CN102443624A

CN102443624A - 一种高通量同时测序多样本cdr3受体库的方法

Info

Publication number: CN102443624A
Application number: CN2010105025609A
Authority: CN
Inventors: 姚新生; 贺晓燕
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2010-10-11
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-10-11
Also published as: CN102443624B

Abstract

本发明公开了一种高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法，根据V基因家族的同源性，只设计一套TCR或BCR链可变区V基因家族上游引物，然后通过设计与样本等数量的适合和上游引物配对的TCR或BCR链的C或J基因特征性下游引物，每个样本分别用一条特征性下游引物与同一套上游引物进行扩增，扩增出TCR或BCRCDR3区，然后将所有扩增后的样本混合成一个待测序样本库，测序；其中，所述特征性下游引物是由不同的ATCG碱基组成设计而成的。本发明使得运行一次高通量测序程序，可同时测得多个样本的CDR3序列，高通量测序成本大大降低，使得高通量测序技术在CDR3受体库测序研究中具有了广泛的应用价值。

Description

一种高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法

技术领域

本发明涉及T/B细胞CDR3受体库的测序方法，特别涉及一种高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法。

背景技术

近二十年来，T/B淋巴细胞的TCR/BCR CDR3受体库，在T/B细胞的发育、进化、分化、增殖成熟、亚群等研究和T/B细胞与感染、肿瘤、自身免疫病、干细胞和器官移植等研究中得到较为广泛的应用。CDR3受体库研究技术是基于TCR/BCR基因重排规律，在TCR( alpha/beta/gamma/delta链)和BCR(heavy/light链)的可变区(variable)基因设置上游引物，在连接区（joining）J基因或恒定区（constant）C基因设置下游引物，通过PCR扩增出目的链的PCR产物，用SSCP技术、GeneScan技术、荧光定量溶解曲线技术等分析PCR扩增各链不同家族产物的多（poly）、寡(oligo)、单(mono)克隆性（偏向性），代表相应链的T/B细胞克隆增生性（spectratyping 或immunescope技术）。或者用针对TCR/BCR不同多肽链的各可变区基因家族的单克隆抗体，采用FCM分析各链不同家族所代表的相应T/B细胞的表达频率，或者用PCR-ELISA/荧光定量PCR分/DNA杂交等技术分析各链不同V基因家族组成的T/B细胞CDR3频率。或采用单细胞PCR 技术监测研究样本中T/B细胞的CDR3/或通过转特异性TCR/BCR链基因的细胞/动物模型来研究CDR3/或者通过特定的抗原和TCR/BCR CDR3的互补性在相应的疾病/模型中进行研究等等。这些技术在TCR CDR3 受体库的应用中存在很大的局限性，随着第二代测序技术的进展，Roche 454测序平台和Illumina 的solexa测序平台等高通量测序技术，可对样本中的所有T/B细胞CDR3基因组成进行大规模的测序分析，使全面的分析样本中的CDR3受体库成为可能。

但这些高通量测序技术的运行成本比较高（每运行一次16万元以上），每次获得的测序读数是非常庞大的（454测序每次100万条以上读数，solexa每次测序5G以上读数），这限制了Roche 454测序平台和Illumina 的solexa测序平台等高通量测序技术在CDR3受体库分析中的广泛应用。但如果能同时把多个样本组合成一个测序文库上机运行一次检测程序，测序获得大量的CDR3库后，能把每个测序获得的CDR3序列特异地分到各个来源的样本中，就可使Roche 454测序平台和Illumina 的solexa测序平台等高通量测序技术广泛应用到CDR3受体库的基础和临床应用研究中。

但目前使用Roche 454测序平台和Illumina 的solexa测序平台等高通量测序技术进行CDR3受体库的测序时，都是不同的样本设计不同的上下游引物，测序前样本制备成本高，工作量大，操作繁琐，高通量测序成本极高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种经济、简便、实用的高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

本发明高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法：根据V基因家族的同源性，只设计一套TCR或BCR链可变区V基因家族上游引物，然后通过设计与样本等数量的适合和上游引物配对的TCR或BCR链的C或J基因特征性下游引物，每个样本分别用一条特征性下游引物与同一套上游引物进行扩增，扩增出TCR或BCR CDR3区，然后将所有扩增后的样本混合成一个待测序样本库，按高通量测序程序运行测序，总的测序结果数据根据每个样本特征性下游引物分到不同的样本中；其中，所述特征性下游引物是由不同的ATCG碱基组成设计而成的。

上述方法中所述的特征性下游引物有两种设计方式：

1、特征性下游引物可以设计程多条不同的适合与上游引物配对的TCR或BCR链的C或J基因下游引物，不同的下游引物（ATCG组成的特征性序列）用于区分不同的样本。比如设计5条特异下游引物，分别和同一套上游引物进行PCR扩增5个不同样品中的CDR3库，组成一个待测序样本库，在高通量测序仪上一次运行测序程序，获得的高通量测序结果根据5个样本中特定的下游引物序列可进行分开。

2、也可以设计一条TCR或BCR的C或J基因不同位点的特征性下游引物，或在同一位点引物的5’端加上多个不同碱基标签组成（接头），一种标签对应一个样本，这样就可以区分不同样本来源的同一次高通量测序结果。比如在同一条下游引物上分别添加10个ATCG组成不一样的5个特征性的接头，分别和同一套上游引物进行PCR扩增5个不同样品中的CDR3库，组成一个待测序样本库，在高通量测序仪上一次运行测序，获得的高通量测序结果根据5个样本中特定碱基组成的标签（接头）下游引物序列进行分开。

前述方法中所述的TCR或BCR链可以是人、鼠、斑马鱼的TCR或BCR链。

与现有技术相比，本发明针对多个不同的样本，设计一套上游引物，每一个样本用一条特征性下游引物进行样本来源的区分，这样使得运行一次高通量测序程序，可同时测得多个样本的CDR3序列，高通量测序成本大大降低，使得高通量测序技术在CDR3受体库测序研究中具有了广泛的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案。

以高通量测序分析人的TCR β 链CDR3 受体库为例：

1、人TCR β链V基因家族包含45个功能性基因家族和7个ORF,根据52个基因的同源性设计36条上游引物（见表一，也可以设计45条或52条或其他同源家族组合）。

2、人TCR β链的C和J基因的多条不同碱基组成的引物设计：

1）根据人TCR β链的C基因（TRBC1/TRBC2,高度同源性，见表2），可在TRBC基因的前端设计多条适合和上游引物配对的下游引物，比如：

（1）TRBC ttctgatggc tcaaacac ；

（2）TRBC gaagcagag atctcccac；

（3）TRBC acctgaacaa ggtgttccca ；

（4）TRBC ccacacccaa aaggccacac；

（5）TRBC gccacactg gtgtgcctg 等等。

用每条下游引物，比如（1）TRBC ttctgatggc tcaaacac，分别和36条上游引物进行一个样本量的PCR ，可扩增出该样本中TCR β链CDR3 受体库；分别用第（2）、（3）、（4）、（5）条下游引物扩增不同的样本，最终混合成一待测序样本文库，上机检测，测序结果根据特定的下游引物组成，把总体获得的数据分离到不同的5个样本中。

2）根据人TCR β链的J基因（总共13个），在每个J基因上设计适合和上游引物配对的多条下游引物，以人的TRBJ1-1为例，设计如下：

（1）TRBJ1-1- acaactgt gagtctggtg cc ；

（2）TRBJ1-1 actgt gagtctggtg ccttg；

（3）TRBJ1-1 gagtctggtg ccttgtccaa ；

（4）TRBJ1-1 ggtg ccttgtccaa agaaag；

（5）TRBJ1-1 gtg ccttgtccaa agaaagc 等等。

用每条下游引物，比如（1）TRBJ1-1--- acaactgt gagtctggtg cc，分别和36条上游引物进行一个样本量的PCR ，可扩增出该样本中TCR β链 V基因和TRBJ1-1基因重排产生的CDR3 受体库；可把不同特定序列的下游引物所扩增的不同样本最终混合成一待测序样本库，上机检测，测序结果中，根据特定的下游引物组成，把总体获得的数据分离到不同的样品中。

3、人TCR β链的C和J基因的同一条引物不同碱基组成的引物设计：

1）在同一条TRBC下游引物的5’端添加不同的接头，比如添加5个不同碱基组成的引物：

(1) TRBC - MID- ACGAGTGCGT -ttctg atggctcaaa cac ;

(2) TRBC - MID- ACGCTCGACA ttctg atggctcaaa cac;

(3) TRBC - MID- AGACGCACTC ttctg atggctcaaa cac;

(4) TRBC -MID- AGCACTGTAG ttctg atggctcaaa cac;

(5) TRBC - MID- ATCAGACACG ttctg atggctcaaa cac 等等。

用每条带不同标签的下游引物，比如(1) TRBC - MID- ACGAGTGCGT ttctg atggctcaaa cac ; 分别和36条上游引物进行一个样本量的PCR ，可扩增出该样本中TCR β链CDR3 受体库；可把不同接头引物所扩增的不同样品，最终混合成一待测序样本库，上机检测，测序结果中，根据特定的接头下游引物组成，把总体获得的数据分离到不同的样品中。

2）在同一条TRBJ下游引物的5’端添加不同的接头，比如添加5个不同碱基组成的引物：

（1）TRBJ1-1---MID- ACGAGTGCGT acaactgt gagtctggtg cc ；

（2）TRBJ1-1---MID- ACGCTCGACA acaactgt gagtctggtg cc ；

（3）TRBJ1-1---MID- AGACGCACTC acaactgt gagtctggtg cc ；

（4）TRBJ1-1---MID- AGCACTGTAG acaactgt gagtctggtg cc ；

（5）TRBJ1-1---MID- ATCAGACACG acaactgt gagtctggtg cc 等等

用每条带不同标签的下游引物，比如（1）TRBJ1-1--- ACGAGTGCGT acaactgt gagtctggtg cc，分别和36条上游引物进行一个样本量的PCR ，可扩增出该样本中TCR β链 V基因和TRBJ1-1基因重排产生的CDR3 受体库；可把不同接头引物所扩增的不同样品，最终混合成一待测序样本库，上机检测，测序结果中，根据特定的接头下游引物组成，把总体获得的数据分离到不同的样品中。

[0020] 表一人TCR β链V基因家族包含45个功能性基因家族和7个ORF，根据52个基因的同源性设计36条上游引物

表二人TCR β链的C基因

表三人TCR β链的J基因

Claims

1.一种高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法，其特征在于：根据V基因家族的同源性，只设计一套TCR或BCR链可变区V基因家族上游引物，然后通过设计与样本等数量的适合和上游引物配对的TCR或BCR链的C或J基因特征性下游引物，每个样本分别用一条特征性下游引物与同一套上游引物进行扩增，扩增出TCR或BCR CDR3区，然后将所有扩增后的样本混合成一个待测序样本库，按高通量测序程序运行测序，总的测序结果数据根据每个样本特征性下游引物分到不同的样本中；其中，所述特征性下游引物是由不同的ATCG碱基组成设计而成的。

2.按照权利要求1所述高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法，其特征在于：所述特征性下游引物是多条不同的适合与上游引物配对的TCR或BCR链的C或J基因下游引物。

3.按照权利要求1所述高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法，其特征在于：所述特征性下游引物是一条TCR或BCR的C或J基因不同位点设计的下游引物，或在同一位点引物的5’端加上多个不同碱基标签组成。

4.按照权利要求1或3任一所述高通量同时测序多样本CDR3受体库的方法，其特征在于：所述TCR或BCR链来源于是人、鼠、斑马鱼样本。