×漂洗液。吸打混匀10次(需迅速操作，防止试剂、样品温度低于47℃)。混匀后样本置于47℃加热模块上5分钟。重复此步骤，用47℃的1×漂洗液共洗涤两次。将1.5mL的离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。
(5)向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液I，涡旋混匀2分钟。将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液Ⅱ，涡旋混匀1分钟。将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液Ⅲ，涡旋混匀30秒。将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。
(6)1.5mL离心管从磁力架上取下，加入45μL PCR水，溶解洗脱磁珠捕获样本。
1.9捕获DNA的PCR扩增
(1)按下表制备捕获后PCR mix，制备好后涡旋震荡混匀。富集引物F和富集引物R均购自英潍捷基公司。
(2)磁珠吸附DNA PCR的扩增程序设定如下：
(3)杂交捕获DNA PCR产物的回收纯化：用核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，磁珠使用量为0.9×，纯化后的文库溶于30μL的ddH2O中。
1.10文库定量
对文库进行2100Bio Analyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR检测，记录文库浓度。
1.11文库上机测序
构建好的文库采用Nextseq 550AR进行测序(PE75)。
1.12数据处理及分析
将获得的测序数据输入实施例1的装置，检测ITD。检测结果如下表所示。
检测结果表明样本的FLT3存在ITD：在13号染色体编码区第1802位置上DNA发生突变，在编码区第1802～1803之间插入了长度为57bp(AGATCATATTCATATTCTCTGAAATCAACGTAGAAGTACTCATTATCTGAGGA)的片段。导致FLT3编码蛋白第601位亮氨酸(L)缺失，在该位置插入19个氨基酸(LGSSDNEYFYVDFREYEYDL)。
1.13结果验证
采用毛细管电泳方法对同一患者骨髓样本是否发生上述突变进行验证，检测结果表明，该样本存在FLT3-ITD情况，验证结果与1.12检测结果一致。本发明的检测装置能够成功检出骨髓样本中血液病相关的体细胞突变。
比较例1现有技术用于检测ITD的装置
比较例1的用于检测ITD的装置不具有用于区分可能发生ITD的测序片段和不可能发生ITD的测序片段的模块，且需要对序列进行组装。
对于一个ITD阳性样本，利用PE测序方法，获取同一批下机数据，同时采用实施例1和比较例1的装置检测ITD，检测结果如表1所示。
表1
| 检出个数 | 阳性位点个数 | 阳性率 | |
| 比较例1的装置 | 8 | 8 | 4.14±8.16％ |
| 实施例1的装置 | 1 | 1 | 41.15％ |
比较例1检出ITD位点数8个，实际上发生变异的位置相距在SVLEN内，且插入片段reads数均相同，本装置将这样的reads合并为同一位置的ITD变异，同时用fisher精确检验(P<0.05)，确定此位点为阳性ITD位点。
工业实用性
根据本发明，提供了一种检测速度快、资源要求低、稳定性高的用于检测血液病ITD的装置及方法。
Claims (7)
1.一种用于检测ITD的装置，其包括以下模块：
测序数据获取模块，用于获取测序数据；
比对模块：其与所述测序数据获取模块相连接，用于将获取的测序数据与参考序列进行比对，获取测序片段在基因中对应的位置；
区分模块：其与所述比对模块相连接，用于区分可能发生ITD的测序片段和不可能发生ITD的测序片段；
模式比对模块，其与所述区分模块相连接，用于对于可能发生ITD的测序片段，根据其soft-clipping的模式，向前或向后进行比对；
真实ITD判断模块：其与所述模式比对相连接，用于判断所述可能发生ITD的测序片段是否真实发生了ITD；以及
输出模块：其与所述真实ITD判断模块相连接，用于输出ITD检测结果。
2.根据权利要求1所述的装置，其用于检测FLT3-ITD。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述区分模块包括以下子模块：
长度过滤子模块：其与所述比对模块相连接，用于过滤soft-clipping长度小于设定值的测序片段；
比对结果模式判断子模块：其与所述长度过滤模块相连接，用于根据所述比对模块的比对结果，对于两个片段描述信息相同的测序片段R1和R2，根据其cigar信息，分别确定该两个测序片段的比对信息，若测序片段左侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“TS”，若测序片段右侧发生soft-clipping，则比对结果模式为“ST”，若测序片段无soft-clipping，则比对结果模式为“SS”，将测序片段中发生soft-clipping的部分与正常比对部分的结合处作为断点；
ITD区分子模块：其与所述比对结果模式判断模块相连接，用于根据所述测序片段R1和R2的比对结果模式信息和参考序列编号信息，判断与上述片段描述信息对应的DNA片段是否可能发生ITD。
4.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述模式比对模块执行下述操作：
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为ST，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段起始比对位置向前比对，取最大唯一比对序列；
如果可能发生ITD的测序片段的soft-clipping模式为TS，则利用模式增长算法将T作为模式，从该测序片段末端比对位置向后比对，取最大唯一比对序列。
5.根据权利要求1或2所述的装置，其中，所述真实ITD判断模块包括下述子模块：
断点信息获取子模块：其与所述区分模块相连接，用于将具有soft-clipping的测序片段根据断点分为左右两侧，获取ITD断点信息，所述ITD断点信息包括：
left_pos：断点左侧位置，
left_seq：断点左侧碱基序列，
right_pos：断点右侧位置对应的比对位置，
right_seq：断点右侧碱基序列，以及
sup：断点支持度，支持该断点的reads个数，默认为1；
断点筛选子模块：其与所述断点信息获取子模块相连接，用于筛选真实ITD断点；
断点初次合并子模块：其与所述断点筛选子模块相连接，用于将具有相同的断点信息的断点合并为一个断点，并将具有相同断点信息的断点个数作为新合成的断点的支持度；其中，相同的断点信息是指left_chr、left_pos、right_chr和right_pos均相同；以及
断点再次合并子模块：其与所述断点初次合并子模块相连接，将left_chr和right_chr相同、但right_pos或left_pos相差一定值以内的真实ITD断点合并为一个ITD断点。
6.根据权利要求5所述的装置，其中，所述断点筛选子模块按如下规则筛选真实ITD断点：
a.若存在断点A和B，A中left_pos等于B中left_pos，A中right_pos等于B中right_pos，则只要存在此类断点A和B，将该断点A和B判断为真实ITD断点；以及
b.若存在断点A，A中sup个数大于一定值，且断点支持度/断点右侧或左侧位置深度所得的值大于一定值，且该断点支持度与soft-cliping reads支持参考基因组深度和健康人在该位点的测序深度做fisher精确检验，差异显著，且因模式增长算法是无错匹配保证了比对质量，则确定该断点为ITD阳性断点；以及
c.模式ST发生soft-clipping的测序片段的序列位置与断点位置长度为ITD的长度，right_pos与断点之间的序列信息即为ITD的序列信息。
7.根据权利要求5所述的装置，其中，所述断点再次合并子模块根据断点信息，若存在断点A中left_pos与断点B中right_pos距离的绝对值小于ITD长度，且断点A确定的内部串联重复序列信息和断点B确定的内部串联重复序列信息一致，则将此断点A和断点B合并为同一个ITD断点，最终得到ITD检测结果。
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