CN109337966A - 一种分子标签及其试剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种分子标签，其全长序列为5'‑NNNNNNNNNTGACT‑3'，是由9个随机碱基N组成的标签编码部分和5个碱基组成的起界限作用的固定序列两部分组成，该全长序列的两侧为黏性末端，3'端有由固定序列突出的胸腺T碱基，5'端含有一个磷酸化基团。本发明的分子标签只具有标签功能，能够兼容所有的二代测序技术和已有测序平台；该分子标签没有索引，制备方便，成本低，只需合成随机碱基功能模块；该分子标签在使用时无需改动任何原高通量测序实验流程，不会和原有高通量测序索引冲突；应用本发明的分子标签的样本可以和普通样本混合测序而互不影响。本发明还公开了含有该分子标签的试剂、该分子标签的使用方法及数据分析方法。

Description

一种分子标签及其试剂和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兼容所有二代测序等高通量测序技术的分子标签的试剂及其应用方法。

背景技术

二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术在基因检测中得到广泛运用，是精准医疗时代的主流技术。高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)，是相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)而言的。NGS 技术通量高、价格低，对百分之一频率以上基因变异的检测非常精准。但是，NGS技术对于超低频变异检测的效果不佳，究其原因在于NGS技术本身会引入一些错误(背景噪音)，这些错误发生的频率等于甚至大于微量基因变异的超低频率，我们无法分区出真实的基因变异。

液体活检技术是目前精准医疗领域热门之一；相比传统的组织活检，液体活检具有微创、易重复、时效性高的特点。液体活检应用前景广阔，包括个体化用药、肿瘤检测、疾病分型、早期筛查等。液体活检的检测对象包括三类：循环肿瘤细胞(CTC)、外泌体(Exosome) 和循环肿瘤DNA(ctDNA)。其中，循环肿瘤细胞难获取，外泌体成分不易分离。ctDNA是目前最易获取且成分单一的活检对象。生物体细胞凋亡后，裂解的DNA进入血液中形成细胞循环DNA(cfDNA)；肿瘤细胞凋亡裂解进入到血液的DNA形成就是循环肿瘤DNA(ctDNA)。细胞循环DNA中，ctDNA含量极低，百分之一、千分之一甚至更低。ctDNA的频率已经达到乃至低于NGS背景噪音水平，常规的测序操作无法满足ctDNA变异检测的需求。虽然，通过增大测序深度可以在一定程度上提高ctDNA的检测准确性，但更深测序意味着更高的测序成本，而且也无法消除PCR过程产生的扩增错误。

为了克服NGS的背景噪音，诞生了分子标签技术(一组随机碱基)。分析NGS技术过程，我们发现噪音主要来自扩增和测序；如果我们给所有原始ctDNA引入一个唯一编码标签(Barcode)，通过Barcode来区分哪些是PCR扩增引入的分子序列，哪些是样本中原始的分子序列，这样就可以还原真实变异。分子标签技术的要点是为每一条原始DNA分子添加唯一编码(Barcode)，待测序完成后，结果数据中相同编码的片段表示来源于同一条原始DNA分子，这些片段分为一组，只有那些组内共享的变异才是真实的变异。

目前实现分子标签技术的方案主要有两类。

第一类主要是针对life公司的测序仪。它是将分子标签连接到扩增引物上，通过扩增将标签添加到目的片段中。这种方法适用于采用多重扩增技术富集目的产物的方法，不兼容捕获富集方案。此外，引入标签的扩增过程本身也会引入错误。

第二类主要针对的是illumina公司测序仪。它是对二代测序接头进行改造，目前常见有两种思路，一种是替换索引序列，另一种是接在测序引物之后。

NSG测序仪在接头位置设计有索引，以实现多样本混合测序(以索引的种类区分样本)。根据索引位置数目，分为单索引测序和双索引测序。替换索引的方法，就是将双索引接头中，一个索引的位置替换为分子标签(一组随机碱基)，测序依然按照双索引测序。测序结果中的两个索引序列，一个是真索引(用于区分样本)，一个随机碱基(分子标签)。显而易见，这个方法，只能采用双索引测序，而事实上并非所有NSG测序仪都支持双索引测序(illumina 公司目前测序效能最高的型号X10测序仪就不支持双索引测序)，而且实际使用中，单索引测序的容量已经足够，双索引测序使用的情况非常少。

第二种是接在测序引物之后，最典型的就是双重分子标签测序(DuplexSequence)技术 (Nature protocols,2014,9(11):2586-2606.)。双重分子标签测序方法如下：(1)分别合成接头的两条单链，一条为标准接头序列(单索引接头中，不带索引序列的那条单链；双索引接头中，第二索引所在的单链)；一条在标准接头序列的5'端新加一段固定序列(充当酶切位点)和随机序列(分子标签)；(2)退火，接头的两条单链合并成Y型；(3)使用聚合酶，补平新加序列为双链；(4)使用内切酶，切出黏性末端(突出碱基为T碱基)；(5)用新合成的接头代替标准接头进行建库测序。上述两种方法都可以实现分子标签的应用。之后，又出现将两种方法同时应用的iDES方法(Nature biotechnology,2016,34(5):547-555.)，进一步提升了分子标签降噪的水平。

以上的方法可以实现分子标签的应用，但存在一个共同的缺陷，没有将分子标签模块化，缺少兼容目前已有的技术环境的考虑。扩增法不能兼容捕获测序平台，且扩增法自身引入的错误无法排除；索引替换法要求测序平台必须支持双索引测序，且现实中多个样本混测很少需要双索引；双重分子标签测序法需要针对每个测序平台定制全套索引接头，兼容性也不高，且实际测序中常规测序样本和超低频变异样本都有(同一个索引序列有两套接头)，新接头和正常建库接头极易混淆。此外，目前分子标签产品大都没有配套的数据分析方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种分子标签，其只具有标签功能，能够兼容所有的二代测序技术和已有测序平台，将该分子标签添加到目的DNA片段两侧可以区分原始分子序列和扩增引入分子序列，区分真正的变异与实验错误，提高测序准确性。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种兼容所有高通量测序方法及测序平台的分子标签，其全长序列为5'-NNNNNNNNNTGACT-3'，是由9个随机碱基N组成的标签编码部分和 5个碱基组成的起界限作用的固定序列两部分组成，该全长序列的两侧为黏性末端，3'端有由固定序列突出的胸腺T碱基，5'端含有一个磷酸化基团。其中，随机碱基N选自A、T、C、G。

本发明的分子标签的具体结构如图1所示。

本发明的分子标签只包含标签功能，通过黏性末端高效连接到样品DNA的两侧，发挥分子标签的功能，而不影响原有高通量测序体系，适用于所有已有的高通量测序实验体系。

本发明还提供一种分子标签试剂，包括本发明的分子标签和溶剂，其中分子标签浓度为 50μM，溶剂优选为双蒸馏水。

本发明还提供所述分子标签及分子标签试剂用于DNA高通量测序的应用。

具体的，所述应用包括步骤1～步骤3：

步骤1.将分子标签连接到样品DNA两端；具体方法如下：

1.1准备样品DNA；如果样品DNA过长，需要将DNA片段化，一般用超声打断，如果样品DNA是ctDNA，无须再超声打断；

1.2将样品DNA进行末端修复补平；

1.3将样品DNA进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化，使3'端突出一个腺嘌呤A碱基；

1.4使用磁珠法对步骤1.3的产物进行纯化，只保留样品DNA，可防止残留的磷酸基团使分子标签产生平末端自连现象；

1.5使用T4连接酶将本发明的分子标签连接到步骤1.4处理完成的样本DNA两端，所形成的新片段的两端为分子标签(通常随机碱基序列不一致)，中间为原始样品DNA；

步骤2.完成高通量测序建库操作；具体方法如下：

2.1使用磁珠法纯化步骤1.5中的产物；

2.2将纯化后的产物进行标准的高通量测序(兼容所有二代或者新的高通量测序体系)建库操作；

步骤3.连接测序接头、扩增、进行DNA高通量测序；具体方法如下：

3.1步骤2.2的产物进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化；

3.2使用T4连接酶连接测序接头到步骤3.1产物的两端；

3.3使用接头引物对连接产物进行聚合酶链式反应，获取扩增产物；

3.4将扩增产物进行DNA高通量测序。推荐双端测序以保证标签降噪高效。

具体的，所述应用包括步骤4：高通量测序之后的数据分析

4.1将原始数据(FASTQ格式)进行过滤质控；

4.2提取分子标签序列并通过检测标签数据有效性进一步过滤质量不高的测序数据；

4.3将新的测序结果数据进行基因组比对；

4.4根据标签编码将基因组定位相同的比对结果序列(SAM格式)进行分组；

4.5以组为单位，检查比对结果序列，仅将组内共享的变异保留下来；

4.6对校验后的结果序列进行变异分析；

4.7对变异结果进一步解读分析。

具体的，步骤4.2中提取标签的方法是：

1.只保留固定序列的位置和碱基组成都正确的reads；

2.截取固定系列及之前的随机标签序列；

3.将随机标签序列加到fastq格式的信息行(第一行)中；

4.将新的fastq信息行、截短的reads组成新的fastq文件；

5.成对reads都必须通过检验，否则都去除。

具体的，步骤4.4中分组时，将Bracode信息相当reads的比对结果分为一组。

具体的，步骤4.5中，以组为单位扫描序列，只保留共享变异，其余全部改为参考序列

碱基；合并同组reads为一条，并在描述信息列新添原组统计信息。

与现有技术相比，本发明提高的分子标签及其应用具有以下有益效果：

1.本发明的分子标签作为一个独立模块仅具有标签功能，能独立使用，其序列中不含有接头、引物以及索引序列等，而现有技术中的分子标签的序列中既包括标签功能片段，还包含接头、引物或索引中的一种或多种，其除了标签功能之外还发挥着充当接头、引物或索引的功能。

2.本发明的分子标签没有索引，制备方便，只需合成随机碱基功能模块，其兼容性高，其作为一种模块化的分子标签可以与现有各种检测方法配合使用，所有高通量测序都可以应用。

3.本发明的分子标签在应用中，可先将分子标签接入样本DNA的两端，然后再继续现有的各种高通量测序试验流程，原无需改动任何原高通量测序实验流程。

4.本发明的分子标签中的固定序列不仅作为标签编码和样品片段分界，也可以作用测序质量校验；该分子标签的一侧末尾留有包含T碱基和磷酸基团的黏性末端，极大提高连接效率。

5.本发明的分子标签应用实验步骤简单，样本DNA的5'端磷酸化、3'腺苷酸化、纯化、连接模块化分子标签试剂，涉及到实验试剂常见、便宜，操作简单，成本低。

6.本发明的分子标签本身不含索引，不会和原有高通量测序索引冲突；应用本发明的分子标签的样本可以和普通样本混合测序而互不影响。

7.应用本发明的分子标签在双端测序时，同一组内模块化分子标签的顺序可以指示测序正负链方向。

附图说明

图1为本发明的分子标签的具体结构。

图2为样本DNA两端连接本发明的分子标签的示意图。

图3为应用本发明的分子标签进行高通量测序之后的数据分析方法流程图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1分子标签试剂的制备

制备本发明的分子标签试剂的一种具体实施方式如下：

1.设计程序将序列5'-NNNNNNNNNTGACT-3'(N表示ATCG四种碱基)中可能序列全部罗列出来，并去除包含5个以上连续相同碱基的序列；分别合成所有列出的序列，并合成对应的互补链5'-GTCANNNNNNNNN-3'(末尾少一个A碱基)，并且互补链的5'端加磷酸基团修饰。

2.退火合成双链，将合成的每对序列以及其互补序列分别加水溶解混匀，使其浓度达到 100μM，放入PCR，设置95℃5分钟，后关闭PCR仪器等候1个小时。降温过程必须缓慢进行，不能使用PCR自带的降温体系；所以95摄氏度加热5分钟完成之后，必须确保关闭 PCR仪器。

3.将每种双链产物使用乙醇法沉淀(步骤2中的产物DNA)，得到每对序列的DNA产物沉淀；

1)取500μl的混合液聚到一个2ml离心管中；

2)加入50μl体积的乙酸钠(3mol/L，PH＝5.2)充分混匀(总体积550μl)；

3)将550μl溶液平均分成2管(每管275μl)，并，每个管子都加入675μl室温的无水乙醇，充分混匀；

4)在4℃下，12,000g离心30分钟，小心移出上清液；

5)两管分别加入1ml 75％(vol/vol)乙醇充分混匀，立刻，在4℃下12000g离心30分钟，小心移出上清液；

6)吸干液体，于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干(5分钟)。

4.将所有双链产物全部混在一起，加双蒸馏水，使其浓度为50μM，混匀保存在-20℃的环境下。

按上述方法制备的分子标签试剂制备方法简单，只需合成随机碱基功能模块，其兼容性高，其作为一种模块化的分子标签可以与现有各种检测方法配合使用，所有高通量测序都可以应用。而现有技术中的分子标签通常是既包括标签功能片段，还包含接头、引物或索引等序列，相比之下制备难度较大，且受接头、引物或索引的限制通常只局限于某种具体的测序方案，不能兼容所有的测序方法及测序平台。

实施例2分子标签试剂的使用

将本发明的分子标签应用于DNA测序的一种具体实施方式如下：

1.准备样品DNA，如果样品DNA过长，需要采用超声打断将DNA片段化，如果是ctDNA不需要超声打断；

2.使用建库试剂，将样品DNA进行末端修复，使DNA双链的片段修复成平末端，并且将5'末端磷酸化；

3.将样品DNA 3'端腺苷酸化，在末端修复后的3'末端加一个腺苷酸A，用来和分子标签一端突出碱基T配对；

4.将步骤3中的产物纯化，只保留DNA片段；可采用磁珠法进行纯化，经过纯化后，可以防止残留的磷酸基团使模块化分子标签产生平末端自连现象；

5.使用建库试剂中的T4连接酶将步骤4中产物和分子标签相连；连接后，两端为分子标签，中间为步骤4中产物；

6.纯化步骤5中的产物，纯化方法采用磁珠法；

7.步骤6的产物，和原始DNA特性完全一致，只不过增长了28碱基。新的DNA片段可以用任何一种测序进行高通量测序。

8.进行正常的高通量测序步骤，获取原始测序数据。

本发明的分子标签仅具有标签功能，能独立使用。该分子标签应用于DNA测序实验步骤简单，只需提前将样本DNA的5'端磷酸化、3'腺苷酸化、纯化、连接分子标签试剂，所涉及到实验试剂和方法均是本领域常用试剂和常规方法，试剂便宜，操作简单，成本低。使用本发明的分子标签能够兼容所有的DNA高通量测序技术及测序平台，无需改动原高通量测序实验流程，兼容性强，应用非常方便。本发明的分子标签本身不含索引，不会和原有高通量测序索引冲突，可以和普通样本混合测序而互不影响；在双端测序时，根据同一组内模块化分子标签的顺序还可以指示测序正负链方向。

采用本发明的分子标签进行DNA高通量测序时，所获得的原始数据按以下方法进行数据分析：

1.将原始数据(FASTQ格式)进行质控，过滤掉低质量的序列和不配对的序列(双端测序)；

2.提取分子标签序列并检测标签数据有效性；

截取测序序列开头14碱基(标签长度为9碱基)，子序列的结尾5个碱基必须是分子标签中的固定序列且随机碱基部分不得含有不确定碱基(N)。检查通过后，将随机碱基序列添加到FASTQ格式的描述信息行中。

3.将新的测序结果数据进行基因组比对；

4.根据标签编码将基因组定位相同的比对结果序列(SAM格式)进行分组，分两种情况：双端测序(推荐)，配对序列中的两个标签编码组合为准，不分先后，所有两个标签编码相同的结果序列都归为一组。单端测序，以序列的标签编码为准，所有相同的归为一组。

5.以组为单位，检查比对结果序列，仅组内共享的变异才会被保留下来；

6.校验完成后会有两个输出文件，一个是SAM格式用于变异检索，一个是FASTQ格式用于多种形式的基因组比对分析；

7.对校验后的结果序列进行变异分析，分析种类包括：单核苷酸变异、插入和缺失、结构性变异以及拷贝数变异。

8.对变异结果进一步注释解读分析。

根据本实施例所提供的分子标签试剂的使用方法及数据分析方法，在相同试验条件下与 life公司的测序仪(多重扩增技术方案)、illumina公司测序仪(替换索引序列方案、接在测序引物之后的方案)的进行比较，比较结果如表所示：

目的基因	变异种类	变异频率	多重PCR标签	接头标签	本发明标签
						EGFR	L858R	0.1％	√	√	√
EGFR	T790M	0.1％	√	√	√
						KRAS	G12D	0.1％	√	√	√
NRAS	Q61K	0.1％	√	√	√
						NRAS	A59T	0.1％	√	√	√
PIK3CA	E545K	0.1％	√	√	√

实验采用的是ctDNA的标准品(已知变异位点和频率)，用了三种不同的标签进行测试。其中，多重PCR标签配合life公司测序仪进行试验，接头标签配合illumina公司测序仪进行试验，本发明标签同时配合life公司测序仪和illumina公司进行试验；试验方案按照所使用测序仪的标准操作流程进行。测序仪结果发现，三种标签法在灵敏度上效果一致，都可以将标的变异检测出来；但是，本发明的标签兼容所有测序系统，通用性更高。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种兼容所有高通量测序方法及测序平台的分子标签，其特征在于，所述分子标签的全长序列为5'-NNNNNNNNNTGACT-3'，是由9个随机碱基N组成的标签编码部分和5个碱基组成的起界限作用的固定序列两部分组成；所述全长序列的两侧为黏性末端，3'端有由固定序列突出的胸腺T碱基，5'端含有一个磷酸化基团；所述随机碱基N选自A、T、C、G。

2.一种分子标签试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的分子标签和溶剂。

3.如权利要求2所述的分子标签试剂，其特征在于，所述溶剂为双蒸馏水，分子标签浓度为50μM。

4.如权利要求1所述分子标签用于高通量测序的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：

步骤1、将分子标签连接到样品DNA两端；

步骤2、进行高通量测序建库操作；

步骤3、连接测序接头、扩增、进行高通量测序。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤1的具体操作为：

1.1准备样品DNA；如果样品DNA过长，需要将DNA片段化，一般用超声打断，如果样品DNA是ctDNA，无须再超声打断；

1.2将样品DNA进行末端修复补平；

1.3将样品DNA进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化，使3'端突出一个腺嘌呤A碱基；

1.4使用磁珠法对步骤1.3的产物进行纯化，只保留样品DNA，可防止残留的磷酸基团使分子标签产生平末端自连现象；

1.5使用T4连接酶将本发明的分子标签连接到步骤1.4处理完成的样本DNA两端，所形成的新片段的两端为分子标签，中间为原始样品DNA。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：

2.1使用磁珠法纯化步骤1得到的产物；

2.2将纯化后的产物进行标准的高通量测序建库操作。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：

3.1将步骤2所得产物进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化；

3.2使用T4连接酶连接测序接头到步骤3.1产物的两端；

3.3使用接头引物对连接产物进行聚合酶链式反应，获取扩增产物；

3.4将扩增产物进行高通量测序。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

步骤4、高通量测序之后的数据分析，分析方法如下：

4.1将原始数据进行过滤质控；

4.2提取分子标签序列并通过检测标签数据有效性进一步过滤质量不高的测序数据；

4.3将新的测序结果数据进行基因组比对；

4.4根据标签编码将基因组定位相同的比对结果序列进行分组；

4.5以组为单位，检查比对结果序列，仅将组内共享的变异保留下来；

4.6对校验后的结果序列进行变异分析；

4.7对变异结果进一步解读分析。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤4.2中提取标签的方法是：

只保留固定序列的位置和碱基组成都正确的reads；截取固定系列及之前的随机标签序列；将随机标签序列加到fastq格式的信息行中；将新的fastq信息行、截短的reads组成新的fastq文件；成对reads都必须通过检验，否则都去除。